معلومة

كيف يتسبب تثبيط السيتوكروم ج أوكسيديز في موت الخلية؟

كيف يتسبب تثبيط السيتوكروم ج أوكسيديز في موت الخلية؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أدرك أن تثبيط السيتوكروم ج أوكسيديز يمنع إطلاق أيونات H + في الفضاء بين الغشاء ، وأن التدرج الأيوني مطلوب لعمل سينسيز ATP. ومع ذلك ، لست متأكدًا من سبب موت الخلايا.

هل هذا:

أ) منع أكسدة السيتوكروم C ، ومنع حركة الإلكترون لمركب السيتوكروم bc1 ، والذي بدوره يمنع حركة الإلكترون من الأجزاء السابقة في السلسلة ، مما يؤدي إلى إغلاق سلسلة نقل الإلكترون تمامًا؟ وبالتالي ، لا يتم إنتاج ATP وتموت الخلية بسبب نقص ATP.

ب) منع أكسدة السيتوكروم C ، ولكن لا تمنع الأكسدة في مجمعات البروتين الأخرى * ، ما عليك سوى تقليل عدد أيونات H + المتاحة لعمل سينسيز ATP ، وتقليل كمية ATP المنتجة ، وتموت الخلية بسبب انخفاض مستويات ATP.

ج) أخرى.

أدرك في كلتا الحالتين ، أن عدد ATP يتم تخفيضه فقط ، حيث يتم إنتاج ATP بواسطة طرق أخرى ، لذا فإن بياني "نقص ATP" ليس صريحًا تمامًا.

* في هذه الحالة ، كيف تتعامل الخلية مع الإلكترونات المحررة؟ هل هناك متقبلون للإلكترون لإزالة هذا؟


نادرًا ما يكون التثبيط ثنائيًا - فهو دائمًا ما يتعرض له التأثيرات المتكافئة. لذلك يمكن أن تكون الإجابة إما من الخيارين ، اعتمادًا على كمية المانع الموجودة في النظام. إذا كان هناك كمية كبيرة من المانع في الخلية ، فقد تكون أكثر أو أقل تماما استئصال إنتاج ATP بواسطة ETC.

من ناحية أخرى ، إذا لم يكن هناك ما يكفي من المانع لإغلاقه الكل أوكسيديز السيتوكروم سي ، ستلاحظ فقط انخفاضًا في كمية ATP التي تنتجها ETC (والتي قد لا تزال كافية قتل الخلية).

يعتمد أيضًا على نوع التثبيط الذي يحدث. هل هو قابل للعكس أم أنه ملزم بشكل دائم؟ هل تتحلل بسرعة؟ هذه الجوانب هي أيضا مهمة للنظر فيها.


مثبط ببتيد من السيتوكروم ج/ إينوزيتول 1،4،5-ترابط مستقبلات الفوسفات يحجب مسارات موت الخلايا الجوهرية والخارجية

أقسام * Neuroscience، & # x02020 Pharmacology and Molecular Sciences، & # x02021 Psychiatry and Behavioral Sciences، The Johns Hopkins University School of Medicine، 725 North Wolfe Street، Baltimore، MD 21205

داميان ب.فان روسوم

أقسام * Neuroscience، & # x02020 Pharmacology and Molecular Sciences، & # x02021 Psychiatry and Behavioral Sciences، The Johns Hopkins University School of Medicine، 725 North Wolfe Street، Baltimore، MD 21205

راندين ل باترسون

أقسام * علم الأعصاب ، & # x02020 علم الأدوية والعلوم الجزيئية ، و & # x02021 الطب النفسي والعلوم السلوكية ، كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز ، 725 شارع نورث وولف ، بالتيمور ، ماريلاند 21205

سليمان هـ. سنايدر

أقسام * Neuroscience، & # x02020 Pharmacology and Molecular Sciences، & # x02021 Psychiatry and Behavioral Sciences، The Johns Hopkins University School of Medicine، 725 North Wolfe Street، Baltimore، MD 21205


نقص أوكسيديز السيتوكروم ج

يوجد حاليًا 4 أشكال معروفة لنقص كوكس. يمكن أن يختلف مدى وشدة العلامات والأعراض بشكل كبير من حالة إلى أخرى.

في أحد الأشكال ، يُشار إليه بنوع اعتلال عضلي الميتوكوندريا الطفلي الحميد ، قد تقتصر الأعراض على عضلات الهيكل العظمي. قد تحدث نوبات من الحماض اللبني ويمكن أن تسبب مضاعفات تهدد الحياة إذا تركت دون علاج. ومع ذلك ، مع العلاج المناسب ، قد يتعافى الأفراد المصابون بهذا النوع من الحالة تلقائيًا خلال السنوات القليلة الأولى من الحياة. [1]

في الشكل الثاني من الاضطراب ، المشار إليه باسم نوع اعتلال عضلي الميتوكوندريا الطفلي ، تتأثر عضلات الهيكل العظمي بالإضافة إلى العديد من الأنسجة الأخرى (مثل القلب والكلى والكبد والدماغ و / أو النسيج الضام). تبدأ الأعراض المصاحبة لهذا الشكل عادةً في غضون الأسابيع القليلة الأولى من الحياة وقد تشمل ضعف العضلات ومشاكل القلب. قد يعاني الأطفال المصابون أيضًا من نوبات من الحماض اللبني. [1]

يُعتقد أن الشكل الثالث لنقص كوكس هو شكل جهازي من الحالة ويشار إليه بمرض لي. يتميز هذا الشكل بالتنكس التدريجي للدماغ بالإضافة إلى خلل في العديد من الأعضاء الأخرى بما في ذلك القلب والكلى والعضلات و / أو الكبد. قد تبدأ أعراض هذا الشكل ، والتي تشمل في الغالب الجهاز العصبي المركزي ، ما بين ثلاثة أشهر وسنتين من العمر وقد تشمل فقدان المهارات الحركية المكتسبة سابقًا و / أو التحكم في الرأس ضعف القدرة على المص وفقدان الشهية والتقيؤ والتهيج والنوبات المحتملة. قد تحدث الإعاقة الذهنية أيضًا. [1]

في الشكل الرابع لنقص كوكس ، النوع الفرنسي الكندي ، يتأثر الدماغ (كما في مرض لي) والكبد بشكل خاص بالإضافة إلى عضلات الهيكل العظمي والأنسجة الضامة. ومع ذلك ، في هذا الشكل ، يبدو أن للكلى والقلب نشاط إنزيم شبه طبيعي. الأفراد الذين يعانون من هذا الشكل قد يعانون من نقص التوتر النمائي والتشوهات الطفيفة في الوجه. [1]

على الرغم من أن بعض الأفراد المصابين بشكل خفيف يظلون على قيد الحياة حتى مرحلة المراهقة أو البلوغ ، إلا أن هذه الحالة غالبًا ما تكون قاتلة في مرحلة الطفولة. [2]

يسرد هذا الجدول الأعراض التي قد يعاني منها الأشخاص المصابون بهذا المرض. بالنسبة لمعظم الأمراض ، تختلف الأعراض من شخص لآخر. قد لا تظهر جميع الأعراض المذكورة على الأشخاص المصابين بنفس المرض. تأتي هذه المعلومات من قاعدة بيانات تسمى علم الوجود الظاهري للنمط البشري (HPO). يجمع HPO معلومات عن الأعراض التي تم وصفها في الموارد الطبية. يتم تحديث HPO بانتظام. استخدم معرف HPO للوصول إلى مزيد من المعلومات المتعمقة حول أحد الأعراض.


ميراث

السيتوكروم ج يمكن أن يكون لنقص أوكسيديز أنماط وراثية مختلفة اعتمادًا على الجين المعني.

عندما تحدث هذه الحالة بسبب طفرات في الجينات داخل الحمض النووي النووي ، فإنها موروثة في نمط وراثي جسمي متنحي ، مما يعني أن كلا نسختي الجين في كل خلية بها طفرات. يحمل كل من والدي الفرد المصاب بحالة جسمية متنحية نسخة واحدة من الجين المتحور ، لكنهم لا يظهرون عادةً علامات وأعراض الحالة.

عندما تحدث هذه الحالة بسبب طفرات في الجينات داخل mtDNA ، فإنها موروثة في نمط الميتوكوندريا ، والذي يُعرف أيضًا باسم وراثة الأمهات. ينطبق هذا النمط من الوراثة على الجينات الموجودة في mtDNA. نظرًا لأن خلايا البويضات ، وليس خلايا الحيوانات المنوية ، تساهم بالميتوكوندريا في تطور الجنين ، يمكن للأطفال فقط أن يرثوا الاضطرابات الناتجة عن طفرات mtDNA من أمهاتهم. يمكن أن تظهر هذه الاضطرابات في كل جيل من الأسرة ويمكن أن تؤثر على كل من الذكور والإناث ، لكن الآباء لا ينقلون السمات المرتبطة بالتغيرات في mtDNA إلى أطفالهم.


النتائج

النوع البري S. cerevisiae تخضع الخلايا الثابتة لعملية PCD مستحثة بحمض الخليك

ركزت الدراسة على دور الميتوكوندريا في عملية PCD التي تم الإبلاغ عنها سابقًا والتي يسببها حمض الأسيتيك في S. cerevisiae W303-1A (لودوفيكو وآخرون.، 2001 أ). تم استخدام الخلايا الثابتة بدلاً من الخلايا الأسية لهذا الغرض. تعتبر الخلايا من مرحلة النمو الثابت أكثر فائدة لأنها تمتلك ميتوكوندريا نشطة بالكامل وتعرض كتلة ميتوكوندريا أعلى. عند التعرض لتركيزات مختلفة من حمض الأسيتيك عند درجة الحموضة 3.0 ، وفي وجود الجلوكوز ، S. cerevisiae تلتزم الخلايا الثابتة أيضًا بعملية PCD. يعتمد هذا الاستنتاج على الكشف عن موت الخلايا المصحوب بفواصل شرائط الحمض النووي التي تم تقييمها بواسطة مقايسة TUNEL (بياناتنا غير المنشورة) ، وهي علامة استماتة واضحة ، وحقيقة أن هكسيميد حلقي يمنع موت الخلية (الشكل 1). تمشيا مع المقاومة العالية المعترف بها للخلايا الثابتة لعوامل الإجهاد المختلفة ، لوحظ التأثير فقط لتركيزات حمض الأسيتيك الأعلى. في الواقع ، على الرغم من أن تركيزات حمض الخليك & gt120 ملي مولار نخرية للخلايا الأسية ، فإنها تحفز عملية PCD في الخلايا الثابتة. في الواقع ، يؤدي تركيز 140 ملي مولار من حامض الخليك ، بعد 200 دقيقة ، إلى 50 ٪ من فقدان صلاحية الخلية التي تم تقييمها بواسطة cfu و 30 ٪ من الخلايا الإيجابية TUNEL. تم اختيار هذا التركيز (140 ملم) لإجراء تحليل وظائف الميتوكوندريا. أدى الحضانة بتركيزات حمض الخليك و GT200 ملي مول إلى عدم وجود تلطيخ TUNEL يمكن اكتشافه (بياناتنا غير المنشورة).

التين. 1. موت الخلية المبرمج لل S. cerevisiae W303-1A يتم تثبيط الخلايا الثابتة التي يسببها حمض الأسيتيك جزئيًا بواسطة سيكلوهكسيميد وهي مستقلة عن الفسفرة المؤكسدة. البقاء النسبي (النسبة المئوية لـ cfu على لوحات أجار YEPD 100 ٪ تقابل عدد cfu في الوقت 0) من الخلايا المحتضنة لمدة 200 دقيقة مع 140 ملي مولار من حمض الخليك في غياب (▪) أو وجود سيكلوهيكسيميد () أو أوليغوميسين (▴) ).

لتقييم ما إذا كان PCD الناجم عن حمض الأسيتيك في S. cerevisiae يتأثر بتثبيط الفسفرة المؤكسدة ، وقد أجريت المعالجة بحمض الأسيتيك في وجود أوليغوميسين. يوضح الشكل 1 أن موت الخلايا لم يتأثر بالعقار.

السيتوكروم ج ينتقل من الميتوكوندريا إلى العصارة الخلوية أثناء عملية PCD التي يسببها حمض الأسيتيك

للتحقق مما إذا كانت عملية PCD المستحثة بحمض الخليك مصحوبة بإطلاق CytC من الميتوكوندريا إلى العصارة الخلوية ، ومستويات CytC في الميتوكوندريا وفي PMS (التي تحتوي على بروتينات خلوية قابلة للذوبان) من S. cerevisiae تم الكشف عن خلايا W303-1A التي تخضع للحمض PCD بواسطة تحليل لطخة غربية. تم تقليل كمية CytC الموجودة في الميتوكوندريا للخلايا المعالجة بـ 140 ملي حمض أسيتيك بمقدار ضعفين إلى ثلاثة أضعاف مقارنة بالميتوكوندريا من الخلايا غير المعالجة (الشكل 2). تم اكتشاف هذا الجزء من CytC "المفقود" في الميتوكوندريا من الخلايا المعالجة بحمض الخليك في الدورة الشهرية ، بينما لم يتم اكتشاف CytC في الدورة الشهرية لخلايا التحكم غير المعالجة (الشكل 2). لم يتم الكشف عن مستويات بروتينات الميتوكوندريا الأخرى ، مثل الوحدات الفرعية COX II و V في PMS (بياناتنا غير المنشورة) ، على الرغم من أنه تم العثور على COX II قد انخفض في الميتوكوندريا (الموصوفة أدناه). تم تأكيد انخفاض كمية CytC في الميتوكوندريا عن طريق تحليل أطياف السيتوكروم للميتوكوندريا من الخلايا المعالجة وغير المعالجة. كما هو مبين في الشكل 3 أ ، كان هناك بعض الانخفاض في كمية السيتوكرومات ج + ج1 المستخرجة من أغشية الميتوكوندريا.

التين. 2. في S. cerevisiae W303-1A السيتوكرومج من الميتوكوندريا إلى العصارة الخلوية أثناء PCD الناجم عن حمض الأسيتيك. تم اكتشاف CytC عن طريق الكشف المناعي في الميتوكوندريا (5 و 10 و 20 ميكروغرام من البروتين) والمواد الطافية بعد الميتوكوندريا التي تم الحصول عليها من S. cerevisiae الخلايا الثابتة غير المعالجة (أ) أو الخلايا المعالجة بـ 140 ملي مولار من حامض الخليك (ب).

التين. 3. إطلاق CytC يوازي تقليل السيتوكروم ج أوكسيديز في الخلايا المعالجة بالحمض. (أ) أطياف السيتوكروم. أطياف السيتوكروم S. cerevisiaeالميتوكوندريا المعزولة من الخلايا غير المعالجة (الخط الكامل) أو من الخلايا المعالجة بـ 140 ملي مولار من حمض الأسيتيك (الخط المتقطع). نطاقات الامتصاص α المقابلة للسيتوكرومات أ + أ3 لديها الحد الأقصى عند 603 نانومتر. الحد الأقصى المقابل للسيتوكرومب هو 560 نانومتر والسيتوكرومج + ج1، 550 نانومتر. (ب) تنخفض مستويات الحالة المستقرة للوحدة الفرعية COX II في الميتوكوندريا من الخلايا المعالجة بالحمض. الكشف المناعي للوحدات الفرعية COX II و V و ATPase 6 في أغشية الميتوكوندريا في S. cerevisiae الخلايا غير المعالجة (أ) أو الخلايا المعالجة بـ 140 ملي مولار من حامض الخليك (ب).

تم تقييم مستويات CytC أيضًا في الميتوكوندريا وفي الدورة الشهرية من S. cerevisiae ATP10 الخلايا الطافرة ، التي لا تخضع لعملية PCD التي يسببها حمض الأسيتيك كما هو موضح أدناه. لم يتم اكتشاف CytC في PMS ووجد أنه في المستوى الطبيعي في الميتوكوندريا ، مقارنة بالخلايا غير المعالجة (بياناتنا غير المنشورة). تشير هذه النتائج إلى أن CytC ينتقل على وجه التحديد من الميتوكوندريا إلى العصارة الخلوية أثناء PCD الناجم عن الحمض.

يتم إنتاج أنواع ROS في الميتوكوندريا أثناء عملية PCD التي يسببها حمض الأسيتيك

S. cerevisiae الخلايا الثابتة W303-1A ملطخة بـ MitoTracker Red CM-H2تم تحليل Xros ومعالجته بـ 140 ملي مولار من حامض الخليك عن طريق قياس التدفق الخلوي. لا يمكن اكتشاف زيادة في التألق الأحمر الذي يشير إلى الخلايا مع زيادة إنتاج الميتوكوندريا ROS إلا بعد 100 دقيقة من العلاج (بياناتنا غير المنشورة). أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها بعد 200 دقيقة من العلاج وجود مجموعة سكانية غير متجانسة ومجموعة سكانية فرعية ثانية (45٪) بمتوسط ​​كثافة مضان أعلى (الشكل 4). أظهر تحليل epifluorescence أن هذه المجموعة السكانية الفرعية تعرض مضانًا أحمر ساطعًا موضعيًا في الميتوكوندريا (بياناتنا غير المنشورة). علاوة على ذلك ، أظهرت الخلايا المقتولة أعلى تألق أحمر يتوافق مع تلطيخ خلية غير محدد (بياناتنا غير المنشورة).

الشكل 4. يتم إنتاج أنواع ROS في الميتوكوندرياS. cerevisiae W303-1A الخلايا المعالجة بحمض الخليك. تراكب الرسوم البيانية للفلورة الحمراء التي تم الحصول عليها للخلايا الملطخة بـ MitoTracker Red CM-H2XRos. الخلايا غير المعالجة (خط رمادي رفيع) ، أو الخلايا المعالجة بـ 140 ملي مولار من حمض الأسيتيك (خط أسود سميك).

يصاحب PCD الناجم عن حمض الأسيتيك تعديلات الميتوكوندريا

تم تقييم قدرة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا المعزولة من الخلايا المعالجة وحمض الخليك على شكل استقطاب عن طريق قياس امتصاص الأكسجين باستخدام NADH كركيزة. تم تقييم تأثير CytC المضاف خارجيًا على التنفس في مجموعة من التجارب. تظهر النتائج الواردة في الجدول 1 أن الميتوكوندريا المعزولة من الخلايا المعالجة بحمض الخليك 140 ملي مولار لها انخفاض كبير في استهلاك الأكسجين ، مع انخفاض بنسبة 75 ٪ تقريبًا في نشاط أوكسيديز NADH. على الرغم من ملاحظة زيادة استهلاك الأكسجين بمقدار 2.8 ضعفًا بعد إضافة CytC ، إلا أن عدم القدرة على استعادة معدل التنفس بشكل كامل مع هذه الإضافة يشير إلى أن جزءًا إنزيميًا من السلسلة التنفسية يمكن أن يتأثر جوهريًا.

الجدول 1. الأنشطة التنفسية للميتوكوندريا من الخلايا المعالجة وحمض الأسيتيك تم تقييم الميتوكوندريا بطريقة الاستقطاب من أجل NADH أوكسيديز. تم الإبلاغ عن الأنشطة المحددة (يتم التعبير عنها في شكل جزيئات نانوية من O2 في الدقيقة لكل مليغرام من البروتين) للتنفس غير الحساس لـ KCN. نشاط أوكسيديز السيتوكروم (معبر عنه بالميكرومولات من السيتوكروم جيتأكسد في الدقيقة لكل مليغرام من بروتين الميتوكوندريا) تم اختباره طيفيًا في الميتوكوندريا المنفعلة باستخدام ديوكسيكولات البوتاسيوم عن طريق قياس أكسدة فيروسيتوكروم ج عند 550 نانومتر. NADH السيتوكروم ج اختزال (معبرا عنه بالميكرومولات من السيتوكروم ج تم قياس انخفاضه في الدقيقة لكل مليغرام من بروتين الميتوكوندريا) أيضًا قياسًا طيفيًا كما هو موضح في المواد والطرق. لم تختلف المعدلات المقاسة في فحصين مستقلين على الأقل بنسبة & gt10٪. القيم المبلغ عنها هي متوسط ​​الفحصين.

لإنشاء الأساس الكيميائي الحيوي للانخفاض في نشاط الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ، تم قياس أنشطة اختزال NADH-CytC و COX للميتوكوندريا المعزولة من الخلايا غير المعالجة والمعالجة بالحمض. كما هو مبين في الجدول 1 ، أدى العلاج بـ 140 ملي مولار من حمض الأسيتيك إلى انخفاض بنسبة 50 ٪ من نشاط COX في أغشية الميتوكوندريا ، في حين كان نشاط اختزال NADH-CytC مطابقًا بشكل أساسي لتلك التي تم الحصول عليها بالميتوكوندريا من الخلايا غير المعالجة. تؤكد هذه النتائج أن مركب COX قد تأثر ، في حين أنه معقدقبل الميلاد1 لم يتأثر بالعلاج. تم تسجيل أطياف السيتوكروميس في الميتوكوندريا المعزولة (الشكل 3 أ) لتوضيح التغيرات الملحوظة في سلسلة الجهاز التنفسي (الجدول 1). بالاتفاق مع نشاط COX المنخفض الملحوظ ، انخفاض في كمية السيتوكرومات أ + أ3 لوحظ في أغشية الميتوكوندريا للخلايا المعالجة بحمض الخليك ، بينما لوحظت مستويات السيتوكروم ب لم تتأثر (الشكل 3 أ).

عندما تم تحليل الوحدتين الفرعيتين COX II و V عن طريق الكشف المناعي لبروتينات الميتوكوندريا التي تم الحصول عليها من الخلايا المعالجة بحمض الخليك 140 ملي مولار ، تم العثور على كمية بروتين COX II ولكن ليس COX V أقل مما كانت عليه في عنصر التحكم (الشكل 3 ب). بالإضافة إلى ذلك ، كمية السيتوكرومب من عند قبل الميلاد1 المعقدة والوحدة الفرعية 6 من ATPase ظلت متطابقة للسيطرة (الشكل 3 ب).

أفادت بعض الدراسات حول موت الخلايا المبرمج في الثدييات عن زيادة ميكرومتر بعد المنبه القاتل ، مع تناقص ميكرومتر لاحقًا في عملية الوفاة (Vander Heiden وآخرون.، 1997 ، 1999). تمشيا مع هذه الملاحظات ، في دراستنا ، تسببت معالجة حمض الأسيتيك في حدوث فرط استقطاب طفيف عابر يتبعه إزالة الاستقطاب (بياناتنا غير المنشورة). ومع ذلك ، على الرغم من انخفاض ميكرومتر ، حافظت الخلايا على تلطيخ الميتوكوندريا المحدد الذي يشير إلى أن سلامة غشاء الميتوكوندريا لا تزال محفوظة (بياناتنا غير المنشورة).

التنفس الميتوكوندريا ضروري للخضوع في S. cerevisiae لعملية PCD التي يسببها حمض الخليك

تم تحليل متطلبات وظيفة الميتوكوندريا في عملية PCD التي يسببها حمض الأسيتيك من خلال دراسة ثلاثة S. cerevisiae W303-1A سلالات متحولة ، وهي ρ 0 ، تفتقر إلى الحمض النووي للميتوكوندرياATP10 متحولة ، تم حذفها في عامل تجميع لـ ATPase الميتوكوندريا والصفر CYC3 متحولة ، محذوفة في الجين الذي يشفر الهيم لياز ، ضروري للربط التساهمي لمجموعة الهيم بالشكل الإسوي 1 و 2 من أبوسيتوكروم ج (بيرس وشيرمان ، 1995). وقد لوحظ أن هذه السلالات الطافرة كانت أكثر مقاومة للموت الناجم عن حمض الأسيتيك ، مقارنة بالسلالة البرية. بالإضافة إلى ذلك ، لم يكن للهكسيميد الحلقي أي تأثير على البقاء (الشكل 5) ولم يتم العثور على خلايا إيجابية TUNEL ، لأي من تركيزات حمض الأسيتيك التي تم اختبارها ، حتى بالنسبة للتركيزات التي تحفز نسبة مئوية من الخلايا الميتة مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من النوع البري (لدينا بيانات غير منشورة).

التين. 5. الخلايا الطافرة التي تعاني من قصور في الجهاز التنفسي S. cerevisiae W303-1A أكثر مقاومة لحمض الخليك ولا يثبط الموت الناجم عن الحمض بواسطة سيكلوهكسيميد. البقاء النسبي (النسبة المئوية لـ cfu على لوحات أجار YEPD تتوافق 100 ٪ مع عدد cfu في الوقت 0) من النوع البري ، ρ 0 (تفتقر إلى الحمض النووي للميتوكوندريا) ، ΔATP10 (مستنفد من ATPase) ، و ΔCYC3 (المستنفد من CytC) من خلايا S. cerevisiae حضانة لمدة 200 دقيقة بحمض الأسيتيك في حالة عدم وجود (أشرطة سوداء) أو وجود (أشرطة بيضاء) من السيكلوهكسيميد.


المواد والأساليب

الكواشف

تم شراء أسكوربات الصوديوم ، L- أرجينين ، ديثيونيت الصوديوم ، S-ethylisothiourea (S-EITU) ، myxothiazol ، نتريت الصوديوم ، مثبط بروتياز فول الصويا ، التتراسيكلين و N ، N ، N ′ ، N tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD) ألدريتش سيجما. كانت وسائط استنبات الخلايا و hygromycin و trypsin-EDTA من Invitrogen. كان Blasticidin من Calbiochem.

تحضير البلازميد وترنسفكأيشن

تم الحصول على خط الخلية المحرض على التتراسيكلين Tet-iNOS 293 والذي يعبر بشكل ثابت عن NOS من الخلايا الغضروفية البشرية كما هو موصوف سابقًا (Mateo et al. ، 2003). باختصار ، تم استنساخ cDNA الذي يشفر منطقة الترميز الكاملة لجين NOS (انضمام GenBank رقم X73029) في ناقل التعبير المحرض pcDNA5 / FRT / TO (Invitrogen) باستخدام بادئات PCR المصممة لاحتواء مواقع تقييد لـ هينdIII و زهوأنا عند النهايتين 5 و 3 ، على التوالي ، أعطي نتيجة لذلك بنية DNA PCDNA5 / FRT / TO-iNOS. بالنسبة للترنس ، تم نقل 2 × 10 6 خلية Flp-In ™ T-REx ™ -293 (Invitrogen) ، التي تعبر بثبات عن مثبط التتراسيكلين ، مع 0.3 ميكروغرام من pcDNA5 / FRT / TO-iNOS و 3 ميكروغرام من إعادة التركيب Flp التعبير عن البلازميد (pOG44) باستخدام 7.5 ميكرولتر من lipofectamine 2000 (Invitrogen) ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد ثمانية وأربعين ساعة من تعداء العدوى ، تم اختيار الخلايا في وسط نمو مكمل بـ 200 ميكروغرام مل -1 هيجرومايسين ب و 15 ميكروغرام مل -1 بلاستيدين.

ثقافة الخلية وتحريض NOS البشري في خلايا Tet-iNOS293

تمت زراعة خلايا Tet-iNOS 293 في قوارير T-175 باستخدام وسيط النسر المعدل من Dulbecco الخالي من الفينول الأحمر (DMEM) الذي يحتوي على 25 ملي مولار من الجلوكوز ، 4 ملي جلوتامين ، 15 ميكروغرام مل -1 بلاستيدين ، 200 ميكروغرام مل -1 هييجروميسين ب و 10٪ (حجم / حجم) من مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة (HI-FBS) ، كما هو موصوف سابقًا (ماتيو وآخرون ، 2003). تم تحقيق أقصى تعبير عن NOS البشري في خلايا Tet-iNOS293 خلال 15 ساعة من الحضانة مع وسيط الحث (DMEM يحتوي على 25 ملي مولار من الجلوكوز ، 4 ملي جلوتامين ، 10 ٪ HI-FBS ، 1.5 ميكروغرام مل -1 تتراسيكلين و 500 ميكرومتر S-EITU يضاف الأخير لتجنب توليد NO من L- أرجينين في الوسط الضروري لثنائي NOS ونشاط الإنزيم الناتج). في ظل هذه الظروف ، حققنا جيل NO حساسًا وقابلًا للتكرار من NOS استجابة لتركيزات صغيرة من L-arginine الخارجي. كان الإنتاج الأساسي لـ NO واضحًا في هذه الخلايا (انظر النتائج) حتى في حالة عدم وجود L-arginine الخارجي ، على الأرجح بسبب تحويل L-arginine المتولد داخليًا بواسطة NOS بمجرد إزالة المثبط (S-EITU).

تم حصاد الخلايا عن طريق التربسين ، ثم بالطرد المركزي عند 115 ز لمدة 10 دقائق وإعادة تعليقها بتركيز 5 × 10 6 خلايا مل -1 في محلول Hanks-VLS (20 ملي مولار HEPES ، 5.5 ملي مولار جلوكوز ، 5.37 ملي مول كلوريد ، 1.26 ملي كلوريد الكالسيوم2، 0.5 ملي MgCl2، 0.4 ملي MgSO4، 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 4.2 ملي مولار NaHCO3، 0.34 ملي مولار Na2HPO4 و 1٪ سائل HI-FBS). كانت صلاحية الخلية دائمًا أكثر من 95 ٪ ، كما تم قياسها بواسطة طريقة استبعاد Trypan Blue. تم وضع المعلقات الخلوية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع التحريض المستمر (80 دورة في الدقيقة) لضمان بقائها مؤكسجة جيدًا وعند درجة حرارة ثابتة طوال التجارب. بعد ساعة واحدة من الحضانة لإزالة مثبط NOS ، تم طرد الخلايا مرة أخرى وإعادة تعليقها عند تركيز خلية يبلغ حوالي 2 × 10 7 خلية مل -1 في محلول Hanks-VLS. تم تحضين الخلايا بعد ذلك لمدة ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل وضعها في غرفة VLS في قسامات بحجم 1 مل نهائي. في نهاية كل تجربة ، تم تخفيف قسامات مقدارها 50 ميكرولتر في ثلاث نسخ ، في 10 مل من المخزن المؤقت متساوي التوتر ، وتم إجراء عد الخلايا على الفور باستخدام عداد كولتر (سلسلة Z ، بيكمان كولتر FL). تمت إضافة L-arginine دائمًا عند تركيز O2 في الغرفة (تقريبًا) 70 ميكرومتر. هذا [O2] لأن كلا من معلمات دراستنا ، التنفس وحالة الأكسدة والاختزال في السيتوكرومات أأ3 و cc1، ظلت مستقلة عن [O2] أعلى من -50 ميكرومتر (في حالة عدم وجود L-arginine خارجي المنشأ ، حدثت تغييرات كبيرة من خطوط الأساس في السيتوكرومات aa3، والتنفس عند 34.4 ± 1.1 و 9.8 ± 1.1 ميكرومتر O2، على التوالى).

القياس المتزامن لحالات الأكسدة السيتوكرومية والتنفس و NO إطلاق من L- أرجينين الخارجية

نظام التحليل الطيفي للضوء المرئي (VLS) هو في الأساس نفس الموصوف من قبل (هوليس وآخرون ، 2003) مع بعض التحسينات في النظام البصري واكتشاف أكسيد النيتروجين. باختصار ، تم استبدال محزوز الحيود بآخر مشتعل عند 400 نانومتر (Horiba-Jobin Yvon ، ستانمور ، المملكة المتحدة) ، لزيادة حساسية الكشف عن الضوء في المنطقة المرئية ، والألياف الضوئية مع تلك ذات القطر الأساسي الأكبر والفتحة العددية (Thorlabs ، Ely ، المملكة المتحدة) ، من أجل تحسين التسليم وجمع الضوء. تسمح هذه التحسينات على النظام بزيادة معدل أخذ العينات من 50 إلى 100 هرتز ، على الرغم من الحفاظ على المتوسط ​​بحيث يتم تسجيل نقطة بيانات أو طيف كل 500 مللي ثانية. تم استبدال القطب NO بمستشعر نانوي (amiNO-700 Innovative Instruments ، FL) ، تمت معايرته باستخدام تركيزات قياسية من NaNO2 في التفاعل مع 10 ملي مولار و 100 ملي مولار2وبالتالي4 عند 37 درجة مئوية. كانت حساسية القطب لتوليد NO في المتوسط ​​أكثر من 250 باسكال نانومتر -1. معايرة نوع Clarke O2 قطب كهربائي (رانك بروس ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) وتصحيحات لاستجابته الزمنية وخلفيته O2 تم تنفيذ الاستهلاك على النحو الموصوف سابقًا (هوليس وآخرون ، 2003). معدل تنفس الميتوكوندريا (VO2) كمشتق زمني لـ [O2].

يتم تحويل التغييرات المقاسة في التوهين البصري إلى تغييرات في حالات الأكسدة والاختزال في السيتوكروميات الميتوكوندريا من خلال مجموعتين من المربعات الصغرى الخطية متعددة الأطوال الموجية تناسب معاملات الامتصاص المحددة (هوليس وآخرون ، 2003). لحساب تغييرات عدم الامتصاص في أطياف التوهين ، تم تضمين خلفية من الدرجة الأولى في خوارزمية ملائمة المربعات الصغرى ، الموصوفة بواسطة (x· λ) +ذ، أين λ هو الطول الموجي و x و ذ هي المعاملات (المتغيرة) الحرة لخلفية الدرجة الأولى. تم إجراء عمليات محاكاة لإثبات قدرة التركيب على استعادة التغييرات المعتمدة على الأكسدة والاختزال في تركيزات السيتوكروم ضمن نطاق تغييرات الأكسدة والاختزال التي لوحظت هنا (البيانات غير معروضة).

تم إجراء قياس طول المسار ، المطلوب لتحديد التغيرات المعتمدة على الأكسدة والاختزال في تركيزات السيتوكروم ، على النحو الموصوف سابقًا (هوليس وآخرون ، 2003). ضمن نطاق تركيزات الخلايا المستخدمة هنا ، هناك عنصر مهم (ص& lt0.001) تم ملاحظة ارتباط سلبي بين تركيز الخلية وطول المسار. وهكذا ، تم حساب طول المسار (β) من تركيز الخلية باستخدام المعادلة β =ص· [خلية] +ف، حيث [الخلية] هو تركيز الخلية والمعاملات ص و ف كانت -0.23 ± 0.01 سم 10-7 خلايا مل -1 و 2.56 ± 0.03 سم ، على التوالي (ن=16).

القياس الكمي للتغيرات في معدل التنفس والحد من السيتوكرومات أأ3 و cc1

التغييرات في حالات الأكسدة والاختزال في السيتوكرومات أأ3 و cc1 يتم التعبير عنها كنسبة مئوية من التغييرات تتراوح بين 0٪ في [O.2] - خط الأساس المستقل (قبل إضافة ارجينين عند ∼70 ميكرومتر O2) و 100٪ عند اختزالها بالكامل عند نقص الأكسجين. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن حالات الأكسدة والاختزال في السيتوكرومات أأ3 و cc1 في [O2] - خط الأساس المستقل ليس 0٪ ، أي مؤكسد بالكامل. تم تصميم هذا التخصيص لتوفير مقارنة أفضل مع VO2، والتي تم تطبيع القيمة القصوى لها أثناء الحالة المستقرة إلى 100٪. باستخدام الطريقة الموضحة أدناه لتحديد إجمالي تركيزات السيتوكروم ، النسبة المئوية للسيتوكروم أأ3 و cc1 في أشكالهم المختصرة في [O2] - تم تقدير خط الأساس المستقل بـ 11.8 ± 1.4 و 11.4 ± 1.6٪ ، على التوالي (ن= 6). بالنسبة لحالة السيتوكروم أأ3 يعكس هذا في الغالب (80-90٪) حالة الأكسدة والاختزال في السيتوكروم أ ولا يستخدم لاستخلاص استنتاجات حول أنواع الأكسدة والاختزال التي تسكن المركز الحفاز (أ3· النحاسب). قياس السيتوكرومات سم مكعب1 تتألف من إشارة مجمعة من السيتوكروم ج1 من مجمع قبل الميلاد1 و السيتوكروم ج في الفضاء بين الغشاء ، على الرغم من أن نسبة ج: ج1 في خلايا Tet-iNOS293 غير محدد.

تقدير التركيز الكلي لـ CcO ورقم دوران (TN) للإنزيم في الجسم الحي

إجمالي تركيز CcO ([CcO]المجموع) في خلايا التنفس عن طريق القياس من خط الأساس للحد الأقصى من السيتوكروم أأ3 في نقص الأكسجين (Δ [aa3]أحمر) وفي تجربة مستقلة ، تم الحصول على الحد الأقصى من الأكسدة بعد إضافة 1 ميكرومتر من myxothiazol (Δ [aa3]أوكسي) ، أي [CcO]المجموع= (Δ [أأ3]أحمر+ Δ [أأ3]أوكسي) / β ، حيث هو طول المسار المحدد من رقم الخلية كما هو موضح أعلاه. ثم تم تقدير معدل دوران الإلكترون (eTN) للإنزيم (بالإلكترونات في الثانية) من التركيز الكلي للإنزيم و VO الأقصى2 خلال [O2] - مرحلة مستقلة (VO2 ماكس) باستخدام المعادلة eTN = VO2 ماكس4 / [CcO]المجموع، العامل 4 الذي يمثل عدد الإلكترونات في دورة دوران واحدة لـ CcO ، أي استهلاك جزيء واحد من O2.

تحليل احصائي

تم تحديد متوسط ​​الانحراف المعياري للتحليل الكمي للنتائج. تم استخدام اختبار Z (ثنائي الذيل) لتحديد التغييرات المهمة إحصائيًا في VO2 و cytochromes aa3 و cc1 من [س2] - القيم الأساسية المستقلة ، و (أحادية الطرف) ر- تم استخدام الاختبار لتحديد الارتباطات ذات الدلالة الإحصائية بين المتغيرات التابعة والمستقلة (طول المسار مقابل تركيز الخلية و eTN مقابل انخفاض التنفس).


الخصائص الفيزيائية

الكتلة الجزيئية: 3
12384 دا (فرسي)
12327 دا (بقري)
12384 دا (حمامة)
12،588 دا (خميرة الخميرة)
12،233 دا (بشري)

النقطة الكهروضوئية (pI): 4 نطاق من 10.0 - 10.5 (فرسي)
الخصائص الطيفية: 5 (فرسي)
λmax = 550 نانومتر (شكل مخفض)
E مم = 29.5 (شكل مخفض ، محلول فوسفات 0.1 مولار ، درجة حموضة 6.8)
E مم = 8.4 (شكل مؤكسد ، محلول فوسفات 0.1 مولار ، درجة الحموضة 6.8)

وقت التخزين الموصى به للمحاليل المائية
التخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية (المجمد): 6 أشهر
التخزين في 2-8 درجة مئوية (الثلاجة): أسبوعين
التخزين عند 20-25 درجة مئوية (درجة الحرارة المحيطة): 3 أيام


فك اقتران الميتوكوندريا وأول أكسيد الكربون

الأيض التأكسدي للميتوكوندريا مصحوب بتوليد ROS بسبب الاختزال غير الكامل للأكسجين إلى أنيون فوق أكسيد. تحت التحكم المناسب ، يعمل توليد ROS كعوامل إرسال في كل مكان. ومع ذلك ، في ظل الظروف المرضية ، قد يؤدي انعكاس تدفق الإلكترون إلى توليد دائم ومضر لـ ROS ، وبالتالي فإن الفصل الخفيف في الميتوكوندريا هو آلية خلوية متأصلة للحد من الإجهاد التأكسدي. يتكون فك الاقتران من تبديد الطاقة عن طريق تسرب البروتون عبر الغشاء الداخلي ، مما يتسبب في زيادة تعويضية في استهلاك الأكسجين ، والتي لا تقترن بإنتاج ATP. أظهر Iacono وزملاؤه أن CORM-3 يحمي الميتوكوندريا من الإجهاد التأكسدي عن طريق إحداث حالة فصل خفيفة (Iacono et al. ، 2011). تزيد تركيزات الميكرومولار المنخفضة من CORM-3 من استهلاك الأكسجين في ظل الحالة 2 من التنفس (بطريقة مستقلة ADP) ، مما يشير إلى تأثير عدم اقتران بين تقليل الأكسجين وإنتاج ATP. علاوة على ذلك ، فإن مثبط نازعة هيدروجين السكسينات (المركب II) ، مالونات يعكس بشكل كبير تأثير فك الاقتران الناجم عن CORM-3. وبالمثل ، فإن مثبطات بروتين فك اقتران (UCP) و ATP / ADP translocator (ANT) ، وهي بروتينات تشارك في عملية فك اقتران الميتوكوندريا ، تمنع أيضًا فصل الميتوكوندريا بسبب التركيزات المنخفضة من CORM-3. عندما يبدأ التنفس في المركب II باستخدام السكسينات كركيزة ، يكون هناك انعكاس لنقل الإلكترون إلى المركب I مع مستويات أعلى من إنتاج ROS. في ظل هذه الظروف ، منع CORM-3 التوليد المفرط لـ ROS ، مما يحد من الإجهاد التأكسدي (Iacono et al. ، 2011). في المقابل ، عندما يبدأ نقل الإلكترون فسيولوجيًا بإضافة البيروفات / المالات ، فإن CORM-3 يعزز توليد ROS في المركب III بسبب تثبيط IV المعقد ، بطريقة تعتمد على التركيز. منذ أن أنشأ Iacono وزملاؤه هذه البيانات باستخدام ملف في المختبر النهج (الميتوكوندريا المعزولة) ، يمكن للمرء أن يتكهن ما إذا كان تأثير الفصل المعتدل المعزز بثاني أكسيد الكربون مناسبًا من الناحية الفسيولوجية في ظل الظروف المرضية.

في نهج حديث وأكثر تفصيلاً ، وجد المؤلفون أنفسهم أن ثاني أكسيد الكربون يستهدف حامل الفوسفات. في الواقع ، من خلال زيادة نشاط حامل الفوسفات ، يعزز ثاني أكسيد الكربون نقل البروتونات والفوسفات داخل الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى تأثير معتدل لفك الاقتران (Long et al. ، 2014).


يؤدي تثبيط الفسفرة المؤكسدة إلى الموت السريع لخلايا الأليورون المُعالجة مسبقًا من GA ، ولكن ليس لخلايا Aleurone المُعالجة مسبقًا بـ ABA

تتوسط أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) موت الخلايا المبرمج في خلايا الأليورون ، والذي يعززه حمض الجبريليك (GA) ويمنعه حمض الأبسيسيك (ABA). تحتوي الميتوكوندريا النباتية على مسارين تنفسيين متميزين: التنفس من خلال السيتوكروم سي أوكسيديز يزيد من إنتاج ROS ، بينما التنفس من خلال مسار أوكسيديز البديل يقلل ذلك. أثناء دراسة تأثيرات GA و ABA على تقسيم التنفس بين هذين المسارين أثناء عملية الإنبات ، اكتشفنا أن مثبطات الفسفرة المؤكسدة مثل أزيد الصوديوم و 2 ، 4-دينيتروفينول تحفز الموت السريع لخلايا الأليورون المُعالجة مسبقًا GA ولكن ليس من ABA- الخلايا المعالجة. كان التنفس الهوائي الوظيفي مطلوبًا لإشارات GA ، وقد غيرت إشارات GA من 6 إلى 12 ساعة الحالة الخلوية لخلايا aleurone لتكون شديدة التأثر بتثبيط الفسفرة المؤكسدة. كانت الظروف اللاهوائية أيضًا قادرة على محاكاة تأثيرات مثبطات الجهاز التنفسي في تحفيز موت الخلايا على وجه التحديد في الخلايا المعالجة بـ GA ، ولكن تم استفزاز موت الخلايا بشكل أبطأ بكثير. لم يمنع العلاج بمضادات الأكسدة المختلفة هذه العملية على الإطلاق ، مما يشير إلى أنه لا توجد أنواع من أنواع الأكسجين التفاعلية مسؤولة عن موت الخلايا الناجم عن مثبطات الجهاز التنفسي. Our observation implicates that GA may partition all the electrons produced during mitochondrial respiration only to the cytochrome oxidase pathway, which would at least partly contribute to cellular accumulation of ROS.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


Cytochrome ج oxidase-modulatory near-infrared light penetration into the human brain: Implications for the noninvasive treatment of ischemia/reperfusion injury

Maik Hüttemann, Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI 48201.

Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University, Detroit, Michigan, USA

Department of Ophthalmology, Visual and Anatomical Sciences, Wayne State University, Detroit, Michigan, USA

Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University, Detroit, Michigan, USA

Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University, Detroit, Michigan, USA

Department of Emergency Medicine, University of Michigan Medical School, Ann Arbor, Michigan, USA

Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University, Detroit, Michigan, USA

Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University, Detroit, Michigan, USA

Department of Health Care Sciences, Eugene Applebaum College of Pharmacy & Health Sciences, Wayne State University, Detroit, Michigan, USA

College of Medicine, Dankook University, Cheonan-si, Republic of Korea

Department of Emergency Medicine, University of Michigan Medical School, Ann Arbor, Michigan, USA

Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University, Detroit, Michigan, USA

Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, Wayne State University, Detroit, Michigan, USA

Maik Hüttemann, Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI 48201.

Funding information: Office of the Assistant Secretary of Defense for Health Affairs through the Peer Reviewed Medical Research Program, Grant/Award Number: W81XWH-16-1-0175 U.S. National Institutes of Health, Grant/Award Number: R42NS105238

الملخص

Near-infrared light (IRL) has been evaluated as a therapeutic for a variety of pathological conditions, including ischemia/reperfusion injury of the brain, which can be caused by an ischemic stroke or cardiac arrest. Strategies have focused on modulating the activity of mitochondrial electron transport chain (ETC) enzyme cytochrome ج oxidase (COX), which has copper centers that broadly absorb IRL between 700 and 1,000 nm. We have recently identified specific COX-inhibitory IRL wavelengths that are profoundly neuroprotective in rodent models of brain ischemia/reperfusion through the following mechanism: COX inhibition by IRL limits mitochondrial membrane potential hyperpolarization during reperfusion, which otherwise causes reactive oxygen species (ROS) production and cell death. Prior to clinical application of IRL on humans, IRL penetration must be tested, which may be wavelength dependent. In the present study, four fresh (unfixed) cadavers and isolated cadaver tissues were used to examine the transmission of infrared light through human biological tissues. We conclude that the transmission of 750 and 940 nm IRL through 4 cm of cadaver head supports the viability of IRL to treat human brain ischemia/reperfusion injury and is similar for skin with different skin pigmentation. We discuss experimental difficulties of working with fresh cadavers and strategies to overcome them as a guide for future studies.


شاهد الفيديو: Enzymes شرح بالعربي (سبتمبر 2022).