معلومة

ماذا سيكون التركيز المولي للحمض النووي البشري في خلية بشرية طبيعية؟

ماذا سيكون التركيز المولي للحمض النووي البشري في خلية بشرية طبيعية؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تحتوي الخلية البشرية ثنائية الصبغيات على 46 كروموسومًا. تحتوي الخلية أحادية الصيغة الصبغية على حمض نووي يبلغ طوله حوالي 3.2 مليار قاعدة. ما هو التركيز المولي للحمض النووي في الخلية إذن؟ كيف نحسب؟


سأفترض أن هذا هو "التركيز المولي للحمض النووي" ، تقصد "التركيز المولي للنيوكليوتيدات".

حجم الخلية

بافتراض خلية نصف قطرها 0.05 نانومتر (نانومتر). بافتراض وجود كرة كاملة ، يكون حجم هذه الكرة 5.24 دولارًا cdot 10 ^ {- 4} nm ^ 3 = 5.24 cdot 10 ^ {- 11} L $.

بالطبع ، يختلف حجم الخلية كثيرًا بين أنواع الخلايا المختلفة. ستعتمد النتيجة النهائية بشكل كبير على حجم الخلية الذي تم النظر فيه (بفضلRoland fo تسليط الضوء على ذلك في التعليق).

عدد النيوكليوتيدات

في النواة

يبلغ حجم الجينوم أحادي العدد حوالي 3.2 دولار cdot 10 ^ 9 $ نيوكليوتيدات. وبالتالي فإن الجينوم بأكمله هو 6.4 دولار cdot 10 ^ 9 $ نيوكليوتيدات. نظرًا لوجود شريطين من الحمض النووي في كل جينوم أحادي الصبغة ، يتعين علينا مضاعفة المزيد من الضرب في اثنين للحصول على 1.28 دولار cdot 10 ^ {10} $ نيوكليوتيدات. لاحظ أن هذا الرقم قد يكون أقل في أوقات أخرى من دورة الحياة. ما أقوم بحسابه هنا هو العدد الأقصى من النيوكليوتيدات لكل نواة

في الميتوكوندريا

يوجد حوالي 1500 ميتوكوندريا لكل خلية. تحتوي كل ميتوكوندريا على حوالي 16000 نيوكليوتيد ينتج عنها ما مجموعه 2.4 دولار cdot 10 ^ 7 $ نيوكليوتيد في ميتوكوندريا لكل خلية.

ميتوكوندريا + نواة

2.4 دولار cdot 10 ^ 7 + 1.28 cdot 10 ^ {10} ≈ 1.28 cdot 10 ^ {10} $. هذا هو mtDNA لا يكاد يذكر.

في المولات

رقم Avogadro هو حوالي 6 دولارات cdot 10 ^ {23} $. ومن ثم ، يوجد $ frac {1.28 cdot 10 ^ {10}} {6 cdot 10 ^ {23}} = 3.2 cdot 10 ^ {- 14} $ مول من النيوكليوتيدات لكل خلية.

مولارية

يتم تعريف المولارية على أنها عدد المولات لكل لتر. لذلك فهو كذلك

$$ frac {3.2 cdot 10 ^ {- 14}} {5.24 cdot 10 ^ {- 11}} ≈ 0.0006M $$


2nd PUC Biotechnology: المبادئ والعمليات أسئلة وأجوبة الكتاب النصي NCERT

السؤال رقم 1.
هل يمكنك إدراج 10 بروتينات مؤتلفة تُستخدم في الممارسة الطبية؟ اكتشف أين يتم استخدامها كعلاجات (استخدم الإنترنت).
إجابة:
البروتينات المؤتلفة المستخدمة في الممارسة الطبية كعلاجات هي كما يلي:

  • OKT-3 ، وهو جسم مضاد علاجي يستخدم لعكس رفض زرع الكلى الحاد.
  • ReoPro للوقاية من تجلط الدم.
  • منشط البلازمينوجين النسيجي (TPA) مخصص لاحتشاء عضلة القلب الحاد.
  • يستخدم الأسباراجيناز لعلاج بعض أنواع السرطان.
  • الدناز لعلاج التليف الكيسي.
  • يستخدم الأنسولين في داء السكري.
  • يستخدم عامل تخثر الدم الثامن لعلاج الهيموفيليا أ.
  • عامل تخثر الدم التاسع لعلاج الهيموفيليا ب.
  • لقاح التهاب الكبد B للوقاية من التهاب الكبد B.
  • تمت الموافقة على عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية لقرح الجلد / السكري. كما أنه يحفز التئام الجروح.

السؤال 2.
قم بعمل مخطط (مع تمثيل بياني) يوضح إنزيم التقييد ، الركيزة. الحمض النووي الذي تعمل عليه ، والموقع الذي تقطع فيه الحمض النووي ، والمنتج الذي تنتجه.
إجابة:

السؤال 3.
مما تعلمته ، هل يمكنك معرفة ما إذا كانت الإنزيمات أكبر أم أن الحمض النووي أكبر في الحجم الجزيئي؟ كيف عرفت؟
إجابة:
تختلف الخلايا البشرية في الحجم والحجم. الحمض النووي ثابت في حجمه. هذا يجعل من الصعب (مثل المستحيل) تحديد تركيز الحمض النووي. يمكن إعطاء نطاق فقط ، وهذه المعلومات لها قيمة عملية قليلة أو معدومة وحتى أقل معنى.

السؤال 4.
ماذا سيكون التركيز المولي للحمض النووي البشري في الخلية البشرية؟ استشر معلمك.
إجابة:
التركيز المولي هو نسبة عدد مولات المذاب في محلول مقسومًا على حجم المحلول المعبر عنه باللترات.
متوسط ​​وزن قاعدي الحمض النووي = 650 دالتون (1 دالتون يساوي كتلة ذرة هيدروجين واحدة أو 1.67 × 10-24 جرامًا)
الوزن الجزيئي للمزدوج الذي تقطعت به السبل
جزيء DNA = العدد الإجمالي. عدد القاع × 650 دالتون
يبلغ طول الجينوم البشري 3.3 × 10 9 نقطة أساس.
ومن ثم وزن الجينوم البشري ،
= 3.3 x 10 9 bp x 650 Da
= 3.59 × 10-12 جرام.
يمكن حساب التركيز المولي للحمض النووي وفقًا لذلك.

السؤال 5.
هل الخلايا حقيقية النواة لها نوكليازات مقيدة؟ برر جوابك.
إجابة:
يسهل المفاعل الحيوي للخزان المقلوب الخلط وتوافر الأكسجين. يتحكم في درجة الحرارة ودرجة الحموضة داخل المفاعل الحيوي.

السؤال 6.
إلى جانب خصائص التهوية والخلط الأفضل ، ما المزايا الأخرى التي توفرها المفاعلات الحيوية للخزان المقلَّب للحصول على قوارير اهتزاز أكثر من اللازم؟
إجابة:
تستخدم قوارير الرج في زراعة وخلط المواد المرغوبة على نطاق صغير في المختبر. المفاعلات الحيوية عبارة عن أوعية يتم فيها تحويل المواد الخام بيولوجيًا إلى منتجات محددة بواسطة الميكروبات والخلايا النباتية والحيوانية وإنزيماتها. تُستخدم المفاعلات الحيوية في إنتاج الكتلة الحيوية على نطاق واسع أو بيع المنتجات في ظل ظروف معقمة. هنا يمكن معالجة كميات كبيرة (100-1000 لتر) من المستنبتات. يوفر المفاعل الحيوي الظروف المثلى لتحقيق المنتج المطلوب من خلال توفير ظروف النمو المثلى (درجة الحرارة ، ودرجة الحموضة ، والركيزة ، والأملاح ، والفيتامينات ، والأكسجين). المفاعلات الحيوية الأكثر استخدامًا هي من نوع التحريك.

يعتبر المفاعل الحيوي أكثر فائدة من قوارير الاهتزاز. يحتوي على نظام محرض لخلط المحتويات بشكل صحيح ، ونظام توصيل الأكسجين لتوفير الأكسجين ، ونظام التحكم في الرغوة ، ونظام التحكم في درجة الحرارة ، ونظام التحكم في درجة الحموضة ، ومنفذ أخذ العينات لسحب الأحجام الصغيرة من الثقافة بشكل دوري.

السؤال 7.
اجمع 4 أمثلة لتسلسل الحمض النووي المتناوب من خلال استشارة معلمك. من الأفضل محاولة إنشاء تسلسل متناغم باتباع قواعد الزوج الأساسي.
إجابة:

السؤال 8.
هل يمكنك تذكر الانقسام الاختزالي والإشارة إلى المرحلة التي يتكون فيها الحمض النووي المؤتلف؟
إجابة:
Meiosis I & # 8211 Pachytene & # 8211 عندما تظهر عقدة إعادة التركيب بعد تكوين مركب synaptonemal.

السؤال 9.
هل يمكنك التفكير والإجابة عن كيفية استخدام إنزيم المراسل لرصد تحول الخلايا المضيفة بواسطة الحمض النووي الغريب بالإضافة إلى علامة قابلة للتحديد؟ الإجابة: تساعد العلامة القابلة للتحديد في تحديد الخلايا المضيفة المحولة وسيتم القضاء على الخلايا غير المحولة وستنمو الخلايا المحولة فقط. في حين أن جين المراسل هو الجين الذي يمكن مراقبة تعبير النمط الظاهري له ، وبالتالي فهو يبلغ عن النشاط أو التغيير مقدمًا لتأثير التعديل ، بالإضافة إلى القضاء على الخلايا غير المحولة بواسطة علامات مختارة. صف بإيجاز ما يلي:
(أ) أصل التكرار
(ب) المفاعلات الحيوية
(ج) المعالجة النهائية
إجابة:
(أ) أصل النسخ المتماثل (on): أحد المكونات الرئيسية للبلازميد هو سلسلة من القواعد حيث يبدأ النسخ المتماثل. يطلق عليه أصل النسخ المتماثل (on). هذا جزء محدد من جينوم البلازميد يعمل كإشارة بدء للتكرار الذاتي (لعمل نسخة أخرى من نفسه). يمكن لأي قطعة من الحمض النووي عند ربطها بهذا التسلسل أن تتكاثر داخل الخلايا المضيفة. تُستخدم هذه الخاصية لعمل عدد من نسخ الحمض النووي المرتبط (أو إدراج الحمض النووي).

(ب) المفاعلات الحيوية: عبارة عن أوعية يتم فيها تحويل المواد الخام بيولوجيًا إلى منتجات محددة بواسطة الميكروبات والخلايا النباتية والحيوانية وإنزيماتها. يُسمح لهم بتوليف البروتينات المرغوبة والتي يتم استخلاصها وتنقيتها أخيرًا من الثقافات. عادة ما يتم استخدام المزارع الصغيرة الحجم في المختبرات للبحث وإنتاج كميات أقل من المنتجات. ومع ذلك ، يتم إنتاج المنتجات على نطاق واسع في المفاعلات الحيوية & # 8217. المفاعلات الحيوية الأكثر شيوعًا هي مفاعل حيوي من نوع التحريك (التخمير) الذي يحتوي على ثقافة دفعية أو ثقافة مستمرة.

(ج) المعالجة النهائية: بعد تكوين المنتج في المفاعلات الحيوية ، يخضع لبعض العمليات قبل أن يصبح المنتج النهائي جاهزًا للتسويق. تتضمن هذه العمليات فصل وتنقية المنتجات التي تسمى مجتمعة المعالجة النهائية. يخضع المنتج بعد ذلك لاختبار مراقبة الجودة ويحفظ في مواد حافظة مناسبة. تختلف عملية المصب واختبار مراقبة الجودة باختلاف المنتجات

السؤال 11.
اشرح باختصار
(أ) PCR
(ب) تقييد الإنزيمات والحمض النووي
(ج) الكيتيناز
إجابة:
أ. إن تضخيم الحمض النووي في المختبر عن طريق الدورات المتكررة لفصل الخيوط والبلمرة هو تفاعل البوليميراز المتسلسل.
ب. يسمى إنزيم نوكلياز الذي يقطع الحمض النووي بتسلسل فريد من نوعه نوكلياز التقييد. تُعرف أيضًا باسم السكاكين الجزيئية أو المقص الجزيئي أو المبالط الجزيئية.
ج. إن الكيتيناز عبارة عن إنزيمات هضمية تعمل على تكسير عظام الجليكوسيد في تشي قصدير.

السؤال 12.
ناقش مع معلمك واكتشف كيفية التمييز بينهما
(أ) DNA البلازميد والحمض النووي الكروموسومي
(ب) الحمض النووي الريبي والحمض النووي
(ج) نوكلياز خارجي و نوكلياز داخلي
إجابة:

(أ) DNA البلازميد والحمض النووي الكروموسومي

DNA البلازميد كروموسومات الحمض النووي
(ط) إنه DNA خارج النواة إنه DNA نووي
(2) أنها تسوس الجينات غير التناسلية تمتلك جينات حيوية
(3) قد تحمل الخلية البكتيرية واحدًا إلى عدة DNA بلازميد. تحمل الخلية البكتيرية DNA صبغيًا واحدًا فقط

RNA الحمض النووي
(ط) إنه حمض الريبونوكليك حمض Deqxy ribonucleic
(2) هو واحد تقطعت بهم السبل الازدواجية
(3) الحمض النووي الريبي المنتج من قالب الحمض النووي يعمل الحمض النووي للوالدين كقالب للحمض النووي
(4) قاعدة النيتروجين Uracil موجودة بدلاً من الثايمين ، الذي يتزاوج مع الأدينين. أزواج الثايمين مع الأدينين

(ج) نوكلياز خارجي و نوكلياز داخلي

نوكلياز خارجي نوكلياز
(ط) يكسر الحمض النووي من النهايات يقطع الحمض النووي من الداخل
(2) الأجزاء المنفصلة عبارة عن نيوكليوتيدات صغيرة هذه الأجزاء المنفصلة كبيرة الحجم بشكل عام
(3) لا يمكن استخدام الأجزاء المنفصلة في الهندسة الوراثية يتم استخدام الأجزاء المنفصلة المرغوبة في الهندسة الوراثية

2nd PUC Biotechnology: المبادئ والعمليات أسئلة وأجوبة إضافية

التكنولوجيا الحيوية في علم الأحياء الثاني من جامعة كاليفورنيا: المبادئ والعمليات سؤال واحد ذي علامة واحدة

السؤال رقم 1.
بملاحظة الزوج المعين يملأ الفراغات

  1. قطع الحمض النووي: تقييد نوكلياز :: ربط الحمض النووي: & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230.
  2. الكيتيناز: الفطريات :: السليلوز: & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 ..
  3. البروتين: Protease :: RNA: & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230

سؤال. 2.
ما هو بوليميريز الحمض النووي النشط في درجات الحرارة العالية؟
إجابة:
بوليميريز DNA Taq نشط في درجات حرارة عالية.

السؤال 3.
تستخدم نوكليازات تقييدية لقطع الحمض النووي في مواقع محددة .. اسم أول نوكلياز داخلي معزول من الإشريكية القولونية.
إجابة:
ايكو ارى

سؤال. 4.
اكتب الصيغة الكاملة لـ PCR. في أي إنزيم يستخدم؟
إجابة:
تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).
يستخدم Taq DNA في PCR.

السؤال 5.
قم بتسمية التقنية المستخدمة لفصل أجزاء الحمض النووي في المختبر
إجابة:
الكهربائي. (دهلي 2005)

سؤال. 6.
تم تشكيل الحمض النووي المؤتلف الأول في.
إجابة:
في بكتيريا السالمونيلا التيفية.

السؤال 7.
اكتب وظيفة إنزيم التقييد في خلية بكتيرية؟
إجابة:
مسؤول عن تقييد نمو البكتيريا.

سؤال. 8.
أين تقطع هند 2 جزيء الحمض النووي؟
إجابة:
يقطع جزيء الحمض النووي عند مجموعة محددة من 6 أزواج أساسية.

السؤال 9.
لماذا تستخدم البلازميدات والعاثيات بشكل شائع كناقلات استنساخ؟
إجابة:
تتمتع البلازميدات والعاثيات بالقدرة على التكاثر داخل الخلايا البكتيرية بشكل مستقل عن الحمض النووي الصبغي.

سؤال. 10.
ما نوع الشحنة الموجودة في الحمض النووي؟
إجابة:
شحنة سالبة.

السؤال 11.
ما هي المعالجة النهائية؟
إجابة:
المعالجة النهائية هي استعادة المنتج من الخلايا المعدلة وراثيًا كاملة النمو وتنقيته وحفظه

سؤال. 12.
ما هو التفريد؟
إجابة:
الرحلان الكهربائي هو سؤال تقني يستخدم في المختبرات من أجل فصل الجزيئات الكبيرة على أساس الحجم.

السؤال 13.
ما هو العلاج الجيني؟
إجابة:
إنه استبدال الجين المعيب بجين طبيعي سليم وظيفي. تساعد هذه الطريقة في التغلب على تأثير الاضطرابات المختلفة مثل فقر الدم المنجلي ، وبيلة ​​الكابتون ، وتسكيد ، وعمى الألوان ، إلخ.

سؤال. 14.
قم بتسمية التقنية التي يجب أن نعزل بها قطعة الحمض النووي.
إجابة:
الكهربائي.

السؤال 15.
ما هو التضخيم؟
إجابة:
إنها عملية صنع نسخ متعددة من أجزاء الجينات / الحمض النووي ذات الأهمية.

السؤال 16.
ما هو البروتين المؤتلف؟
إجابة:
إنه مركب كيميائي حيوي أو بروتين مفيد ينتج داخل الخلية المضيفة غير المتجانسة بطريقة التكنولوجيا الحيوية المؤتلفة.

السؤال 17.
ما هو المفاعل الحيوي أو التخمير؟
إجابة:
وهي عبارة عن وعاء يتم فيه تنفيذ العملية الكيميائية الحيوية باستخدام الخلايا الحية ووسط نموها.

السؤال 18.
ما المقصود بالتحويل البيولوجي؟
إجابة:
إنها العملية التي يتم من خلالها تحويل المواد الخام بيولوجيًا إلى منتجات محددة باستخدام الميكروبات أو الخلايا النباتية أو الحيوانية و / أو إنزيماتها.

السؤال 19.
لماذا تُستخدم جينات مقاومة المضادات الحيوية كعلامات انتقائية للإشريكية القولونية؟
إجابة:
نظرًا لأن الإشريكية القولونية لا تحتوي على أي جينات مقاومة للمضادات الحيوية ، يتم استخدام جينات مقاومة المضادات الحيوية من الخارج كعلامة اختيار.

2nd PUC Biotechnology: المبادئ والعمليات سؤالان متعلقان بالعلامات

السؤال رقم 1.
قم بتسمية العلماء الذين قاموا ببناء الحمض النووي المؤتلف. قم بتسمية البكتيريا التي عزلوا منها الجين.
إجابة:
كان ستانلي كوهين وهربرت بوير أول من قام ببناء الحمض النووي المؤتلف. قاموا بعزل الجين من البكتيريا. السالمونيلا تيفيموريوم.

السؤال 2.
تم ترك فجوات قليلة في الجدول التالي توضح مصطلحات معينة ومعانيها ، تملأ الفجوات.
معاني المصطلح
(i) & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 .. تسلسل غير مشفر في الحمض النووي حقيقي النواة
(ii) & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 .. التقنية المستخدمة في حل نزاعات الأبوة
(3) نوكلياز تقييد & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 ..
(4) البلازميدات & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 ..
(v) المعدلة وراثيا & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 ..
(6) متواليات النيوكليوتيدات مع عيوب قاعدة واحدة & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230 & # 8230.

السؤال 3.
قم بتسمية التقنية الخاصة في التكنولوجيا الحيوية التي تظهر خطواتها في الشكل ، استخدم الشكل لتلخيص التقنية في ثلاث خطوات.
إجابة:

  • حامل القالب
  • بصمة الحمض النووي
  • الحمض النووي خارج النواة
  • الكائنات الحية التي تحتوي على جينات كائنات أخرى تم الحصول عليها من خلال الهندسة الوراثية.
  • تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد. (SNPs)

السؤال 3.
قم بتسمية التقنية الخاصة في التكنولوجيا الحيوية التي تظهر خطواتها في الشكل ، استخدم الشكل لتلخيص التقنية في ثلاث خطوات.
إجابة:

(أ) التكنولوجيا المؤتلفة
(ب)

  • قطع وعزل الجين البشري
  • دمج الجين البشري في البلازميد لإنتاج الحمض النووي المؤتلف أو البلازميد
  • دمج البلازميدات المؤتلفة في البكتيريا للحصول على منتج جيني

السؤال 4.
الرجوع إلى الرسم البياني والإجابة على ما يلي:
(ط) من ما تي1& # 8211 يتم الحصول على البلازميد؟
(2) قم بتسمية الإنزيم المتضمن في الخطوة الأولى
(3) ما يحدث في الخطوة الثانية
(4) يسمى النبات المنتج الهجين أو المعدل وراثيا
(5) هل سيكون للنبات المنتج جينات أخرى مع الجينات المرغوبة؟ نعم أو لا شرح.
إجابة:

(ط) الأورام الجرثومية
(2) تقييد نوكلياز
(3) دمج الجينات في T.1 البلازميد في منطقة T-DNA.
(4) المعدلة وراثيا
(ت) نعم. الجين المحدد القابل للتحديد والذي غالبًا ما يكون جينًا مقاومًا للمضادات الحيوية

السؤال 5.

دراسة ارتباط أجزاء الحمض النووي الموضحة أعلاه
(ط) الاسم & # 8220a & # 8221 DNA و & # 8220b & # 8221 DNA
(2) قم بتسمية إنزيمات التقييد التي تتعرف على هذا التناظر
(3) قم بتسمية الإنزيم الذي يمكنه ربط جزأين من الحمض النووي (CBSE 2008)
إجابة:
(ط) (أ) & # 8211 ناقلات الحمض النووي
(ب) & # 8211 الحمض النووي الأجنبي

السؤال 6.
اشرح أهمية
(أ) أوري
(ب) أمبير R و
(c) rop in E. Coli vector الموضح أدناه (CBSE 2008)
إجابة:

  • أوري & # 8211 أصل النسخ المتماثل
  • amp R & # 8211 الجين المضاد للمضادات الحيوية الأمبيسيلين
  • rop & # 8211 الجين الذي ينتج البروتينات المشاركة في تكرار البلازميد.

السؤال 7.
من الخصائص المثيرة للاهتمام لأنزيمات التقييد القطع الجزيئي ولصق إنزيمات التقييد عادةً ما تتعرف على الشكل المتماثل

لاحظ أن الخصلة العلوية هي نفسها الخصلة السفلية لكنها تقرأ للخلف. عندما يقطع الإنزيم الشريط بين G و A ، فإنه يترك سلاسل متدلية

(أ) ما هو التسلسل المتماثل للحمض النووي المعروف باسم؟
(ب) ما هي أهمية هذه السلاسل المتدلية؟
(C) قم بتسمية إنزيم التقييد الذي يقطع الشريط بين G و A.
إجابة:
(أ) تسلسل متناوب
(ب) نهايات لزجة
(C) Eco RI

سؤال. 8.
ما هو DNA ligase؟
إجابة:
DNA ligase هو نوع معين من الإنزيم ، وهو ligase الذي يسهل الانضمام إلى خيوط DNA معًا عن طريق تحفيز تكوين رابطة phosphodiester.

السؤال 9.
ما هي نواقل الاستنساخ؟ ما هي الوظائف التي تؤديها هذه النواقل؟
إجابة:
نواقل الاستنساخ هي تلك الكائنات الموجودة على الحمض النووي الخاص بها والتي يمكن أن تتكاثر بشكل مستقل عن الحمض النووي المضيف وتزيد من عدد نسخها جنبًا إلى جنب مع الحمض النووي الغريب المرتبط بها. الوظائف هي:

  • أنها تساعد في ربط الحمض النووي الأجنبي / الأجنبي مع ذلك الخاص بالمضيف
  • كما أنها تساعد في اختيار المؤتلف من غير المؤتلف

سؤال. 10.
ما هو Ti- بلازميد؟
إجابة:
Ti أو البلازميد المحفز للورم هو بلازميد يعد جزءًا من المعدات الوراثية التي يستخدمها ورم الأجرعية لنقل مادتها الوراثية إلى النباتات.

السؤال 11.
تسلسل النوكليوتيدات المتناظرة لها أهمية في تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف. يشرح. أعط مثالا لتسلسل الحمض النووي المتناوب.
إجابة:
Palindrome في الحمض النووي هو سلسلة من أزواج القواعد التي تقرأ نفس الشيء على الخيوط عندما يظل اتجاه القراءة كما هو. يتعرف كل نوكلياز تقييد على تسلسل محدد للنيوكليوتيدات المتناوبة ويقطع خيط الحمض النووي بعيدًا قليلاً عن مركز الموقع المتناظر ، ولكن بين القاعدتين على الخيوط المقابلة.
مثال على الحمض النووي المتناظر
5 & ​​# 8242 & # 8211 GAATTC & # 8211 3 & # 8242
3 & # 8242 & # 8211 CTTAAG & # 8211 5 & # 8242

سؤال. 12.
اسم العالم الذي اكتشف طريقة تصنيع الحمض النووي الاصطناعي.
إجابة:
مُنحت جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء في عام 1968 بشكل مشترك لكل من روبرت دبليو هولي وهارجوبيند خورانا وم.

التكنولوجيا الحيوية في علم الأحياء الثاني في جامعة كاليفورنيا: المبادئ والعمليات سؤال ثلاث علامات

السؤال رقم 1.
فيما يلي الخطوات المختلفة في تقنية الحمض النووي المؤتلف. رتبهم حسب تسلسل الحدوث.
أ. نقل الحمض النووي المؤتلف إلى المضيف.
ب.استخلاص المنتج.
ج. تفتيت الحمض النووي عن طريق نوكلياز تقييد
د. ربط جزء من الحمض النووي في ناقل.
ه. عزل الحمض النووي.
F. زراعة الأسقف المضيفة في وسط على نطاق واسع.
ز. عزل جزء الحمض النووي المطلوب.
إجابة:
أ. عزل الحمض النووي.
ب. تجزئة الحمض النووي عن طريق نوكليازات التقييد
ج. عزل جزء الحمض النووي المطلوب.
د. ربط جزء من الحمض النووي في ناقل.
ه. نقل الحمض النووي المؤتلف إلى المضيف.
F. زراعة الخلايا المضيفة في وسط على نطاق واسع.
ز. استخلاص المنتج.

السؤال 2.
تمثيل تخطيطيًا لمتجه استنساخ E Coli pBR 322 الذي يوضح موقع التقييد.
إجابة:

السؤال 3.
ارسم مخططًا مكتوبًا عليه لمفاعل حيوي لخزان متقلب.
إجابة:

السؤال 4.
اقرأ التسلسل الأساسي التالي لخيط DNA معين وأجب عن الأسئلة التالية.

(ط) ما يسمى & # 8220 تسلسل باليندروم & # 8221 في bNA؟
(2) اكتب تسلسل النوكليوتيدات Palindromic الموضح في خيط DNA المعطى واذكر الإنزيم الذي سيتعرف على مثل هذا التسلسل.
(3) اذكر أهمية الإنزيمات التي تحدد متواليات النوكليوتيدات المتناوبة.
(AI & # 8211 2008)
إجابة:
(ط) التسلسل المتناوب للحمض النووي هو سلسلة من أزواج القواعد التي تقرأ نفس الشيء على الخيوط ، عندما يتم الحفاظ على اتجاه القراءة كما هو ، أي في الاتجاه 5 & # 8242 → 3 & # 8242.
(ii) 5 & # 8242 GAA TT C & # 8211 3 & # 8242
3 & # 8242 CTTA AG & # 8211 5 & # 8242
هذا التسلسل مقيد بواسطة إنزيم التقييد Eco RI
(3) يقوم الإنزيم الذي يحدد تسلسل النوكليوتيدات المتناظرة بقطع الخيوط بين نفس القاعدتين ، وغالبًا ما ينتج نهايات لزجة ومن ثم فهي مفيدة في تكوين الحمض النووي المؤتلف.

2nd PUC Biotechnology: المبادئ والعمليات خمس علامات سؤال

السؤال رقم 1.
صِف بالتفصيل مكونات مفاعل حيوي بسيط لخزان مقلَّب مع رسم تخطيطي مُصنَّف.
إجابة:
عادةً ما يكون المفاعل الحيوي ذو الخزان المقنن عبارة عن وعاء أسطواني بقاعدة منحنية لتسهيل خلط المحتوى. يعمل المحرك على تسهيل الخلط وتوافر الأكسجين في جميع أنحاء المفاعل الحيوي.

يحتوي المفاعل الحيوي على نظام محرض ، ونظام لتوصيل الأكسجين إلى جانب نظام التحكم في الرغوة ، ونظام التحكم في درجة الحرارة ، ونظام التحكم في درجة الحموضة ، ومنافذ أخذ العينات لإزالة كميات صغيرة من المزرعة بشكل دوري. يوفر ظروف نمو مثالية لدرجة الحموضة ودرجات الحرارة والركيزة والأكسجين وما إلى ذلك لتحقيق المنتجات المطلوبة.

سؤال. 2.
ما هو استنساخ؟ يعطي تحضيره واستخراجه وتنقيته.
إجابة:
كائن حي أو خلية أو مجموعة من الكائنات الحية ، يتم إنتاجها لاجنسيًا من سلف ، وهي وراثية.

1. استنساخ الجينات: يتم استخدام الخطوات التالية بواسطة استنساخ الجينات:

1. تحضير الجين: يتم تقطيع الحمض النووي المستخرج من كائن حي ، مع الجين المعني إلى قطع بحجم الجين باستخدام إنزيم تقييد.

2. الإدراج في ناقل: يتم قطع البلازميدات البكتيرية بنفس إنزيم التقييد. البلازميدات عبارة عن دوائر صغيرة من الحمض النووي في الخلايا البكتيرية الموجودة بشكل طبيعي بالإضافة إلى الحمض النووي البكتيري الآخر.

3. تحويل الخلايا المضيفة: ثم يتم نقل البلازميدات المؤتلفة إلى بكتيريا باستخدام الترشيح الكهربائي. البلازميد صغير بما يكفي لتمر عبر الثقوب إلى الخلايا. ومع ذلك ، فبدلاً من استخدام الكهرباء لإحداث ثقوب في البكتيريا ، يتم ذلك عن طريق تبديل درجة الحرارة بين الساخنة والباردة. تُزرع البكتيريا في طبق استنبات ويُسمح لها بالنمو إلى مستعمرات. تسمى جميع المستعمرات الموجودة على كل اللوحات مكتبة الجينات.

2 - استنساخ النبات: زراعة الأنسجة النباتية هي طريقة للتكاثر تنتشر بشكل شائع كبديل للاستنساخ.

يمكن استنساخ النبات بشكل مصطنع باستخدام زراعة الأنسجة. يعمل التكاثر الخضري لأن نهاية القطع تشكل كتلة من الخلايا غير المتخصصة تسمى الكالس ، ينقسم الكالس ويشكل خلايا متخصصة مختلفة في نهاية المطاف مكونًا نباتًا جديدًا.

السؤال 3.
(أ) إذا كان على إنزيم التقييد أن يقطع الحمض النووي ، فيجب أن يكون الحمض النووي في شكل نقي ، أي خالٍ من الحمض النووي الريبي والبروتينات المرتبطة به. كيف يتم تحقيقها؟
(ب) لا تمثل سوى خطوات تقنية الحمض النووي المؤتلف (r DNA) بشكل تخطيطي.
إجابة:
(أ) تتم إزالة RNAs باستخدام إنزيمات تسمى ribonucleases (RNases) تتم إزالة البروتينات باستخدام إنزيم البروتياز.
(ب)

السؤال 4.
(أ) عرض فقط بشكل تخطيطي الخطوات الثلاث في تفاعل البوليميراز المتسلسل ،
(ب) كيف يتم تحقيق التضخيم المتكرر باستخدام هذه الطريقة؟
إجابة:

(ب) يتم تحقيق التضخيم المتكرر عن طريق استخدام بوليميراز DNA القابل للحرارة ، وهو معزول عن بكتيريا Thermus aquaticus. يظل نشطًا أثناء درجة الحرارة المرتفعة المستخدمة في تمسخ الحمض النووي المزدوج الشريطة.

السؤال 5.
قم بعمل تمثيل تخطيطي لإظهار إنزيم التقييد ، الحمض النووي الركيزة على u الذي يعمل في الموقع الذي يقطع فيه الحمض النووي والمنتج الذي ينتجه.
إجابة:


آسيا والمحيط الهادئ

سيتم عرض الموقع باللغة الإنجليزية.

نحن نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لضمان عمل موقعنا بشكل آمن وسليم ، فهي ضرورية لعمل خدماتنا ولا يمكن إيقاف تشغيلها في أنظمتنا. عادةً ما يتم تعيينها فقط استجابةً للإجراءات التي اتخذتها والتي ترقى إلى مستوى طلب الخدمات ، مثل تسجيل الدخول أو استخدام عربة التسوق أو ملء النماذج. يمكنك ضبط متصفحك لحظر ملفات تعريف الارتباط هذه أو تنبيهك بها ، لكن بعض أجزاء خدماتنا لن تعمل بدونها. مثل ملفات تعريف الارتباط الأخرى التي نستخدمها ، قد تكون ملفات تعريف الارتباط الضرورية للغاية إما ملفات تعريف ارتباط الطرف الأول أو ملفات تعريف ارتباط الطرف الثالث.

نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتذكر إعداداتك وتفضيلاتك. على سبيل المثال ، قد نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتذكر تفضيلات اللغة الخاصة بك.
السماح بملفات تعريف الارتباط المفضلة

نحن نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لجمع معلومات حول كيفية تفاعلك مع خدماتنا ولمساعدتنا في قياسها وتحسينها. على سبيل المثال ، قد نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتحديد ما إذا كنت قد تفاعلت مع صفحة معينة.
السماح بملفات تعريف الارتباط الخاصة بالأداء / الإحصائيات

نحن وشركاؤنا الإعلانيون نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتقديم الإعلانات ، ولجعلها أكثر ملاءمة وذات مغزى بالنسبة لك ، ولتتبع كفاءة حملاتنا الإعلانية ، سواء على خدماتنا أو على مواقع الويب الأخرى ووسائل التواصل الاجتماعي.
السماح بملفات تعريف الارتباط التسويقية


المحاضرة 31: الطب الجزيئي 1

قم بتنزيل الفيديو من iTunes U أو Internet Archive.

المواضيع التي تمت تغطيتها: الطب الجزيئي 1

المدربون: البروفيسور روبرت أ. واينبرغ

المحاضرة 10: Molecular Biolo.

المحاضرة 11: Molecular Biolo.

المحاضرة 12: Molecular Biolo.

المحاضرة 13: تنظيم الجينات

المحاضرة 14: Protein Localiz.

المحاضرة 15: الحمض النووي المؤتلف 1

المحاضرة 16: الحمض النووي المؤتلف 2

المحاضرة 17: الحمض النووي المؤتلف 3

المحاضرة 18: الحمض النووي المؤتلف 4

المحاضرة 19: دورة الخلية / الإشارة.

المحاضرة 26: الجهاز العصبي 1

المحاضرة 27: الجهاز العصبي 2

المحاضرة 28: الجهاز العصبي 3

المحاضرة 29: الخلايا الجذعية / استنساخ.

المحاضرة 30: الخلايا الجذعية / استنساخ.

المحاضرة 31: Molecular Medic.

المحاضرة 32: Molecular Evolu.

المحاضرة 33: Molecular Medic.

المحاضرة 34: الإنسان متعدد الأشكال.

المحاضرة 35: الإنسان متعدد الأشكال.

الشكر. نحن نتحدث اليوم عن الطب العقلاني ، وما نتحدث عنه حقًا هو أن فهم البيولوجيا الجزيئية للمرض ساعد بالفعل في إحداث ثورة في علم الطب العلاجي الجديد. وهنا ، في أغلب الأحيان ، تركز المناقشات حول السرطان. ولذا ، سأتحدث عن قصة مثيرة للاهتمام ، فيما يتعلق بالعلاج الحديث للسرطان ، وكيف أن فهمنا للبيولوجيا الجزيئية للمرض يساعد حقًا في تطوير أنواع جديدة جذرية من العلاجات. على سبيل الخلفية ، دعنا نذكر فقط أن معظم العلاجات الكيميائية التي نستخدمها اليوم لعلاج السرطان قد تم تطويرها على مدى 40-50 عامًا الماضية في وقت كانت فيه العيوب الجزيئية والكيميائية الحيوية داخل الخلايا السرطانية غامضة تمامًا. وبالتالي ، إلى الحد الذي طور فيه المرء علاجات كيميائية ، فقد تم تطويرها ببساطة تجريبيًا ، بالتجربة والخطأ.

على سبيل المثال ، بعض العلاجات الكيميائية الأكثر فعالية ضد ابيضاض الدم في مرحلة الطفولة هي العوامل المؤلكلة ، التي تربط مجموعات الميثيل والإيثيل لاستهداف الجزيئات داخل الخلايا. وقد تم التعرف على فائدتها في السرطان لأول مرة بسبب انفجار في حاوية.

أعتقد أنه كان على متن سفينة قبالة نابولي في الحرب العالمية الثانية حيث تم تفريق سلة من العوامل المؤلكلة. تعرض كثير من الناس له ، ونتيجة لذلك أصيب هؤلاء الأشخاص بما يسمى قلة الكريات البيض. تعني البوينيا عمومًا اكتئابًا ، وفي هذه الحالة ، انخفاض في خلايا الدم البيضاء.

تم استخدام عوامل الألكلة هذه بالفعل خلال الحرب العالمية الأولى في حرب الغاز لأنه خلال الحرب العالمية الأولى ، استخدم أحدها ما يسمى بغازات الخردل ، والتي كانت طريقة فعالة للغاية ، بل وأكثر فاعلية من المدفعية في قتل أعداد كبيرة من جنود العدو. وقد لاحظ شخص ما هذه الكريات البيض في 1946-47 نتيجة التعرض غير المقصود لهذه العوامل المؤلكلة ، والتي أصبحت مشتتة كغاز.

وبعد حوالي خمس سنوات ، قام شخص ما بقفزة منطقية مفادها أنه إذا كانت هذه العوامل قادرة على قمع تركيزات الدم الأبيض الطبيعية ، فربما تكون فعالة أيضًا ضد ما يبدو أنه مشكلة ذات صلة ، وهي مشكلة اللوكيميا. ضع في اعتبارك أنه عندما نتحدث عن سرطان الدم ، فإن اللاحقة - الدم تشير إلى الدم بشكل عام ، واللوك - مرة أخرى تشير إلى الدم الأبيض ، أي زيادة خلايا الدم البيضاء في الدم. وهكذا ، من خلال هذا الاكتشاف العرضي ، بدأ المرء في تطوير عوامل مؤلكلة اتضح أنها ناجحة للغاية في علاج ، وفي كثير من الأحيان علاج ، ابيضاض الدم في مرحلة الطفولة ، وأبرزها سرطان الدم الليمفاوي الحاد ، والذي تبين أنه حساس للغاية لهذا والعوامل الأخرى ذات الصلة . لذلك ، هذا شكل شائع جدًا من سرطان الدم في مرحلة الطفولة ، والذي تم علاجه الآن في 60 أو 70٪ من الأطفال الذين عولجوا ، وهو أمر لم يسمع به منذ نصف قرن. لكنني أعود إلى ما قلته من قبل وهو أن هذا النوع من العلاج تم تطويره في مواجهة الجهل التام بطبيعة المرض ، والعيوب الجزيئية التي كانت موجودة في المرض ، والتي كانت مسؤولة عن الهروب ، يمكن ما زلت تسمعني حسنًا ، كنت مسؤولاً عن الانتشار الجامح للخلايا السرطانية. بعد قولي هذا ، أريد أن أذهب إلى نوع مختلف من ابيضاض الدم ، وهذا يسمى ابيضاض الدم النقوي المزمن ، لأعطيكم إشارة إلى مسار الاكتشاف الذي أدى من وصفه الأصلي إلى تطوير علاجات ناجحة إلى حد ما.

ابيضاض الدم النقوي المزمن ، ذكرت البادئة النخاعية- المرة الأخيرة أو المرة السابقة للإشارة إلى نخاع العظام ، وهذا هو سرطان الدم للخلايا القادمة من نخاع العظم من الخلايا النخاعية في نخاع العظام ، وهي مقدمة للأشياء مثل الضامة والخلايا المحببة. لذلك ، تلعب هذه الخلايا دورًا مهمًا في الاستجابة المناعية ، وخلال مرض ابيضاض الدم النقوي المزمن هذا ، والذي يسمى سرطان الدم النخاعي المزمن ، يمكن أن تكون هناك فترة من ثلاث أو أربع سنوات حيث يتطور لدى الأفراد أعداد كبيرة من هذه الخلايا في دمائهم. مجرى. وبعد فترة من ثلاث أو أربع سنوات ، فجأة حدث انفجار فيما يسمى بأزمة الانفجار. ولعلكم تتذكرون أنني ذكرت كلمة انفجار في مناسبة واحدة أيضًا. كل هذا يتناسب مع بعضها البعض في لغز جميل. يشير الانفجار إلى الخلايا البدائية الشبيهة بالجنين ، وفجأة هناك اندلاع للخلايا البدائية الشبيهة بالجنين ، والتي تكون أقل تمايزًا مثل هذه الخلايا الضامة والخلايا المحببة ، والتي كانت حتى هذه النقطة موجودة بأعداد مفرطة للغاية في الدم. هناك أزمة انفجار.

هذا يؤدي إلى ابيضاض الدم النقوي الحاد ، ويحدث الموت عادةً في غضون عام أو عامين ، أو هذا هو الحال تقليديًا. لم يكن لدى أحد حقًا أي فكرة عن الآليات المسببة المحتملة للمرض ، وهذا يسمح لي باستخدام كلمة أخرى قد تصادفك يومًا ما إذا كان عليك الاستمرار في البحث الطبي الحيوي. وهذه هي العوامل المسببة للمرض.

عندما نتحدث عن العوامل المسببة للمرض ، فإننا نتحدث عن العوامل المسؤولة سببيًا عن إحداث المرض. يمكن أن تكون هذه عوامل خارجية ، أو قد تكون حتى عوامل داخلية ، وهي جزيئات داخل الخلايا مسؤولة عن تكوين المرض. وقد تم الاكتشاف الرئيسي في عام 1960 عندما كان الأفراد ينظرون إلى التركيب الكروموسومي لخلايا سرطان الدم النخاعي المزمن.

التركيب الكروموسومي ، سأستخدم كلمة أخرى فقط حتى نتمكن من توسيع مفرداتنا هذا الصباح ، غالبًا ما يُطلق على التركيب الكروموسومي اسم النمط النووي ، أي كوكبة الكروموسومات التي يمكن للمرء رؤيتها عند الانقسام تحت المجهر.

ضع في اعتبارك ، كما قلنا من قبل ، أنه خلال الطور البيني لدورة الخلية ، تكون الكروموسومات غير مرئية بشكل أساسي ، ولكن أثناء الطور الفاصل للانقسام الفتيلي تصبح مكثفة ، وفي تلك المناسبة ، لاحظ الأفراد انتقالًا 9-22.

إذن هنا كروموسوم تسعة بشكل طبيعي. ها هو الكروموسوم رقم 22. وكما تعلم ، فإن نظام الترقيم الذي يحتوي على الكروموسومات البشرية ينتقل من أكبر رقم واحد وصولًا إلى الأصغر.

إذن ، هذا هو الأصغر ، باستثناء كروموسوم Y. وما لاحظوه أنه بدلاً من رؤية مجموعة الكروموسومات العادية ، لاحظوا بدلاً من ذلك ما يشبه إلى حد كبير بنية من هذا النوع هنا ، أي

وقد أدى هذا الانتقال إلى تبادل التسلسلات بين هذين الكروموسومين. لاحظ ، بالمناسبة ، هذا أمر متبادل ، بمعنى أن تسعة يتبرعون بشيء ما لـ 22 ، و 22 يتبرع بشيء لتسعة.

ومع ذلك ، فإن الأجزاء التي يتم تبديلها ليست بالضرورة متساوية في الحجم. لذلك ، اتضح هنا أنه في هذه الحالة ، اكتسب الكروموسوم التاسع في الواقع أكثر بكثير من الكروموسوم 22 المكتسب كنتيجة لتبادل القطع الجينية.

وهذا الانتقال 9-22 جعل أصغر كروموسوم أصغر.

لذلك ، كان هذا بالفعل أصغر كروموسوم كما ذكرت إلى جانب أصغر جسيم جسمي ، أصغر كروموسوم غير جنسي.

الآن أصبح أصغر حجمًا لأنه فقد جزءًا من حجمه نتيجة لانتقال الكروموسومات.

ولأن هذا الاكتشاف تم في فيلادلفيا ، فقد أصبح يعرف باسم كروموسوم فيلادلفيا. هذا الآن منذ حوالي 40 عامًا ، أو كما يطلق عليه أحيانًا ، PH-1 لأسباب ، لا أعرف سبب تسميته PH-1 باستثناء فيلادلفيا.

وعندما بدأ الباحثون في النظر في حالات أخرى من ابيضاض الدم النقوي المزمن ، اكتشفوا أن هذا الانتقال كان موجودًا في كروموسوم فيلادلفيا ، والأهم من ذلك أنه يمكن التعرف عليه في جميع الحالات تقريبًا ، أكثر من 95٪ من حالات ابيضاض الدم النقوي المزمن.

علاوة على ذلك ، كان هذا الكروموسوم موجودًا أيضًا في الخلايا الضامة والخلايا الحبيبية الأكثر تمايزًا والتي كانت موجودة وتنتشر في دم مرضى سرطان الدم النخاعي المزمن. وقد بدأ ذلك في اقتراح فكرة أن هناك خلية جذعية من نوع ما ، خلية جذعية قليلة الجهد التي خلقت أنواعًا مختلفة من خلايا الدم البيضاء الأكثر تمايزًا والتي حافظت على هذا الانتقال الكروموسومي لأن هذا هو ما هو عليه ، ترجمة ، انتقال ، أن كل ذلك كانت خلايا هؤلاء المرضى قد تحملت هذا الانتقال الكروموسومي. وقد بدأ ذلك في اقتراح فكرة أنه نتيجة لحادث وراثي عشوائي يحدث في دم هؤلاء الأشخاص ، تم تحديد هذا الكروموسوم بشكل متكرر. وكان من المحتمل جدًا أن يكون مهمًا سببيًا أو مسببًا في نشأة المرض.

لكن هذا في حد ذاته لم يؤد إلى أي مكان. يمكن للمرء ببساطة التحدث عن ارتباطه حتى العمل من منطقة غير ذات صلة تمامًا ، وهو ما يعني أن دراسة الفيروسات القهقرية اكتشفت فيروس أبيلسون لوكيميا مورين. وسُمي أبيلسون على اسم الزميل هيرب أبيلسون ، الذي اكتشفه لأول مرة في المعاهد الوطنية للصحة وأجرى توصيفه الجزيئي هنا في مركز السرطان الخاص بنا ، واكتشف أبيلسون أن هذا الفيروس الذي درسه يحمل نهايات فيروس سرطان الدم في الفئران ، والذي كان عبارة عن فيروس الوالدين. كان مثل الفيروس الهجين.

وفي منتصفه ، اكتسب فيروس أبيلسون اللوكيميا جينيًا خلويًا ورميًا أوليًا ، قام بتنشيطه ليصبح أحد الجينات الورمية. وبالتالي ، لدينا هنا حالة يتم فيها تنشيط جين خلوي مثل سارك في حالة فيروس ساركوما روس. أصبح هذا يسمى ABL لأسباب واضحة.

وقد اتضح أن هذا الجين كان مهمًا للغاية في فهم كيف أدى انتقال الكروموسومات إلى السرطان.

في الواقع ، إذا أصيب أحد الفئران بفيروس قهقري يحمل هذا الجينوم ، فهذا فقط للإشارة إلى حقيقة أن التكرار ينتهي ، نهايات التكرار النهائي الطويل لهذا الفيروس الطافي ، تحدث مرتين في نهايات هذا الفيروس القهقري. إذا أصاب أحد فأرًا بفيروس أبيلسون ، فقد ظهر مرض كان مشابهًا ظاهريًا على الأقل لابيضاض الدم النقوي المزمن.

وقد بدأ ذلك البحث ، إذن ، عن توطين الكروموسومات لجين آبل البدائي الورمي.

وما تم اكتشافه لاحقًا ، بشكل مذهل بما فيه الكفاية ، هو أن الجين الورمي الأولي لآبل كان على حق عند نقطة الانهيار بين اثنين من الكروموسومات ، تسعة و 22. وما حدث نتيجة هذا الانتقال ، والاندماج الناتج لهذا الكروموسوم مع هذا الكروموسوم كان إنشاء جين الصمامات ، وهو جين هجين يحمل الآن إطارات القراءة لجينين غير متصلين سابقًا ، أحدهما على الكروموسوم التاسع والآخر على الكروموسوم 22. هذا هو بروتين أبيل الطبيعي.

يطلق عليه C Abel ، ويعني الشكل الخلوي أو العادي لهابيل.

وترى ذلك هنا. يتم عرضه بطريقة تخطيطية للغاية.

وها هو البروتين الثاني الذي تم ترميزه على الكروموسوم الآخر.

لذلك ، تم ترميز Abel هنا ، والجين الآخر ، الذي يسمى BCR ، يتم ترميزه هنا ، ونتيجة للانتقال ، يتم ترميز Abel هنا. يتم ترميز BCR هنا. نتيجة للانتقال ، أصبح لدى المرء الآن ليس فقط اندماج القطع الصبغية. لكن المرء لديه اندماج إطارات القراءة لجينين غير مرتبطين سابقًا.

وهنا ، ينتج المرء نتيجة لهذه الاندماجات ، أي واحد من سلسلة من ثلاثة بروتينات اندماج متميزة تمامًا ، والتي لا توجد بشكل طبيعي مسبقًا في الخلية الطبيعية.

ويظهر هنا P-1 85 و P-2 10 و P-2 30. تسمح هذه الانتقالات بأجزاء مختلفة من جين ثانٍ يسمى BCR.

يشير BCR إلى منطقة كتلة نقطة التوقف. تسمى منطقة نقطة الاندماج بنقطة التوقف بين الجينين.

لذلك ، فإن النقطة التي يتم فيها قطع كل جين ودمجها مع الآخر تسمى نقطة التوقف. واتضح أنه داخل منطقة الكروموسوم حيث خرائط BCR ، يوجد في الواقع ثلاثة مواقع يمكن أن يحدث فيها الاندماج. إذا نظرت بعناية إلى هذا الرسم البياني ، سترى أن هناك نطاقات مختلفة لبروتين BCR ، والتي يمكن أن تساهم في بروتين الاندماج.

وما يقوله هذا ، في الواقع ، هو التالي ، هنا ، دعنا نشير فقط إلى هذا الرسم التخطيطي هنا.

لاحظ ، بالمناسبة ، في كل هذه العناصر الثلاثة ، أن بروتين Abel موجود في الطرف C من البروتين.يوجد BCR في نهاية الطرف النهائي. إذن ، ها هو جين BCR.

ها هو جين أبيل هنا. وما وجده المحققون هو أنه قد يكون هناك انقطاع في هذا الجزء من جين BCR ، في هذا الجزء من جين BCR ، أو في هذا الجزء من جين BCR ، مما يؤدي دائمًا إلى اندماج Abel ، في واحد أو اثنين ، أو ثلاثة أنواع مختلفة من بروتينات BCR. ودلّت منطقة مجموعة نقاط التوقف على حقيقة وجود مجموعة كاملة من المواقع في جين BCR الموجود سابقًا والتي يمكن أن يحدث هذا الاندماج فيها ، مما ينتج عنه ، إذا حدث الانقطاع هنا ، فقد حدثت نقطة التوقف هنا ، و BCR للحصول على أطول واحد .

هنا تحصل على الحجم المتوسط ​​هنا ستحصل على الأقصر.

ومن المثير للاهتمام ، كما اكتشف المرء تقريبًا ، أنواعًا أخرى من اللوكيميا المختلفة ، يمكن للمرء أن يرى بروتينات الاندماج المختلفة التي تم إنتاجها. إليكم ابيضاض الدم النقوي المزمن ، والذي تحدثت إليكم عنه من قبل. هنا ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد ، وهنا ابيضاض الدم المزمن والعدلات ، ثلاثة أنواع مختلفة من ابيضاض الدم. لا داعي للقلق بشأن تفاصيل هذه الأمراض ، بصرف النظر عن حقيقة أن بنية هذا البروتين الاندماجي تشجع نمو أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية في نخاع العظام ، والتي بدورها تخلق ثلاثة أنواع مختلفة من الأمراض. . الأهم من ذلك بالنسبة لمناقشتنا كان محاولة فهم طبيعة بروتين الاندماج الناتج ، والذي نتيجة لهذا الاندماج الناجم عن الانتقال الكروموسومي اكتسب الآن بوضوح قوى بيولوجية لم تكن موجودة مسبقًا في أي من البروتينات الأبوية.

تشير هذه الرموز المختلفة هنا إلى سلسلة كاملة من الوظائف المختلفة المرتبطة ببروتين Abel ، وبدلاً من ذلك مع بروتين BCR. ولسنا بحاجة إلى الدخول فيها ، باستثناء أن نقول إن كل اسم من هذه الأسماء المختلفة هنا يسمح للبروتين بمفرده بالارتباط ببروتينات أخرى والقيام بتسلسل إشارات نشط في اتجاه مجرى النهر.

الأهم في مناقشتنا هو إدراك أن هذا المجال SH-1 ، المشار إليه هنا ، SH-1 يشير إلى مجال الأورام اللحمية ، يساوي علم الأورام اللحمية ، يساوي التيروزين كيناز. وبالتالي ، ما هو موجود هنا هو بروتين ، وهو أكثر تفصيلاً من السارك ، ولديه قدرات إرسال أكبر بكثير ، بحكم حقيقة أن هذه المجالات المختلفة المشار إليها هنا تسمح لبروتين الاندماج الناتج بالاستيلاء على مجموعة كاملة شركاء إشارة مختلفين حتى يتمكن من إرسال مجموعة متنوعة من إشارات تنشيط المصب. إذا قام أحدهم بفحص بنية المجال SH-1 ، فقد وجد أن نشاط التيروزين كيناز يشبه إلى حد كبير sarc ، والأهم من ذلك ، إذا أدخل أحد بروتين الاندماج هذا في فيروس ارتجاعي ، الآن بدلاً من Abel ، يمكن للمرء أن يصنع بروتين اندماج BCR Abel .

يمكن للمرء أن يضع هذا في فيروس ارتجاعي كما كان من قبل ، تمامًا مثل هنا.

يمكن للمرء أن يصيب الفئران به ، ويخرج الآن من مرض لا يمكن تمييزه ، في جوهره ، عن ابيضاض الدم النقوي المزمن في البشر. إذا وضع أحدهم طفرة نقطية دقيقة في مجال التيروزين كيناز ، كل البروتين القادر ، هنا مجال التيروزين كيناز ، SH-1 ، هنا. هنا ، نرى مجالات التيروزين كيناز ممثلة في ثلاثة بروتينات اندماج مختلفة. ضع في اعتبارك أن SH-1 هو دائمًا مجال التيروزين كيناز.

إذا وضع أحدهم طفرة نقطية خفية ومعطلة في مجال التيروزين كيناز ، فإن ذلك قضى على الفور على جميع القوى البيولوجية لتكوين اللوكيميا على جزء من هذا الفيروس القهقري هنا ، أو أي نوع آخر من بروتينات الاندماج الأخرى وثيقة الصلة. وبالتالي ، يشير ذلك إلى أن مجال التيروزين كيناز المشار إليه هنا كان بالغ الأهمية حقًا لتكوين الورم ، وأن أي تأثيرات على قدرة إشارات التيروزين كيناز الخاصة به ستؤدي في النهاية إلى انهيار الورم ، أو عدم قدرة الناتجة عن الفيروسات القهقرية لتخلق السرطان بالفعل.

وهكذا ، أصبح لدى المرء الآن ، ولأول مرة حقًا ، عرض واضح لكيفية حدوث سرطان بشري شائع ، ابيضاض الدم النقوي المزمن ، للأسف ليس نادرًا جدًا ، يمكن أن ينشأ نتيجة لحدث عشوائي لانتقال الكروموسومات. قد تسأل ، لماذا يحصل المرء دائمًا على هذا النوع الخاص من النقل؟ حسنًا ، الجواب هو أننا لا نعرف حقًا. يبدو الأمر كما لو كان هناك جهاز موجه يتسبب في استهداف هذه القطعة وهذه القطعة بعضها البعض وتبادل بعضها البعض. ربما لم يكن الأمر كذلك.

ما يحدث على الأرجح هو أن عمليات نقل الكروموسومات تحدث بشكل عشوائي إلى حد ما داخل نخاع العظام ، وفي حالات نادرة هناك انتقال صبغوي ينتج هذا النوع من الاندماج بالضبط. وهذا النوع من الاندماج ، بدوره ، هو المسؤول عن تكوين هذا البروتين الاندماجي ، وهذا البروتين المندمج بدوره يخلق ثمرة CML ، مرض ابيضاض الدم النقوي المزمن. ما يعنيه ذلك حقًا هو أن انتقال الكروموسومات الذي يحدث عشوائيًا في مناسبة نادرة يضرب الفوز بالجائزة الجينية ، والخلية التي تصادف أنها اكتسبت هذا النوع من الانتقال الكروموسومي تبدأ الآن في التكاثر بشكل عشوائي ، مما يؤدي إلى ظهور أول ابيضاض دم نقوي مزمن ، ثم اندلاعه لاحقًا في مرحلة حادة لاحقة حيث توجد على ما يبدو تغييرات جينية إضافية تتعدى هذا الانتقال الكروموسومي والتي تتآمر مع الانتقال الكروموسومي الحالي لتخلق مرضًا شديد العدوانية يؤدي بسرعة إلى وفاة مريض اللوكيميا. قدم ذلك ، من حيث المبدأ ، طريقة جذابة للبدء في تطوير علاج مضاد للسرطان لأن ما قد يتخيله المرء هو أنه يمكن تطوير مثبط التيروزين كيناز.

ضع في اعتبارك الآن أن كينازات التيروزين هي فئة من الإنزيمات التي تربط مجموعات الفوسفات ببقايا التيروزين لبروتينات الركيزة المختلفة. وتذكر أيضًا حقيقة أننا رسمنا سلسلة من مستقبلات عامل النمو التي تحتوي على نطاقات التيروزين كيناز فيها. وأنا أرسم مجالات التيروزين كيناز هنا بهذا الشكل ، عندما يتم تنشيط مستقبلات عامل النمو هذه ، فإنها تربط مجموعات الفوسفات بذيول بعضها البعض. وسأرسم مجموعات الفوسفات مثل هذه ، أي ارتباط الترابط أو دعنا نقول يجند عامل نمو البشرة أو يجند الصفيحة يتسببان في المستقبلين اللذين يتم تحريكهما عادةً في غشاء البلازما ليتحدوا معًا لنقل الفسفرة ، وبعد ذلك لذلك ، لاكتساب قوى الإشارة بشكل فعال ، لأنه بمجرد أن تلتصق هذه الفوسفات ، فإنها تمثل الآن مواقع حيث يمكن للجزيئات الأخرى أن تثبت نفسها وترسل إشارات في اتجاه مجرى النهر. في الواقع ، هناك ما مجموعه 90 كينازات تيروزين مختلفة مشفرة في الجينوم البشري.

وهكذا ، إلى الحد الذي تصبح فيه كينازات التيروزين شديدة النشاط في أنواع مختلفة من السرطانات البشرية ، فإن هذا يمثل من حيث المبدأ طريقة جذابة للغاية لتطوير علاج مضاد للسرطان. لكن دعنا نفكر في المشاكل المتأصلة في مثل هذا المركب. بادئ ذي بدء ، إذا أراد المرء تطوير علاج مضاد للسرطان ، فيجب أن يكون محددًا بشكل معقول لـ Abelson tyrosine kinase ، وليس 89 نوعًا من كينازات التيروزين التي تتعايش أيضًا في الجينوم البشري ، وتكون نشطة ، ومن الواضح أنها مسؤولة عن التمثيل الغذائي الطبيعي للخلايا في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الطبيعية.

لذلك ، على المرء أن يبدأ في التفكير في مسألة نشاط الخلية.

كيف يمكن للمرء أن يصنع مركبًا ذا وزن جزيئي منخفض ، والذي يكون قادرًا بشكل انتقائي على تعطيل Abelson tyrosine kinase كما هو موضح هنا ، مجموعة SH-1 ، ولكنه لا يزعج مجموعة كاملة من كينازات التيروزين الأخرى المسؤولة عن الفسيولوجية الطبيعية الأخرى الآليات.

حسنًا ، ستقول أن هذا سهل جدًا. لدينا 90 جينًا مختلفًا.

يصنع كل جين من الـ 90 جينًا المختلفة بروتينًا مميزًا ، ويجب أن تكون هذه البروتينات مختلفة تمامًا. وبالتالي ، إذا كان بإمكان المرء ، في الواقع ، إذا كان هناك بنية ثلاثية الأبعاد لهذه البروتينات ، فإن كل كينازات التيروزين تبدو متشابهة تمامًا.

لديهم هيكل ثنائي التحميل. هنا هو الموقع النشط للإنزيم. وهذا يعني ، هنا هو الشق التحفيزي ، الموقع الذي يحدث فيه التحفيز الفعلي ، الموقع الذي يتم فيه أخذ فوسفات جاما من ATP من ATP وربطه ببروتين ركيزة إلى هيدروكسيل التيروزين للبروتين الذي هو على وشك الفسفرة. لذا ، أنت فقط تصنع مادة كيميائية منخفضة الجزيء خاصة بمجال التيروزين كيناز لبروتين أبيل. وعندما أرسم هيكل التحميل الثنائي هذا ، يتم نقل بنية التحميل الثنائي هذه هنا داخل مجال SH-1 هنا. لذلك ، هذا له هيكل ثنائي التحميل. من الواضح أنه لم يتم الإشارة إليه هنا في هذا الرسم التخطيطي للغاية.

المشكلة في ذلك هي التالية.

جميع مجالات SH-1 ، جميع نطاقات التيروزين كيناز مرتبطة تطوريًا ارتباطًا وثيقًا ببعضها البعض.

كلها مشتقة من سلائف مجال كيناز التيروزين الذي ربما كان موجودًا ربما منذ 600 أو 700 مليون سنة ، ونتيجة لتكرار الجينات تم تنويعه لصنع 90 كينازات تيروزين مختلفة. وإذا نظرت تحت علم البلورات بالأشعة السينية إلى التركيب ثلاثي الأبعاد لجميع كينازات التيروزين هذه ، فكلها تبدو إلى حد كبير مثل هذا ، أي أنها تحتوي على شقوق حفزية متشابهة إلى حد ما لأنها تختلف عن بروتين سلف مشترك ، ويحتفظون بهذه الثلاثة. تكوين الأبعاد لأن هذا التكوين ثلاثي الأبعاد يبدو مهمًا للاحتفاظ بوظيفتها.

يمكنك أن تتخيل ، على العكس من ذلك ، أنه إذا كان هناك بعض أحفاد مجال أسلاف التيروزين كيناز ، فإن بعضهم أصبح متحورًا وفقد هيكله ثلاثي الأبعاد.

ستفقد هذه الكينازات المتحدرة قدرتها على فسفرة التيروزينات على بروتينات الركيزة ، وبالتالي سيتم التخلص منها من مجموعة الجينات لأنها ستكون معيبة.

وهذا ما يفسر المحافظة القوية في بنية هذه الإنزيمات التسعين المختلفة. تبدو جميعها متشابهة جدًا مع بعضها البعض ، وهذا يخلق صعوبة كبيرة لمطور الدواء لأن عقارًا منخفض الوزن الجزيئي ، والذي يرغب المرء في تطويره ، مناسب هنا. لذا ، سأرسم دواءً منخفض الوزن الجزيئي يتفاعل بطريقة خاصة بالستريو مع بقايا الأحماض الأمينية التي تحاذي هذا الجيب ، هذا الشق التحفيزي ، قد يربط ويعطل بشكل جيد مجال التيروزين كيناز في أبيل. ولكن في الوقت نفسه ، قد يؤدي أيضًا إلى تقييد وإبطال نشاط سلسلة كاملة من كينازات التيروزين الأخرى ، وهذا بدوره قد يؤدي إلى كارثة علاجية.

على سبيل المثال ، إذا كان لديك عامل غير انتقائي ، فيمكنك علاج مريض سرطان الدم النقوي المزمن بمثبط منخفض الوزن الجزيئي ، وهو مركب منخفض الوزن الجزيئي ، والذي من شأنه أن يدخل في هذا الجيب من بروتين BCR Abel.

لكنها قد تدخل بالمثل في الشق التحفيزي لمستقبلات عامل النمو البشري (EGF).

وإذا أسقطت مستقبل EGF ، فقد يتسبب ذلك في حدوث إسهال قاتل لأنه بعد كل شيء ، فإن مستقبل EGF ، كما سأخبرك ، ضروري للحفاظ على بنية البطانة الظهارية للقولون. وهكذا ، قد تقتل المريض لمجرد أنك حرمت الخلايا في قولون ذلك الشخص من قدرتها على الحفاظ على نفسها. هناك سلسلة كاملة من مستقبلات عامل النمو اللازمة لسكتة دموية والتي ناقشناها في المرة السابقة. وهناك ، مرة أخرى ، إذا كان لديك مركب غير انتقائي ، والذي دخل في مجال أحد مستقبلات عامل النمو المسؤول عن تجلط الدم ، يمكنك إغلاق نخاع العظم بالكامل ، ومرة ​​أخرى تقتل المريض. أنا فقط أعطي لكم هذه الأمثلة الدرامية بشكل مفرط لحقيقة أن نشاط الخلية هو اعتبار مهم للغاية في تطوير مثل هذا الدواء. الشيء الآخر هو التقارب مع الهدف ، للشق التحفيزي الذي يتم استهدافه.

ماذا أعني بالتقارب؟ إذا نظرت إلى منحنيات الاستجابة لمركبات مختلفة ، فإن ما تراه هو التالي.

يمكنك رسم خط يشبه هذا ، رسم بياني يشبه هذا ، حيث لدينا هنا سجل لتركيز الدواء.

وهنا 10-4 ، هنا ، لنقم بالآخر ، 10-8 ضرس ، 10-7 ضرس ، 10-6 ، 10-5 ، 10-4.

وهذا هو تركيز الدواء المولي. وهنا نسبة التثبيط. لنفترض ، على سبيل المثال ، أننا تمكنا من أخذ بروتين BCR Abel ودراسته في أنبوب اختبار. ودعونا نقول أننا كنا مهتمين بدراسة مدى استجابة نشاط التيروزين كيناز لعقار مطبق قمنا بتطويره ضده.

إذن ، ها هي النسبة المئوية لتثبيط نشاط التيروزين كيناز لبروتين BCR Abel. الآن ، قد أكون قادرًا على تطوير دواء يبدو منحنى استجابته للجرعة هكذا.

وستقول ، حسنًا ، هذا رائع.

هذا عقار يقوم بإيقاف تشغيل BCR Abel. لم نتعامل حتى مع مسألة نشاط الخلية ، لكن دعنا ننظر إلى المكان الذي يبدأ فيه المرء في رؤية استجابة للجرعة هنا ، 10-5 مولار. وإذا قمت بحساب كمية الدواء التي تحتاج إلى توصيلها من أجل إيقاف بروتين BCR Abel في المريض ، فمن المحتمل أن يكون حجم الحبة التي يجب أن يحصلوا عليها بهذا الحجم كل يوم.

لذا ، ما عليك القيام به هو أنك بحاجة إلى أن تكون مجموعة مقبولة من تركيزات الأدوية منخفضة في هذا المجال هنا. وبالتالي ، فقط حتى تحصل على دواء له منحنى استجابة للجرعة يشبه هذا ، وهو أكثر فاعلية بمقدار مرتين أو ثلاث مرات حيث يكون قادرًا على إيقاف نشاط كيناز بالفعل عند 10-7 في a ، يسمى هذا تركيز دون ميكرومولار.

ميكرومولار هو 10-6. هنا بالفعل عند عُشر الميكرومولار ، 10-7 مولار ، حصلنا بالفعل على إيقاف لوظيفة الإنزيم. وإذا كان بإمكان المرء فعل ذلك ، فقد يكون بمقدور المرء من حيث المبدأ تطوير حبة بهذا الحجم وإعطائها للمريض بدلاً من حبة بحجم كرة القدم. وبالمناسبة ، إذا كان عليك أن تصنع الكثير من الجزيئات العضوية المعقدة للغاية من خلال التخليق العضوي الذي له صلة بهذا ، فهو أيضًا مكلف للغاية.

من الواضح ، إذا كان بإمكانك صنع مركب أقوى بمئات المرات ويتطلب مواد أقل مائة ضعف لإيصاله إلى جسم المريض ، فقد يكون لديك بعض النجاح في علاج المريض. ها هي قضية أخرى.

لذلك ، تحدثنا عن نشاط الخلية. لقد تحدثنا عن الفاعلية أو التقارب ، أو التقارب مع الركيزة أو الفاعلية. لذلك ، سيكون هذا دواءً مقبولاً.

إنه يعمل بالفعل عند التركيز المولي حيث تكون نقطة انعطاف هذا المنحنى. هذا دواء غير مقبول في 10-5. يمكننا أيضًا التحدث عن الحرائك الدوائية. أريد أن أعطيك فكرة عن مدى تعقيد تطوير الأدوية ، ولماذا نادرًا ما ينجح. بالمناسبة ، أنت تعرف كم يكلف تطوير دواء مفيد في العيادة هذه الأيام واختباره على الناس؟ أي شخص لديه أي فكرة؟

كم الثمن؟ نعم. إنها قريبة جدًا من مليار دولار ، ما بين 900 مليون دولار ومليار دولار. هذا الكثير من المال. هذا مال أكثر مما سنكسبه أنا وأنت معًا ، ربما جميعًا ، في العمر. حسنًا ، على أي حال ، الحرائك الدوائية ، ما هي الحرائك الدوائية؟ سعيد لأنني سألت هذا السؤال.

كم من الوقت يبقى الدواء بداخلك بعد تناوله إذا كنت مريضًا بالسرطان؟ ماذا يحدث إذا تم إفراز الدواء عن طريق الكلى خلال دقائق من تناوله ، دعنا نقول ، إما عن طريق الحقن أو عن طريق الفم؟

لذلك يمكننا أن نتخيل ، لنتحدث عن تركيز الدواء.

سأستخدم كلمة تركيز المخدرات في الدم.

وهنا الوقت. وإليك ما تبدو عليه بعض الأدوية عند إعطائها ، دعنا نقول ، شفويا. هذا ما يبدون عليه.

لنفترض هنا التركيز الفعال للدواء: التركيز الفعال. ونعرف التركيز الفعال من إجراء قياسات كهذه.

نحن فقط نقيسها ، ونعمل على حلها. لذلك ، لنفترض أننا طورنا عقارًا قادرًا على ضرب بروتين BCR Abel. ما هي الخواص الحركية التي يذوب بها الدواء في مجرى الدم؟

وقد يبدو هكذا ، حيث أرسم هنا الآن ، هذه ساعة واحدة. هذه ساعتان. هذه ثلاث ساعات وأربع ساعات.

حسنًا ، حقيقة الأمر هي ، إذا كنت ستحاول قتل خلية سرطانية ، وهذا هو اسم هذه اللعبة ، فأنت تريد الاحتفاظ بها لفترة من الوقت لأنه اتضح ، كما تعلم أحدهم ، كان استمرار بقاء الخلايا السرطانية لخلايا سرطان الدم CML يعتمد على استمرار إطلاق بروتين BCR Abel kinase. في الواقع ، كما تعلم المرء ، إذا أوقف المرء إطلاق جزيء التيروزين كيناز في خلية ابيضاض الدم النقوي المزمن ، فإن الخلايا ستنفجر من الداخل.

سوف يخضعون للاستئصال. لذلك ، بدأ هذا في الكشف عن أن بروتين BCR Abel ليس مسؤولاً فقط عن إجبار هذه الخلايا على التكاثر ، ولكنه أيضًا يزودها بشكل مستقل بإشارة مضادة للاستماتة. إنه يمنعهم من السقوط على الجرف في الاستلقاء. إنه يمنعهم من قتل أنفسهم ، ومن الواضح أن هذا أمر بالغ الأهمية لقدرة هذا الورم على التكاثر ، لتوسيع عدد الخلايا في جسم المريض. اتضح أنه إذا زودت هذه الخلايا السرطانية بطريقة فعالة لإيقاف بروتين BCR Abel لمدة 30 أو 40 أو 50 دقيقة ، فلن يحدث الكثير لها. تحتاج إلى حرمانهم من الدواء لفترة طويلة جدًا ، حسنًا ، 15-20 ساعة ، وبالتالي فأنت بحاجة إلى الحرائك الدوائية التي تبدو هكذا. يجب أن يكون موجودًا لفترة طويلة من الوقت ، أو حتى أفضل ، اسمحوا لي أن أعيد رسم ذلك ، حتى يبدو أفضل مثل هذا.

يبقى في الدم لفترة طويلة من الزمن.

تبقى بعض الأدوية في الدورة الدموية لفترة طويلة.

تبقى الأدوية الأخرى في الدورة الدموية لفترة قصيرة جدًا من الزمن.

هناك مشكلة أخرى لم نبدأ الحديث عنها حتى الآن ، وهي عملية التمثيل الغذائي للدواء. اتضح أن العديد من الأدوية التي تعطيها للمريض يتم تحويلها بسرعة عن طريق الإنزيمات والكبد وهما المسؤولان عادة عن إزالة السموم من المواد الكيميائية التي تدخل أجسامنا. وبالتالي ، فإن العديد من الأدوية التي تدخل أجسامنا يتم تغييرها بسرعة أكبر أو أقل إلى شيء آخر ، وإزالة السموم ، وبالتالي تصبح غير ضارة. الآن ستقول ، حسنًا ، يمكنك معرفة ذلك أيضًا ، ولكن إليك ذبابة إضافية في المرهم. لأننا مجتمع متعدد الأشكال ، لأننا نحن البشر غير متجانسين وراثيًا ، أحدنا من الآخر ، يستقلب بعضنا دواءً معينًا بسرعة أكبر بكثير من غيره.

وهنا ، لدينا موقف يحتمل أن يستقلب فيه معظمنا دواء بسرعة كبيرة ، وفي هذه الحالة سيرغب الأطباء في إعطائنا جرعة عالية جدًا من الدواء بحيث يكون لدينا ما يكفي من الدواء لفترة كافية فترة زمنية لإحداث بعض التأثير.

لنفترض أن 97٪ منا قادرون على استقلاب الدواء بسرعة كبيرة ، ونتيجة لذلك ، يتم إعطاؤنا جرعة عالية جدًا من أجل الحصول على جرعة فعالة تصل إلى الورم للتعويض عن حقيقة أن الكثير من هذا الدواء يتم القضاء عليه بسرعة عن طريق التمثيل الغذائي في الكبد. تم تحويله إلى مركب آخر غير ضار كيميائياً. حسنًا ، ستقول ، هذا جيد.

سنأخذ جرعة كبيرة من هذا المركب ، لكن دعونا نفكر في نسبة 3٪ الأخرى من السكان الذين يستقلبون هذا المركب ببطء شديد.مثل الـ 97٪ الآخرين ، سيُعطى هؤلاء الأفراد جرعة عالية من الدواء لأن التجربة تُظهر أنه بشكل عام ، يستقلب معظم البشر الدواء بسرعة كبيرة. هؤلاء الأفراد يستقلبون الدواء ببطء شديد ، وماذا سيحدث لهم؟

حسنًا ، قد ينعقون. لماذا ا؟ لأن هذا الدواء سيكون موجودًا في شكل نشط بيولوجيًا قويًا لفترة طويلة من الزمن في أجسامهم ، وقد يكون له نتيجة مميتة. لذلك ، علينا أن نتعامل مع آثار التباين في التمثيل الغذائي للدواء ، والتنوع في التمثيل الغذائي لأنه اتضح أن الأشخاص المختلفين يستقلبون الدواء بشكل مختلف وأن التباين في استقلاب الدواء يكون أكبر بكثير إذا قارنت طريقة استقلاب الأدوية بالطريقة أن فئران التجارب تستقلب الأدوية. حسنًا ، ستقولون ، لماذا يجب أن نهتم بكيفية استقلاب فئران التجارب لهذا الدواء أو ذاك؟

لماذا هو مهم؟ الحقيقة هي أن التجارب الأولى لعقار مرشح تمت تجربتها في فئران المختبر حيث يتم إعطاء ورم لفئران المختبر ، ويتم حقنها بالعقار لمعرفة ما إذا كان الورم سيبدأ في الانكماش. ولكن إذا كان الأمر كذلك ، إذا قامت فئران المختبر باستقلاب الدواء بطريقة مختلفة تمامًا عن البشر ، فإن نتيجة العمل مع فئران المختبر قد تكون مضللة للغاية. وهذه ليست سوى بعض المشاكل التي تعيق تطوير عقار.

على أي حال ، في عام 1994 تقريبًا ، في شركة كانت مقدمة لشركة Novartis ، كانت تسمى Ciba-Geigy في بازل ، سويسرا. لقد طوروا مركبًا شديد التحديد وقويًا مضادًا لآبل ، منخفض الوزن الجزيئي ، والذي أصبح يسمى ليفيك.

أو في أوروبا يطلق عليه Gleveck. يتم نطقها أيضًا باسم Leveck ، ولكن يتم تهجئتها بشكل مختلف. في الواقع ، كان من بين الصعوبات الأخرى لتطوير هذا الدواء ما يلي.

أراد كبار المسؤولين في شركة الأدوية الذين كانوا يدفعون مقابل هذا البحث في مناسبات متكررة تنظيف برنامج تطوير الدواء بالكامل. لماذا ا؟ لأن عدد حالات ابيضاض الدم النقوي المزمن في جميع أنحاء العالم صغير نسبيًا.

كم عددهم في هذا البلد كل عام؟ لا أعرف ، 10 أو 15000. لذا ، كان السؤال ، من الناحية الاقتصادية ، هل العدد الصغير نسبيًا لحالات هذا المرض يبرر استثمارهم مليار دولار في تطوير الدواء. ربما يحتاجون إلى جيل كامل للحصول على أي مردود من استثماراتهم الأولية.

وهكذا ، حاولوا مرة تلو الأخرى ، مرارًا وتكرارًا ، إغلاق برنامج التطوير هذا لأنه لا يبدو أن له أي فائدة اقتصادية واضحة وطويلة الأجل. بالطبع ، نحن الآن لا نتحدث عن علم الأحياء. نحن نتحدث عن الاقتصاد والاقتصاد العقلاني.

هذا ليس بخل من جانبهم. لا يمكن لشركة أدوية كهذه أن تنفق مليار دولار هنا ومليار دولار هناك دون أن تؤدي في وقت أو آخر إلى نزيف مالي كبير.

لذلك ، تبين أن جليفيك محدد للغاية بالنسبة إلى Abel kinase ، وكما اتضح فيما بعد ، بالنسبة لنوعين آخرين من الكينازات أيضًا.

نوع آخر من الكيناز هو ضد مستقبلات التيروزين كيناز المسمى KIT ، هذا هو مستقبل التيروزين كيناز ، ومستقبل آخر من التيروزين كيناز يسمى مستقبل PDGF ، والذي واجهناه أيضًا في وقت سابق. يحتوي هذان المستقبلان الآخران لعامل النمو ، KIT ومستقبل PDGF أيضًا على مجالات التيروزين كيناز.

لذلك فهم يتبعون هذه الخطة الهيكلية الشاملة هنا ، وقد اتضح من خلال المراوغة التطورية أن هياكل نطاقات التيروزين كيناز الخاصة بهم متشابهة في بعض النواحي مع مجال كيناز التيروزين في Abel ، وبالتالي BCR Abel.

لذا ، في الواقع ، لم يكن لديهم في الواقع دواء محدد تمامًا يمكنه مهاجمة واحد فقط من 90 كينازات التيروزين المشفرة في جينومهم. هاجمت ثلاثة من 90 كينازات التيروزين ، وهي Abel ، و KITT ، ومستقبلات PDGF. وقد يكون هذا ، من تلقاء نفسه ، قد أثبت بالفعل أنه مسمار الموت للبروتين ، إلا أنهم بدأوا في تجربته مع المرضى ، ورأوا بعض الاستجابات الرائعة. اتضح أن الغالبية العظمى من مرضى سرطان الدم النخاعي المزمن الذين عولجوا مع Gleveck بتركيزات علاجية انتهى بهم الأمر إلى مغفرة سريعة لمرض سرطان الدم النقوي المزمن ، مما أدى في النهاية إلى خلوهم من المرض. هذا هو سؤالك اليوم.

لذلك ، يذهب جليفيك إلى الشق الحفاز لـ Abel tyrosine kinase.

إنه يحجب موقع ارتباط ATP لأنه ضع في اعتبارك أن هذه الإنزيمات تحتاج إلى انتزاع فوسفات جاما من ATP ونقله إلى ركيزة بروتينية ، وهو يفعل ذلك لأنه روابط هيدروجينية بالأحماض الأمينية التي تبطن هذا الشق التحفيزي.

بعبارة أخرى ، من الواضح أن هذا الشق التحفيزي هنا مصنوع من الأحماض الأمينية ، وهناك روابط هيدروجينية يمكن أن يتكون منها جليفيك مع الأحماض الأمينية الموجودة في كلا جانبي الشق. كان يجب أن أحضر لك صورة لذلك. ويمكن أن يحدث نوع مشابه من الروابط الهيدروجينية مع الأحماض الأمينية التي تعمل على محاذاة الشقوق التحفيزية لمستقبل PDGF و KIT ، ويمكن أن يحدث الترابط الهيدروجيني بالفعل بتركيزات أقل من 10-6 مولار ، 10-7 ، حتى في بعض الأحيان 10-8 ضرس تحت ظروف معينة. لذلك ، فهو ارتباط تقارب عالٍ ، وهو محدد نسبيًا. ثلاثة فقط من 90 كينازات مختلفة ملزمة. يمكننا القيام بالنوع التالي من التجارب. إذا كنت سأضيف Gleveck إلى الخلايا باستخدام وظيفة BCR Abel ، فهذا هو الرد الذي سيظهره BCR Abel. هنا هو الرد الذي ستظهره مستقبلات عامل النمو العكسي.

لذلك ، إذا قمت بجرعة المريض عند هذا التركيز من الدواء ، فإن جليفيك سيغلق بروتين BCR Abel.

لكنها لن تغلق مستقبلات عامل النمو العشوائي ، الذي يتطلب تركيزات أعلى بكثير من الدواء من أجل إغلاق مجال التيروزين كيناز. وهنا ، يمكننا أن نرى ما نسميه الانتقائية. حقيقة أن هذا الإنزيم يستجيب عند تركيز عقار لوغاريتمي للغاية ، ومستقبل إنزيم EGF وتيروزين كيناز ، وهو مستقبل عامل النمو مرة أخرى ، يتطلب عقارًا عالي التركيز من أجل الحصول على نتيجة. لذا ، ما حدث لمرضى ابيضاض الدم النقوي المزمن. الغالبية العظمى منهم بين 70-80٪ يعانون من انهيار معجزة لمرضهم.

في معظم الحالات ، يمكن رصد هذا المرض مجهريًا. يمكن للمرء أن يبحث عن الخلايا النخاعية غير الناضجة في دمائهم ويرى أين كانت موجودة سابقًا بأعداد كبيرة. لقد أصبحوا الآن مجهريين غير قابلين للاكتشاف (كذا). ومع ذلك ، في هؤلاء المرضى حيث بدا أن المرض ينهار ، لا يزال بإمكان المرء استخدام اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل لإثبات وجود خلايا سرطانية متبقية في دمائهم.

كيف يمكن للمرء أن يفعل ذلك؟ حسنًا ، لنتخيل أن هنا هو بروتين اندماج PCR Abel. إذن ، ها هو PCR ، وهنا أبيل هنا. يمكنك صنع بادئات PCR ، أحدها مخصص لتسلسل PCR ، والآخر مخصص لتسلسل Abel ، والوقت الوحيد الذي ستحصل فيه على منتج PCR هو إذا كان هذان التسلسلان موجودان على نفس برنامج المراسلة جزيء RNA الذي يتم نسخه معكوسًا إلى CDNA.

يمكنك حتى عمل هذا الحمض النووي الجيني أيضًا ، وبالتالي يمكن للمرء أن يكتشف تحديدًا باستخدام اختبار PCR هذا وجود الخلايا التي تحتوي على هذا الانتقال الكروموسومي. إذا كان أحد بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل ضد BCR والآخر هو Abel ، والمسافات بين هذين البادئين ليست بعيدة جدًا ، ولنقل أكثر من كيلوباز ، لذلك تحصل على تضخيم PCR فعال إلى حد ما.

لذلك ، اتضح أن الغالبية العظمى من المرضى الذين تم شفاؤهم خلويًا ، يعني علم الخلايا أن التحليل الخلوي يمثل ما تراه في المجاهر.

إذاً هؤلاء المرضى ، إذا نظرت إلى مسحة من دمائهم ، تم شفاؤهم خلويًا. ولكن إذا استخدمت تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وهو أكثر حساسية بكثير ، فيمكن للمرء أن يكتشف الخلايا السرطانية المتبقية التي قد تكون موجودة في واحدة من بين 105 أو واحدة من أصل 106 خلايا تتحرك في الدورة الدموية ، والتي تكون غير مرئية تقريبًا إذا كنت تبحث من خلال خليط معقد جدا من الخلايا من خلال المجهر الضوئي. وهكذا ، ما حدث هو أن المرضى بدأوا في الانتكاس ، وبعد فترة عدة سنوات ، بدأ عدد من المرضى في إظهار استعادة لحالة سرطان الدم النخاعي المزمن.

في الواقع ، في دراسة أوروبية حديثة ، تشير إلى أن ما بين 10-12٪ من مرضى سرطان الدم النخاعي المزمن الذين عولجوا بغليفيك ينتكسون كل عام.

ماذا أعني بالانتكاس؟ أعني أنهم يظهرون عودة ظهور مرضهم. يعود المرض إلى الحياة ، ومرة ​​أخرى يصابون بالمرض. ومن المثير للاهتمام ، إذا نظر المرء الآن إلى خلاياهم السرطانية ، فماذا تراه؟

في كل حالة تقريبًا ، ترى بعض التغيير في بروتين BCR Abel. في الغالبية العظمى من الحالات ، ترى طفرات نقطية تؤثر على بقايا الأحماض الأمينية التي تبطن التجويف هنا ، وتبطن تجويف بروتين Abel kinase.

لا تؤثر بدائل الأحماض الأمينية على نشاط التيروزين كيناز لهذا الإنزيم. لكنها تمنع Gleveck من الارتباط ، ونتيجة لذلك ، تبدأ الآن في الحصول على مرضى لم تعد أورامهم تستجيب لـ Gleveck. وما حدث الآن هو أن المرء قد طور جيلًا جديدًا من المركبات التي ترتبط بهذا الجيب حتى في وجود بدائل الأحماض الأمينية هذه لتراجع هؤلاء المرضى. اراك يوم الاربعاء.


التنظيم خارج الخلية للإنترلوكين (IL) -1 & # x3b2 من خلال الخلايا الظهارية الرئوية وتعبير مستقبلات IL-1 من النوع الثاني المعيب

يتم إنتاج الإنترلوكين (IL) -1β بشكل أساسي عن طريق الخلايا البلعمية وحيدة النواة المنشطة في مجرى الهواء الرئوي وتعمل كخلية قوية مسببة للالتهابات. يؤدي إطلاق IL-1β في البيئة المكروية لمجرى الهواء إلى إنتاج عوامل مسببة للالتهاب من خلايا مجرى الهواء المتني ، بما في ذلك IL-8. لدراسة تنظيم استجابة الخلايا الظهارية للرئة لـ IL-1β ، تم اختبار خط الخلايا الظهارية من النوع الثاني الشبيه بالمجرى الهوائي A549 والخلايا الظهارية البشرية الطبيعية الأولية (NHBE) لمعدلات الاستجابة النوعية لـ IL-1. على وجه التحديد ، مستقبلات IL-1 من النوع الأول (IL-1RI) ومستقبلات IL-1 من النوع الثاني (IL-1RII) وبروتين ملحق مستقبل IL-1 (IL-1RAcP) ومضاد مستقبل IL-1 (IL-1Ra) وقد تم تحليل. تم الكشف عن التعبير التأسيسي لـ IL-1RI و IL-1RAcP و IL-1Ra في كل من الخلايا الظهارية للمجرى الهوائي البشري الأولية والمخلدة. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم إثبات الغياب التام لتعبير IL-1RII في جميع ظروف الدراسة في كل من خلايا A549 و NHBE. كان كلا النوعين من الخلايا مستجيبًا لـ IL-1β بتركيزات منخفضة تصل إلى 50 إلى 500 بيكوغرام / مل عند قياسها بإطلاق IL-8 في طاف الخلية. تم تثبيط إنتاج وإطلاق الكيميائيات المستحثة بـ IL-1β – بواسطة زيادة 10 إلى 1000 مرة من المولي من IL-1RII أو IL-1Ra المؤتلف ، بينما كان IL-1RI مثبطًا أقل فعالية. على أساس نتائجنا ، نقترح أن الخلايا الظهارية في الرئة البشرية تفتقر إلى القدرة على تنظيم نشاط IL-1β خارج الخلية بسبب عدم القدرة على التعبير عن IL-1RII. قد يكون إطلاق مثبطات IL-1 خارج الخلية ، بما في ذلك IL-1Ra القابل للذوبان و IL-1RII القابل للذوبان ، بواسطة الخلايا الالتهابية الأخرى الموجودة في مجرى الهواء أمرًا بالغ الأهمية لتنظيم نشاط IL-1β في بيئة مجرى الهواء المكروية.

Interleukin (IL) -1β هو سيتوكين قوي للغاية يسبب العديد من التأثيرات الالتهابية في جميع أنحاء الجسم وفي مجرى الهواء الرئوي (1). البلعمة وحيدة النواة هي المصدر الأساسي لـ IL-1β في مجرى الهواء الرئوي (2). يحفز إطلاق IL-1β من الضامة السنخية المنشطة الحمة المحيطة ، والتي تشمل الخلايا الظهارية في الرئة. إن إطلاق الرسل الثاني بواسطة الخلايا الظهارية يعزز تجنيد الخلايا الالتهابية الإضافية والاحتفاظ بها ، بما في ذلك العدلات والخلايا الليمفاوية والوحيدات (3-10). في البشر ، تم التورط في تنشيط IL-1β لظهارة الرئة كمسار التهابي رئيسي في أمراض الرئة ، بما في ذلك التليف الرئوي الخلالي والتليف الكيسي والربو (5).

تشير الدلائل المتزايدة إلى أن نشاط IL-1β منظم بإحكام خارج الخلية في حجرات الأنسجة. لدعم ذلك ، توجد ثلاثة أشكال إسوية لمضاد مستقبل IL-1 (IL-1Ra): إفراز IL-1Ra وشكلان متميزان داخل الخلايا ، يطلق عليهما النوع الأول والنوع الثاني (11). يتم التعبير عن النوع الأول داخل الخلايا من IL-1Ra (النوع I icIL-1Ra) بشكل أساسي بواسطة الخلايا الظهارية ، ويفتقر إلى إشارة الببتيد ، ويتم الاحتفاظ به عمومًا داخل الخلية (12). ومع ذلك ، فقد أثبتت الأدلة الحديثة إطلاق هذا الجزيء من الخلايا الظهارية في الرئة البشرية المعرضة لـ IL-4 و IL-13 و interferon (IFN)-، مما يدعم فكرة أن IL-1 منظم بإحكام في بيئة الرئة المكروية الالتهابية (13) ).

بالإضافة إلى المضاد النقي IL-1Ra ، هناك نوعان من المستقبلات المعروفة لـ IL-1 ، تسمى مستقبلات IL-1 من النوع الأول (IL-1RI) ومستقبل IL-1 من النوع الثاني (IL-1RII). يوجد كلا المستقبلين في أشكال خارج الخلوية مرتبطة بالغشاء وقابلة للذوبان (14 ، 15). تم العثور على مستقبلات من النوع الأول بقدرة 80 كيلو دالتون على سطح جميع الخلايا المستجيبة لـ IL-1 ، وبالاقتران مع البروتين الإضافي لمستقبل IL-1 (IL-1RAcP) ، يكون مسؤولاً عن نقل الإشارات بوساطة IL-1β (1 ، 16-18). إن الوزن الجزيئي لـ IL-1RII المرتبط بالغشاء يبلغ 60 كيلو دالتون ، ولا يحفز سلسلة إشارة ، ويمكن أن يخضع لانقسام ما بعد الترجمة بواسطة البروتياز المعدني لإنتاج الشكل القابل للذوبان من البروتين المثبط بوزن جزيئي يتراوح من 45 إلى 50 كيلو دالتون ، حسب مصدر الخلية (19-21). بالإضافة إلى ذلك ، تم عرض متغير لصق لـ IL-1RII القابل للذوبان (15). على الرغم من وجود أنواع مختلفة من IL-1RII ، فإن جميع الأشكال تربط بشكل تفضيلي IL-1β بتقارب أعلى عند مقارنتها بـ IL-1α و IL-1Ra ، مما يشير إلى دور أساسي مضاد للالتهابات لـ IL-1RII (22-24). إذا أخذنا معًا ، فإن تنظيم تعبير IL-1RII و IL-1Ra في البيئة المكروية للرئة ، وخاصة القدرة على تقليل نشاط IL-1β ، أمر ضروري في الاستجابة الالتهابية للمضيف.

تشمل الخلايا التي تعبر عن IL-1RII وتشارك في التهاب مجرى الهواء الرئوي العدلات والخلايا الليمفاوية B والوحيدات / الضامة (1). ومن المثير للاهتمام ، أنه تم قياس المستويات المرتفعة من IL-1RII القابل للذوبان في مصل الدم المأخوذ من مرضى تعفن الدم ، وفي السائل الزليلي المأخوذ من مرضى يعانون من اضطرابات المفاصل الالتهابية ، وفي سائل غسل القصبات الهوائية (BALF) المأخوذ من مرضى الالتهاب الرئوي اليوزيني الحاد (25-27) ). حددت الدراسات باستمرار الخلايا الالتهابية كمصدر لـ IL-1RII القابل للذوبان وتدعم دورًا في التخلص من IL-1RII كآلية لتنظيم نشاط IL-1 في عمليات الأمراض الالتهابية. من المحتمل أن يكون تنظيم النشاط الحيوي لـ IL-1β داخل البيئة الدقيقة لمجرى الهواء ، وعلى وجه الخصوص ، الخلايا الظهارية في الرئة معقدًا للغاية. أظهر العمل السابق أن الخلايا الظهارية الأولية لمجرى الهواء البشري وخطوط خلايا الرئة البشرية ذات الصلة تستجيب لتركيزات منخفضة جدًا من IL-1β (1 ، 5). على الرغم من عدم إثبات ذلك بعد ، فإن هذا يعني أن IL-1RI و IL-1RAcP يعملان بالتنسيق على سطح الخلية الظهارية في الرئة لتضخيم تنشيط الخلية المستحث بـ IL-1 (28 ، 29). لقد ثبت أن الخلايا الظهارية في الرئة تنتج بشكل أساسي فقط النوع الأول من الشكل داخل الخلايا من IL-1Ra والذي ، في ظل الظروف الأصلية ، يظل خلية مرتبطة (12 ، 13). علاوة على ذلك ، حددت التحقيقات السابقة الخلايا الظهارية في الشعب الهوائية البشرية كمصدر لـ IL-1β (30 ، 31). على حد علمنا ، باستثناء IL-1Ra ، لم يتم إجراء تقييم نقدي لمعدلات الاستجابة المحددة لـ IL-1 في الخلايا الظهارية لمجرى الهواء البشري. علاوة على ذلك ، أظهرت البيانات المتضاربة تعبيرًا عن كل من IL-1RI و IL-1RII في الخلايا الكيراتينية الطلائية البشرية الأولية ، في حين أن الخلايا الظهارية المعوية الأولية للجرذان تعبر عن IL-1RI فقط (32 ، 33). تشير هذه النتائج إلى أن تعبير مستقبل IL-1 في الخلايا الظهارية قد يكون نتيجة لبيئة الأنسجة.

إن تنشيط ظهارة مجرى الهواء بواسطة IL-1β ، وعلى وجه الخصوص ، تنظيم IL-1β بواسطة مستقبلات IL-1 في ظهارة الرئة غير مفهوم جيدًا. يحاول التحقيق الحالي تحديد العلاقة بين IL-1β ، وتفعيل الخلايا الظهارية للرئة ، والتعبير عن معدلات استجابة IL-1 ، والتأثير الصافي على تنشيط الخلية وإطلاق IL-8. نقترح أن الخلايا الظهارية في الرئة البشرية تفتقر إلى القدرة على التعبير عن IL-1RII وبالتالي فهي محدودة في قدرتها على تنظيم نشاط IL-1β خارج الخلية. على هذا النحو ، قد يكون إطلاق مثبطات IL-1 خارج الخلية ، بما في ذلك IL-1RII القابل للذوبان و IL-1Ra القابل للذوبان ، بواسطة الخلايا الالتهابية الأخرى الموجودة في مجرى الهواء أمرًا بالغ الأهمية لتنظيم نشاط IL-1β في بيئة مجرى الهواء المكروية.

تم شراء خلايا A549 ، وهي خط الخلايا الظهارية للرئة البشرية من النوع الثاني (34) ، من American Type Culture Collection (Rockville ، MD) ونمت في 75 سم 2 قوارير زراعة الأنسجة. تم الحفاظ على الثقافات في خليط المغذيات F-12 (GIBCO BRL ، جراند آيلاند ، نيويورك) مع 10 ٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS) (Hyclone ، Logan ، UT) ، 100 U / ml البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (GIBCO) BRL) (وسط نمو كامل) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2. تم تمرير خلايا A549 عند 80 إلى 100 ٪ من التقاء باستخدام 0.25 ٪ من التربسين و 1 ملي مولار من حمض إيثيلين ديامينيتراسيتيك (EDTA) ⋅4Na (GIBCO BRL).

تم شراء الخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية الطبيعية (NHBE) من شركة Clonetics Corp. (سان دييغو ، كاليفورنيا). تم نشر الخلايا وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة في وسط نمو الخلايا الظهارية القصبية (BEGM) (LHC-9 المعدل) مع مكملات كاملة. تم تمرير خلايا NHBE عند التقاء 80 ٪ وفقًا لتوصيات الشركة الصانعة. تم إجراء جميع التجارب على خلايا NHBE في المقطع الثاني أو الثالث. بالنسبة للدراسات التي أجريت باستخدام مثبطات IL-1β ومثبطات IL-1 القابلة للذوبان ، تمت إزالة الهيدروكورتيزون من مزرعة الخلية قبل 24 ساعة من العلاج وخلال وقت الدراسة ، ما لم يذكر خلاف ذلك. تم إجراء إزالة الهيدروكورتيزون من وسط زراعة الخلايا للسماح بالإفراج الأمثل عن IL-8.

تمت تنقية الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) من متطوعين أصحاء عاديين. تم الحصول على الدم Heparinized (الهيبارين الصوديوم 15 U / ml Elkins – Sinn، Inc.، Cherry Hill، NJ) (60 مل) ، وتم تنقية PBMC باستخدام متعدد السكروز / دياتريزوات الصوديوم (Histopaque Sigma Diagnostics، St. الطرد المركزي. تم حساب PBMC (عادةً 20٪ وحيدات ، 80٪ خلايا ليمفاوية) وغسلها وتعليقها بتركيز 5 × 10 6 / مل في RPMI 1640 (BioWhitaker ، Walkersville ، MD) / 5٪ FBS (Hyclone) مع 10 ميكروغرام / مل من polymyxin B (Rorer Pharmaceuticals ، New York ، NY) لتحييد أي سم داخلي ملوث. تم تحضين الخلايا طوال الليل بعد إضافة ديكساميثازون عند 1 × 10 7 م (مختبرات الكاشف الأمريكية ، شيرلي ، نيويورك) وعديد السكاريد الدهني (LPS) (LPS W ، الإشريكية القولونية 0127: مختبرات B8 ديفكو ، ديترويت ، ميتشيغن) بمعدل 1 ميكروغرام / مل. تم شراء خلايا HepG2 من مجموعة American Type Culture Collection ونمت في قوارير زراعة الأنسجة 75 سم 2.تم الحفاظ على الثقافات في الوسط الأساسي الأدنى (MEM) مع الأحماض الأمينية غير الأساسية وبيروفات الصوديوم مع محلول ملح إيرل المتوازن (GIBCO BRL) مع 10 ٪ FBS (Hyclone) ، و 100 U / ml من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (GIBCO BRL) ) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2.

بالنسبة للتجارب التي تتضمن الاستجابة للجرعة والوقت مع IL-1β ، تم تمرير خلايا A549 وطليها في ألواح بوليسترين بستة آبار (Falcon / Fisher ، Pittsburgh ، PA) بكثافة 3 × 10 5 خلايا / بئر في وسط نمو كامل حتى 80 التقاء ٪. نظرًا لأن مرور الخلية وحده يمكن أن يؤدي إلى إطلاق IL-8 في خلايا A549 (الملاحظة الشخصية) ، فقد تم تحضين الخلايا لمدة يومين بعد المرور قبل إجراء مزيد من المعالجة للسماح للخلايا بالوصول إلى حالة الراحة الأصلية. في هذه المرحلة ، تمت إزالة الوسيط واستبداله بوسط نمو كامل يحتوي على تركيزات متزايدة من IL-1β البشري المؤتلف (rhIL-1β) (0 إلى 5 نانوغرام / مل برنامج معدِّلات الاستجابة البيولوجية ، المعهد الوطني للسرطان ، فريدريك ، دكتوراه في الطب) و حضنت لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، تم جمع المواد الطافية الخالية من الخلايا وتم قياس إطلاق IL-8 بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). ثم تم استخدام جرعة IL-1β بمقدار 50 بيكوغرام / مل لتحديد الإصدار المعتمد على الوقت لـ IL-8 بواسطة خلايا A549 في وسط زراعة الخلية. تم جمع وقياس المواد الطافية الخالية من الخلايا لـ IL-8 بواسطة ELISA عند 0 ، 1 ، 2 ، 4 ، 8 ، و 24 ساعة بعد إضافة IL-1β إلى وسط الثقافة. تم إجراء دراسات مماثلة باستخدام خلايا NHBE بنطاق جرعة IL-1β من 0 إلى 50 نانوغرام / مل باستخدام BEGM بدون هيدروكورتيزون. بناءً على دراسات الاستجابة للجرعة ، تم استخدام جرعات من 50 و 500 بيكوغرام / مل من IL-1β في جميع الدراسات اللاحقة التي شملت خلايا A549 و NHBE ، على التوالي. أدت تركيزات IL-1β هذه إلى زيادة ذات دلالة إحصائية في إطلاق IL-8 ، كما هو محدد سابقًا.

بالنسبة للتجارب التي تنطوي على تحليل تعبير البروتين IL-1RII و IL-1Ra ، نمت خلايا A549 و NHBE لمدة 24 ساعة في ظروف الثقافة القياسية. في اليوم التالي ، تم الحصول على مواد طافية خالية من الخلايا وكذلك محللات الخلايا بعد المعالجة بمحلول تحلل يحتوي على 10 ملي مولار تريس (درجة الحموضة 7.5) ، 1 ملي مولار EDTA ، 0.2 ملي ميثوكسيسوكسينيل-ألا-ألا-برو-فال كلورو ميثيل كيتون (منتجات نظام الإنزيم ، ليفرمور ، كاليفورنيا) ، 10 ميكروغرام / مل من لوبيبتين (تشخيصات سيجما) ، و 10 ميكروغرام / مل بيبستاتين (تشخيصات سيجما). تم تخزين المواد الطافية ومحللات الخلية عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

بالنسبة لتجارب التثبيط ، تم تمرير خلايا A549 وطليها إما في 96 طبقًا جيدًا أو ستة ألواح بئر بكثافة خلية إما 2 × 10 4 أو 3 × 10 5 خلية / بئر ، على التوالي ، في وسط نمو كامل. بعد يومين من المرور ، تمت إزالة وسط المزرعة وشطفت الخلايا بوسط خالٍ من المصل ثم حضنت لمدة 24 ساعة باستخدام rhIL-1β (50 بيكوغرام / مل) بمفردها أو بالاشتراك مع واحد أو أكثر من مثبطات الذوبان التالية: أ hIL-1RI الزائدة من 10 إلى 1000 ضعف (هدية كريمة من Dr. Sims) ، أو زيادة من 10 إلى 1000 ضعف من IL-1Ra (هدية لطيفة من Dr. قبل الإضافة إلى خلايا A549 ، تم خلط مثبطات IL-1β و IL-1 القابلة للذوبان وتم تحضينها مسبقًا في وسط نمو كامل عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 15 دقيقة. في نهاية التجربة ، تم جمع المواد الطافية الخالية من الخلايا ومعايرتها لـ IL-8 بواسطة ELISA.

تم إجراء تجارب مماثلة مع خلايا NHBE مع التعديلات التالية: 24 ساعة قبل إجراء التجربة ، تم استبدال BEGM بـ BEGM بدون هيدروكورتيزون كما هو موصوف سابقًا ، تم تحفيز خلايا NHBE بـ 500 بيكوغرام / مل من IL-1β بدلاً من 50 بيكوغرام / مل ، وتم تعديل جرعة مثبطات IL-1 على أساس تركيز IL-1β. كما كان من قبل ، بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، تم اختبار المواد الطافية الخالية من الخلايا لـ IL-8 بواسطة ELISA.

تم أيضًا تحفيز خطوط الخلايا A549 و NHBE باستخدام 0 إلى 1 ميكروغرام / مل من LPS. تم إجراء التحفيز بطريقة مشابهة لتلك الموضحة أعلاه. باختصار ، تم طلاء الخلايا في وسط مناسب وحضنت حتى وصلت إلى 80 ٪ التقاء. تم الحفاظ على خلايا A549 في وسط نمو كامل ، بينما تم وضع خلايا NHBE في BEGM بدون هيدروكورتيزون قبل 24 ساعة من التحفيز وطوال فترة الحضانة باستخدام LPS. تم تحضين الخلايا لمدة 24 ساعة في وجود LPS ، وفي اليوم التالي تم حصاد المواد الطافية الخالية من الخلايا ومعايرتها لإطلاق IL-8 بواسطة ELISA. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحفيز خلايا A549 باستخدام IL-4 (10 و 20 و 30 نانوغرام / مل) و IFN-(250 و 500 وحدة / مل) وديكساميثازون (1 × 10 −7 م) لمدة 24 ساعة كما هو موصوف. سابقا. تم جمع المواد الطافية الخالية من الخلايا ومعايرتها لإطلاق IL-1RII و IL-1Ra بواسطة ELISA.

تم قياس إطلاق IL-8 بواسطة شطيرة ELISA كما هو موضح سابقًا (35). باختصار ، تم استخدام الجسم المضاد IL-8 المضاد للبشر وحيدة النسيلة للفأر (R & ampD Systems ، Minneapolis ، MN) كجسم مضاد للالتقاط ، وتم استخدام الجسم المضاد متعدد النسيلة IL-8 المضاد للبشر (Endogen ، Inc. ، بوسطن ، ماساتشوستس) لتعقيد المستضد. . تم اكتشاف هذا المركب من خلال التفاعل الأنزيمي بين الغلوبولين المناعي المضاد للأرنب (Ig) G المترافق مع الفجل البيروكسيديز (HRP) (مختبرات Bio-Rad ، Hercules ، CA) و 3،3 ، 5،5′-tetramethylbenzidine (TMB) (Moss، Inc.، Pasadena، MD) كركيزة. تمت قراءة العينات بواسطة قارئ لوحة Dynatech MRX بسرعة 450 نانومتر ومقارنتها بـ rhIL-8 (R & ampD) باستخدام برنامج Revelation (Dynatech Laboratories ، Chantilly ، VA).

تم قياس كمية IL-1RII باستخدام شطيرة ELISA (36). باختصار ، تم استخدام IL-1RII مضاد للبشر أحادي النسيلة (0.25 ميكروغرام / بئر) (Genzyme Diagnostics ، Cambridge ، MA) كجسم مضاد للقبض ، وتم استخدام جسم مضاد للبشر IL-1RII متعدد النسيلة لتعقيد المستضد (قدمه الدكتور مارك. Wewers). تم اكتشاف المعقد كما هو موضح أعلاه ، وتمت مقارنة العينات مع IL-1RII المؤتلف البشري. تمت قراءة اللوحات باستخدام برنامج Revelation (Dynatech).

تم قياس كمية IL-1Ra باستخدام شطيرة ELISA كما هو موضح سابقًا (37). باختصار ، تم إنشاء مضاد للبشر IL-1Ra متعدد النسيلة للأرنب ضد IL-1Ra في مختبر الدكتور ويويرز. تم استخدام هذا الجسم المضاد كجسم مضاد للقبض وتم استخدام IL-1Ra (R & ampD) الماعز المضاد للبشر كجسم مضاد للكشف عن ELISA. تم اكتشاف الجسم المضاد للماعز المرتبط باستخدام IgG المضاد للأرنب الماعز المترافق مع HRP (Sigma Diagnostics) وتم تطويره باستخدام TMB (Moss ، Inc.). تم قياس عينات غير معروفة بالمقارنة مع rhIL-1Ra.

تمت تنقية إجمالي الحمض النووي الريبي لتحليل اللطخة الشمالية والتفاعل المتسلسل العكسي للبوليميراز (RT-PCR) عن طريق تعديل طريقة Chomczynski و Sacchi (38). تم تعليق ما يقرب من 1 × 10 6 A549 أو خلايا NHBE في 1 مل من كاشف Trizol (GIBCO BRL). تم تفكيك الخلايا عن طريق الماصات المتكررة ، وتم استخلاص الحمض النووي الريبي بالكلوروفورم وترسبه باستخدام الأيزوبروبانول. تم غسل حبيبات الحمض النووي الريبي مرتين في 75٪ من الإيثانول ، وتجفيفها بالفراغ ، وإعادة تعليقها في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من الريبونوكليز. تم قياس تركيز الحمض النووي الريبي الكلي عن طريق الامتصاص عند 260/280 نانومتر (GeneQuant II Pharmacia BioTech ، Piscataway ، NJ). تم الاحتفاظ بعينات الحمض النووي الريبي المنقى عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

تم إعادة تعليق عشرة أو ثلاثين ميكروغرامًا لكل عينة من إجمالي الحمض النووي الريبي المأخوذ من خلايا A549 أو NHBE ، على التوالي ، في المخزن المؤقت لتحميل عينة الحمض النووي الريبي بنسبة 5: 1 (Sigma ، St. تم تغيير طبيعة خليط الحمض النووي الريبي عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، وتم تبريده على الجليد ، وتحميله على الفور على هلام فورمالديهايد 1٪ agarose / 2.2 M. بعد التحليل ، تم تصوير العينات الملطخة ببروميد الإيثيديوم ثم تم مسحها على أغشية النايلون (Nytran Schleicher & amp Schuell، Keene، NH) عن طريق النقل الشعري باستخدام 20 × فوسفات الصوديوم الملحي EDTA (SSPE). تم بعد ذلك تجميد الحمض النووي الريبي عن طريق الارتباط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية (GS Gene-Linker Bio-Rad). تم فحص البقع الشمالية بالتتابع باستخدام مجسات DNA التكميلية المسمى α 32 P لـ IL-8 البشري (هدية سخية من Genentech ، Inc. ، جنوب سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا) ، IL-1RII البشري (هدية سخية من د. Ueli Gubler و Hoffman LaRoche و Nutley و NJ) و glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Ambion ، Austin ، TX). باختصار ، تم إنشاء شظايا التقييد من البلازميدات المتضخمة التي تشفر IL-8 (480 زوجًا أساسيًا [bp]) و IL-1RII (100 نقطة أساس) و GAPDH (328 نقطة أساس) ، وتم حلها على هلام agarose بنسبة 1 ٪ ، ومعزول ومُسمى بواسطة تحضير عشوائي (مجموعة تصنيع مسبار DNA وإزالته Strip-EZ Ambion) مع α- 32 P deoxyadenosine triphosphate (Easytides NEN، Boston، MA). تم إجراء التهجين بين عشية وضحاها عند 42 درجة مئوية في 50 ٪ فورماميد ، 5 × SSPE ، 0.1 ٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، 2 × محلول دنهارد ، 100 ميكروغرام / مل من الحمض النووي للحيوانات المنوية من سمك السلمون المشوه ، و 1 إلى 5 × 10 6 cpm من المسمى مسبار لكل مليلتر من المخزن المؤقت للتهجين. بعد التهجين ، تم غسل البقع مرتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لكل 2 × SSPE و 0.5٪ SDS ، ومرة ​​واحدة عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في 0.1 × SSPE و 0.5٪ SDS. تم إجراء التصوير الشعاعي الذاتي بين عشية وضحاها وتحليلها كميًا في اليوم التالي باستخدام Phospho-Imager (Molecular Dynamics ، Sunnyvale ، CA).

تم عزل الحمض النووي الريبي الخلوي الكلي من كل من خطوط الخلايا A549 و NHBE كما هو موضح أعلاه. بدءًا من 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل عينة ، تمت إزالة الحمض النووي الملوث باستخدام deoxyribonuclease I (درجة التضخيم GIBCO BRL) عند تفاعل 2 U / 20 ميكرولتر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تبع ذلك إضافة 2 ميكرولتر من 25 ملي EDTA و 2 ميكرولتر من البادئات العشوائية (50 نانوغرام / ميكرولتر GIBCO BRL) وتثبيط الحرارة (70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق). تم تقسيم التفاعل إلى نصف وتم إضافة 5 × محلول مؤقت أول حبلا (GIBCO BRL) ، 2 ميكرولتر من 100 ملي ديثيوثريتول ، و 2 ميكرولتر من مزيج 10 ملي ديوكسينوكليوتيد ثلاثي فوسفات (dNTP) لكل منهما. تمت إضافة Superscript II (100 U GIBCO BRL) إلى أحد الأنبوبين وأضيف حجمًا متساويًا من الماء إلى الآخر ، لحجم نهائي قدره 20 ميكرولتر لكل تفاعل. تم إجراء النسخ العكسي عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة متبوعًا بإلغاء تنشيط الحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. لتضخيم PCR ، بوليميراز الذهب Taq (0.5 U / رد فعل) (Perkin- Elmer ، Foster City ، CA) ، 10 × عازلة تفاعل (5 ميكرولتر / رد فعل) ، 25 ملي MgCl2 (3.2 ميكرولتر / تفاعل) ، و 0.8 ميكرولتر من مزيج dNTP 10 ملي مولار مع 10 ميكرولتر من كل تفاعل RT. احتوى كل تفاعل أيضًا على أزواج من التمهيدي (2.5 × 10 3 ميكرولتر من كل تفاعل تمهيدي / 50 ميكرولتر) لأحد الإجراءات التالية: الاشعال D722-01 و D722-02 (5′-ATGCATCCTACACATACTTGG-3 و 5′-CATCTGAAGCTTTTATTGGG-3 ′ ، على التوالي) لتضخيم جزء 555-bp من بادئات IL-1RI B912-01 و B912-02 (5′-CTCTGGAAGTTGTCAGGAGC-3 ′ و 5′-TGAGGCCATAGCACAGTCAG-3 ، على التوالي) لتضخيم 1،318 تم استخدام جزء -bp من IL-1RII والبادئات IL-1RAcP-5F و IL-1RAcP-6R (5′-GTGCCAGCTCCAAGATACACAGT-3 ′ و 5′-ATGAGCAGGGCCTCTCGTATTCAT-3 ، على التوالي) لتضخيم جزء من IL-1RAcP-6R. -1 RAcP. تم استخدام تضخيم الحمض النووي الريبي لرسالة β-actin باستخدام الاشعال-actin (+) و β-actin (-) (5′-GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3 ′ و 5′-AGGGCCGGACTCATCGTACTC-3 ، على التوالي) لتضخيم جزء 950 نقطة أساس كعنصر تحكم إيجابي لكل عينة. لجميع التضخمات ، تم إجراء PCR لمدة 35 دورة (94 درجة مئوية × 1 دقيقة ، 57 درجة مئوية × 1 دقيقة ، و 72 درجة مئوية × 1 دقيقة) بحجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر. تم تأكيد هوية منتجات التضخيم عن طريق هضم إنزيم التقييد غير المتماثل. تم هضم منتجات IL-1RI RT-PCR بواسطة بامHI لإنتاج شظايا 423 و 123 نقطة أساس المتوقعة وتم هضم منتج IL-1RAcP RT-PCR باستخدام اسستأنا أعطي الشظايا المتوقعة 393 و 272 نقطة أساس.

تم توفير IL-1RII (كدنا) البشري كامل الطول ، عبر الغشاء ، في ناقل تعبير الثدييات pEF-BOS بواسطة الدكتور أولي غوبلر (هوفمان لاروش). باستخدام PCR ، تم تضخيم IL-1RII كامل الطول والمرتبط بالغشاء (14) وشكل مبتور وقابل للذوبان من IL-1RII (الأحماض الأمينية 1-296) (15). كان تكوين عينة PCR كما هو موضح أعلاه باستخدام الاشعال التالية: الاشعال mIL1RII-F (5′-GGCAAGCTTCCACCATGTتم استخدام TGCGCTTGTACGTGTTG-3) و mIL1RII-R (5′-GGCTCTAGAATCATCACTTGGGATAGGATTG-3 ′) لتضخيم بنية IL-1RII المرتبطة بالغشاء. بالنسبة للبناء IL-1RII القابل للذوبان ، تم استخدام الاشعال mIL1RII-F و sIL1RII-R (5′-GGCTCTAGAATCATTACTGGCGTGGCCCCTC-3). تحتوي البادئات على تسلسل إجماع كوزاك (كما هو موضح أعلاه) وفريدة من نوعها 5′-هينdIII و 3′-Xbaأنا المواقع المرافقة. بعد هضم القيد مع هينdIII و Xbaأنا ، تم استنساخ الأجزاء المضخمة بشكل مباشر في ناقل تعبير الثدييات pRc / CMV (Invitrogen ، Carlsbad ، CA). تم تحويل التركيب المعبر عن IL-1RII المرتبط بالغشاء (pRcCMV-mIIR) والبنية المعبرة عن IL-1RII القابلة للذوبان (pRcCMV-sIIR) إلى بكتريا قولونية (TOP 10F ′ Invitrogen) عن طريق التثقيب الكهربائي وتضخيمه في وسط LB (مختبرات ديفكو) الذي يحتوي على الأمبيسلين بتركيز 100 ميكروغرام / مل. بعد التحديد الإيجابي عن طريق تحليل التقييد ، تمت تنقية البلازميدات باستخدام مجموعة عازلة Endofree Giga Plasmid Prep (Qiagen ، سانتا كلاريتا ، كاليفورنيا) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة.

تم بعد ذلك استخدام بلازميدات التحكم pRcCMV-mIIR و pRcCMV-sIIR و pRcCMV لنقل خلايا A549 بشكل عابر باستخدام كاشف تعداء Transfection Transit-LT2 (PanVera Corp. ، Madison ، WI). تم إجراء عمليات التحويل وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة باستخدام ظروف تعداء محسنة مسبقًا. باختصار ، تم طلاء 3 × 10 5 خلايا A549 لكل لوحة من ستة آبار في وسط نمو كامل. في اليوم التالي ، تم خلط 2 ميكروغرام من pRcCMV-mIIR أو pRcCMV-sIIR أو ناقل pRcCMV وحده مع 25 ميكرولتر من كاشف TransIT-LT2 في وسط خالٍ من المصل Opti-MEM I (GIBCO BRL) وتم السماح له بالتعقيد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. خلال هذا الوقت ، تم شطف الخلايا مرتين باستخدام وسيط Opti-MEM I ثم تغطيتها بـ 2 مل من وسط خالٍ من المصل. تم وضع الحمض النووي المعقد فوق الخلايا واحتضانه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون2. في هذه المرحلة ، تم استنشاق الوسط واستبداله بـ 2 مل من وسط النمو الكامل. تم تحضين الخلايا لمدة 72 ساعة إضافية قبل إضافة IL-1β بتركيز 50 بيكوغرام / مل. مباشرة قبل إضافة IL-1β ، تم استرداد قسمة من الوسط لتحليل تركيز IL-1RII بواسطة ELISA. أخيرًا ، تم تحضين الخلايا المصابة بالعدوى المنقولة والمراقبة لمدة 12 ساعة إضافية في وجود IL-1β قبل إزالة المواد الطافية الخالية من الخلايا وقياسها لـ IL-8 بواسطة ELISA.

يتم التعبير عن جميع البيانات كوسائل ± SEM. تم استخدام تحليل التباين (ANOVA) مع اختبار Tukey للفرق المهم بصدق (HSD) لمقارنة استجابة جرعة IL-1β في خلايا A549 و NHBE (Systat ، Evanston ، IL). تم تعريف الدلالة الإحصائية على أنها ص ⩽ 0.05. العينة المستقلة ر تم استخدام الاختبار لمقارنة تركيزات IL-1Ra في خلايا NHBE. تم تعريف الدلالة الإحصائية على أنها ص ⩽ 0.001.

في ظل ظروف الثقافة القياسية ، تم تحضين خلايا A549 و NHBE لمدة 24 ساعة مع زيادة تركيزات IL-1β لتحديد استجابتها فيما يتعلق بإطلاق IL-8. تم قياس كمية IL-8 في المواد الطافية الناتجة الخالية من الخلايا بواسطة ELISA. تم العثور على كل من خلايا A549 وخلايا NHBE تستجيب لـ IL-1β في نطاق picomolar (حوالي 3 و 30 pmol ، على التوالي الشكلان 1 أ و 1 ب). على وجه الخصوص ، أظهرت خلايا A549 زيادة سريعة وملحوظة في إطلاق IL-8 عند تحفيزها بأقل من 50 بيكوغرام / مل من IL-1β ، في حين أظهرت خلايا NHBE زيادة كبيرة في إطلاق IL-8 بجرعة 500 بيكوغرام /. مل من IL-1β. عندما تم قياس إطلاق IL-1 المستحث بـ IL-8 كدالة للوقت ، أطلقت خلايا A549 كمية ملحوظة من IL-8 (3.81 ± 0.47 نانوغرام / مل) في أقل من 4 ساعات بعد إضافة IL-1β ( 50 بيكوغرام / مل) (الشكل 1 ج). استمرت كمية إنتاج IL-8 في الزيادة طوال التجربة. لم يتم إجراء تجارب الاستجابة الزمنية مع خلايا NHBE.

الشكل 1. تأثير IL-1β على إطلاق IL-8 في الخلايا الظهارية في الرئة. (أ) A549 ( الدوائر المملوءة) و (ب) NHBE (دوائر مفتوحة) تم تحفيز الخلايا بتركيزات متزايدة من IL-1β (من 0 إلى 5 نانوغرام / مل ومن 0 إلى 50 نانوغرام / مل ، على التوالي) لمدة 24 ساعة. تم جمع المواد الطافية الخالية من الخلايا ومعايرتها لـ IL-8 بواسطة ELISA. يتم التعبير عن جميع البيانات كوسائل ± SEM. تم استخدام ANOVA مع اختبار HSD لـ Tukey لمقارنة استجابة جرعة IL-1β في خلايا A549 و NHBE (Systat). تم تعريف الدلالة الإحصائية على أنها ص ⩽ 0.05 (*). (ج) تم تحفيز خلايا A549 باستخدام IL-1β بتركيز 50 بيكوغرام / مل ، وتم حصاد المواد الطافية الخالية من الخلايا عند 0 و 1 و 2 و 4 و 8 و 24 ساعة وتم قياسها لـ IL-8 بواسطة ELISA.

للتأكد من أن الذيفان الداخلي لم يكن مصدرًا للتلوث في دراساتنا ، أجريت تجارب مماثلة حيث تم تحضين خلايا A549 و NHBE بجرعات متزايدة من LPS (0 إلى 1 ميكروغرام / مل). لم يُظهر أي نوع من الخلايا زيادة ملحوظة في إنتاج IL-8 على مستوى الخلفية ، بغض النظر عن جرعة LPS (البيانات غير معروضة). لذلك ، في ظل الظروف التي تم اختبارها ، لم يتأثر إطلاق A549 و NHBE IL-8 بتلوث أثر الذيفان الداخلي الموجود في وسط المزرعة أو ، على وجه الخصوص ، نواقل DNA البلازميد المستخدمة في الدراسات اللاحقة.

في البداية ، نمت خلايا A549 و NHBE في ظل ظروف ثقافة قياسية ودُرست لإطلاق IL-1RII القابل للذوبان في طاف الخلية. تمت زراعة خلايا NHBE باستخدام BEGM مع الهيدروكورتيزون وبدونه لأن الدراسات السابقة أظهرت تنظيم إطلاق IL-1RII القابل للذوبان في الخلايا الوحيدة والعدلات بعد العلاج بالديكساميثازون (20 ، 39). عولجت الخلايا أيضًا بين عشية وضحاها باستخدام IL-1β كما هو موصوف سابقًا ، وتمت مراقبتها من أجل تنظيم تعبير بروتين IL-1RII. بعد الزرع بين عشية وضحاها ، تم حصاد المواد الطافية الخالية من الخلايا ومحللات الخلية وتحليلها لبروتين IL-1RII بواسطة ELISA. تحت جميع الظروف التي تمت دراستها ، لا يمكن اكتشاف IL-1RII في خلايا A549 أو NHBE. كعنصر تحكم إيجابي ، تم قياس إطلاق IL-1RII من PBMC البشري المعزول حديثًا والذي عولج طوال الليل باستخدام LPS وديكساميثازون كما هو موضح سابقًا (40). كان IL-1RII القابل للذوبان قابلاً للاكتشاف في المواد الطافية الخالية من الخلايا (الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك ، تم تحفيز خلايا A549 باستخدام IL-4 و IFN-و dexamethasone ، وتم قياسها لإطلاق IL-1RII ، لأن الدراسات السابقة أظهرت إطلاق IL-1RII بواسطة هذه العوامل (13 ، 16 ، 19-21). في كل حالة ، لا يمكن اكتشاف IL-1RII في المواد الطافية الخالية من الخلايا (البيانات غير معروضة).

الجدول 1. عدم وجود تعبير بروتين IL-1RII في خلايا A549 و NHBE

تم تحضين خلايا A549 و NHBE طوال الليل في ظل ظروف الثقافة القياسية مع أو بدون تحفيز IL-1β كما هو موضح في المواد والطرق. في اليوم التالي ، تم حصاد المواد الطافية الخالية من الخلايا (S) ومحللات الخلية (L) وقياسها لبروتين IL-1RII بواسطة ELISA. تمت دراسة NHBE باستخدام وسط مع (+) وبدون (-) إضافة الهيدروكورتيزون (HC). كعنصر تحكم إيجابي ، تمت تربية PBMC البشري المعزول حديثًا طوال الليل باستخدام ديكساميثازون (10 −7 م) و LPS (1 ميكروغرام / مل)

* تم قياس المواد الطافية الخالية من الخلايا لبروتين IL-1RII بواسطة ELISA. تمثل النتائج من PBMC متوسط ​​± SEM لأربعة مواضيع. اختصار الثاني.= لم ينته.

تم إظهار التعبير عن النوع I icIL-1Ra في NHBE وخطوط خلايا الرئة ذات الصلة كبروتين يحتفظ به العصارة الخلوية. ومع ذلك ، فقد أثبتت الأدلة الحديثة إطلاق هذا الجزيء من الخلايا الظهارية لمجرى الهواء البشري (13). أجرينا دراسات لتحديد كمية النوع I icIL-1Ra المحتفظ بها في الخلية ، وعلى وجه الخصوص ، كمية IL-1Ra التي تم إطلاقها في المقصورة خارج الخلية في ظل ظروف دراستنا. لتحقيق ذلك ، نمت كل من خلايا A549 وخلايا NHBE في ظل ظروف الثقافة القياسية. تم تحفيز خلايا A549 باستخدام IL-1β (50 بيكوغرام / مل) و IL-4 (10 إلى 30 نانوغرام / مل) و IFN-(250 و 500 وحدة / مل) وديكساميثازون (1 × 10 7 م) ، بينما تم تحفيز خلايا NHBE باستخدام IL-1β وحده (500 بيكوغرام / مل). في اليوم التالي ، تم قياس المواد الطافية الخالية من الخلايا و / أو lysates الخلوية لمحتوى IL-1Ra بواسطة ELISA. في خلايا A549 التي تم تحفيزها باستخدام IL-1β ، تم اكتشاف كل IL-1Ra في جزء محلول الخلية من العينة (115 ± 5.4 بيكوغرام / مل الشكل 2 ، اللوحة العلوية) ، والتي لم تتأثر بمعالجة IL-1β (121 ± 19.3 بيكوغرام / مل). على أساس العمل السابق من قبل الآخرين ، ولأن ELISA لا يمكنها التفريق بين الأشكال الإسوية المختلفة ، فإننا نفترض أن هذا هو النوع I icIL-1Ra (12 ، 13). لم يتم اكتشاف IL-1Ra في المواد الطافية لخلايا A549 التي تم تحفيزها باستخدام IL-4 أو IFN-أو dexamethasone (البيانات غير معروضة).

التين. 2. تعبير IL-1Ra في الخلايا الظهارية في الرئة. (اللوحة العلوية) A549 و (اللوحة السفلية) تم تحضين خلايا NHBE لمدة 24 ساعة تحت ظروف الثقافة القياسية مع ( الأعمدة المملوءة) أو بدون (أعمدة مفتوحة) تحفيز IL-1β كما هو موضح سابقًا. في اليوم التالي ، تم حصاد المواد الطافية الخالية من الخلايا ومحللات الخلية وقياسها من أجل IL-1Ra بواسطة ELISA. تمت دراسة خلايا NHBE باستخدام وسط مع وبدون إضافة الهيدروكورتيزون. يتم تقديم النتائج كوسائل ± SEM لعينات ثلاثية وتمثل تجربتين منفصلتين. العينة المستقلة ر تم استخدام الاختبار لمقارنة تركيزات IL-1Ra في خلايا NHBE. تم تعريف الدلالة الإحصائية على أنها ص ⩽ 0.001 (*).

تم اكتشاف IL-1Ra في المواد الطافية من كل من خلايا NHBE غير المحفزة و IL-1β (393 ± 26.4 و 591 ± 30.2 بيكوغرام / مل ، على التوالي) ، ومع ذلك ، تم اكتشاف ما يقرب من 10 أضعاف كمية IL-1Ra في محللات الخلية عندما مقارنة مع طاف الخلية (6.2 ± 0.9 و 5.9 ± 0.4 نانوغرام / مل ، على التوالي الشكل 2 ، اللوحة السفلية). على غرار النتائج التي تم الحصول عليها من خلايا A549 ، لم يغير التحفيز باستخدام IL-1β بشكل كبير إجمالي IL-1Ra الموجود في خلايا NHBE. ومع ذلك ، تسبب IL-1β في زيادة ذات دلالة إحصائية في إطلاق IL-1Ra (ص ين ياباني 0.001). بالمقارنة مع خلايا A549 ، أنتجت خلايا NHBE كمية أكبر بكثير من IL-1Ra. تشير نتائجنا إلى أنه في ظل ظروفنا ، يظل IL-1Ra مرتبطًا إلى حد كبير بالخلايا ولا يتم إطلاقه بتركيز عالٍ في الخلايا الظهارية للرئة في ظل الظروف الأصلية أو عند تحفيزها باستخدام IL-1β.

بعد ذلك ، أجريت تجارب لتقييم الكفاءة النسبية لمثبطات IL-1 المعروفة لمنع إطلاق IL-8 الناجم عن IL-1β في الخلايا الظهارية لمجرى الهواء. في تجاربنا ، تم تحفيز خلايا A549 باستخدام IL-1β (50 بيكوغرام / مل) التي تم تحضينها مسبقًا بجرعات زائدة فردية متفاوتة ومجموعات من مثبطات IL-1 القابلة للذوبان ، بما في ذلك IL-1RI و IL-1RII و IL. -1Ra. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، تم جمع المواد الطافية الخالية من الخلايا ومعايرتها لإطلاق IL-8. لم يؤثر الحجب الذي يحتوي على 10 إلى 1000 ضعف من فائض المولي من IL-1RI القابل للذوبان على إنتاج IL-8 الناجم عن IL-1β عند مقارنته بالتحفيز مع IL-1β وحده (10.6 ± 0.4 إلى 8.6 ± 0.3 مع IL-1RI مقابل 9.8 ± 0.2 عنصر تحكم الشكل 3 أ). تم تحقيق تثبيط كبير لإنتاج IL-8 إما بزيادة 1000 ضعف من IL-1RII القابل للذوبان (1.66 ± 0.32 نانوغرام / مل) أو زيادة 100 ضعف من IL-1Ra (1.66 ± 0.97 نانوغرام / مل). تظهر نتائجنا أن الزيادة المولية الكبيرة لمثبطات IL-1 الفردية ضرورية لمنع إطلاق IL-8. علاوة على ذلك ، يعتبر IL-1Ra مثبطًا أكثر فعالية لإطلاق IL-8 المستحث بإنترلوكين IL-8 مقارنة بـ IL-1RII. على الرغم من أن معالجة IL-1RII و IL-1Ra وحدها تمنع إطلاق IL-8 بشكل فعال ، إلا أن تثبيط إطلاق الكيموكين لم يتحسن بشكل كبير عن طريق الجمع بين 1000 ضعف من فائض المولي من IL-1RII القابل للذوبان و 100 ضعف فائض من IL- 1Ra (الشكل 3 ج). تأكيدًا للنتائج السابقة ، عندما تم الجمع بين IL-1Ra و IL-1RI ، تم استعداء قدرة IL-1Ra على تقليل إنتاج IL-8.

الشكل 3. تأثير IL-1Rs القابل للذوبان و IL-1Ra على إطلاق IL-8 الناجم عن IL-1β. (أ) A549 و (ب) تم تحفيز خلايا NHBE باستخدام IL-1β (50 و 500 بيكوغرام / مل ، على التوالي) مع أو بدون إضافة 10 أو 100 أو 1000 ضعف من فائض المولي من IL-1RI القابل للذوبان ( الدوائر المملوءة) ، IL-1RII (دوائر مفتوحة) أو IL-1Ra ( الماس المعبأ). بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، تم حصاد المواد الطافية الخالية من الخلايا وقياسها لإطلاق IL-8 بواسطة ELISA. يتم عرض النتائج كبيانات تمثيلية من ثلاث تجارب منفصلة. تم إجراء تجارب مماثلة في (ج) A549 و (د) خلايا NHBE مع مجموعات مقترنة من المثبطات الفردية حيث تم استخدام 100 ضعف فائض من IL-1Ra بمفرده أو مع زيادة 100 أو 1000 ضعف من IL-1RI و IL-1RII كما هو موضح في ذ-محور. يتم تقديم النتائج كوسائل ± SEM لعينات ثلاثية وتمثل ثلاث تجارب منفصلة. المستوى الأساسي لإنتاج IL-8 في خلايا A549 (أ و ج) كان 0.469 ± 0.075 نانوغرام / مل وفي خلايا NHBE (ب و د) كان 0.296 ± 0.173 نانوغرام / مل.

تم الحصول على نتائج مماثلة من خلال الدراسات التي شملت خلايا NHBE ، ومع ذلك ، كانت الجرعات الزائدة المولية المماثلة لمثبطات IL-1 القابلة للذوبان أكثر فعالية في منع إطلاق IL-8 من خلايا NHBE مقارنة بخط الخلية A549 (الشكل 3 ب). قد يكون هذا بسبب حقيقة أن خطوط الخلايا تحتوي بشكل عام على عدد أكبر من IL-1RI على سطح الخلية مقارنة بالخلايا الأولية (1). أيضًا ، على عكس النتائج التي تم الحصول عليها من خلايا A549 ، لوحظ تثبيط إنتاج IL-8 عند إضافة جرعات زائدة من المولي من IL-1RI القابل للذوبان. في الواقع ، خفض IL-1RI 1000 مرة مستوى IL-8 تقريبًا إلى مستوى التحكم غير المعالج (0.37 ± 0.07 نانوغرام / مل مقابل 0.30 ± 0.17 نانوغرام / مل). كانت IL-1RII و IL-1Ra القابلة للذوبان مرة أخرى مثبطات فعالة. ومع ذلك ، تم تحقيق تثبيط كبير لإنتاج IL-8 مع أقل من IL-1RII و IL-1Ra (100 و 10 أضعاف ، على التوالي) مما هو مطلوب مع خط الخلية A549. على غرار خلايا A549 ، فإن إضافة IL-1RI بالاشتراك مع IL-1RII لا يزيد من القدرة على منع إطلاق IL-8 (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، فإن إضافة الفائض من IL-1RI إلى IL-1Ra يتداخل مع قدرة مضاد المستقبلات على منع إشارات IL-1β حيث أن الكمية المقاسة لـ IL-8 تزيد عن الضعف عند مقارنتها بزيادة مضاعفة بمقدار 100 ضعف. IL-1Ra وحده (الشكل 3 د). كما هو موضح ، كانت هناك حاجة إلى زيادة 10 إلى 100 ضعف من IL-1Ra لتثبيط إطلاق IL-8 الناجم عن IL-1 ، وبالتالي ، فإن إطلاق IL-1Ra الداخلي بواسطة خلايا NHBE (كما هو موضح في الشكل 2 ب) ربما كان غير كافٍ لمنع إطلاق IL-8. تشير هذه النتائج معًا إلى أن الإنتاج المحلي لمستقبلات IL-1 من النوع II و IL-1Ra ، عند وجود فائض جزيئي نسبي ، يثبط استجابة الخلايا الظهارية الرئوية لـ IL-1β كما تم قياسه بإطلاق IL-8. ومع ذلك ، يبدو أن IL-1RI القابل للذوبان يساهم بدرجة أقل بكثير ، وفي الواقع ، قد يتداخل مع تثبيط IL-1β عن طريق استعداء IL-1Ra القابل للذوبان من الارتباط بـ IL-1RI على سطح الخلية.

افترضنا أن انخفاض إفراز IL-8 بواسطة خلايا A549 و NHBE التي عولجت بمثبطات IL-1 القابلة للذوبان نتجت عن المنافسة المباشرة مع مستقبل تحويل إشارة IL-1RI الأصلي. على هذا النحو ، توقعنا أن انخفاض إطلاق IL-8 كان نتيجة مباشرة لانخفاض نقل الإشارة بوساطة IL-1 وبالتالي التعبير الجيني IL-8. لاختبار ذلك ، تم إجراء تحليل اللطخة الشمالية باستخدام مجموع الحمض النووي الريبي المعزول من خلايا A549 و NHBE. تم علاج الخلايا طوال الليل بـ IL-1β في غياب أو وجود مثبطات IL-1 ، كما هو موضح سابقًا. كما هو متوقع ، في كل من خلايا A549 و NHBE ، تم الكشف عن زيادة في IL-8 messenger RNA (mRNA) في العينات التي تم علاجها باستخدام IL-1β مقارنة بتلك التي لم تكن كذلك (الشكل 4).

الشكل 4. تأثير IL-1Rs القابل للذوبان و IL-1Ra على التعبير الجيني IL-1β المستحث بـ IL-8. تم تحفيز خلايا A549 و NHBE باستخدام IL-1β (50 و 500 بيكوغرام / مل ، على التوالي) مع أو بدون إضافة فائض جزيئي من IL-1RI المؤتلف القابل للذوبان (100 و 1000 مرة) ، IL-1RII (1000- أضعاف) ، و IL-1Ra (100 ضعف). بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي وتحليله بواسطة تحليل لطخة شمالية باستخدام مسبار (كدنا) المسمى بـ 32 P لـ IL-8 البشري ، متبوعًا بمسبار (كدنا) لـ GAPDH البشري المعبر عنه بشكل أساسي.

في كلا النوعين من الخلايا ، تم أيضًا فحص العينات التي تم تحفيزها باستخدام مثبطات IL-1β بالإضافة إلى مثبطات IL-1 القابلة للذوبان. وفقًا للنتائج التي تم الحصول عليها من ELISA ، لم يكن هناك انخفاض كبير في تعبير IL-8 mRNA المستحث بـ IL-1β في خلايا A549 عولجت ب 100 إلى 1000 ضعف من فائض المولي من IL-1RI القابل للذوبان (الشكل 4). أدى احتضان خلايا A549 في وجود IL-1β بالإضافة إلى زيادة مقدارها 1000 ضعف من IL-1RII أو زيادة 100 ضعف من IL-1Ra إلى انخفاض كبير في تعبير رسالة IL-8 عند مقارنتها بـ IL-1β العلاج وحده. تم الحصول على نتائج مماثلة مع خلايا NHBE التي تم علاجها بـ IL-1RII أو IL-1Ra (الشكل 4). ترتبط نتائج تحليل اللطخة الشمالية جيدًا بدراساتنا السابقة التي تظهر انخفاضًا في إطلاق بروتين IL-8 ، وتشير إلى أن انخفاض إطلاق IL-8 عن طريق إضافة IL-1RII أو IL-1Ra يرجع إلى تثبيط إشارة IL-1 التنشيط والنسخ الجيني النشط.

بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل نفس العينات المأخوذة من خلايا A549 و NHBE باستخدام ترميز مسبار (كدنا) جزئي لـ IL-1RII البشري (البيانات غير معروضة). تمشيا مع عدم وجود تعبير بروتين IL-1RII ، لم يتم اكتشاف mRNA لـ IL-1RII في أي من العينات ، بينما أظهر التهجين باستخدام مسبار GAPDH البشري إشارة قوية بكثافة مماثلة في جميع العينات.

كشف التحليل الأولي لخلايا A549 و NHBE عن عدم وجود IL-1RII قابل للقياس. لتأكيد عدم وجود تعبير IL-1RII ، تم إجراء تحليل RT-PCR لنسخة IL-1RII. تم استخدام الحمض النووي الريبي المعزول من خلايا HepG2 ، وهو خط خلوي معروف للتعبير عن شكل الغشاء لـ IL-1RII ، كعنصر تحكم إيجابي (41). لا يمكن الكشف عن نصوص IL-1RII في خلايا A549 أو NHBE ، بغض النظر عن ظروف الثقافة. أسفر العلاج بـ IL-1β أو الهيدروكورتيزون عن نتائج مماثلة ، مما يشير إلى أن أياً من العاملين لم يتسبب في التعبير عن IL-1RII (الشكل 5). خدم الاشعال ل β-actin البشري كعنصر تحكم إيجابي لتفاعلات RT لكل عينة لإثبات سلامة الحمض النووي الريبي. على أساس نتائجنا ، نستنتج أن خلايا A549 و NHBE معيبة في قدرتها على التعبير عن IL-1RII الذي يساهم في استجابتها الحساسة لـ IL-1.

الشكل 5. تحليل تعبير IL-1RI و IL-1RacP و IL-1RII بواسطة RT-PCR. نمت خلايا NHBE في ظل ظروف الثقافة القياسية وأجري RT-PCR على 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي. تم تشغيل كل عينة بالتوازي مع (RT +) (الممر 1) وبدون (RT−) (الممر 2) RT. المنتجات المضخمة من الممر 1 تم هضمها أيضًا باستخدام إنزيمات تقييدية (الممر 3) لإنتاج أجزاء التقييد المتوقعة ، وبالتالي تأكيد الهوية. تمت مقارنة PCR لكل زوج تمهيدي أيضًا مع عنصر تحكم إيجابي مناسب (الممر 4) على النحو التالي: تمت مقارنة IL-1RI مع تضخيم PCR لـ IL-1RI cDNA IL-1RAcP البشري مع تضخيم PCR لـ IL-1RAcP cDNA و IL-1RII البشري مع RT-PCR من إجمالي الحمض النووي الريبي المأخوذ من خلايا HepG2 ، وهي خلية خط معروف للتعبير عن IL-1RII. أخيرًا ، تم تحليل كل عينة من الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها بالتوازي مع أزواج التمهيدي التي تضخيم منتج 950 نقطة أساس للأكتين البشري (الممر 5، RT + حارة 6، RT−). تم استخدام أزواج التمهيدي لـ IL-1RI التي تضخمت منتجًا بقوة 555 نقطة أساس يمكن هضمه إلى شظايا متوقعة 423 و 123 نقطة أساس باستخدام باممرحبًا ، بالنسبة لـ IL-1RacP الذي يضخم منتجًا بقوة 665 نقطة أساس يمكن هضمه إلى شظايا 393 و 272 نقطة أساس متوقعة باستخدام اسستتم تصميم I و IL-1RII لتضخيم منتج بقوة 1،318 نقطة أساس. يتم عرض النتائج كبيانات تمثيلية من ثلاث تجارب منفصلة. تم الحصول على نتائج متطابقة مع خلايا A549 (البيانات غير معروضة).

لتوضيح دور إشارات IL-1β في ظهارة الرئة فيما يتعلق بأفراد عائلة مستقبلات IL-1 ذات الصلة ، تم اختبار عينات RNA نفسها بشكل أكبر بواسطة RT-PCR لوجود كل من IL-1RI و IL-1RAcP. كما هو متوقع ، بناءً على التجارب السابقة التي تُظهر حساسية رائعة لخلايا A549 و NHBE تجاه IL-1β ، تُظهر نتائجنا أن خلايا A549 و NHBE تعبر بشكل أساسي عن mRNA لـ IL-1RI ، كما يتضح من تضخيم جزء الحمض النووي بالحجم الصحيح تم تأكيد هويته عن طريق هضم إنزيم التقييد (الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ وجود جزء من الحمض النووي المتضخم يتوافق مع IL-1RAcP في خلايا A549 و NHBE في ظل ظروف غير محفزة و IL-1β - محفزة. تؤكد نتائجنا أن خلايا A549 و NHBE تستجيب لـ IL-1β بتركيزات منخفضة نسبيًا ، وهذا يرجع جزئيًا إلى التعبير التأسيسي لـ IL-1RI و IL-1RAcP.

أظهر العمل السابق أن الارتباط بالجليكوزيل لمستقبلات IL-1 المثبطة والقابلة للذوبان ، جنبًا إلى جنب مع موقع المستقبل (خارج الخلية مقابل المرتبط بالغشاء) ، قد يؤثر على فعاليتها في حصار IL-1 (42 ، 43). لذلك ، على الرغم من محدودية تعداء العدوى في خط الخلية A549 ، افترضنا أن الإفراط في التعبير عن الغشاء و / أو بروتين IL-1RII القابل للذوبان بواسطة خلايا A549 قد يعزز القدرة على تنظيم إطلاق IL-8 بوساطة IL-1β. لإنجاز هذه المهمة ، تم إنشاء ناقلات التعبير عن الثدييات لترميز بروتينات IL-1RII المرتبطة بالغشاء والقابلة للذوبان المعينة pRcCMV-mIIR و pRcCMV-sIIR ، على التوالي ، في مختبرنا واستخدمت للإفراط في التعبير عن كل من بروتينات المستقبل بشكل عابر في خلايا A549. في تجاربنا الأولية ، أظهرت المواد الطافية الخالية من الخلايا والمحللات الخلوية المأخوذة من خلايا A549 الأصلية والناقلات المنقولة فقط عدم وجود أي بروتين IL-1RII يمكن اكتشافه بواسطة ELISA. أظهر lysates الخلية والثقافة الطافية التي تم الحصول عليها من خلايا A549 المنقولة بواسطة pRcCMV-mIIR أو pRcCMV-sIIR كمية ملحوظة من IL-1RII خلال 24 ساعة بعد تعداء (الشكل 6 ، اللوحة العلوية).

الشكل 6. تأثير الإفراط في التعبير عن IL-1RII على إطلاق IL-8 في خلايا A549. نمت خلايا A549 في ظل ظروف استزراع قياسية وتم نقلها بشكل عابر باستخدام نواقل التعبير عن الثدييات بما في ذلك pRcCMV كعنصر تحكم سلبي pRcCMV-mIIR ، والذي يرمز إلى بروتين IL-1RII كامل الطول الذي يمتد عبر الغشاء و pRcCMV-sIIR ، والذي يرمز إلى مقطوع. ، بروتين IL-1RII قابل للذوبان. تم حصاد قسامة من وسط الثقافة بعد 72 ساعة من تعداء وتم قياسها لـ IL-1RII في مواد طافية خالية من الخلايا بواسطة ELISA (اللوحة العلوية). في نفس النقطة الزمنية ، تم رفع الوسط بـ IL-1β (50 جزء من الغرام / مل) واحتضانه لمدة 12 ساعة. في اليوم التالي ، تم تحليل المواد الطافية الخالية من الخلايا لـ IL-8 بواسطة ELISA (اللوحة السفلية).

بعد ذلك ، أجرينا نفس تجارب تعداء الخلايا ، وسمحنا للخلايا بالبقاء في ثقافة ثابتة لمدة 3 أيام بعد تعداء العدوى ، ثم حضنت الخلايا والوسط المكيف بـ IL-1β (50 بيكوغرام / مل) لمدة 12 ساعة. على الرغم من إنتاج IL-1RII القابل للكشف المناعي مع كل من التركيبات pRcCMV-mIIR و pRcCMV-sIIR ، لم يتم منع إطلاق IL-8 الناجم عن IL-8 (الشكل 6 ب). علاوة على ذلك ، كان للترنس تأثير إيجابي على إطلاق IL-8 بالإضافة إلى ذلك الناجم عن IL-1 ، كما يتضح من التحكم في ناقلات الأمراض (الشكل 6 ، اللوحة السفلية). بالمقارنة مع التجارب التي تم وصفها بالفعل ، والتي تمت فيها إضافة IL-1RII القابلة للذوبان خارجيًا إلى خلايا A549 لمنع IL-1β ، أنتج الإنتاج الأصلي لـ IL-1RII في خلايا A549 المنقولة بشكل عابر زيادة من 3 إلى 5 أضعاف من IL- 1RII. هذا أقل بكثير من جرعة IL-1RII المؤتلف اللازمة لمنع إطلاق IL-8. تشير نتائجنا معًا إلى أن الإنتاج الأصلي لبروتين IL-1RII في شكل قابل للذوبان أو مرتبط بالغشاء لا يعزز بشكل كبير من فاعلية حصار IL-1.

تم اعتبار IL-1β وسيطًا مركزيًا للالتهاب في مجموعة متنوعة من اضطرابات الرئة. ينتج عن الإنتاج المفرط لـ IL-1β وإطلاقه بواسطة البلاعم السنخية تنشيط خلايا مجرى الهواء المتني المحيطة والتي بدورها تطلق مواد كيميائية قوية ، مثل IL-8 و monocyte chemotactic protein-1 ، القادرة على تجنيد الخلايا الالتهابية (1). -5 ، 7). بالإضافة إلى تعزيز تجنيد الخلايا الالتهابية في مجرى الهواء ، يمكن أن يحفز IL-1β الخلايا الظهارية للرئة على إطلاق عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة (GM-CSF) وعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF). يمكن أن يمنع GM-CSF و M-CSF المشتق من الخلايا الظهارية الرئوية موت الخلايا المبرمج للخلايا الالتهابية الموجودة في مجرى الهواء ويعزز احتباس الخلايا وبالتالي يساهم في تطور مرض الرئة المزمن (6-9). علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي تنشيط الخلايا الظهارية بواسطة IL-1 إلى إفراز عوامل النمو التي تسبب تكاثر الخلايا الليفية ، وإنتاج الكولاجين ، وإعادة تشكيل مجرى الهواء السفلي ، وكلها تساهم في مرض الرئة التدريجي (1 ، 22 ، 23). تؤكد نتائجنا الحساسية الرائعة لكل من A549 والخلايا الظهارية الشعب الهوائية الأولية البشرية لـ IL-1β. علاوة على ذلك ، فإن نتائجنا هي الأولى التي توضح أن IL-1RI و IL-1RAcP ، وهما ضروريان لتضخيم إشارة IL-1 ، يتم التعبير عنها بشكل أساسي في الخلايا الظهارية في الرئة. ينتج عن تعايش كلا العاملين تضخيم إشارة IL-1 في الخلايا الظهارية للرئة وزيادة واضحة في إطلاق IL-8. من المثير للاهتمام ملاحظة أن النتائج الأولية التي تم الحصول عليها باستخدام خلايا NHBE تُظهر تحريض تعبير IL-1RAcP مع علاج IL-1β (البيانات غير معروضة) ، مما يشير إلى أن IL-1β قد يعزز إشاراته الخاصة في ظهارة الرئة بطريقة paracrine. يدعم هذا العمل أيضًا تنشيط IL-1β للخلايا الظهارية في الرئة كمسار حاسم في تجنيد الخلايا المناعية والاحتفاظ بها من الأوعية الدموية إلى مجرى الهواء الرئوي. ومع ذلك ، فإنه يحدد أيضًا نقصًا نسبيًا في فهمنا لتنظيم IL-1β خارج الخلية في البيئة المكروية لمجرى الهواء.

حاليًا ، هناك ثلاثة مثبطات داخلية معروفة لـ IL-1β والتي من المحتمل أن تنظم النشاط الحيوي لـ IL-1 في مجرى الهواء. تتضمن هذه العوامل IL-1RI القابل للذوبان ، IL-1RII المرتبط بالغشاء والقابل للذوبان ، وعائلة جزيئات IL-1Ra. تربط كل من مستقبلات IL-1RI القابلة للذوبان ومستقبلات IL-1RII IL-1β و IL-1α و IL-1Ra ولكن مع تقاربات مختلفة بوضوح ، مما يشير إلى دور مميز لكل جزيء في تعديل IL-1 (1). يربط IL-1RI القابل للذوبان IL-1Ra بأكبر قدر من التقارب ، يليه IL-1α ثم IL-1β.في المقابل ، فإن مستقبل النوع الثاني يربط IL-1β بأكبر قدر من التقارب ، يليه IL-1α ثم IL-1Ra (1). الأهم من ذلك ، أن جميع الدراسات التي أجريت على الأشكال الإسوية لبروتين IL-1RII قد أثبتت دورها كمستقبل للطعم المثبط لـ IL-1 (1 ، 16 ، 19 ، 21 ، 22). أخيرًا ، يوجد IL-1Ra كثالثة أنواع وظيفية مختلفة يمكنها التنافس مباشرة مع IL-1 للارتباط بمستقبلات IL-1 (11). الأكثر صلة بدراساتنا هو النوع I icIL-1Ra ، والذي تم الإبلاغ عنه سابقًا أنه يتم التعبير عنه بواسطة الخلايا الظهارية للرئة (12) ويمكن إطلاقه استجابةً للسيتوكينات المختلفة ، وبالتالي يخفف من نشاط IL-1 خارج الخلية (13). تظهر نتائجنا أن كل مثبط فردي ، في شكل مؤتلف قابل للذوبان ، يمكن أن يمنع إطلاق IL-8 الناجم عن IL-1β بطريقة متسقة مع كل من خلايا A549 و NHBE. كان IL-1Ra مثبطًا فائقًا لنشاط IL-1β ، يليه IL-1RII القابل للذوبان ثم IL-1RI القابل للذوبان ، والذي كان له نشاط تثبيط أقل بشكل ملحوظ. عندما تمت دراسة التوليفات المزدوجة من المثبطات الثلاثة في وجود IL-1β ، لوحظ نقص في النشاط التآزري (خاصة مع IL-1Ra و IL-1RII). علاوة على ذلك ، حدث انعكاس للنشاط المثبط لـ IL-1Ra عندما كان IL-1RI موجودًا. النتيجة الأخيرة ليست مفاجئة ، وهي متوافقة مع التحقيقات السابقة التي تظهر أن IL-1RI القابل للذوبان يربط IL-1Ra ، مما يسمح بالربط دون عوائق بين IL-1β وبروتين IL-1RI المحول للإشارة المرتبط بالغشاء (44 ، 45).

تم فحص قدرة الخلايا الظهارية في الرئة على التعبير عن IL-1RII وبالتالي توفير آلية للتنظيم الذاتي للنشاط الناجم عن IL-1β. تظهر نتائجنا باستمرار نقص تعبير IL-1RII بواسطة الخلايا الظهارية للرئة في ظل جميع ظروف الدراسة. قد تفسر هذه النتيجة بشكل أكبر سبب استجابة الخلايا الظهارية للرئة لتنشيط IL-1β. الخلايا الظهارية الرئوية معيبة في قدرتها على تقليل الاستجابة لـ IL-1β خارج الخلية أو ، على وجه الخصوص ، على سطح الخلية بسبب غياب التعبير عن IL-1RII. أظهر العمل السابق أن العوامل الأخرى ذات الصلة ، بما في ذلك الذيفان الداخلي وعامل نخر الورم (TNF) -α و IL-4 و IL-13 والقشرانيات السكرية ، تحفز إفراز IL-1RII القابل للذوبان من العدلات والخلايا البلعمية أحادية النواة (16 ، 19-21) ). من المهم ملاحظة أن التعبير التأسيسي لـ IL-1RII تم اكتشافه في الوحيدات / الضامة والعدلات قبل علاج TNF-α و IL-4 و IL-13. باستثناء IL-1 و dexamethasone و IL-4 و IFN-و endotoxin ، لا يمكننا استبعاد احتمال أن تحفز العوامل الأخرى تعبير IL-1RII في الخلايا الظهارية في الرئة. ومع ذلك ، من الواضح أن التعبير التأسيسي لـ IL-1RII لم يكن موجودًا في الخلايا الظهارية في الرئة. تم إجراء دراساتنا في خط خلوي ممثل للخلايا الظهارية السنخية من النوع الثاني (A549) والخلايا الظهارية التي تمثل مساحة مجرى الهواء العلوي (NHBE) لذلك ، لا يمكننا أيضًا استبعاد إمكانية تعبير IL-1RII بواسطة خلايا متني الرئة الأخرى. ومع ذلك ، فإن تحليل BALFs الذي تم الحصول عليه من متطوعين بالغين أصحاء أظهر باستمرار نقصًا في بروتين IL-1RII كما تم قياسه بواسطة ELISA (البيانات غير معروضة). في سياق البيئة المكروية لمجرى الهواء ، تشير نتائجنا إلى أن الخلايا الظهارية الرئوية يجب أن تعتمد على ذوبان IL-1RII القابل للذوبان من مصادر أخرى في مجرى الهواء الرئوي لتنظيم استجابتها لـ IL-1β.

أظهرت التحقيقات السابقة أن الخلايا الظهارية في الرئة تنتج شكلاً داخل الخلايا من IL-1Ra. في دراساتنا على خلايا A549 ، يمكن اكتشاف IL-1Ra فقط في محللات الخلية ، ولم يتأثر الإنتاج بالعلاج بـ IL-1β. في خلايا NHBE ، تم اكتشاف IL-1Ra إلى حد كبير في الخلايا الخلوية ومع ذلك ، تم العثور على كمية صغيرة في المواد الطافية التي زادت بعد العلاج بـ IL-1β. كما هو الحال مع خلايا A549 ، لم تتم زيادة الكمية التراكمية لـ IL-1Ra المقاسة في المواد الطافية ومحللات الخلايا لخلايا NHBE بعد العلاج بـ IL-1β. علاوة على ذلك ، كانت كمية IL-1Ra المكتشفة في NHBE supernatants أقل بكثير من التركيز (التركيزات) المستخدمة لتثبيط نشاط IL-1 ، لذلك ، كان لـ IL-1Ra الأصلي تأثير ضئيل أو معدوم على تثبيط IL-1β في البيئة خارج الخلية في منطقتنا. دراسات. على غرار الدراسات الموصوفة سابقًا مع IL-1RII ، تتسبب العوامل الأخرى الموجودة في مجرى الهواء ، بما في ذلك IL-4 و IL-13 و IFN-، في زيادة إطلاق النوع I icil-1Ra من الخلايا الظهارية في الرئة ، وبالتالي توفير آلية لتنظيم استجابة الخلايا الظهارية للرئة خارجيًا لـ IL-1β (13). ومع ذلك ، في هذه الدراسات ، زاد تركيز النوع I icIL-1Ra بمقدار 2 إلى 3 أضعاف فقط فوق خط الأساس ، وهو ما يميز استجابة المرحلة الحادة. في المقابل ، لم تظهر دراساتنا باستخدام خط خلوي مختلف ولكن مرتبط (A549) زيادة في إطلاق النوع I icIL-1Ra في الخلايا المعالجة بـ IL-4 أو IFN-γ أو ديكساميثازون. لذلك ، فإن إطلاق النوع I icIL-1Ra بواسطة الخلايا الظهارية الرئوية وحدها قد لا يفسر الزيادة الكبيرة اللازمة لمنع إشارات IL-1. على غرار IL-1RII القابل للذوبان ، قد يعتمد زيادة تعبير IL-1Ra وإطلاقه في مجرى الهواء الالتهابي على مصادر خلوية أخرى ، بما في ذلك العدلات والخلايا الأحادية ، لتنظيم نشاط IL-1 في الرئة (37 ، 46).

باختصار ، تشير نتائجنا إلى أن الخلايا الظهارية للرئة معيبة في قدرتها على تقليل الاستجابة لـ IL-1β بسبب نقص إنتاج IL-1RII. من الواضح أن IL-1β هو وسيط مهم للالتهابات لأمراض الرئة. على وجه الخصوص ، تم توثيق التأثيرات متعددة الاتجاهات لهذا الجزيء على الخلايا الظهارية في الرئة جيدًا. لذلك ، يجب تنظيم النشاط الحيوي لـ IL-1 بإحكام في بيئة مجرى الهواء المكروية. قدرة الخلايا الظهارية في الرئة على تنظيم استجابتها لـ IL-1 في الجسم الحي يمكن تحديدها ، إلى حد كبير ، من خلال توافر مثبطات قابلة للذوبان - وبالتحديد IL-1Ra و IL-1RII - التي تطلقها الخلايا المنظمة المناعية الموجودة في مجرى الهواء ، والتي تشمل العدلات والخلايا الليمفاوية والوحيدات / البلاعم. علاوة على ذلك ، تشير نتائجنا إلى أن الوفرة النسبية لكل مثبط مطلوبة لتثبيط مشاركة IL-1β بفعالية في مجمع مستقبلات تحويل الإشارة. فيما يتعلق بالنشاط الحيوي خارج الخلية IL-1 في البيئة المكروية للرئة ، فإن الوفرة النسبية لكل معدل استجابة IL-1 والتركيز المحلي لـ IL-1β يحددان التأثير العام المؤيد أو المضاد للالتهابات.


عينة من حساب المولارية

  • احسب مولارية محلول محضر بإذابة 23.7 جرام من KMnO4 في كمية كافية من الماء لصنع 750 مل من المحلول.

لا يحتوي هذا المثال على عدد مولات المذاب أو اللترات اللازمة لإيجاد المولارية ، لذلك يجب أن تجد عدد مولات المذاب أولاً.

لتحويل الجرامات إلى مولات ، نحتاج إلى الكتلة المولية للمذاب ، والتي يمكن إيجادها في جداول دورية معينة.

    من K = 39.1 جم
  • الكتلة المولية لل Mn = 54.9 جم
  • الكتلة المولية O = 16.0 جم
  • الكتلة المولية لـ KMnO4 = 39.1 جم + 54.9 جم + (16.0 جم × 4)
  • الكتلة المولية لـ KMnO4 = 158.0 جرام

استخدم هذا الرقم لتحويل الجرامات إلى مولات.

  • مولات KMnO4 = 23.7 جم KMnO4 × (1 مول KMnO4/ 158 جرام KMnO4)
  • مولات KMnO4 = 0.15 مول KMnO4

الآن هناك حاجة إلى لترات من الحل. ضع في اعتبارك أن هذا هو الحجم الإجمالي للمحلول ، وليس حجم المذيب المستخدم لإذابة المذاب. تم تحضير هذا المثال بما يكفي من الماء لصنع 750 مل من المحلول.

  • لتر من المحلول = مل من المحلول × (1 لتر / 1000 مل)
  • لتر من المحلول = 750 مل × (1 لتر / 1000 مل)
  • لتر من المحلول = 0.75 لتر

هذا يكفي لحساب المولارية.

  • مولارية = مولات محلول / لتر محلول
  • المولارية = 0.15 مول من KMnO4/ 0.75 لتر من المحلول
  • مولارية = 0.20 م

مولارية هذا المحلول هي 0.20 م (مولات لكل لتر).


البحث الذي يشمل الموضوعات البشرية والحيوانات والأخطار البيولوجية وسلامة المختبرات

روبرت في سميث ،. إدوارد ف.لينر ، بحث الخريجين (الإصدار الرابع) ، 2016

المخاطر البيولوجية وسلامة المختبرات

تشمل المخاطر البيولوجية المحتملة أو الحقيقية جزيئات الحمض النووي المؤتلف ، والممرضات (للحيوانات والبشر و / أو النباتات) والكائنات الدقيقة (الفيروسات والبكتيريا والفطريات والعوامل الطفيلية) والمواد الكيميائية المشعة أو السامة (بما في ذلك مسببة للسرطان) للحيوانات والبشر. توجد مجموعة متنوعة من الإرشادات أو المعايير الفيدرالية للتعامل مع هذه العوامل والتخلص منها.

الحمض النووي المؤتلف والكائنات الحية التي تحتوي على جزيئات الحمض النووي المؤتلف. حدثت أول جهود بحثية مهمة باستخدام مادة حمض الديوكسي ريبونوكلييك المؤتلف (DNA) في أوائل السبعينيات. كما لاحظ فريدريكسون [211] ، تميزت السنوات القليلة الأولى من أبحاث الحمض النووي المؤتلف بالجدل. المخاطر المحتملة لإدخال مادة وراثية غريبة في بكتيريا الأمعاء الشائعة ، مثل الإشريكية القولونية، تم المبالغة في تقديرها أو إساءة فهمها. أعطى التقدم الحذر في هذا المجال البحثي للعلماء والمسؤولين الفيدراليين وجهات نظر أكثر واقعية تم استخدامها لإعداد أحدث إرشادات المعاهد الوطنية للصحة التي تم تبنيها مؤخرًا [212] والتي تتمتع بقوة القانون أقل من اللوائح التي تحكم البحوث البشرية والحيوانية ، ولكن مع ذلك يتم اتباعها بصرامة من قبل جميع المؤسسات لأن انتهاك إرشادات المعاهد الوطنية للصحة يهدد تمويل المعاهد الوطنية للصحة لجميع الأبحاث التي تنطوي على عمل الحمض النووي المؤتلف. يتم إدارة إرشادات المعاهد الوطنية للصحة من قبل مكتب أنشطة التكنولوجيا الحيوية (OBA) في مكتب سياسة العلوم ([212] داخل مكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة) ، وهي مصممة لضمان الاهتمام المناسب بممارسات وإجراءات السلامة الحيوية ، والمبادئ الأخلاقية في البحث ، بما في ذلك الحمض النووي المؤتلف والكائنات الحية التي تحتوي على جزيئات الحمض النووي المؤتلف. المبادئ التوجيهية مفصلة للغاية ، ولكنها توجه الباحثين بشكل عام بالخطوات التالية اللازمة للعمل مع الحمض النووي المؤتلف:

تقييم المخاطر - متمايز من خلال مجموعة المخاطر (RG) تحجيم RG1 حتى RG4 ، بدءًا من العوامل التي لا يُعرف عنها أنها تسبب مرضًا بشريًا (RG1) ، والانتقال من خلال العوامل التي يُتوقع أن تسبب درجات أكبر من المرض البشري (RG2 و RG3) ، صعودًا من خلال تلك العوامل قد يسبب مرض عضال (RG4).

تصنيف التجارب - باستخدام مقياس RG لتحديد أنواع التجارب المتوقعة من استخدام مادة DNA المؤتلفة ، خارج الكائنات الحية ، من خلال استخدام مثل هذه المواد في النباتات والحيوانات والبشر.

تحديد أدوار المحققين ، والمؤسسة ، وربما المعاهد الوطنية للصحة في البحث - بناءً على التقييمات المذكورة سابقًا ، وتحديد الأدوار المحتملة للمحققين ، وموظف السلامة الحيوية في المؤسسة ، ولجنة السلامة الحيوية المؤسسية (IBC المقدمة لاحقًا) و IRB ، و OBA ، و اللجنة الاستشارية للحمض النووي المؤتلف بتكليف من المعاهد الوطنية للصحة (RAC) في تصميم وإجراء التجارب.

توجيه أنظمة الاحتواء الضرورية - تحديد واستخدام أنظمة الاحتواء المناسبة ، كما تم تصنيفها ضمن مقياس مستوى السلامة الحيوية من BL1 إلى BL4 ، مع ارتباط ترتيب الترتيب بفئات RG المذكورة سابقًا ، ومع أنظمة الاحتواء المادي والمرافق المطورة بشكل شائع (في زيادة صرامة الاحتواء) بموجب نظام مستوى السلامة الحيوية (BL1 – BL4).

كما هو مقترح في الخطوات المذكورة سابقًا ، يجب استدعاء التفكير الكبير والتخطيط والوعي بالامتثال في جميع الأعمال مع الحمض النووي المؤتلف والكائنات التي تحتوي على جزيئات الحمض النووي المؤتلف. لحسن الحظ ، يجب أن يكون المحققون ذوو الخبرة ، وموظفو السلامة الأحيائية ، ورئيس أو أعضاء IBC التابعون للمؤسسة متاحين للتشاور.

على غرار IRB و IACUC ، يتم تعيين IBC من قبل رئيس الجامعة ، ولكن يتم تفويض الإشراف على إجراءات اللجنة إلى كبير مسؤولي الأبحاث في الجامعة. تتكون IBC [212] مما لا يقل عن خمسة أعضاء لديهم مجتمعين خبرة في الحمض النووي المؤتلف أو تقنية جزيئات الحمض النووي الاصطناعية. يجب أن يكونوا قادرين أيضًا على تقييم سلامة أبحاث الحمض النووي المؤتلف ، ومخاطر هذا البحث على الصحة العامة والبيئة. يجب ألا يكون اثنان على الأقل من أعضاء IBC منتسبين إلى الجامعة (بخلاف عضويتهم في IBC) ، ويجب أن يمثلوا الصحة العامة والمصالح البيئية للمجتمع المحيط. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تعيين عضو واحد على الأقل لكل منهم ، من ذوي الخبرة ذات الصلة في مسببات الأمراض النباتية (أو الآفات) أو أمراض الحيوانات ، إذا كانت هذه المجالات هي محور البحث الخاضع للمراجعة. أيضًا ، يجب أن يكون مسؤول السلامة الحيوية بالمؤسسة عضوًا في IBC ، إذا تم إجراء البحث على مستويات BL3 أو BL4 ، أو في حالات العمليات واسعة النطاق (& gt10 L). ستكون IBC في العديد من الجامعات مسؤولة عن جميع المخاطر البيولوجية (الواردة لاحقًا) ، وليس فقط تلك المرتبطة بجزيئات الحمض النووي المؤتلف.

تتمثل مسؤولية IBC في أبحاث الحمض النووي المؤتلف في تقييم المقترحات الخاصة بالمخاطر المحتملة ، والتأكد من تبني الاحتياطات المناسبة. يعتبر رئيس IBC مصدرًا جيدًا للمعلومات والمشورة. يمكن استشارته ، إذا تم التخطيط للعمل مع أي حمض نووي مؤتلف ، أو غيره من المخاطر البيولوجية المحتملة التي يتم تحديدها على أنها مسؤولية IBC.

المخاطر الميكروبيولوجية. العوامل المسببة للأمراض والفيروسات المسببة للأورام هما خطران بيولوجيان يتطلبان معالجة خاصة. لم يتم إصدار اللوائح الفيدرالية في هذه المجالات ، على الرغم من نشر المعايير من قبل مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) والمعاهد الوطنية للصحة ، في وثيقة (السلامة الحيوية في المختبرات الميكروبيولوجية والطبية الحيوية (BMBL) ، 2009) يمكن تنزيلها شحن مجاني. يحتوي BMBL على ثروة من المعلومات تحت عناوين الموضوعات التالية:

تقييم المخاطر البيولوجية

معايير مستوى السلامة الحيوية للمختبر (BL1-BL4)

معايير مستوى السلامة الحيوية للحيوانات الفقارية لمرافق أبحاث Vivarium

مبادئ السلامة الحيوية في المختبرات

الصحة المهنية والوقاية المناعية

بيانات ملخص العامل: البكتيريا والفطريات والطفيليات والريكتسيا والفيروسات والسموم والبريونات

يجب أن يكون لدى جميع الباحثين الخريجين الذين يعملون مع المخاطر الميكروبيولوجية المحتملة نسخة من BMBL للعمل المرجعي المناسب.

عادةً ما يكون للجامعات مسئولي سلامة مع مسئوليات الإشراف والامتثال للأجهزة التي تنبعث منها إشعاعات مؤينة أو مواد مشعة ، ومواد كيميائية سامة (بما في ذلك المواد المسرطنة) ، والأدوية المجدولة في البحث. يجب إدراج الروابط إلى هؤلاء الأفراد والمكاتب التي يخدمونها والسياسات ذات الصلة على موقع الويب الخاص بمكتب خدمات البحث التابع للمؤسسة أو ما يعادله.

مخاطر الإشعاع. غالبًا ما يقدم مسؤول السلامة الإشعاعية بالجامعة تقاريره إلى كبير مسؤولي الأبحاث في المؤسسة ، وسينسق الجهود مع لجنة السلامة من الإشعاع (RSC) التي تم تعيينها بشكل مشابه لـ IRB و IACUC و IBC. تم تصميم برنامج السلامة من الإشعاع بالاشتراك مع RSC ، ولكن تتم صيانته على أساس يومي من قبل مسؤول السلامة الإشعاعية المسؤول عن:

إنهاء الأنشطة التي تسبب مخاطر الإشعاع

تفتيش المناطق التي يتم فيها تخزين مصادر الإشعاع (بما في ذلك المعدات المنتجة للإشعاع) أو استخدامها في البحث

إنفاذ برنامج الشراء وحفظ السجلات ، مطلوب من جميع المستخدمين المصرح لهم للمصادر أو المواد المشعة

صيانة أنظمة التخلص السليم من النفايات المشعة

إدارة البرامج التعليمية حول احتياطات وإجراءات السلامة

ضمان أن يتم الاحتفاظ بمصادر الإشعاع الجديدة وفقًا للوائح الفيدرالية ولوائح الولاية و

الخدمة كحلقة وصل بين مسؤولي الجامعة والمسؤولين الفيدراليين ومسؤولي الولاية ، من أجل ضمان استيفاء متطلبات الترخيص والأمان الإشعاعي.

لاستخدام المصادر والمواد المشعة ، يجب على الباحثين الحصول على موافقة من خلال RSC وضابط السلامة الإشعاعية. عادة ، يكون المستشار هو المستخدم المصرح له والذي قد يشرف على الأنشطة ذات الصلة من قبل الطلاب. يؤدي هذا إلى تضخيم مسؤوليات الطلاب ، ويتطلب أن يصبحوا على اطلاع جيد ، كما هو مطلوب من خلال التدريب المتاح من خلال مكتب السلامة من الإشعاع بالجامعة أو ما يعادله.

يجب أن تكون نسخة من دليل السلامة من الإشعاع بالجامعة متاحة إلكترونيًا من خلال مكتب السلامة من الإشعاع. قد يكون التسجيل في دورة (دورات) السلامة الإشعاعية مطلوبًا قبل الحصول على شهادتك لاستخدام المصادر الخاضعة للرقابة أو المواد المشعة. حتى لو كانت الخلفية في الفيزياء أو الكيمياء ، فإن الأفكار العملية المكتسبة من خلال دورة السلامة الإشعاعية ستكون ذات قيمة.

الليزر. الزيادة السريعة في استخدام الليزر (تضخيم الضوء من خلال الانبعاث المحفز للإشعاع) على مدى العقود العديدة الماضية ، للعديد من التطبيقات الطبية ، وفي كل من البحوث الأساسية والتطبيقية في تخصصات العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات ، مثل الكيمياء ، والعديد من مجالات الهندسة ، لقد كانت الفيزياء ، وحتى علوم الأرض والأحياء ، حافزًا للجامعات لتطوير برامج أمان الليزر. في بعض الأوساط الأكاديمية ، يتم إنشاء لجنة منفصلة لسلامة الليزر (LSC) ، ولكن في العديد من الكليات والجامعات ، يقع استخدام الليزر ضمن اختصاص RSC (غالبًا ما يؤدي إلى إعادة تسمية اللجنة إلى RLSC). هناك نوعان رئيسيان من الليزر ، الموجات النبضية والمستمرة ، والتي تختلف في نوع الطاقة المولدة. عادةً ما يتم وصف احتمال الخطر لليزر وفقًا لـ "الفئة" من قبل المعهد القومي الأمريكي للمعايير (ANSI) [214] ، واللجنة الكهروتقنية الدولية (IEC) [215]. تمثل أشعة الليزر من الفئة الأولى أدنى مستوى من الخطر في ظل ظروف التشغيل العادية ، بينما في الطرف الآخر من المقياس ، لا يمكن أن تسبب أشعة الليزر من الفئة الرابعة ضررًا في شبكية العين فحسب ، بل يمكن أن تسبب أيضًا إشعاع الجلد ومخاطر الحريق. أو بشكل أكثر تحديدًا:

الفئة الأولى - الليزر أو أنظمة الليزر التي لا تخضع لظروف التشغيل العادية تشكل خطرًا.

الفئة الثانية - أنظمة الليزر ذات الطاقة المنخفضة والضوء المرئي أو الأنظمة التي لا تشكل عادةً خطرًا بسبب استجابات النفور البشري العادية (الوميض وحركات العين وما إلى ذلك). قد تشكل بعض المخاطر المحتملة إذا تم عرضها مباشرة لفترات طويلة من الوقت (على غرار العديد من مصادر الضوء التقليدية).

الفئة IIIA - أشعة الليزر أو الأنظمة التي عادةً لا تؤذي العين ، إذا تم عرضها لفترات مؤقتة فقط بالعين المجردة ، ولكنها قد تشكل خطرًا أكبر إذا تم عرضها باستخدام بصريات المجموعة. يجب أن تحتوي جميع أنواع الليزر من الفئة IIIA على ملصق تحذير ، ويجب أن يحمل بعضها ملصق خطر.

الفئة IIIB - أشعة الليزر أو الأنظمة التي من شأنها أن تسبب تلفًا للعين ، إذا تم عرضها مباشرة.

الفئة الرابعة - أشعة الليزر أو الأنظمة التي تسبب تلفًا في شبكية العين من المشاهدة المباشرة أو المشاهدة المنعكسة. قد ينتج عن مثل هذه الليزرات مخاطر إشعاعية كبيرة للعين والجلد ، فضلاً عن مخاطر الحريق.

كما هو الحال مع الأنواع الأخرى من المخاطر المهنية ، فإن العمل باستخدام الليزر يتطلب من جميع المستخدمين الحصول على تدريب معتمد من الولاية أو الحكومة الفيدرالية على الصحة والسلامة البيئية (EHS) ، وفحص المعدات بشكل منتظم بواسطة LSO. يجب أن تكون على دراية بنوع وفئة الليزر المستخدمة في المختبر الذي تنضم إليه ، حتى تتمكن من الحصول على إرشادات التدريب والسلامة المناسبة.

الكيماويات الخطرة والسامة. يوجد في الجامعات عادة مكاتب EHS مسؤولة عن تفتيش ومراقبة المختبرات حيث يتم استخدام المواد الكيميائية الخطرة (الأسباب المحتملة للحرائق أو الانفجارات) والمواد الكيميائية السامة. ستساعد مكاتب البيئة والصحة والسلامة أيضًا في تدريب الباحثين الجدد الذين يجب عليهم استخدام مواد كيميائية خطرة أو سامة في عملهم. يمكن أيضًا زيادة جهود الجامعات في مجال البيئة والصحة والسلامة من خلال لجنة سلامة المختبرات المؤسسية والعمل (ILSC) ، والتي تم تكليفها وتشكيلها بالتوازي مع IRB و IACUC و IBC.

تتولى مكاتب البيئة والصحة والسلامة مسؤولية التقاط المواد الكيميائية التي يحتمل أن تكون خطرة وسامة والتخلص منها بالشكل المناسب ، ومن المهم للباحثين المتخرجين أن يكونوا على دراية جيدة بحاويات النفايات وخزائن الأمان المستخدمة للاحتواء المؤقت. يجب أيضًا إبلاغ الباحثين عن الإجراءات الروتينية المناسبة لطلب التخلص الدائم من المواد الخطرة والسامة ، كما يجب عليهم تجنب التخلص من المواد الكيميائية في المصارف أو في مصارف المجاري العامة.

يجب أن يصبح الباحثون على دراية جيدة بالمواد الكيميائية الخطرة والسامة ، خاصة تلك التي يمكن استخدامها في أبحاثهم. نوصي بأن يحصل جميع الباحثين المتخرجين على نسخة من الممارسات الحكيمة في المختبر [216] يمكن تنزيله دون تكلفة من خلال موقع المجلس القومي للبحوث. ستجد فيه أوصافًا حديثة للموضوعات التالية:


بيولوجيا الخلية الفصل 20

أ) الحمض النووي الريبي المتورط في تعطيل كروموسوم إكس
ب) الجينات التي يتم نسخها وترجمتها باستمرار في الخلية
ج) الحمض النووي الريبي الذي يوجه بروتينات كاس إلى الحمض النووي التكميلي
د) الحمض النووي الريبي الذي يتحد مع مجمع الإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC)
هـ) المتواليات التي ، عند ميثليتها ، يمكنها إسكات التعبير الجيني
و) آلية التحكم في النسخ الشائعة لمسارات التخليق الحيوي بدائية النواة
ز) عناصر التحكم البعيدة المشاركة في تنظيم النسخ
ح) تسلسلات الحمض النووي الريبي التي تربط الجزيئات الصغيرة
ط) عناصر التحكم القريبة المشاركة في تنظيم النسخ
ي) عوامل النسخ التي تتحكم في نسخ الجينات المهمة في النمو

2) البروتينات المتجانسة - J) عوامل النسخ التي تتحكم في نسخ الجينات المهمة في النمو

3) Xist RNA - A) RNA متورط في تعطيل كروموسوم X

4) قمع المنتج النهائي - F) آلية التحكم النسخي الشائعة لمسارات التخليق الحيوي بدائية النواة

5) كاتمات الصوت والمعززات - ز) عناصر التحكم البعيدة المشاركة في تنظيم النسخ

6) المحولات الريبية - H) تسلسلات الحمض النووي الريبي التي تربط الجزيئات الصغيرة

7) crRNA - C) RNA الذي يوجه بروتينات Cas إلى الحمض النووي التكميلي

8) الجينات التأسيسية - ب) الجينات التي يتم نسخها وترجمتها باستمرار في الخلية

9) جزر CpG - E) التي ، عند ميثليتها ، يمكنها إسكات التعبير الجيني

10) صناديق GC و CAAT - I) عناصر التحكم القريبة المشاركة في تنظيم النسخ


خصائص الخلايا السرطانية

ستيف GSCHMEISSNER / جيتي إيماجيس

الخلايا السرطانية لها خصائص تختلف عن الخلايا الطبيعية.

  • تكاثر الخلية: تكتسب الخلايا السرطانية القدرة على التكاثر دون حسيب ولا رقيب. قد تحتوي هذه الخلايا على طفرات جينية أو طفرات صبغية تؤثر على الخصائص التناسلية للخلايا. تتحكم الخلايا السرطانية في إشارات النمو الخاصة بها وتستمر في التكاثر دون رادع. إنهم لا يعانون من الشيخوخة البيولوجية ويحافظون على قدرتهم على التكاثر والنمو.
  • الاتصال الخلوي: تفقد الخلايا السرطانية القدرة على التواصل مع الخلايا الأخرى من خلال الإشارات الكيميائية. كما أنها تفقد الحساسية للإشارات المضادة للنمو من الخلايا المحيطة. عادة ما تقيد هذه الإشارات النمو الخلوي.
  • التصاق الخلية: تفقد الخلايا السرطانية جزيئات الالتصاق التي تبقيها مرتبطة بالخلايا المجاورة. تتمتع بعض الخلايا بالقدرة على الانتشار أو الانتشار إلى مناطق أخرى من الجسم من خلال الدم أو السائل الليمفاوي. بمجرد دخولها إلى مجرى الدم ، تطلق الخلايا السرطانية رسلًا كيميائيًا يسمى الكيموكينات التي تمكنها من المرور عبر الأوعية الدموية إلى الأنسجة المحيطة.
  • تخصص الخلية: الخلايا السرطانية غير متخصصة ولا تتطور إلى خلايا من نوع معين. على غرار الخلايا الجذعية ، تتكاثر الخلايا السرطانية أو تتكاثر عدة مرات ، لفترات طويلة من الزمن. يكون تكاثر الخلايا السرطانية سريعًا ومفرطًا حيث تنتشر هذه الخلايا في جميع أنحاء الجسم.
  • موت الخلية: عندما تتلف الجينات الموجودة في الخلية الطبيعية بشكل يتعذر إصلاحه ، فإن بعض آليات فحص الحمض النووي تشير إلى تدمير الخلايا. تسمح الطفرات التي تحدث في آليات فحص الجينات بعدم اكتشاف الأضرار. ينتج عن هذا فقدان قدرة الخلية على الخضوع لموت الخلية المبرمج.

طول جزيء الحمض النووي البشري

تحتوي الكروموسومات الموجودة في نواة الخلية على جميع المعلومات التي تحتاجها الخلية لمواصلة عمليات حياتها. وهي تتكون من مادة كيميائية معقدة (حمض نووي) تسمى حمض الديوكسي ريبونوكلييك ، أو الحمض النووي للاختصار. أدى فك العلماء للتركيب الكيميائي للحمض النووي إلى فهم مفاهيمي بسيط للعمليات الجينية. الحمض النووي هو المادة الوراثية لجميع الخلايا. وهو عبارة عن جزيء ضخم حلزوني مزدوج الشريطة يتكون من مونومرات نيوكليوتيد مع سكر ديوكسيريبوز والقواعد النيتروجينية أدينين (أ) ، سيتوزين (ج) ، جوانين (G) ، وثايمين (T). في كروموسومات الخلية ، يحدث الحمض النووي كخيوط رفيعة ملفوفة حلزونيًا تلتف بدورها حول أخرى ، مثل سلم ملتوي.

جزيء الحمض النووي مترابط بشكل جيد للغاية بحيث لا يمكن رؤيته إلا تحت المجاهر الإلكترونية عالية القوة. للتعرف على المدة الدقيقة لمقارنة جزيء الحمض النووي غير الملفوف بالخلية النموذجية ، يتم تكبير الخلية 1000 مرة. في هذا المقياس ، سيكون الطول الإجمالي لكل الحمض النووي في نواة الخلية 3 كيلومترات - المسافة المكافئة لنصب لنكولن التذكاري إلى العاصمة في واشنطن العاصمة.

يشتمل الجينوم البشري على المعلومات الواردة في مجموعة واحدة من الكروموسومات البشرية والتي تحتوي بدورها على حوالي 3 مليارات زوج قاعدي (bp) من الحمض النووي في 46 كروموسومًا (22 زوجًا جسميًا + 2 كروموسومات جنسية). يتم حساب الطول الإجمالي للحمض النووي الموجود في إنسان بالغ واحد عن طريق تكاثر

(طول 1 بي بي) (عدد بي بي لكل خلية) (عدد الخلايا في الجسم)
(0.34 & # 0215 10 & # 87229 م) (6 & # 0215 10 9) (10 13)
2.0 & # 0215 10 13 متر

وهذا يعادل ما يقرب من 70 رحلة من الأرض إلى الشمس والعودة.

2.0 & # 0215 10 13 متر = 133.691627 وحدة فلكية
133.691627 / 2 = 66.8458135 ذهابًا وإيابًا إلى الشمس

في المتوسط ​​، يتكون كروموسوم بشري واحد من جزيء الحمض النووي الذي يبلغ طوله حوالي 5 سنتيمترات.


شاهد الفيديو: ما هو الحمض النووي DNA وكيف يعمل شرح بسيط وعلمي (قد 2022).