معلومة

كيف تفرز بروتين مؤتلف من الإشريكية القولونية؟

كيف تفرز بروتين مؤتلف من الإشريكية القولونية؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ما هي بعض المسارات الإفرازية التي يمكن استخدامها لإفراز إنزيم بكتيري مؤتلف من الإشريكية القولونية؟

لدي بروتين مؤتلف (29 كيلو دالتون) سأعبر عنه في خلايا الإشريكية القولونية BL21. في الوقت الحالي ، أقوم بتمرير صوتنة الإشريكية القولونية لاستخراج الإنزيم ، ولكن في المستقبل أود أن تفرز الإشريكية القولونية الإنزيم.


وفقًا لفريق iGEM Kyoto لعام 2012:

مسار إزاحة الأرجينيت التوأم (TAT) هو نظام إفراز [داخلي] في الإشريكية القولونية. يمكن لهذا النظام أن يحمل البروتينات التي لها إشارة torA تسلسل الأحماض الأمينية عند الطرف N. يؤلف TatA و TatB و TatC و TatD مجمع Tat على الغشاء الداخلي. يتعرف مجمع T على ببتيد إشارة torA ثم ينقل البروتين (مع torA) من السيتوبلازم إلى periplasm. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البروتين الذي مر عبر مسار TAT يقطع إشارة torA. البروتينات التي يفرزها هذا النظام ليس لها علامة تعيق تنشيط البروتين.

ابتكر الفريق كاسيتًا به جينات TAT لزيادة التعبير عن المسار وشمل أيضًا جين Kil ، الذي يثقب الغشاء الخارجي ، مما قد يساعد في الانتشار الخارجي للبروتين المفرز. لاحظوا ذلك ، بالأحرى لسان في الخد

وغني عن القول ، أن وظيفة الغشاء الخارجي كغشاء ضرورية لبقاء بكتيريا الإشريكية القولونية. بمعنى آخر ، يؤدي الإفراط في التعبير عن كيل إلى موت الخلية. لهذا السبب ، يجب أن نجد المقدار المناسب من التعبير.

ملحوظة: وفقًا لدفتر المختبر الخاص بهم ، لم يلاحظ الفريق أبدًا GFP خارج الخلية عبر مجهر متحد البؤر (ابحث في تلك الصفحة عن "متحد البؤر"). وبالتالي. احذر :)

تتضمن صفحة مشروعهم أيضًا بعض المراجع إلى الأدبيات التالية:

  • تريسي بالمر وبن سي بيركس "مسار تصدير البروتين المزدوج للأرجينين (تات)"
  • J. H. تشوي. S. Y. Lee "الإنتاج الإفرازي وخارج الخلية للبروتينات المؤتلفة باستخدام الإشريكية القولونية"
  • G. Miksch · E. Fiedler · P. Dobrowolski · K. Friehs "يتوسط جين الكيل للبلازميد ColE1 للإشريكية القولونية التي يتحكم فيها محفز يعتمد على مرحلة النمو في إفراز بروتين محيطي غير متجانس أثناء المرحلة الثابتة"
  • براد إيه سيبل * وباتريك جيه والش "تراكم أكسيد ثلاثي ميثيل أمين في الحيوانات البحرية: علاقته بتخزين الأسيل جلسرين"

إنتاج البروتين المؤتلف خارج الخلية من الإشريكية القولونية

الإشريكية القولونية هو المضيف الأكثر استخدامًا لإنتاج البروتين المؤتلف وهندسة التمثيل الغذائي. يعد إنتاج الإنزيمات والبروتينات خارج الخلية مفيدًا لأنه يمكن أن يقلل بشكل كبير من تعقيد العملية الحيوية ويحسن جودة المنتج. يعد إنتاج البروتينات خارج الخلية ضروريًا لتطبيقات الهندسة الأيضية حيث تكون الركائز عبارة عن بوليمرات مثل lignocelluloses أو xenobiotics نظرًا لأن الامتصاص الكافي لهذه الركائز غالبًا ما يكون مشكلة. العقيدة التي E. القولونية يفرز أي بروتين لم يواجه تحديًا من خلال التعرف على قدرته الطبيعية على إفراز البروتين في السلالات المختبرية الشائعة وزيادة قدرته على إفراز البروتينات في الخلايا المهندسة. إن وجود هذه المراجعة المخصصة للإنتاج خارج الخلية هو شهادة على الإنجازات البارزة التي حققها المجتمع بشكل جماعي في هذا الصدد. ظهرت أربع استراتيجيات للهندسة E. القولونية الخلايا لإفراز البروتينات المؤتلفة. في بعض الحالات ، تم الوصول إلى مستويات إفراز مثيرة للإعجاب ، عدة جرامات لكل لتر. مستوى الإفراز هذا على قدم المساواة مع أنظمة التعبير حقيقية النواة الأخرى. وسط هذا التفاؤل ، من المهم أن ندرك أنه لا تزال هناك تحديات كبيرة ، خاصة عند النظر إلى النجاح الذي لا يمكن التنبؤ به مسبقًا ، ويتضمن الكثير من التجارب والأخطاء. تقدم هذه المراجعة لمحة عامة عن التطورات الحديثة في الهندسة E. القولونية للإنتاج خارج الخلية للبروتينات المؤتلفة وتحليل إيجابيات وسلبيات كل استراتيجية.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


داس ، أ. 1990. الإفراط في إنتاج البروتينات في الإشريكية القولونية: المتجهات والمضيفين والاستراتيجيات. طرق في الانزيم. 182: 93–112.

Holland، B.، Kenny، B.، Steipe، B. and Plückthun، A. 1990. إفراز بروتينات هيتيرول ogous في الإشريكية القولونية. طرق في الانزيم. 182: 132–143.

مارستون ، إف وهارتلي ، د. 1990. إذابة مجاميع البروتين. طرق في الانزيم. 182: 264–276.

Uhlen، M. and Moks، T. 1990. اندماج الجينات لغرض التعبير: مقدمة. طرق في الانزيم. 185: 129–143.

بولاغ ، د. وإيدلشتاين ، S.J. 1990. طرق البروتين ، ص. 32 - 33. وايلي ليس ، نيويورك.

يب ، ج. وهشت ، م. 1994. تجزئة Periplasmic الإشريكية القولونية ينتج البلاستوسيانين المؤتلف على الرغم من عدم وجود تسلسل إشارة. التعبير عن البروتين وتنقيته 5: 317–323.

Rojas، N. and Hecht، M.H. نتائج غير منشورة.

Nikkila، H.، Gennis، R.B. and Sligar، S.G. 1991. الاستنساخ والتعبير عن الجين الذي يشفر السيتوكروم القابل للذوبان ب 562 من الإشريكية القولونية. يورو. J. Biochem. 202: 309–313.

Brunet ، A.P. ، Huang ، E.S. ، Huffine ، M.E. Loeb ، J.E. Weltman ، R.J. وهشت ، م. 1993. دور المنعطفات في بنية البروتين الحلزوني ألفا. طبيعة سجية 364: 355–358.

فرانكس ، ف. 1981. الفيزياء الحيوية والكيمياء الحيوية لدرجات الحرارة المنخفضة والتجميد ، ص. 3-20. في: تأثيرات درجات الحرارة المنخفضة على الأغشية البيولوجية. موريس ، جي جي ، كلارك ، أ. (محرران). المطبعة الأكاديمية ، نيويورك.

لي ، ب ، ماكينا ، ك. وبرامهول ، ج. 1985. ، دراسات حركية لاستئصال غشاء كرات الدم الحمراء البشرية. Biochimica et Biophysica Acta 815: 128–134.

موريس ، ج. 1981. الجسيمات الشحمية كنظام نموذجي للتحقيق في إصابة التجميد ، ص. 241-262. في: تأثيرات درجات الحرارة المنخفضة على الأغشية البيولوجية. موريس ، جي جي ، كلارك ، أ. (محرران). الصحافة الأكاديمية. نيويورك.

Hecht ، M.H. ، Richardson ، JS ، Richardson ، DC and Ogden ، R.C. 1990. من جديد تصميم وتعبير وتوصيف فيليكس: بروتين حزمة رباعي الحلزون من تسلسل أصلي مثل التسلسل. علم 249: 884–891.

Kamtekar، S.، Schiffer، J.M.، Xiong، H.، Babik، J.M. and Hecht، M.H. 1993. تصميم البروتين عن طريق الزخرفة الثنائية للأحماض الأمينية القطبية وغير القطبية. علم 262: 1680–1685.

ستودييه ، إف دبليو وموفات ، بكالوريوس 1986. استخدام الجراثيم T7 RNA poly merase لتوجيه التعبير الانتقائي عالي المستوى للجينات المستنسخة. جيه مول. بيول. 189: 113–130.

عمان ، E. ، Brosius ، J. و Ptashne ، M. 1983. ناقلات تحمل هجين trp-lac محفز مفيد للتعبير المنظم للجينات المستنسخة في الإشريكية القولونية. الجين 25: 167–178.


الإنتاج الإفرازي وخارج الخلية للبروتينات المؤتلفة باستخدام الإشريكية القولونية

الإشريكية القولونية هو أحد أكثر العوائل استخدامًا لإنتاج البروتينات المؤتلفة. ومع ذلك ، غالبًا ما تكون هناك مشاكل في استعادة غلة كبيرة من البروتينات المطوية بشكل صحيح. تتمثل إحدى طرق حل هذه المشكلات في إفراز البروتينات المؤتلفة في الفضاء المحيط بالبلازما أو وسط المزرعة. للإنتاج الإفرازي للبروتينات المؤتلفة مزايا عديدة ، مثل بساطة التنقية ، وتجنب هجوم البروتياز ، وامتداد N-terminal Met ، وفرصة أفضل لطي البروتين الصحيح. بالإضافة إلى نظام Sec الراسخ ، تم مؤخرًا استخدام نظام نقل الأرجينين المزدوج (TAT) للإفراز الفعال للبروتينات المطوية. كما تم تطوير استراتيجيات مختلفة لإنتاج البروتينات المؤتلفة خارج الخلية. للإنتاج الإفرازي للبروتينات المعقدة ، يمكن التلاعب بالبروتياز المحيطي والبروتياز لتحسين مردود البروتينات المفرزة. تناقش هذه المراجعة التطورات الحديثة في الإنتاج الإفرازي وخارج الخلية للبروتينات المؤتلفة باستخدام بكتريا قولونية.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


4. النتائج

4.1 عزل البلازميد

DNA البلازميد S. simulans تم استخراجه وضبط التركيز إلى 4 & # x003bcg / & # x003bcL التي تم استخدامها كقالب لتضخيم الجين المشفر ليسوستافين.

4.2 بناء البلازميد المؤتلف pET-lys

تم تأكيد نتيجة التسلسل من خلال المقارنة بقاعدة البيانات باستخدام برنامج أداة البحث المحلية المحاذاة الأساسية (بلاست). أظهر إجراء هضم الإنزيم ومقايسة PCR ونتائج التسلسل أن الجين المستهدف قد تم إدخاله بشكل صحيح في pET-lys البلازميد المؤتلف (لا تظهر البيانات).

4.3 تعبير وتنقية الليسوستافين الناضج المؤتلف

تم تحويل البلازميد المؤتلف الإيجابي إلى مضيف ، بكتريا قولونية BL21 (DE3). أدت إضافة IPTG إلى زيادة التعبير عن البروتين المؤتلف بوزن جزيئي 42 كيلو دالتون تقريبًا. تمت تنقية البروتين المعبر عنه بنجاح عن طريق كروماتوجرافيا التقارب باستخدام راتنج Ni-NTA (الشكل 1). نتج عن عملية التنقية والغسيل الكلوي إنتاج حوالي 30 مجم من البروتين النقي من 1 لتر بكتريا قولونية BL21 (DE3) + ثقافة الحيوانات الأليفة.

تُظهر المواد الهلامية SDS-PAGE مستخلص الخلية غير المستحث من بكتريا قولونية BL21 (DE3) + PET-lys لمدة ساعة واحدة (الممر 1) وساعتين (الممر 2) ، مستخلص الخلية المستحث لمدة ساعتين (الممر 3) وأربع ساعات (الخط 4) ، والبروتينات المستخرجة بعد كروماتوغرافيا تقارب Ni-NTA ( حارة 5). يتم عرض علامة الوزن الجزيئي عالية المدى على اليسار (الممر M).


استنتاج

لقد قمنا بتصميم LARDs على أساس النمذجة المقارنة لـ المتألقة P. الليباز وربطها وراثيا بـ GFP و EGF. يحتوي اثنان من LARDs (LARD0 و LARD1) على هيكل & # x003b2-roll وإما رابط Pro-Gly أو موقع عامل Xa بين بروتينات الاندماج و LARDs. قمنا أيضًا بإرفاق الليباز بالكامل (TliA) وراثيًا بـ GFP و EGF و CTP. تم إفراز البروتينات المندمجة مع الليباز بالكامل بكتريا قولونية مع ناقل ABC وأظهر نشاط الليباز كشكل سليم مدمج في supernatnat. تم تصدير GFP و EGF المدمج مع LARDs أو TliA إلى الوسط خارج الخلية في بكتريا قولونية تحتوي على ناقل ABC من المتألقة P. و E. أقحوان. في هذا التقرير فقط بكتريا قولونية تم استكشافه كمضيف تعبير لإمكانية نقل ABC لإنتاج البروتين المؤتلف. التعبير الإفرازي لبروتينات الاندماج في بكتريا قولونية سوف تمتد إلى من هم في المتألقة P. حيث يتم التعبير بشكل أفضل عن ناقل ABC TliDEF [13]. المتألقة P. مكمل TliDEF ينتج ليباز خارج الخلية يصل إلى حوالي 15٪ من إجمالي البروتينات [13]. من المتوقع بناء مصنع فعال لتصنيع البروتين باستخدام الزائفة كمضيف.


نبذة مختصرة

بروتوكولات الزراعة القياسية للثقافات عالية الكثافة الخلوية المؤتلف بكتريا قولونية الاعتماد على تخصيب الهواء بالأكسجين لمنع الحد من الأكسجين. تؤثر هذه الطريقة لزيادة إمدادات الأكسجين على اقتصاديات العملية بسبب التكلفة العالية للأكسجين النقي. ضغط المفاعل هو نهج بديل لتحسين نقل كتلة الأكسجين. في هذه الدراسة ، فإن أداء المفاعل الحيوي المضغوط للضغط الجوي في نمو rبكتريا قولونية تم تقييم الخلايا. تم إجراء التجارب في مفاعل حيوي للضغط الجوي ذي الحلقة الداخلية المضغوطة (ALB) وفي مفاعل خزان مقلوب غير مضغوط (STR) ، وكلاهما بحجم عمل 5 لتر ، ومجهز بنظام للتحكم التلقائي ومراقبة الضغط ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة ، والأكسجين المذاب. أظهر الضغط أنه أمر حاسم لتحسين أداء ALB في تكوين الكتلة الحيوية (29 جمDCW L −1) وإنتاج البروتين (201 مجمبروتين زDCW −1) ، مما أدى إلى إنتاجية البروتين (240 مجمبروتين −1 h 1) وكفاءة الطاقة (11 جمبروتين kWh −1) مماثلة لما تم تحقيقه في STR (200 مجمبروتين L −1 h −1 و 13 جمبروتين kWh −1 على التوالي). نظرًا لارتفاع تكلفة الأكسجين النقي ، تبين أن تخصيب الهواء غير مجدٍ اقتصاديًا لـ ALB. من خلال الضغط على المفاعل الحيوي حتى 0.41 ميجا باسكال ، بدون إمداد الأكسجين النقي ، تقدر زيادة الكفاءة الاقتصادية بمقدار 8.7 ضعفًا ، ما يُظهر إمكانات هذه الإستراتيجية المبتكرة للمزارع الهوائية.


ظروف الثقافة ومراقبة النمو

تغيير ظروف الثقافة هو أسهل طريقة لتغيير نمو بكتريا قولونية وتؤثر بشكل مباشر على المحصول الحجمي للبروتين المؤتلف. غالبًا ما يتجاهل الباحثون فوائد تحسين العوامل الخارجية (باستثناء درجة حرارة الثقافة بعد الاستقراء). سابقًا ، نبهنا إلى أن وسيط Luria-Bertani (LB) (يمكن القول إنه أكثر وسائل الإعلام شيوعًا للنمو بكتريا قولونية) بعيدًا عن أن يكون الوسيط الأنسب للإفراط في إنتاج البروتين. 4 يؤدي التبديل ببساطة إلى مرق أكثر ثراءً (مثل Terrific Broth) إلى زيادة كثافة الخلايا النهائية. أيضًا ، اكتسبت وسائط الحث التلقائي شعبية ، والعديد من الأمثلة على إنتاج البروتين الناجح من خلال النمو بكتريا قولونية في وسائط الحث الذاتي تكثر في الأدبيات. تتكون وسائط الحث الذاتي من مصدرين على الأقل للكربون: الجلوكوز واللاكتوز (يضاف الجلسرين أيضًا لزيادة الغلة). 62 الجلوكوز هو مصدر الكربون المفضل ، وبمجرد استنفاده (عادةً أثناء النمو الأسي) ، يبدأ استهلاك اللاكتوز. وهذا بدوره يؤدي إلى إنتاج البروتين من الأنظمة القائمة على لاك المروجين. هناك العديد من المزايا لاستخدام وسائط الحث الذاتي: يتم تحقيق كثافة بكتيرية أعلى ، ونقطة زمنية للتحريض قابلة للتكاثر بشكل كبير ، ولم يعد هناك حاجة لإيقاف الثقافة من أجل إضافة IPTG. برياند وآخرون أظهرت أن الحث التلقائي يمكن تحقيقه أيضًا عن طريق تغيير استقلاب الخلية داخليًا. اكتشفوا بالصدفة أن إنتاج Hsp70 البشري في بكتريا قولونية يتداخل بطريقة ما مع وظيفة إنزيم نازع هيدروجين الجلسيرالديهيد 3-فوسفات الداخلي ، مما يؤدي بشكل غير مباشر وبالتالي إلى إزالة LacI والتعبير اللاحق عن الجين المعني ، إذا كان تحت تأثير المروج القائم على lac. 63 هذه المنصة (تسمى SILEX ، سقزم-أناnducibإله السابقpression) يسمح بالحث التلقائي دون أي تعديل متوسط ​​ويعمل في ظل العديد من ظروف الثقافة.

توفر الوسائط المعقدة وفرة من العناصر الغذائية ولكن القليل من التحكم في الحالة الأيضية للخلايا في المزرعة. يستفيد إنتاج البروتين من خلال خفض معدل النمو بحيث يمكن الوصول إلى التوازن بين التوليف والطي. درجة حرارة المزرعة هي أسهل طريقة للتحكم في معدل النمو. ومع ذلك ، في المفاعلات الحيوية الكبيرة ، يمكن أن يؤدي التحكم في درجة الحرارة إلى زيادة تكاليف الإنتاج بشكل كبير ، لذلك يتم استخدام وسائل أخرى للتحكم في معدل النمو. نحن نتفق مع وجهة نظر Krause et al. أن هناك انفصالًا بين المبادئ المطبقة في إنتاج البروتين المؤتلف في مزارع الدُفعات الغذائية ومزارع هز القارورة. 64 في السابق ، تتم مراقبة درجة التهوية ومعدل تغذية الجلوكوز عن كثب ، حيث أن هذه المعلمات ذات أهمية قصوى لتحقيق عوائد عالية. ومع ذلك ، على نطاق المختبر ، نادرا ما يؤخذ هذا في الاعتبار. لحسن الحظ ، يُظهر التقدم في هذا المجال نتائج واعدة ستؤدي إلى اعتمادها. على سبيل المثال ، تم الوصول إلى مصدر الكربون المتحكم به في قوارير الاهتزاز من خلال الإطلاق المتحكم فيه للجلوكوز من خلال انتشاره من حبات السيليكون 65 أو تحلل السكريات في الموقع. 66 يمكن تعديل توافر الأكسجين من خلال تصميم القارورة المناسب 67 أو عن طريق إضافة زيوت مؤكسجة غير قابلة للامتزاج. 68 أخيرًا ، تم تكييف الأجهزة التي تراقب هذه المعلمات وغيرها مع الثقافات في الألواح الدقيقة وقوارير الاهتزاز بحيث يمكن العثور على أفضل الظروف لإنتاج البروتين المؤتلف. 69 ومع ذلك ، نظرًا لأن مراقبة حالة الاستزراع على مقياس اهتزاز القارورة تتضمن أجهزة متخصصة ، فإنها لا تزال غير مستخدمة على نطاق واسع.

أخيرًا ، قد يصبح الضوء قريبًا معلمة أخرى للضبط أثناء الزراعة مع إدخال T7RNAPs (Opto-T7RNAPs) المحفز للضوء الأزرق (Opto-T7RNAPs). 70 لإنشاء Opto-T7RNAP ، تم تقسيم البوليميراز إلى جزأين ، ثم تم دمج كل منهما في مثبطات محفزة للضوء. عند إضاءة الثقافة بمصابيح LED تنبعث منها ضوء أزرق ، تتفاعل المثبطات ، ويتم إنشاء T7RNAP وظيفي. وهكذا ، يعمل الضوء الأزرق كمحفز للتعبير. علاوة على ذلك ، تنفصل Opto-T7RNAP في الظلام ، مما يسمح بالتحكم الديناميكي والدقيق في إنتاج البروتين. يمكن أن تحل أنظمة الضوء الأزرق / Opto-T7RNAP محل IPTG كمحفز ، وهي ميزة جذابة ، خاصة في عمليات التخمير عالية النطاق.


إنتاج وجمع وتنقية البروتينات المؤتلفة

تم إنتاج العديد من البروتينات بواسطة نواقل التعبير عن الثدييات. يتم زيادة محصول تخليق البروتين في بعض الحالات عن طريق إدخال intron بين المروج والجين المستنسخ. ومع ذلك ، فإن سبب ذلك غير واضح.

تعبير منسق:

من خلال تنسيق التعبير عن الجين المستنسخ والواسم المحدد ، يمكن زيادة إنتاج البروتين المؤتلف. يوضح الشكل 11.5 التعبير المنسق لـ DHFR (علامة) والجين المستنسخ. يتم إدخال جين DHFR بالقرب من الجين المستنسخ وكلاهما يخضعان لسيطرة محفز واحد وتسلسلات نهائية (polyadenylation). جين DHFR محاط بتسلسل الإزالة الداخلية. عندما يتم التعبير عن الجينات ، يتم تصنيع DHFR بواسطة نسخة أولية بينما يتكون البروتين المؤتلف من mRNA المقسم.

التعبير عن اثنين من الجينات المستنسخة:

تتكون بعض البروتينات من وحدتين أو أكثر. على سبيل المثال ، الهيموغلوبين هو رباعي الأسطوانات بنسختين من كل وحدة فرعية ، أي α2β2. يمكن تصنيع كل وحدة فرعية بشكل منفصل عن طريق الجين المستنسخ المقابل ، ثم يتم خلطها لتشكيل البروتين المتعدد في المختبر. هذه الطريقة ليست مرضية للغاية لأن التجميع المختبر للبروتينات المتعددة ليس فعالاً. تم تطوير تقنيات في السنوات الأخيرة لإنتاج نوعين مختلفين من البروتينات (أي وحدات فرعية من بروتين متعدد الوحدات) في نفس الخلية في وقت واحد.

نظام التعبير ثنائي الاتجاه:

يتم نقل اثنين من نواقل التعبير ، يحمل كل منهما جينًا مستنسخًا لكل وحدة فرعية ، إلى خلايا مضيفة (الشكل 11.6). تقوم هذه الجينات بترميز وحدات البروتين الفرعية المقابلة. ثم يتجمعون لتشكيل بروتين وظيفي. نظام التعبير ثنائي النواقل له قيود معينة - فقدان ناقل واحد ، الإفراط في التعبير عن الجين المستنسخ في أحد النواقل. هذا يسبب عدم توازن في تكوين وتجميع الوحدات الفرعية.

ناقل التعبير الجيني:

يتم استخدام ناقل واحد يحمل جينات مستنسخة للتغلب على المشكلة المذكورة أعلاه. يمكن وضع الجينين تحت السيطرة المستقلة للمحفزات وتسلسلات عديد الأدينيل (الشكل 11.7) لإنتاج البروتين المُجمع بوحدتين فرعيتين. ومع ذلك ، لا تضمن هذه الطريقة إنتاج كميات متساوية من وحدتين فرعيتين.

ناقل التعبير Dicistronic:

يمكن بناء ناقل ديسيسترونيك بجينين مستنسخين مرتبطين ببعضهما البعض في تسلسل صغير من الحمض النووي يحتوي على موقع دخول ريبوزومي داخلي (IRES). تسمح IRES ، الموجودة في فيروسات الثدييات ، بالنسخ والترجمة في وقت واحد لإنتاج البروتين المجمع (الشكل 11.8). يخضع نسخ الجين IRES لسيطرة محفز واحد وإشارات إنهاء. باستخدام ناقل التعبير dicistronic ، يمكن تحقيق تخليق كميات متساوية من وحدات البروتين الفرعية.

جمع وتنقية البروتينات المؤتلفة:

عندما يتم إنتاج البروتينات المؤتلفة بواسطة الجينات المستنسخة ، فإنها تبدأ في التراكم. المهمة التالية هي جمع وتنقية منتج الجين المحدد ، أي البروتين المطلوب. هذه ليست مهمة سهلة لأن البروتين المؤتلف في كثير من الأحيان يكون غريبًا على الخلية المضيفة التي تمتلك آلية إنزيمية لتحطيم البروتينات الخارجية.

وبالتالي ، يمكن أن يتحلل الأنسولين البشري المنتج في الخلايا المضيفة البكتيرية بواسطة البروتياز. يمكن حل هذه المشكلة باستخدام سلالات بكتيرية (مثل الإشريكية القولونية) ناقصة في البروتياز. ولكن هناك عيبًا لأن البروتياز عبارة عن إنزيمات دفاعية ، وبالتالي فإن السلالات الجديدة التي تفتقر إلى هذه الإنزيمات تكون عرضة للتدمير السهل.

في نهج بديل ، يتم دمج البروتينات المؤتلفة مع البروتينات المضيفة الأصلية. تقاوم بروتينات الاندماج نشاط البروتياز. في بعض الأحيان ، تتراكم البروتينات الأجنبية على شكل تكتلات في الكائن الحي المضيف ، مما يقلل من تحلل الأنزيم البروتيني. تكمن مشكلة تراكمات البروتين في أن النشاط البيولوجي قد يُفقد أثناء استخلاص البروتين من التكتلات.

تصدير وإفراز البروتينات المؤتلفة:

يكون إنتاج البروتينات المؤتلفة فعالاً إذا تم تصديرها وإفرازها بسرعة في البيئة (الوسط المحيط). علاوة على ذلك ، فإن استعادة البروتينات الأجنبية وتنقيتها أسهل من البروتينات المصدرة. بُذلت جهود جادة لتطوير طرق لزيادة تصدير البروتينات المؤتلفة.

تفرز بعض أنواع البكتيريا العصوية الرقيقة كميات كبيرة من البروتينات خارج الخلية. يتم إدخال تسلسل قصير للحمض النووي ، يسمى تسلسل الإشارة من هذه الأنواع ، في B. subtilis الأخرى. تنتج هذه البكتيريا الحمض النووي المؤتلف الموسوم بببتيد الإشارة ، والذي يعزز التصدير والإفراز (الشكل 11.9). يمكن إزالة إشارة الببتيد بعد تنقية البروتين الأجنبي.

في الواقع ، تم استخدام تسلسل الإشارة وببتيد الإشارة بشكل فعال لإنتاج الأنسولين المؤتلف.

تنقية البروتينات المؤتلفة:

هناك العديد من التقنيات المستخدمة لتنقية البروتينات المؤتلفة من خليط من البروتينات المفرزة.

بروتينات الانصهار والتنقية:

تم وصف إنتاج بروتين الاندماج. إلى جانب تقليل التدهور ، تعمل بروتينات الاندماج على تبسيط تنقية البروتينات المؤتلفة. نناقش بإيجاز اثنين من تقنيات التنقية أدناه.

علامات التقارب:

في هذه التقنية ، يتم ربط تسلسل DNA الصغير للببتيد (تسلسل قصير من الأحماض الأمينية) بالجين المستنسخ. هذا الببتيد ، بدوره ، له صلة بالارتباط بمركب أو جزيء ضخم أو حتى عنصر. يعمل تسلسل الأحماض الأمينية الموسومة ، والذي يشكل جزءًا من البروتين المؤتلف كعلامة تقارب أو علامة تعريف. تم وصف استخدام علامة hexahistidine بإيجاز في العمود التالي.

تسلسل الحمض النووي الذي يشفر لستة بقايا هيستيدين (His6) مرتبط بجين مستنسخ. بروتين الاندماج (أي البروتين المؤتلف الموسوم بـ His6) يمكن عزله عن طريق تمرير خليط مستخلص الخلية عبر عمود معبأ بحبيبات agarose حمض النيكل وثرياسيتيك.

يرتبط البروتين المؤتلف المطلوب من خلال بقايا هيكساهيستيدين بأيونات النيكل (Ni 2+). يمكن استخلاص بقية البروتينات بسهولة من العمود. يمكن بعد ذلك التخلص من بروتينات الاندماج المرتبطة عن طريق خفض درجة الحموضة في محلول المخزن المؤقت. بالتناوب ، يمكن إزالة بروتينات الاندماج بشكل انتقائي عن طريق ربط علامة heaxahistidine بمركب منافس مثل imidazole.

الخطوة التالية هي إزالة علامة hexahistidine. يمكن القيام بذلك عن طريق الهضم مع البروتياز الذي يعمل على وجه التحديد في موقع العلامة. هناك حاجة لإزالة بقايا هيكساهيستيدين فقط إذا تم استخدام البروتين المؤتلف كعامل علاجي. لجميع الأغراض الأخرى ، تعتبر علامة hexahistidine مقبولة ، لأنها لا تتدخل في البنية والوظيفة الطبيعية للبروتينات.

تنقية الانجذاب المناعي:

تم وصف تقنية تنقية كروماتوغرافيا الانجذاب المناعي لبروتينات الاندماج مع إشارة خاصة إلى الإنترلوكين -2 البشري. ينضم جين lnterleukin-2 إلى تسلسل DNA صغير يشفر علامة الببتيد (الذي يصنع 8 أحماض أمينية ، Asp-Tyr-Lys-Asp- Asp-Asp-Asp-Lys) ينتج بروتين اندماج في الخميرة (S. cerevisiae). الببتيد الواسم له وظيفة مزدوجة - يقلل من تحلل الإنترلوكين 2 ، إلى جانب المساعدة في تنقيته.

يمكن تنقية بروتين الاندماج ، إنترلوكين -2 المرتبط بببتيد محدد بواسطة كروماتوجرافيا الانجذاب المناعي (الشكل 11.10). يتم تجميد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المحددة (MAb) ضد الببتيد الواسم على دعامة من مادة البولي بروبيلين. تعمل هذه MAb على أنها يجند (الأجسام المضادة الببتيدية المضادة للواسمات) وترتبط بشكل انتقائي ببروتينات الاندماج الموسومة بببتيد الواسم. ومع ذلك ، فإن البروتينات المتبقية تمر عبر عمود الانجذاب المناعي. يمكن استخلاص بروتينات الاندماج المنقى مناعيًا لاحقًا من العمود.


7 خطوات متضمنة في تحضير DNA المؤتلف

تسلط النقاط التالية الضوء على الخطوات السبع التي ينطوي عليها تحضير الحمض النووي المؤتلف. الخطوات هي: 1. اختيار الحمض النووي الهدف 2. اختيار ناقل DNA أو ناقل DNA مناسب للاستنساخ 3. اختيار نوكليازات تقييدية 4. إجراء لإنتاج الحمض النووي المؤتلف (rDNA) 5. إدخال الحمض النووي الريبي في الخلية المضيفة 6. اختيار الخلايا المحولة / المنقولة و 7. عزل الخلية التي تحتوي على ناقل الحمض النووي الريبي المتجه الذي يحمل الجين محل الاهتمام

الخطوة رقم 1. اختيار الحمض النووي المستهدف:

يتم اختيار الحمض النووي المستهدف مع مراعاة النقاط التالية:

(أ) ينبغي أن يكون من السهل استخراجها من مصدر وجودها الطبيعي.

(ب) ينبغي أن يكون من الممكن دمجه في المتجه في مثل هذا المكان حيث يمكن استنساخه ونسخه وترجمته حسب الرغبة.

(ج) يجب أن يكون منتج الجين (البروتين) المنتج مهمًا تجاريًا أو مهمًا لأغراض البحث.

(د) قد يكون الحمض النووي الغريب (الجين) محل الاهتمام فيروسيًا أو بكتيريًا أو من أصل نباتي أو حيواني.

يتم استنساخ جينات البروتينات التالية بشكل عام ، أي يتم إدخالها في ناقل الحمض النووي والحمض النووي المؤتلف المنتج والبروتين المستخرج للاستخدام البشري.

خطوة # 2. اختيار ناقل DNA مناسب أو ناقل DNA مناسب للاستنساخ:

ناقل الاستنساخ هو جزيء الحمض النووي الذي يتم فيه إدخال الحمض النووي المستهدف لإنتاج جزيء الحمض النووي المؤتلف. إن وسيلة الاستنساخ الجيدة هي تلك التي تحتوي على موقع واحد فقط للقطع بواسطة نوكلياز داخلي محدد. هناك أنواع مختلفة من النواقل التي يمكن استخدامها لاستنساخ أجزاء من الحمض النووي الغريب ونشرها (استنساخها) في مضيف مناسب.

بلازميد:

هذه عناصر وراثية غير صبغية موجودة في مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية. وهي عبارة عن جزيئات DNA دائرية مزدوجة مجدولة ومغلقة يتراوح حجمها من 1 كيلو بايت إلى 200 كيلو بايت. غالبًا ما تحتوي البلازميدات على جينات ترميز للإنزيمات التي تكون في ظل ظروف معينة مفيدة للمضيف البكتيري.

الأنماط الظاهرية التي تمنحها البلازميدات المختلفة هي:

أنا. مقاومة المضادات الحيوية.

ثانيا. إنتاج المضادات الحيوية.

ثالثا. تدهور المركبات العضوية المعقدة.

رابعا. إنتاج الكوليسين.

v. إنتاج السموم المعوية.

السادس. إنتاج إنزيمات التقييد والتعديل.

لكي يكون البلازميد مفيدًا كناقل استنساخ ، يجب أن يمتلك عدة خصائص ، مثل:

أنا. يجب أن يحمل واحدًا أو أكثر من العلامات القابلة للتحديد للسماح بتحديد الأشكال المتحولة والحفاظ على البلازميد في التجمعات البكتيرية.

ثانيا. يجب أن يحتوي على موقع التعرف الفردي لواحد أو أكثر من إنزيمات التقييد في مناطق البلازميد غير الضرورية للنسخ المتماثل.

ثالثا. يجب أن تكون صغيرة نسبيًا ويجب تكرارها بطريقة مريحة.

رابعا. يفضل وضع مواقع التقييد هذه ، التي يمكن إدخال دنا أجنبي فيها ، داخل الجينات المشفرة للواسمات الانتقائية ، بحيث يؤدي إدخال جزء دنا أجنبي إلى تعطيل الجين.

بعض البلازميدات شائعة الاستخدام كناقلات لتحضير الحمض النووي المؤتلف هي- pMB-9 ، pBR- 322 ، pBR-325 ، pKC-7 ، pAC-4 ، C-184 ، pAC-105 ، pMK-16 ، pMF-3 ، pBRHl و pUB-110 و pCB-16.

العاثيات:

تُعرف العاثيات بشكل شائع باسم العاثيات. هم الفيروسات التي تصيب البكتيريا. على غرار الفيروسات الأخرى ، فإن العاثيات بسيطة جدًا تحتوي على غلاف بروتيني يسمى قفيصة ، يحيط بجزيئات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي مثل الجينوم. تشمل الجينات في هذا الجينوم جين النسخ المتماثل لـ DNA / RNA للعاثية وجين غلاف البروتين.

بكتريوفاج لامدا (λ):

تحدث العدوى بسبب جسيم الملتهمة عن طريق مهاجمة السطح الخارجي للبكتيريا وحقن كروموسوم الحمض النووي الخاص بها في الخلية. هذا الحمض النووي ، حوالي 50 كيلو بايت ، خطي مزدوج تقطعت به السبل ، مع نهايات تكميلية مفردة تقطعت بهم السبل من 12 نيوكليوتيد في الطول (نهايات متماسكة) ، يتم ترتيبها في دائرة في الخلية المضيفة من خلال اقتران النهايات المتماسكة ويتم نسخها على أنها جزيء دائري ، خلال المرحلة المبكرة من العدوى. خلال هذه المرحلة ، قد تعتمد العاثية إما المرحلة التحليلية أو الطور اللايسوجيني.

في سياق الطور التحليلي ، يظل دنا الملتهمة مستقلاً في الخلية ، ويتكرر ، ويكود بروتينات القفيصة ويشكل عددًا كبيرًا من جزيئات الملتهمة داخل الخلية ، مما يؤدي إلى تحلل (تكسر) الخلية البكتيرية وبالتالي إطلاق جسيم العاثية. في سياق المرحلة اللايسوجينية ، يتم دمج الحمض النووي للعاثية في الكروموسوم البكتيري ويوجد كذلك في العديد من الانقسامات الخلوية ، وفي الوقت نفسه يتم تركيب مكونات القفيصة وتخلخلها وإطلاق جزيئات الملتهمة من حين لآخر. قد يتحول هذا إلى مرحلة ليتي في أي وقت.

الجراثيم M13:

إنها فجوة DNA صغيرة جدًا ، مفردة تقطعت بهم السبل تبلغ 10 كيلو بايت. يحدث حقن جزيء M13 DNA في الإشريكية القولونية عبر Pilus ، أي الهيكل الذي يربط خليتين أثناء الاقتران الجنسي. يقوم الحمض النووي داخل الخلية بتوليف خيط تكميلي ويصبح الوسيط المزدوج الذي تقطعت به السبل والمعروف باسم الشكل التكراري (RF).

الخصلة الأصلية هي (+) الخصلة ، والشريط التكميلي هو (-) الخصلة المصنوعة في البكتيريا. يتم تغليف الخيط (+) فقط في معاطف الملتهمة الجديدة. يعمل RF لـ Ml3 مثل البلازميد ، والذي يمكن الحصول عليه بسهولة من خلايا الإشريكية القولونية واستخدامها لتقنية rDNA. بعض متجهات M13 هي M13 mp2 و M13 mp5 و fdlOl و fdl07 و fd-tet.

الكوسميدات:

Cosmid هو ناقل استنساخ يتكون من موقع lambda cos (امتدادات متماسكة مفردة مجدولة في نهايات جزيء الحمض النووي) يتم إدخالها في بلازميد ، وتستخدم لاستنساخ أجزاء DNA يصل حجمها إلى 40 كيلو بايت. الحد الأقصى لحجم الحمض النووي الذي يمكن إدخاله في أي بلازميد هو 5 كيلو بايت وأن حجم البكتيريا Ml3 أقل من 3 كيلو بايت.

ومن ثم سيكون من الصعب إدخال واستنساخ جينات كبيرة ، خاصة تلك الخاصة بالحمض النووي حقيقية النواة. السابق. جين الكولاجين alpha-2 للدجاج هو 38 كيلو بايت. ومن ثم تم تعديل جينوم لامدا العاثية بواسطة كولينز وجون في عام 1978 عن طريق حذف بعض القواعد وإدخال تسلسلات تمديد تكميلية مفردة تقطعت بهم السبل في نهايات جزيء الحمض النووي الخاص بها المسمى موقع Lambda Cos ، من أجل تسهيل إدخال واستنساخ جزيئات الحمض النووي الكبيرة.

نظرًا لقدرتها على الاحتفاظ بحمض نووي كبير الحجم ، يتم استخدام الكوسميدات لإنشاء مكتبة جينومية ، أي مجموعة من الجينات المؤتلفة التي تحتوي على الحمض النووي الكامل الموجود في كائن حي فردي. لقد أثبت بناء المكتبات في نواقل العاثيات X أنها وسيلة فعالة لعزل أجزاء من الحمض النووي من جينومات حقيقية النواة المعقدة.

يتم تحديد الكوسميدات من خلال:

1. علامة مقاومة للأدوية وأصل بلازميد للنسخ المتماثل.

2. موقع واحد أو أكثر من مواقع التقييد الفريدة للاستنساخ.

3. جزء من الحمض النووي يحمل النهايات المتماسكة المربوطة (موقع كوس) للعاثية X.

4. حجم صغير لاستيعاب شظايا DNA حقيقية النواة بطول 40-45 كيلو بايت.

خطوة # 3. اختيار نوكليازات تقييدية:

إنها نوكليازات داخلية (إنزيمات) تقطع جزيئات الحمض النووي والكرات فقط عند عدد محدود من متواليات النوكليوتيدات المحددة التي تكون متناظرة غير ميثيلية. يعطي عمل بعض نوكليازات الحمض النووي شظايا DNA ذات نهايات لزجة / متماسكة بينما يعطي البعض الآخر شظايا DNA غير حادة الأطراف. يتم عرض عدد قليل من نوكليازات التقييد في الشكل.

خطوة # 4. إجراء إنتاج الحمض النووي المؤتلف (rDNA):

(أ) إعداد استنساخ بنيات الحمض النووي المتجهية:

يتم استخلاص الحمض النووي المستهدف من الكائن المصدر الذي يمكن أن يكون إما بكتيريا أو فطريات أو نباتًا أو DNA خلية حيوانية ، من خلال طرق تحليلية مختلفة يتم من أجلها فتح الخلايا أولاً لتحرير المحتويات إما عن طريق التعطيل الميكانيكي (طحن المواد المجمدة) أو عن طريق استخدام مواد كيميائية مثل الليزوزيم ، EDTA ، المنظفات - كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، إلخ ، إما بمفردها أو بالاشتراك مع مادة كيميائية واحدة أو أكثر.

ثم يتم تنقية الحمض النووي من مستخلص الخلية الذي يتم معالجة المستخلص من أجله بالبروتياز والنوكليازات الداخلية ثم يتم ترسيب البروتينات بالفينول والكلوروفورم وطردها في النهاية. سيتم قياس الحمض النووي في مقياس الطيف الضوئي عند 260 نانومتر ، عند هذا الطول الموجي للامتصاص (أ260) من 1.0 يتوافق مع 50 جالونًا من الحمض النووي مزدوج الشريطة / مل.

يمكن أيضًا استخدام هذا الامتصاص فوق البنفسجي للتحقق من نقاء الحمض النووي حيث تكون نسبة امتصاص الحمض النووي عند 260 نانومتر و 280 نانومتر (A260280) هو 1.8. تشير النسبة الأقل من 1.8 إلى أن المستحضر ملوث إما بالبروتين أو بالفينول. يتم اتباع إجراء مماثل لاستخراج الحمض النووي من النواقل. The target DNA is then inserted into the vector DNA, by various procedures.

Two of them are described below:

(i) rDNA formation by the use of restriction endonuclease creating sticky ends:

To join together two duplex DNAs from different species, the two DNAs are separately acted upon by the same restriction endonuclease (BamHI) giving staggered (cohesive/sticky) two stranded cut. Therefore the staggered ends of the two DNAs will be complementary in sequence. Then the two cut DNAs are heated, mixed and cooled, so the sticky ends will base-pair to produce a new kind of recombinant DNA which is joined by DNA ligase.

(ii) rDNA formation by use of restriction endonuclease creating blunt ends:

Both the target DNA and the vector DNA are acted Upon by the same restriction endonuclease (Haelll) producing blunt ends. Poly ‘G’ tails are added at the 3′ ends on both strands of the target duplex DNA and poly ‘C’ tails at the 3′ end of the vector DNA by the use of enzyme terminal transferase. Since these two added tails are complementary to each other, they will enable the two DNAs to be paired with the created cohesive ends upon heating and cooling. The nicks are joined by the enzyme ligase.

(b) Preparation of Complementary DNA (cDNA):

It is a cloning technique which involves the con­version of purified mRNA to DNA, prior to its insertion into a vector. Depending upon the source of mRNA its purification procedure varies and in fact many methods for purification of mRNA are avail­able.

The mRNA of interest i.e. beta-globin gene mRNA is obtained by lysing the reticulocytes and the polyribosomes are collected by centrifugation and treated with antibody specific for this protein. The antibody will attach to the just complete protein on the polyribosome and precipitate it. From this precipitate the mRNA is obtained by affinity column chromatography.

The mRNA obtained so, is used as a template and a complementary DNA (cDNA) is made with the enzyme reverse transcriptase. All eukaryotic mRNAs contain poly ‘A’ tails at the 3′ end. Therefore a poly T nucleotide is added, which base pairs with the poly ‘A’ tail of mRNA. This serves as the primer for the enzyme reverse transcriptase that now tran­scribes the mRNA to make a new complementary strand of cDNA.

The mRNA is then removed and the single stranded cDNA is now replicated by DNA polymerase-I to yield a ‘hairpin’ double stranded DNA. The hair pin and poly A & T tails are cleaved by nucleases. Thus a synthetic double stranded cDNA, specific for the protein beta-globin is produced.

The complimentary DNA prepared above is inserted into a vector (plasmid, phage-DNA etc.). For insertion, a poly ‘A’ tail is added to the opposite 3′ ends of the two strands of the duplex cDNA by terminal transferase. Then the plasmid or vector is opened at a single point to yield the linear DNA by the action of restriction endonuclease producing flush/blunt ends.

Conversely, poly ‘T’ tails are attached to the two 3′ ends of the linear plasmid vector. The tailed linear plasmid and the tailed DNA are allowed to undergo base pairing by heating, mixing and cooling, thereby forming an enlarged circular plasmid containing the new gene i.e. the rDNA. The ends are joined by ligase.

(c) Construction of a DNA Probe:

If the amino acid sequence of a protein/peptide is known then a DNA probe can be chemically synthesized and used to prepare a rDNA and thus clone it in a suitable host. This DNA probe can also be used to screen the gene for this particular protein/peptide in the genomic library.

The DNA probe obtained by this method is not the exact sequence as present naturally in the genomic DNA, because the genetic code is degenerate i.e. more than one codon exists for some of the amino acids. Hence all the possible coding sequences for a given amino acid sequence have to be prepared.

Supposing the following is the amino acid sequence of a part of a peptide:

The nucleotide sequence obtained in any one of the mentioned sequences above, will serve the purpose of formation of rDNA and it’s cloning, resulting in the production of the same desired protein/peptide.

Step # 5. Introduction of the rDNA into a Host Cell:

The rDNA produced in the 4 th step above can be cloned (made into many copies) and/or its gene product expressed by introducing it into a suitable host. Various methods are adopted for introduction of the different vectors into different hosts. Any DNA molecule can be introduced into any living cell and the process is called transformation. Transfection is a process of introduction of purified phage DNA.

(a) When the DNA molecule is kept in close proximity of bacterial cells, most species of bacteria are able to take up DNA molecules from the medium without any difficulty.

(b) Some species of bacteria cannot take DNA easily hence they have to be treated physically and/ or chemically in order to make them competent to take up DNA molecules.

(c) E. coli cells incubated with ice-cold solution of 50 mM calcium chloride at 4°C for 30 minutes, become competent to take up DNA molecules, wherein the DNA molecules get attached to the cell exterior. Later the DNA molecules enter the cell upon incubation at 42°C for 2 minutes.

(d) Even after the above mentioned physical/and/or chemical treatment, only 0.01% of the bacterial cells in the same culture gets transformed. Hence the transformed cells have to be selected from non-transformed cells.

(e) Transfection of phage DNA into bacterial cells is also done by the same procedure as that of plasmid introduction into E. coli cells, described above (a) to (d).

(f) Transfection can also be done by packaging the phage DNA into the mature lambda phage particle and then infecting the bacterial cells with it.

(g) The yeast cells of Saccharomyces cerevisiae are transformed by treatment with lithium chloride or lithium acetate.

(h) Calcium phosphate, DEAE dextran and protoplast fusion are used to introduce DNA into the ani­mal cells.

(i) The cell wall of fungal and plant cells are broken by enzymes to get the intact protoplast, which can easily take up DNA. In some cases, the transformation of protoplast is stimulated by a special technique called electroporation. The transformed protoplast reforms the cell wall, divide and regenerate a transformed organism.

(j) An alternative method of introducing any DNA into any of the living cells is by microinjection, using a fine syringe, DNA molecules are directly injected into the nucleus of the cell to be transformed.

Step # 6. Selection of the Transformed/Transfected Cells:

All the cells, incubated in the same culture with the rDNA do not take up the DNA even after physical and/or chemical treatment. Only 0.01% of the total cells incubated becomes competent and takes up DNA to be inserted. Rest of the cells remain without taking up the DNA. Therefore there should be some procedure by which the cells that have taken up the external DNA can be sorted out from those cells which have not taken up the external DNA.

There are various methods for distinguishing the transformed cells from the non-transformed cells, which depends upon the type of vector used and the type of the cell transformed. The basic principle in all these methods is the use of a ‘marker’ i.e. either the vector or the transformed cell will either be resistant or sensitive to an antibiotic and/or will synthesize or be devoid of an enzyme acting on a metabolite and converting it into some recognizable product. Thus the ‘markers’ are the antibiotics and/or enzymes to which the transformed cells respond.

One of the example based on which all the above phenotypic markers are selected, is that of the plasmid cloning vector pBR322. E. coli cells are normally sensitive to the antibiotic ampicillin and tetracycline i.e. they die if the medium in which they are grown is supplied with these antibiotics.

E. coli cells which take up the plasmid vector pBR 322 become resistant to ampicillin and tetracycline antibiotics because pBR 322 has two sets of genes, one set of gene that codes for P-lactamase enzyme that modifies ampicillin into a form that is non-toxic to the bacterium and a different set of genes that codes for enzymes that detoxify tetracycline.

So, those E. coli cells which have taken pBR322 (i.e. transformed cells) can be sorted out from the cells which have not taken pBR322 (i.e. non-transformed cells) by growing all the cells in medium containing ampicillin and tetracycline wherein the cells containing the plasmid pBR322, survive, whereas the cells devoid of pBR322 die.

This is to say that the E. coli cells have transformed from ampicillin and tetracycline sensitive (amp s -tet s ) to ampicillin and tetracycline resistant (amp R -tet R ) cells. rDNA prepared using the plasmid pBR322, when entered into an E. coli cell exhibits only ampicillin resistance but not tetracycline resistance, because the restriction endonuclease (Bam-II) used, cleaves pBR322 in the gene for tetracycline resistance, hence this gene gets inactivated.

Step # 7. Isolation of the Cell Containing Insert-vector rDNA Holding the Gene of Interest:

In the 6 th step the transformed cells i.e. those cells that have taken up the rDNA are sorted out. Now from these cells the cell containing the gene of interest has to be isolated. The complete human genomic DNA is cleaved into about 7,00,000 pieces by the action of the restriction endonuclease and all of these DNA fragments can be inserted into a cosmid and such an insert containing all the genomic DNA of an organism is called genomic library.

An E. coli genomic library contains all E. coli genes and likewise human genomic library contains all human genes, so on and so forth. From this gene library any one gene, which is commercially important i.e. for example insulin gene, beta-globin gene, growth hormone gene etc., has to be isolated. For this each cell is cloned separately and different procedures are adopted to select the desired clone.

All these procedures are based on two basic themes:

1. Direct Selection of the Desired Gene:

This is just like marker selection procedure, described above, where selection occurs directly in the culture plate itself by the detection of the presence of the protein product of that gene.

2. Identification of the Clone from a Genomic Library:

In this an initial “shot gun” cloning is done to clone all the genes in the genomic library and each gene clone is identified separately by one of the following methods:

(a) By analysing the expression of the gene product.

(b) A DNA probe can be synthesized chemically with a complementary sequence to the desired gene and used to hybridize the DNA from each clone.

(c) A complementary DNA (cDNA) can be prepared from mRNA for a particular gene and then hybridized with the DNA insert.

Hybridization of DNA with another DNA can be done or DNA with RNA or RNA can be hybrid­ized with another RNA, for which different methods are developed.

A few among them are:

أنا. When DNA-DNA hybridization is made then it is known as southern blotting.

ثانيا. When DNA-RNA hybridization occurs, it is known as northern blot.

ثالثا. When RNA-RNA hybridization occurs, it can be called eastern blot. Actually eastern blot is named for hybridization between protein and ginseng (plant glycoside) so as to identify small molecules like cholesterol, phospholipids etc.

iv. When protein-protein hybridization takes place, it is known as western blotting.

Southern and northern blot hybridization:

DNA is fragmented by restriction endonuclease and then separated by electrophoresis. The DNA is then denatured and filtered on nitrocellulose. To this filter is added radio labelled 32 P-DNA probe, with base sequence complementary to the DNA (gene) of interest, which will hybridize (stick/base pair/anneal) to the complementary DNA. The position of hybridization is detected by autoradiography. The radiolabelled probe specific for gene under study can be purified RNA, a cDNA, or a segment of DNA cloned in E. coli.

In AIDS diagnosis, the component protein of HIV-virus are separated in polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and trans blotted onto nitrocellulose strips, which are then incubated with individual’s serum. Any HIV antibodies present, bind to viral proteins contained on test strip. The bound antibody visualized by using a conjugate enzyme and chromogenic.

Dot-blot hybridization:

The procedure is the same as southern/northern blotting, but the only difference is that the DNA fragments are not separated by electrophoresis, instead they are directly applied as a dot on nitrocellulose and hence it is known as dot-blot hybridization.

Uses of rDNA technology/gene cloning:

The uses of rDNA technology/gene cloning are enormous and wide spread in all the fields of biological sciences. rDNA technology is being implemented in newer and newer fields of application.

To quote a few uses of rDNA in use at present are:

(1) By the use of rDNA technology, genes of interest can be inserted, so as to treat various diseases.

(2) Hereditary diseases can be diagnosed in the fetus itself.

(3) rDNA and gene cloning helps in the sequencing of DNA/gene.

(4) Various genes in the chromosomes can be located and the integrated viral genes can be traced out in it.

(5) Mechanism of gene regulation can be studied.

(6) Desired proteins like insulin, hormones, interferon’s, vitamins can be manufactured in bacteria on an industrial basis.

(7) Improved antibiotics can be produced from mixtures of genes from different bacteria.

(8) Recombinant vaccines can be produced by rDNA technology.

Synthesis of human insulin (humulin) using rDNA technology:

Diabetic patients, whose elevated sugar levels are due to impaired insulin production, have been treated with insulin derived from the pancreatic glands of abattoir animals. Though bovine and porcine insulin are similar to human insulin, their composition is slightly different. Consequently, a number of patients’ immune systems produce antibodies against it, neutralizing its actions and resulting in inflammatory responses at injection sites.

This led to synthesizing human insulin i.e. ‘humulin’ by inserting the insulin gene into a suitable vector, the E. coli bacterial cell, to produce insulin that is chemically identical to its naturally produced counter­part. The genetic code for insulin is found in the DNA at the top of the short arm of the eleventh chromosome. It contains 153 nitrogen bases (63 in the chain A and 90 in the chain B).

Manufacturing humulin:

DNA with specific nucleotide sequences for A and B polypeptide chains of insulin are synthesized chemically. 63 nucleotides are required for synthesizing the chain A and 90 for the B chain, plus a codon at the end of each chain, signalling the termination of protein synthesis.

An anticodon, incorporating the amino acid methionine, is then placed at the beginning of each chain which allows the removal of the insulin protein from the bacterial cell’s amino acids. The synthetic A and B chain ‘genes’ are then separately inserted into the gene for a bacterial enzyme β-galactosidase, which is carried in the vector’s plasmid. Insertion of the A gene is carried out by use of the restriction enzyme EcoRl and for B gene Hind-III is used. The recombinant plasmids are then introduced into E. coli cells. The insulin gene is expressed as it replicates with the P-galactosidase as the cell multiplies.


الانتماءات

UC Davis Genome Center, University of California, Davis, USA

Martin Dragosits & Ilias Tagkopoulos

Department of Biomedical Engineering, University of California, Davis, USA

Department of Computer Science, University of California, Davis, USA

Department of Chemistry, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, Vienna, Austria

Martin Dragosits, Daniel Nicklas & Ilias Tagkopoulos

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

المؤلف المراسل


شاهد الفيديو: ESCHERICHIA COLI or a kind of bacteria which common cause of Urinary Tract Infection or UTI (شهر نوفمبر 2022).