معلومة

تنظيف لوحة PCR في الوقت الحقيقي

تنظيف لوحة PCR في الوقت الحقيقي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل استخدم أي شخص PCR في الوقت الفعلي ، هل أن لوحة PCR في الوقت الفعلي تستخدم مرة واحدة أم لا؟ وإلا كيف لتنظيف اللوحة بعد التفاعل لمنع النتيجة الخاطئة في المرة القادمة التي تستخدم فيها؟


الحل المحتمل هو استخدام الحمض النووي انطلق حل ، أعرف أن العديد من الأشخاص يستخدمونه في المعامل المجاورة وكانوا سعداء بتنظيف طاولة العمل الخالية من الحمض النووي. تنص ورقة المنتج

عندما يتم تجفيف 500 نانوغرام من قالب الحمض النووي في أنبوب PCR ، فإنه يصبح غير قابل للتضخيم عند العلاج باستخدام الحمض النووي انطلق حلول. تظهر التجارب الإضافية أن الحمض النووي يتحلل إلى نيوكليوتيدات حرة.

يرجى ملاحظة أنني لا أروج لأي منتج معين هنا ويمكنك شراء أي منتج / تقنية مماثلة لتطبيقك المحدد. بوضوح أفضل توصية هي استخدام لوحات جديدة لكل تفاعل ولكن هذا / منتج مشابه يمكن أن يكون خيارًا أيضًا على الرغم من أن خطر تلوث الحمض النووي في تفاعل قائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يجب موازنته بعناية مقابل استخدام ألواح طازجة ببساطة مع الأخذ في الاعتبار أن المنتج نفسه ليس مجانيًا أيضًا.

توفر ورقة المنتج تعليمات لتنظيف / معالجة أنابيب PCR ، ومن ثم أفترض أنك تستخدم نفس البروتوكول للألواح إذا كان لديك أجهزة الطرد المركزي اللوحية المتوفرة في مختبرك. يمكنك التخلص من المحاليل عن طريق النقر على الألواح على منديل لإخراج السائل من الآبار.


تتمثل إحدى الفضائل المزعومة لألواح RT-PCR في عدم قدرتها على ربط الحمض النووي. (انظر على سبيل المثال التشكيلة على http://www.fisher.co.uk/product/brand_listing.php/T/Thermo٪20Scientific٪20ABgene/PCR٪20plate). على هذا النحو ، كل ما عليك القيام به لإزالة الحمض النووي (الجينوم ، المضخم ، أو البادئات) هو شطفها. يشير هذا إلى أن الشطف قد يعمل أيضًا مع dNTP.

من ناحية أخرى ، العديد من أنواع لوحات RT-PCR مصنوعة من البولي كربونات القادر على ربط البروتين. سأكون قلقًا بشأن كمية غير متساوية من البوليميراز الملتصقة بالبئر. للتغلب على ذلك ، يجب إعادة استخدام ، في أي لوحة PCR ، فقط تلك الآبار التي شهدت البوليميراز من قبل.

ليس لدي أي فكرة عما إذا كانت الجزيئات الأخرى مرتبطة بالآبار ، لكن من المفترض أنها تقع على نموذج الحمض النووي أو البروتين.

سيكلفك لوحًا واحدًا وأوصافًا واحدة فقط لأربع ردود أفعال لاختبار ما إذا كانت هذه اللوحات قابلة لإعادة الاستخدام أم لا. في الجولة الأولى ، قم بقياس عينتين ، A و B ، لبعض النصوص. اشطف الآبار ، وقس العينات A و B مرة أخرى. إذا كانت نسبة النسخ A / B مختلفة تمامًا بين المحاولة الأولى والثانية ، فأنت تعلم أنه لا يمكنك إعادة استخدامها. سأكون قلقًا أيضًا إذا كان الأمر سيستغرق العديد من الدورات للوصول إلى مرحلة الهضبة في المحاولة الثانية. اجتياز هذه الاختبارات ، قد تكون مستعدًا تمامًا. إذا فشلت هذه الاختبارات ، فقد لا يزال بإمكانك استخدام الآبار المتبقية. دعنا نعرف.


6 طرق لتقليل التلوث أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل

تسمح الطبيعة الحساسة لـ PCR للعلماء باستخراج وتضخيم ملامح الحمض النووي المفيدة. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي هذا المستوى العالي من الحساسية أيضًا إلى حدوث مشكلات لأنه يمكن تضخيم النموذج الخطأ. في إدخال المدونة هذا ، سنستكشف بعض النصائح التي يجب وضعها في الاعتبار لتضمينها في بروتوكولنا.

  • 1 المقدمة
  • 2) بناء المختبر
  • 3) سير العمل أحادي الاتجاه
  • 4) تقنية سحب العينات
  • 5) تغيير القفازات بشكل متكرر
  • 6) تقنية التنظيف المعقم
  • 7) قم بتضمين الضوابط في البروتوكول الخاص بك

1 المقدمة

تعطي دراسة التعبير الجيني في خلية أو نسيج في لحظة معينة نظرة ثاقبة على قدرة الخلية على تخليق البروتين. تعتبر فحوصات التعبير الجيني ، على سبيل المثال ، التنميط الجيني ، أداة مهمة وتستخدم على نطاق واسع في دراسات السمية النانوية. هناك عدة طرق متاحة لتحديد التعبير الجيني ، مثل تحليل اللطخة الشمالية ، ومقايسة حماية الريبونوكلياز (RPA) ، والتحليل التسلسلي للتعبير الجيني (SAGE) ، والنسخ العكسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) ، وسلسلة البوليميراز الكمية في الوقت الحقيقي التفاعل (qRT-PCR) ، صفائف PCR ، والمصفوفات الدقيقة. من بين هذه التقنيات ، يظل تحليل اللطخة الشمالية طريقة قياسية لاكتشاف وتقدير مستويات الرنا المرسال على الرغم من ظهور تقنيات أكثر قوة. يتضمن النشاف الشمالي استخدام الرحلان الكهربائي لفصل عينات الحمض النووي الريبي حسب الحجم ، ثم الكشف عن الرنا المرسال بمسبار تهجين مكمل لجزء من التسلسل المستهدف. إن تقنية RPA هي تقنية حساسة للغاية لتقدير كميات معينة من الحمض النووي الريبي في المحلول. يمكن إجراؤه على الحمض النووي الريبي الخلوي الكلي أو مرنا المختار بولي (A) كهدف. تُستخدم طريقة SAGE ، بالإضافة إلى مصفوفات PCR والمصفوفات الدقيقة ، لدراسة التعبير الجيني الجزئي أو الشامل في الخلايا أو الأنسجة في ظروف تجريبية مختلفة. في هذا الفصل ، سوف نصف طرق تحديد التعبير الجيني باستخدام RT-PCR و PCR في الوقت الحقيقي. RT-PCR كأداة بسيطة وغير مكلفة وحساسة للغاية ومحددة نسبيًا لتحديد مستوى التعبير عن الجينات المستهدفة. في الوقت الحقيقي PCR هي طريقة كمية لتحديد عدد نسخ قوالب PCR ، مثل DNA أو cDNA ، وتتكون من نوعين: قائم على المسبار وقائم على مقسم. يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي المستند إلى المسبار ، والمعروف أيضًا باسم TaqMan PCR ، زوجًا من بادئات PCR ومسبار قليل النوكليوتيد الفلوروجيني الإضافي مع كل من صبغة الفلورسنت المراسل وصبغة التبريد المرفقة. تتطلب الطريقة القائمة على interalator (SYBR Green) صبغة DNA مزدوجة الشريطة في PCR والتي ترتبط بالحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل حديثًا وتولد الفلورة. تتطلب كلتا الطريقتين جهاز تدوير حراري خاص مجهز بكاميرا حساسة تراقب التألق في كل عينة على فترات متكررة أثناء PCR. التقنيات الأساسية التي يقوم عليها كل من RT-PCR و PCR في الوقت الحقيقي هي عزل RNA الكلي والنسخ العكسي (RT) و PCR. يتضمن النسخ العكسي تخليق الحمض النووي من الحمض النووي الريبي باستخدام بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي. يمكن لـ PCR تضخيم نسخة واحدة أو بضع نسخ من قطعة من الحمض النووي عبر عدة أوامر من حيث الحجم ، مما ينتج آلاف إلى ملايين النسخ من تسلسل DNA معين. هنا سوف نقدم إجراءات مفصلة لـ RT-PCR و PCR في الوقت الحقيقي.


تذييل

معلومة

آخر

Avantor & reg ، إحدى شركات Fortune 500 ، هي المزود العالمي الرائد للمنتجات والخدمات ذات المهام الحرجة للعملاء في مجال الأدوية الحيوية والرعاية الصحية والتعليم والحكومة والتقنيات المتقدمة وصناعات المواد التطبيقية. تُستخدم محفظتنا في كل مرحلة تقريبًا من مراحل أنشطة البحث والتطوير والإنتاج الأكثر أهمية في الصناعات التي نخدمها. تأتي إحدى أعظم نقاط قوتنا من امتلاك بنية تحتية عالمية ذات موقع استراتيجي لدعم احتياجات عملائنا. تمكننا بصمتنا العالمية من خدمة أكثر من 225000 موقع للعملاء وتمنحنا وصولاً مكثفًا إلى مختبرات البحث والعلماء في أكثر من 180 دولة. نضع العلم في حركة لخلق عالم أفضل. للحصول على معلومات ، قم بزيارة www.avantorsciences.com وتجدنا على LinkedIn و Twitter و Facebook.

& نسخ 2021 VWR International، LLC. كل الحقوق محفوظة.
& نسخ 2021 FORTUNE Media IP Limited جميع الحقوق محفوظة. مستخدمة بموجب ترخيص.

لا يدعم موقع الويب هذا إصدار Internet Explorer الخاص بك. نوصيك بالترقية إلى Internet Explorer 11 أو مستعرض آخر مدعوم ، والتحقق لمعرفة ما إذا كنت تستخدم IE11 في وضع عرض التوافق.


أطلق العنان للإمكانيات.

نظام MagNA Pure 24 الجديد. أتمتة التنقية النووية بكل ثقة.

قد لا يروي مزيجك الرئيسي القصة كاملة.

نطالب بالحقيقة. اطلب Evoscript.

مرحبًا بكم في عصر جديد من شركة Roche ضمن علوم الحياة

نحتفل بالطلاب والباحثين والمديرين الذين يعملون بلا كلل في السعي وراء الاكتشاف. من خلال تطوير الأدوات والكواشف التي تعتمد عليها كل يوم ، فإننا نسعى جاهدين لدعم اختراقك التالي حتى تتمكن من التركيز على ما تفعله: الاكتشاف.

صنعت لاكتشاف المزيد.

ارتقِ بجهاز qPCR إلى المستوى التالي مع مزيج Multiplex Master الجديد المركّز 5x من Roche. اكتشف عددًا أكبر من الأهداف لكل تفاعل ، واعمل بشكل أكثر كفاءة ، وزد عيناتك القيمة.

فحوصات وحدات LightMix

تمكّنك فحوصات LightMix Modular CE-IVD المعيارية في التصميم من إنشاء لوحة للكشف عن مسببات الأمراض مناسبة لك تمامًا. سواء كانت مقايسة سداسية أو واحدة ، تعمل مقايسات LightMix المعيارية على تغيير نموذج اكتشاف العوامل الممرضة. تستخدم جميع الاختبارات نفس البروتوكول القياسي لتوليد النتائج في ثلاث خطوات سهلة.

نظام LightCycler ® 96

يعتبر نظام LightCycler ® 96 System بديهيًا لجميع مستويات الخبرة ، وهو حل qPCR متوسط ​​الإنتاجية للباحثين الأكاديميين ، ويوفر مزيجًا مثاليًا من تجانس درجة الحرارة واستنساخ البيانات.

كيف تحقق أقصى استفادة من يومك في المختبر

لا شيء يتفوق على الإثارة والشعور بالفخر المصاحب للتجربة الناجحة. وعلى الرغم من أن العلم الجيد هو بالتأكيد القوة الدافعة وراء هذه الإنجازات ، فلا ينبغي تجاهل القدرة على زيادة إنتاجيتك وفرص النجاح. يمكننا جميعًا أن نتعامل مع تلك الفجوات الزمنية الصعبة عند تشغيل الجل أو أثناء غسل العينات أو احتضانها. في هذه المقالة ، سنقوم بإدراج أفضل 10 نصائح لزيادة إنتاجية معملك.

تم تصميم نظام MagNA Pure 96 ، المصمم لسير العمل المتسارع ، لتنقية الأحماض النووية عالية الإنتاجية - يتم استخراج 96 عينة في أقل من ساعة واحدة - مما يؤدي إلى زيادة الإنتاجية وتقليل أخطاء المعالجة بشكل كبير.

ما علاقة القالب به؟

في هذه المقالة ، سنناقش أهمية البدء بقالب (كدنا) عالي الجودة لتجارب RT-qPCR وأهم النصائح لكيفية القيام بذلك.

اكتشف الحل المناسب لك

يبدأ سير العمل الجيني الخاص بك بتنقية الحمض النووي. ابدأ بثقة وقم بزيادة كفاءة سير العمل لديك باستخدام حلول Roche اليدوية والآلية. استخدم طاولتنا المفيدة لتوجيه عملية استخلاص الحمض النووي التالية.

PCR في الوقت الحقيقي عالي الأداء.

استفد من خبرة Roche في PCR في الوقت الفعلي وحقق نتائج دقيقة ومتسقة مع مجموعة كاملة من الأدوات والكواشف والمقايسات والمستهلكات لتناسب أي إنتاجية أو ميزانية للمختبر.


سيساعدك هذا المساعد عبر الإنترنت في العثور على تنقية الحمض النووي وكواشف PCR في الوقت الفعلي المناسبة لتطبيقاتك.


المعلومات التي تحتاجها ، عندما تحتاجها. تم تحسينه الآن مع موجز الأخبار للبقاء على اطلاع دائم بالاتجاهات الحالية في البحث ويتم تقديمه بثلاث لغات: الإنجليزية والصينية واليابانية.

قاعدة بيانات منشورات سير العمل الجينومي

مجموعة من المنشورات حول منتجات Roche Genomic المخصصة لتطبيقاتك البحثية.

آخر تحديث في 20.04.2021
حقوق النشر © لعام 2021 لشركة Roche Molecular Systems، Inc.

المنتجات مخصصة لبحوث علوم الحياة فقط. لا تستخدم في إجراءات التشخيص ما لم يذكر خلاف ذلك. يحتوي موقع الويب هذا على معلومات حول المنتجات التي تستهدف مجموعة واسعة من الجماهير ويمكن أن تحتوي على تفاصيل المنتج أو المعلومات التي لا يمكن الوصول إليها أو غير صالحة في بلدك. يرجى العلم أننا لا نتحمل أي مسؤولية للوصول إلى هذه المعلومات التي قد لا تتوافق مع أي عملية قانونية أو لائحة أو تسجيل أو استخدام صالح في بلدك الأصلي.


لوحات PCR-96 بشكل جيد

يرجى تحديد الخيارات الخاصة بك عند تقديم طلبك. اسألنا إذا كنت بحاجة إلى مساعدة.

هذا المنتج لم يعد في المخزن

مزيد من المعلومات

تم التصنيع في غرف الأبحاث المعتمدة من ISO9000 ، وخالية من DNase / RNase ، وقابلة للتعقيم بدرجة حرارة 121 ℃ وقابلة للتجميد T -80 ℃.

يرجى تحديد أحد المنتجات أدناه والإشارة إلى اختيارك في الطلب:

لوحة بيضاء أم لوحة واضحة؟

الملف القياسي مقابل الملف الشخصي المنخفض؟

اللوحة ذات التنانير مقابل اللوحة غير المتعرجة؟

المنتج الموصى به

انظر أدناه للحصول على دليل اختيار لوحة PCR ، أو اسألنا إذا كنت بحاجة إلى مساعدة.

دليل الاختيار: 96-WELL PCR لوحات

الأبيض مقابل. واضح:

توجه الصفائح والأنابيب البيضاء إشارة أكثر بكثير إلى كاشف أداة qPCR من اللوحات الشفافة التقليدية. يضمن انعكاس الإشارة المحسّن اكتشاف أدنى مستويات التألق. كما تمنع جدران البئر البيضاء الإشارة من المرور عبر كتلة cycler حيث يمكن أن تنعكس أو تمتص بشكل غير متسق ، مما يؤدي إلى زيادة مستويات الضوضاء في التألق المكتشف. هذا يمنع الاختلافات في كتلة cycler من التأثير على بيانات qPCR. يزيد البلاستيك الأبيض PCR الخاص بنا من الحساسية ويقلل من التباين ويزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء داخل مقايسة qPCR.

توفر الألواح الشفافة راحة البال في القدرة على التحقق من خطوات المص مباشرة بعد كل إجراء سحب ، حيث يمكنك رؤية الكاشف مضافًا إلى البئر كما تريد. الألواح الشفافة مناسبة لمعظم التطبيقات.

تنطبق هذه الاعتبارات أيضًا على الآبار ذات 8 شرائح وأنابيب PCR الفردية.

الملف القياسي مقابل الملف الشخصي المنخفض

تعد الآبار القياسية (ذات الارتفاع الكامل حوالي 21.0 مم) "قياسية" بالنسبة إلى الألواح منخفضة المظهر وتتناسب مع معظم أجهزة التدوير الحرارية الكلاسيكية وأنظمة الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، مثل Bio-Rad's iCycler® و iQ ™ series real - أنظمة الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وأنظمة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) العادية وأنظمة تسلسل الحمض النووي. تتيح لك هذه اللوحات استخدام كميات كبيرة من التفاعل. تقلل هذه الألواح من خطر تناثر التلوث الناتج عن التلوث المتقاطع ، مما يقلل من مخاطر التلوث المتبادل من البئر إلى البئر.

تعتبر الآبار منخفضة الحجم (حوالي 15.5 مم) هي التصميم الأحدث الذي يقلل من إمكانية تكوين المكثفات ويوفر مزايا لالتقاط الضوء في فحوصات التألق والتفاعلات منخفضة الحجم و PCR السريع. وقد تم التوصية بها للأجهزة الأحدث مثل أجهزة التدوير الحرارية C1000 Touch ™ و S1000 ™ من Bio-Rad ، وأنظمة الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي من سلسلة CFX ، وأنظمة تفاعل البوليميراز المتسلسلة السريعة من شركة Applied Biosystems. تقلل اللوحات ذات المظهر المنخفض المساحة الميتة وتزيد من كفاءة PCR.

يرجى الرجوع إلى دليل نظام PCR ، إذا لزم الأمر أو اسألنا. يمكن للأجهزة ذات الأغطية القابلة للضبط أن تستخدم عادةً الآبار ذات المستوى القياسي والمنخفض. تشمل هذه الأدوات الدوارات الحرارية من سلسلة Bio-Rad's 1000 وسلسلة DNA Engine®. تتطلب بعض الأنظمة ملفات تعريف قياسية أو لوحات منخفضة الارتفاع فقط.

تنطبق هذه الاعتبارات أيضًا على الآبار ذات 8 شرائح وأنابيب PCR الفردية.

سيم متجنب مقابل لا متجنب.

تعتبر الألواح شبه المنحرفة أكثر مقاومة للالتواء بسبب الصلابة التي يوفرها التنورة على المحيط الخارجي للصفيحة. تسمح هذه اللوحات أيضًا بوضع العلامات أو الترميز الشريطي.

تنسيق غير متعرج متوافق مع معظم أجهزة التدوير الحرارية. يمكن أيضًا تقطيع هذه الألواح بسهولة إلى أحجام مقطعية كما هو مطلوب من قبل المستخدم ، بحيث لا يتم إهدار اللوحة بأكملها ، عندما تكون هناك حاجة إلى أقل من 96 بئراً لبعض التجارب.


بروتوكول PCR القياسي

متعادل: استخدام مزيج خاص أو محلي الصنع 10x rxn ، على سبيل المثال: Cetus ، Promega. يجب أن يحتوي هذا على: بحد أدنى 1.5 ملي Mg2 + ، عادة بعض المنظفات ، ربما بعض الجيلاتين أو BSA. تقدم Promega الآن 25 ملي MgCl2 ، للسماح بتحديد المستخدم [Mg2 +] لتحسين التفاعل مع مجموعات مختلفة من البادئات والأهداف.

اصنع مزيجًا رئيسيًا من الكواشف في غياب الحمض النووي باستخدام ماصة خالية من الحمض النووي ، ثم الاستغناء عن الأنابيب الفردية (باستخدام ماصة خالية من الحمض النووي) ، وإضافة الحمض النووي إلى التفاعلات الفردية استخدام نصائح التوصيل.

تفاعلات تامة مع 50UL من البرافين السائل عالي الجودة أو الزيت المعدني لضمان عدم حدوث تبخر: هذا يغير تركيزات المادة المتفاعلة. ملاحظة: أحدث الحكمة أنه يمكن للمرء أن يستخدمها فازلين - هذا يسمح أيضا & quot بدء التشغيل السريع & quot PCR.

استخدام نصائح الأنابيب الموصلة: يمنع تلوث الهباء الجوي للماصات.

يوصى باستخدام المنظفات فقط لـ Taq من Promega (حتى 0.1٪ حجم / حجم ، Triton X-100 أو Tween-20). DMSO يبدو أنه يسمح بتمسخ أفضل للتسلسلات المستهدفة الأطول (& gt1kb) والمزيد من المنتجات.

لا تستخدم نفس الأنابيب لتوزيع الأحماض النووية كما تستخدم لتوزيع الكواشف

تذكر أن حجم العينة يجب ألا يتجاوز 1/10 من حجم التفاعل ، ويجب ألا تكون تركيزات عينة الحمض النووي / NTP / التمهيدي عالية جدًا ، وإلا فإن كل Mg2 + المتاح يكون مخلبًا من المحلول ويتأثر تفاعل الإنزيم سلبًا. أي زيادة في dNTPs أكثر من 200uM تعني [Mg2 +] يجب إعادة تحسينها.

تجنب استخدام المخازن التي تحتوي على EDTA مثل CHELATES EDTA Mg 2 +

يجب تفضيل التركيزات المنخفضة من التمهيدي والهدف و Taq والنيوكليوتيدات لأنها تضمن عمومًا منتجًا أنظف وخلفية أقل ، ربما على حساب حساسية الكشف.

شروط التفاعل الموصى بها:

الشروط الأولية:

التمسخ الأولي في البداية: 92-97 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. إذا قمت بتغيير طبيعة الخواص عند 97 درجة مئوية ، فإن العينة غير الطبيعية تضيف فقط بقية المزيج بعد أن يتصادم التفاعل مع درجة حرارة التلدين (يمنع تمسخ الإنزيم المبكر).

درجة حرارة التلدين الأولية: على أعلى مستوى ممكن لمدة 3 دقائق (على سبيل المثال: 50 - 75 درجة مئوية). تعني الظروف الأولية الصارمة منتجًا غير محدد أقل ، خاصة عند التضخيم من الحمض النووي الجيني حقيقيات النوى.

درجة حرارة الاستطالة الأولية: 72 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. هذا يسمح باستطالة كاملة للمنتج على قوالب نادرة.

ركوب الدراجات في درجة الحرارة:

  • 92-94 درجة مئوية لمدة 30-60 ثانية (تفسد)
  • 37-72 درجة مئوية لمدة 30-60 ثانية (صلب)
  • 72 درجة مئوية لمدة 30-60 ثانية (استطالة) (60 ثانية لكل كيلوبايت طول التسلسل المستهدف)
  • 25-35 دورة فقط (وإلا فإن تسوس الإنزيم يسبب تشوهات)
  • 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في النهاية للسماح بالاستطالة الكاملة لجميع الحمض النووي للمنتج

& quotQuickie & quot PCR ممكن تمامًا: على سبيل المثال ، [94 درجة مئوية 30 ثانية / 45 درجة مئوية 30 ثانية / 72 درجة مئوية 30 ثانية] × 30 ، للمنتجات القصيرة (200 - 500 نقطة أساس).

يمكنك استخدام الجليسيرول في ثقوب أنبوب تفاعل الدورة الحرارية لضمان اتصالات حرارية جيدة

لا تقم بتشغيل دورات كثيرة جدًا: إذا كنت لا ترى شريطًا به 30 دورة ، فمن المحتمل أن تكون قد فزت بـ & # 39t بعد 40 بدلاً من ذلك ، خذ قسمة من مزيج التفاعل وأعد تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الكواشف الطازجة. ارى هنا.

& quot بداية ساخنة & quot PCR:

في ظروف معينة يرغب المرء في ذلك تجنب خلط البادئات واستهداف الحمض النووي في درجات حرارة منخفضة في وجود طق بوليميراز: Taq pol يكاد يكون فعالا مثل Klenow pol عند 37 ا ج وبالتالي ، إذا أخطأ في التلدين التمهيدي عند درجة حرارة منخفضة قبل تمسخ القالب الأولي ، & quot؛ تضخيم & quot خاص قد يحدث. يمكن تجنب ذلك عن طريق إضافة الإنزيم فقط بعد التمسخ الأولي ، قبل أن يبرد التفاعل إلى درجة حرارة التلدين المختارة. يتم القيام بذلك بسهولة أكبر عن طريق وضع الشمع & quotgems & quot TM في أنبوب التفاعل بعد إضافة كل شيء ما عدا الإنزيم ، ثم وضع الإنزيم فوق الأحجار الكريمة: يذوب الشمع عندما تصل درجة الحرارة إلى +/- 80 درجة مئوية ، ويختلط الإنزيم مع باقي خليط التفاعل بينما يطفو الشمع المنصهر في الأعلى ويختم المزيج ، ليحل محل الزيت المعدني. المعلومات هي أن & quotgems & quot يمكن استبدالها بـ Vaseline TM.

PCR غير المتماثل لإنتاج ssDNA:

ما عليك سوى استخدام نسبة 100: 1 مولارية من البادئين (على سبيل المثال: التمهيدي 1 عند 0.5 ميكرو مولار ، التمهيدي 2 عند 0.005 ميكرومتر). هذا يسمح بإنتاج ssDNA بشكل أساسي بمعنى التمهيدي الأكثر وفرة ، وهو مفيد لأغراض التسلسل أو صنع تحقيقات ssDNA.

الكشف عن المنتجات:

خذ 1/10 - 1/3 من مزيج التفاعل بحرص من تحت الزيت أو من تحت الفازلين أو الشمع الصلب ، باستخدام ماصة مجهرية ذات طرف مسدود ، في منطقة بعيدًا عن منطقة تحضير PCR!

امزج هذا مع بعض محلول تحميل الهلام (1: 1 - 1: 5 مزيج: مخزن تحميل مؤقت): هذا هو TBE الذي يحتوي على 10-20٪ من الجلسرين أو السكروز واندفاعة من صبغة تتبع البروموفينول الأزرق (BPB).

تحميل 5 - 30ul من العينة في آبار من 0.8 - 3.0 ٪ هلام الاغاروز البحري المكون في TBE ، يفضل أن يحتوي على 50 نانوجرام / مل بروميد إيثيديوم.

قم بتشغيله عند 80-120 فولت (ليس بطيئًا جدًا أو منتجات صغيرة لا تنتشر بسرعة كبيرة أو تشوه العصابات) حتى يصل BPB إلى نهاية الجل (المنتجات الكبيرة) أو 2/3 هلام أسفل (منتجات صغيرة). استخدم علامات الحمض النووي التي تتراوح من 2 كيلو بايت إلى 100 نقطة أساس أو أقل (يوصى باستخدام علامات BM PCR).

عرض على صندوق ضوء الأشعة فوق البنفسجية في 254 - 300 نانومتر ، صورة 1-5 ثوان.

من الأفضل رؤية المنتجات الصغيرة على هلام الاغاروز بنسبة 3٪ الذي كان اجري بسرعة (على سبيل المثال: 100 فولت) ، مع تشغيل BPB إلى & frac12 - 2/3 أسفل الجل. من الأفضل تضمين EthBr في الجل وفي المخزن الهلامي ، نظرًا لأن تلطيخ ما بعد الرحلان الكهربائي يمكن أن يؤدي إلى تلطيخ الشريط بسبب الانتشار ، وإذا لم يكن هناك EthBr في المخزن المؤقت ، فإن الصبغة تتدفق للخلف من الهلام ، ويتم تجريد العصابات الأصغر من الصبغة ولا تكون مرئية.

NUSIEVE TM gel (FMC Corp) يمكن استخدامه أيضًا للمنتجات الصغيرة - دقة أفضل من الاغاروز.

بولي أكريلاميد يمكن أن تكون المواد الهلامية ملطخة بالفضة بواسطة بروتوكولات بسيطة للكشف عن الحساسية الشديدة.

يمكن نشاف المواد الهلامية مباشرة بعد النقع في 0.5M NaOH / 1.5M NaCl لمدة 10-20 دقيقة: & quot؛ تجفيف النشاف & quot يعمل بشكل جيد (على سبيل المثال: هلام ذو طبقات زائدة وأسفل مع أكوام المناشف الورقية والأشرطة المضغوطة تنتقل لأعلى ولأسفل) ، كما تفعل النشاف الكلاسيكي & quotSouthern & quot . العصابات التي تم تنظيفها بهذه الطريقة مثبتة تساهميًا بالفعل على أغشية النايلون ، وتحتاج ببساطة إلى شطفها في 5xSSPE قبل التهجين المسبق.

المثال الموضح هو الكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري النوع 16 (HPV-16) الحمض النووي المضخم من عينات خزعة عنق الرحم (Williamson A-L ، Rybicki EP (1991) الكشف عن فيروسات الورم الحليمي البشري التناسلي عن طريق تضخيم تفاعل سلسلة البوليميراز باستخدام بادئات متداخلة متداخلة. J Med Virol 33: 165-171). اللوحة اليسرى عبارة عن صورة هلام agarose ملطخ بـ EthBR 2٪ ، واليمين عبارة عن صورة أشعة ضوئية لطخة جنوبية تم فحصها باستخدام 32 P المسمى HPV-16 DNA. لاحظ مدى حساسية النشاف ومدى دقة الاكتشاف.

وسم منتجات PCR بالديجوكسيجينين

يمكن تصنيف منتجات PCR بشكل ملائم للغاية باستخدام digoxigenin-11-dUTP (Boehringer-Mannheim) من خلال دمج الكاشف في تركيز dTTP النهائي الفعال بنسبة 10-35٪ في مزيج نيوكليوتيدات بتركيز نهائي 50-100uM dNTPs (Emanual ، 1991 Nucleic Acids Res 19 : 2790). يسمح هذا بالاستبدال إلى مدى معروف من التحقيقات ذات الطول المحدد تمامًا ، والذي بدوره يسمح بظروف التهجين المحددة بدقة. إنها أيضًا أكثر الوسائل فاعلية في وضع العلامات على منتجات PCR ، حيث من المحتمل أن تكون غير آمنة ومكلفة للغاية لمحاولة القيام بالمثل مع 32P-dNTPs ، كما أن ترجمة النيك أو دمج الملصقات العشوائية غير مناسب لأن القوالب غالبًا ما تكون صغيرة جدًا للكفاءة وضع العلامات.

اصنع مزيج DIG-dNTP لـ PCR على النحو التالي:

DIG خليط النيوكليوتيدات

  • Dig-11-dUTP 350 أوم
  • dTTP 650 أوم
  • dATP 1 ملم
  • dCTP 1 ملم
  • dGTP 1 ملم

لكل 50 ميكرولتر من المسبار المركب ، يتم إجراء تخفيف 1/10 من مزيج DIG-nucleotide عند إضافته إلى الكواشف الأخرى كما هو موضح أعلاه. يمكن تحليل المنتجات بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام - ملاحظة: المنتجات أكبر من المنتجات غير المستبدلة - واكتشافها مباشرة على البقع مناعية. يمكن استخدام المجسات على شكل 5-10 ul قسامات مباشرة من خلطات منتجات PCR ، مختلطة بمزيج التهجين والتشويه. يمكن إعادة استخدام المجسات حتى 10 مرات ، وتخزينها مجمدة بين التجارب وغليها حتى تفسد طبيعتها.

تنظيف منتجات PCR

  • التخلص من الزيوت المعدنية: ببساطة أضف 50ul من الكلوروفورم إلى قارورة التفاعل والدوامة والطرد المركزي لفترة وجيزة ، وقم بإزالة & quot؛ قطيرة & quot؛ مائي حل مع ميكروبيص.
  • التخلص من الشمع أو الفازلين: ببساطة & quotspear & quot جوهرة الشمع وإزالتها كما هو الحال بالنسبة للزيت أو أنبوب ثقب القاع ونفخ قطرة مائية للفازلين.
  • تنظيف الحمض النووي: 3 خيارات
    • البروتوكول الذي يعطي DNA نظيفًا بدرجة كافية للتسلسل هو ما يلي: زيادة الحجم إلى 100ul بالماء ، إضافة 10M ammonium acetate soln. إلى 0.2 مليون تركيز نهائي (حجم 1/5) ، أضف حجمًا متساويًا من الأيزوبروبانول (بروبان -2-أول) ، اتركه على المنضدة 5 دقائق ، جهاز طرد مركزي 20 دقيقة عند 15000 دورة في الدقيقة ، قم بإزالة السائل باستخدام ماصة ، وأعد التعليق في ماء 100ul أو TE ، كرر هطول الأمطار.
    • قم ببساطة باستخراج الفينول- CHCl3 (أضف 20ul الفينول إلى الطور المائي ، الدوامة ، أضف 50ul CHCl3 ، الدوامة ، الطرد المركزي ، قم بإزالة أعلى المرحلة المائية ، كرر استخراج CHCl3).
    • اصنع طورًا مائيًا يصل إلى 400ul ، ودور خلال خرطوشة Millipore Ultrafree-MC NMWL 30000 (عند 6000 دورة في الدقيقة في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة) ، واغسلها بماء 2x400ul ، واجمع عينة +/- 20ul: هذا نقي بدرجة كافية للتسلسل.

    المنتج نظيف بدرجة كافية للهضم المقيد مباشرة بعد التفاعل ، ومع ذلك ، يوصى بتنظيف الفينول كلوروفورم كحد أدنى.

    تسلسل منتجات PCR:

    من الأفضل القيام بذلك باستخدام ssDNA الذي تم إنشاؤه بواسطة PCR غير المتماثل ، و & quotlimiting & quot التمهيدي للتسلسل. ومع ذلك ، فإن التسلسل الفعال لـ dsDNA الناتج عن PCR العادي ممكن باستخدام التعديل على بروتوكول SequenaseTM الذي نشره Bachmann وآخرون. (1990) (NAR 18: 1309). حمض نووي نظيف تم تعليقه في المخزن المؤقت التسلسلي الذي يحتوي على 0.5٪ Nonidet P-40 و 0.5٪ Tween-20 وتمهيدي التسلسل ، وتم تغيير طبيعته عن طريق التسخين إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، والتبريد المفاجئ على الجليد الرطب ، والمتسلسل بواسطة بروتوكول & quotclose-to-primer & quot (على سبيل المثال : يمزج التمديد المخفف).

    استنساخ منتجات PCR

    استراتيجية الاستنساخ T-A: يبدو أن Taq والبوليميراز الأخرى لها نشاط ترفيهي طرفي ينتج عنه إضافة غير مقولبة لنيوكليوتيد واحد إلى 3 & # 39-أطراف منتجات PCR. في وجود جميع dNTPs الأربعة ، تتم إضافة dA بشكل تفضيلي ومع ذلك ، يؤدي استخدام dNTP واحد في خليط تفاعل إلى إضافة (غير فعالة نسبيًا) لهذا النيوكليوتيد. يؤدي هذا إلى تعقيد الاستنساخ ، حيث إن منتج PCR المزعوم نهاية حادة غالبًا لا يكون كذلك ، وغالبًا ما لا تعمل بروتوكولات الاستنساخ ذات النهايات الحادة أو أنها غير فعالة للغاية. يمكن معالجة ذلك عن طريق احتضان منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام T4 DNA pol أو Klenow pol ، والذي & يقتبس & يقتبس النهايات بسبب نشاط 3 & # 39- & gt5 & # 39 خارجي نوكلياز (Lui and Schwartz، 1992 BioTechniques، 20: 28-30). ومع ذلك ، فإن نشاط ترانسفيراز الطرفي هذا هو أيضًا أساس استراتيجية الاستنساخ الذكية: هذا يستخدم Taq pol لإضافة dT واحد إلى النهايات 3 & # 39 من ناقل الاستنساخ غير الحاد مثل pUC أو pBluescript TM ، وربط بسيط لـ منتج PCR في البلازميد الآن & quotsticky-endsticky & quot (Marchuk et al. ، 1990 NAR 19: 1156).

    دمج مواقع التقييد في الاشعال: على الرغم من أن هذا قد يتم تبسيطه من خلال دمج مواقع التقييد نفسها أو مواقع مختلفة في الأطراف 5 & # 39 من بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل - مما يسمح بتوليد نهايات لزجة واستنساخ مباشر في نواقل مناسبة - يجب أن يكون لها على الاكثر قاعدتان إضافيتان 5 & # 39 لتسلسل التعرف للتأكد من أن الإنزيمات ستتعرف في الواقع على التسلسل - وغالبًا ما يتبين أنه حتى عند القيام بذلك ، فإن كفاءة قطع المنتج الطازج تقترب من الصفر. يمكن معالجة هذا في بعض الأحيان عن طريق احتضان المنتج الطازج بـ Proteinase K (للهضم من Taq pol المرتبط بإحكام) ، لكن في كثير من الأحيان لا يتم ذلك. حل المشكلة هو استخدام طريقة & quotKlenow-Kinase-Ligase & quot (KKL): يتضمن هذا & quot؛ تلميع & quot المنتجات مع Klenow ، مما يجعلهم قادرين على الحصول على 5 & # 39-phosphorylation (ملحوظة: لا تحتوي برايمرات OLIGONUCLEOTIDE على 5 & # 39-فوسفات. ) ، وربط الأجزاء معًا للحصول على متسلسلات ، ثم تقييدها بأنزيمات التقييد المناسبة لتوليد الأجزاء اللاصقة المناسبة للاستنساخ (Lorens ، 1991 PCR Methods and Applications ، 1: 140-141).


    لوحات وشرائط وختم لتسلسل PCR و Real Time PCR و amp 24 صفحة

    يتم تصنيع مستهلكات EuroClone PCR لمجموعة متنوعة من أجهزة التدوير الحرارية وأنظمة PCR في الوقت الفعلي وأجهزة التسلسل للحصول على أداء ركوب مثالي. التصنيع ومراقبة الجودة يتم إنتاج جميع المواد الاستهلاكية البلاستيكية في ظل ظروف الغرفة النظيفة في منشآت القولبة بالحقن الحديثة. يتم ترشيح الجسيمات والخلايا البكتيرية والملوثات الأخرى من الغلاف الجوي. تخضع المنتجات لمجموعة واسعة من فحوصات مراقبة الجودة أثناء وبعد عملية الإنتاج. تضمن الاختبارات المرئية والبيولوجية عدم وجود الملوثات وسلامة PCR الكمي. على وجه الخصوص ، عدم وجود.

    لوحات FrameStar & Reg تعمل لوحات Primo FrameStar & reg المكونة من 2 لوحات Primo FrameStar & reg على زيادة الاستقرار الحراري إلى أقصى حد في درجات الحرارة المرتفعة مما يمنع فقدان العينة عن طريق تقليل التمدد الحراري أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل. يجمع التصميم المكون من عنصرين بين مزايا أنابيب البولي بروبيلين الرقيقة الجدار للحصول على أفضل نتائج PCR وتنورة وسطح صلب من البولي كربونات للحصول على أعلى مستوى من الثبات الحراري والصلابة. على عكس لوحات PCR القياسية من قطعة واحدة ، يكون التبخر من مواضع الزاوية والصفوف الخارجية ضئيلًا ، مما يسمح بتقليل أحجام الكاشف وتوفير التكاليف. & bull تقلل التكنولوجيا المكونة من عنصرين.

    لوحات FrameStar & reg Primo & reg Framestar & reg 384 مصممة جيدًا من أجل PCR عالي الإنتاجية ، يتوافق FrameStar & reg 384 مع غالبية 384 كتلة PCR و qPCR وأدوات التسلسل. يزيل التصميم الصلب المكون من عنصرين الالتواء والتشوه أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل مما يجعله مثاليًا للاستخدام مع الأنظمة الروبوتية. قط. بريمو & ريج Framestar & reg 384 بئر صافية مثالية للاستخدام مع الأنظمة الروبوتية مرجع الشبكة الأبجدية الرقمية متوافق مع غالبية 384 بلوك PCR و qPCR 30 و microl سعة العمل الموصى بها (سعة 55 ومايكرول كحد أقصى) عرض اللوحة: عمق اللوحة: المسافة إلى مركز A1 من الحافة العلوية : المسافة إلى.

    لوحات FrameStar & reg Primo & reg Framestar & reg 96 ملف تعريف قياسي شبه ملتف (زاوية القطع A12) مصممة خصيصًا لتكون متوافقة بشكل مباشر مع جميع أجهزة التدوير الحرارية الرئيسية بما في ذلك جميع أدوات ABi ، يمكن استخدام هذه اللوحة مباشرة في أدوات ABi 96well بدون الحاجة إلى مهايئات. يزيل التصميم الصلب المكون من عنصرين الالتواء والتشوه أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل مما يجعله مثاليًا للاستخدام مع الأنظمة الروبوتية. يسمح شبه التنورة بوضع العلامات أو الترميز الشريطي. اللوحة متاحة أيضًا مع حامل (ECPCR0730C). قط. لوحة بئر بريمو وريج فرامستار وريج 96 ، شبه ملتوية ، آبار صافية بريمو وريج فرامستار وريج 96.

    اللوحات القياسية الألواح القياسية تعمل الأنابيب ذات الجدران الرقيقة لألواح PCR القياسية EuroClone على زيادة نقل الحرارة إلى أقصى حد وتسهل الحواف المرتفعة الختم. يتكون النطاق من صفيحة غير متعرجة ، واثنتان شبه متجاورتان ولوح كامل. تتوفر الألواح غير المبطنة أيضًا بصفائح Tear-A-Way PCR ، وهي نوعان من اللوحات المثقبة إما في الاتجاه الرأسي ، أو تمزيقها إلى شرائح 8well ، أو في الاتجاه الأفقي ، وتمزيقها إلى شرائح 12well. لوحة بئر بريمو وريج 96 ، بدون حواف متوافقة مع معظم أجهزة التدوير الحرارية وأجهزة التسلسل ، مسح الآبار المرجعية الشبكية السوداء لعينة سهلة.

    الألواح القياسية Primo & reg 96 well Plate ، شبه ملتوية متوافقة مع معظم أجهزة التدوير الحرارية وأجهزة التسلسل ، مسح الآبار المرجعية الشبكية السوداء لسهولة التعرف على العينة تمنع حواف البئر المرتفعة التلوث المتبادل وتسهل الختم مناسبة لإغلاق الغطاء (ECPCR0751 و ECPCR0752) ، مانعة للتسرب بالحرارة والمواد اللاصقة 250 قدرة العمل الموصى بها والميكروول (سعة 300 ميكرول كحد أقصى) عرض اللوحة: عمق اللوحة: بريمو 96 صفيحة بئر شبه ملتوية ، آبار صافية عرض اللوحة: عمق اللوحة: المسافة إلى مركز A1 من الحافة العلوية: المسافة إلى مركز A1 من الحافة اليسرى: الملعب (المسافة بين A1 و A2): حسنًا.

    لوحات قياسية بريمو و reg 96 صفيحة جيدة ، ذات جوانب منخفضة ، متوافقة مع معظم أجهزة التدوير الحرارية وأجهزة التسلسل. وختم لاصق 150 ومايكرول عمق العمل الموصى به: 85،48 & plusmn0،50 مم سعة اللوح (سعة 200 & ميكرول كحد أقصى) عرض اللوحة: قطر البئر (c): المسافة إلى مركز A1 من الحافة العلوية: لوحة بريمو 96 ذات غطاء جانبي منخفض ، مسح 50 14،38 & plusmn0،25 mm المسافة إلى مركز A1 من الحافة اليسرى.

    أنابيب وأشرطة PCR يتم تصنيع أنابيب EuroClone وشرائط الغطاء من مادة البولي بروبيلين البكر في منشأة إنتاج غرف الأبحاث المعتمدة من الفئة 7 ISO. تتوفر الشرائط بتنسيق قياسي وأيضًا بأنابيب منخفضة الارتفاع. Primo 0.2ml Individual PCR tubes, flat caps Flat and domed cap designs Primo® 0.2ml Individual PCR tubes, domed caps Suitable for all standard 0.2ml block thermal cyclers 0.25 ml recommended working capacity (0.3 ml max capacity) Suitable for most standard thermal cyclers Individually numbered tubes Available with domed or flat optical caps RNase, Dnase, human genomic.

    Primo® low profile Tube Strips Primo low profile PCR tube strips are available in clear polypropylene for standard PCR techniques. For fluorescent detection, like qPCR low profile PCR strips are available with white well tubes which give the highest sensitivity and the highest consistency as most of the fluorescence is reflected back to the detector. Cat. Description Primo Low profile 8 tubes/strip. Clear wells + flat optical caps Primo® Low profile 8 tubes/strip. White wells + flat optical caps Available with either clear or white tubes Supplied with flat optical caps RNase, Dnase, human.

    Adhesive Sealing Tapes Adhesive Sealing Tapes EuroClone offers a wide range of adhesive sealing materials processed under strictly controlled environmental conditions and certified free from DNase, RNase and human genomic DNA. Primo® PCR Seals A strong polyester transparent adhesive seal recommended for PCR but it can also be used for qPCR and other optical applications. This seal enables a high seal integrity and efficiently prevents sample evaporation. The seal can be easily peeled from the plate. The PCR seal is also available in a flexible format with perforated sheets to enable tearing.


    Parting Words

    While these tips may seem like common sense to qPCR experts, they should help newcomers to save a lot of time and money, and well as maximize their chances of getting consistent results! There are also many online support resources, including a very active Yahoo List group. Fortunately, there are many experts who enjoy helping others master the art of qPCR.

    If you want to share your best practices tips, get in touch with us by writing in the comments field!

    Literature:

    Originally published on January 20, 2009. Revised and updated in May 2017.