معلومة

إيجاد طريقة سهلة ورخيصة لصباغة dNTP

إيجاد طريقة سهلة ورخيصة لصباغة dNTP



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أريد قياس OD لمعرفة تركيز dNTP. أي فكرة لصباغة dNTP بأرخص الأسعار وأسهل طريقة؟


قد يكون هناك مثل هذه الصبغة ، لكنني لست على علم بذلك. الطريقة القياسية لقياس dNTPs والأحماض النووية بشكل عام هي الامتصاصية عند 260 نانومتر. تحتوي هذه المقالة على جدول معاملات الانقراض المولي لـ dNTPs (الجدول 10.2). هم انهم

معامل الانقراض المولي الطول الموجي dATP 259 nm 15،200 dCTP 280 nm 13،100 dGTP 253 nm 13،700 dTTP 267 nm 9،600

في الممارسة العملية للعمل الروتيني مع الحمض النووي ، يمكنك استخدام 260 نانومتر وافترض أن الامتصاص 1 يتوافق مع [DNA] = 50 ميكروغرام مل-1. باستخدام متوسط ​​القيم الواردة في الجدول ، وبغض النظر عن حقيقة أن هذه في الواقع بأطوال موجية مختلفة ، وباستخدام متوسط ​​تقريبي dNTP ميغاواط قدره 500 ، أحسب امتصاصًا لـ 50 ميكروغرام مل-1 حل جميع dNTPs الأربعة كـ 1.3 ، لذا فهذه اتفاقية معقولة بالنظر إلى جميع الافتراضات التي قدمتها.

توجد أصباغ فلورية يمكن استخدامها لقياس الحمض النووي ، ولكنها تعتمد على وجود قواعد مكدسة ، لذا فهي ليست مفيدة لـ dNTPs المجانية.

لذا ، هناك أخبار سيئة إذا لم يكن لديك مقياس طيف ضوئي للأشعة فوق البنفسجية. هناك خطط متاحة لبناء مقاييس طيفية بسيطة باستخدام Lego وبعض المكونات الإلكترونية الضوئية. تميل هذه إلى استخدام مصابيح LED كمصدر للضوء ، لكنني لا أعرف ما إذا كانت مصابيح LED للأشعة فوق البنفسجية متوفرة.


سيكون من الصعب تحقيق مستوى دقة الطول الموجي المطلوب للتمييز بين dNTPs ، مع الأخذ في الاعتبار أنك تقوم بتجربة DIY. فقط مقاييس الطيف الضوئي الدقيقة للغاية يمكنها تحقيق ذلك وهي باهظة الثمن.

تقنية أخرى يمكنك تجربتها هي كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC). إنها رخيصة ويمكنك بسهولة القيام بها بنفسك. لكنك بحاجة إلى معايير للتمييز بين NTP و NDP و NMP ؛ قد تنشأ الأخيرين بسبب التدهور أثناء التجربة. يستخدم الناس عمومًا مزيجًا من مضادات الأكسدة والحماية لتقليل تدهور النيوكليوتيدات.

تتمثل إستراتيجية القيام بذلك في إزالة الفوسفات باستخدام الفوسفاتاز ثم إجراء TLC باستخدام النيوكليوسيدات (وهي مستقرة تمامًا).

يمكنك التحقق من هذه المراجعة على الحمض النووي TLC.


مقدمة عملية في الرحلان الكهربائي لعلم الأحياء

يهتم المختبر الذي أعمل فيه بآليات العمليات البيولوجية الأساسية ، باستخدام الخميرة كنموذج حي.

آمل أن ينضم إليّ صديق جيد ، فيزيائي ومدير تنفيذي للتسويق التكنولوجي من خلال التدريب والمهنة ، في المختبر. هذه هي ملاحظاتي غير الرسمية التي أرسلها إليه لجعله سريعًا بطريقة عملية لمختبرنا ، مع التركيز على الأساليب الكلاسيكية القديمة للبدء بها. آمل أن يجد هو والآخرون المهتمون بإجراء مثل هذا الانتقال الوظيفي إلى مختبر حيوي هذه المقدمة العملية مفيدة أيضًا.


الملخص

في هذا العمل طبقنا تقنية تحلل ضوئي فلاش لدراسة السلوك الحركي لملح الفلافيليوم الاصطناعي في محلول مائي. العمليات الحركية التي يتم تشغيلها بواسطة نبضة ضوئية لفلاش الكاميرا العادي ، متبوعة بمقياس طيف ضوئي معدل بشكل ضئيل ، يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر. يؤدي الضوء إلى تغييرات امتصاص عكسية ويتم إثبات نوعين عابرين مختلفين قبل الاسترداد الكامل للنظام. تم الإبلاغ عن السلوك الحركي والأطياف للأنواع العابرة. التجربة المقترحة رخيصة وسهلة وتسمح للطلاب من جميع المستويات بالتعرف على مفاهيم حركية الاضمحلال العابر وأطياف الوقت التي تم حلها.


إعادة التفكير في عملية الصباغة باستخدام البيولوجيا التركيبية

20٪ من تلوث مياه الأرض ناتج عن معالجة المنسوجات ، ويلزم 1800 جالون من الماء لصنع زوج واحد من الجينز الأزرق. هذه كمية مذهلة من المياه العذبة المطلوبة لصنع قطعة واحدة من الملابس & # 8211 لكن الصناعة على وشك التغيير.

تريد Colorifix ومقرها المملكة المتحدة تقليل هدر المياه طوال عملية الصباغة من خلال الاستفادة من القدرات البيولوجية للميكروبات.

"كجزء من مشروع جهاز الاستشعار الحيوي للزرنيخ الذي تقوده جامعة كامبريدج ، ذهب فريقنا إلى جنوب آسيا مع نموذجنا الأولي لجهاز الاستشعار الحيوي ، وشرح للناس كيفية عمله ، ثم طلبوا من الأشخاص قائمة بالمواد الكيميائية التي اعتقدوا أنها تستحق المراقبة ،" يقول الدكتور Orr Yarkoni ، الشريك المؤسس والرئيس التنفيذي لشركة Colorifix.

يقول ياركوني ، "عندما عدنا [إلى المملكة المتحدة] وقمنا بواجبنا ، اكتشفنا أن معظم هذه المواد الكيميائية المعنية كانت من صناعة النسيج ، وأن الصباغة كانت السبب الرئيسي لاستخدام المياه والمواد الكيميائية" ، كما قال ياركوني ، الذي قرر بعد ذلك لاستخدام البيولوجيا التركيبية لإنتاج الأصباغ وتقليل الملوثات ، بدلاً من مجرد مراقبتها.

بعد بضع سنوات من البحث مع الدكتور جيمس أجيوكا والدكتور ديفيد نوجنت ، تم إنتاج Colorifix في عام 2016. كان التقدم العلمي سريعًا ، وسرعان ما نظر الفريق في طرق لتقليل الضرر البيئي الذي تسببه صناعة النسيج ، بما يتجاوز مجرد إنتاج الأصباغ.

د. نوجينت (على اليسار) وأجيوكا (على اليمين) في مختبر Colorifix في نورويتش بإنجلترا. الصورة مجاملة من Colorifix.

"عادة ، يتم [ترسيب الصبغة على القماش] باستخدام مواد كيميائية أو مركبات منتجة بيولوجيًا ، ولكن بدون عامل بيولوجي. نحن نستخدم الخلايا نفسها لإنتاج الصبغة وإيداعها في الألياف ، لذلك نحن نستخدم علم الأحياء للعملية بأكملها. القيام بذلك هو ما يسمح لنا بتوفير المياه والطاقة وإزالة المواد الكيميائية. نحن نستخدم علم الأحياء لنقل تلك الأصباغ والأصباغ إلى الألياف ، "يشرح ياركوني.

حتى الآن ، طورت Colorifix مجموعة من الألوان ، كل منها مشتق من أصباغ طبيعية.

"معظم أصباغنا اليوم من الحشرات ، وبعض الأصباغ الميكروبيولوجية والطيور وما إلى ذلك. حسنًا ، نحن نبحث في كل مكان عن الأصباغ الآن. يقول ياركوني ، الذي يسارع إلى الإشارة إلى أن الفائدة الحقيقية لـ Colorifix هي عملية الصباغة الفريدة ، أكثر من إنتاج الأصباغ الحيوية.

في مقابلة سابقة مع Vogue Australia ، أكد Yarkoni أن عملية الصباغة تستخدم 10 مرات أقل من الماء وتستهلك طاقة أقل بنسبة 20 في المائة ، ويرجع ذلك أساسًا إلى أن الشركة تستخدم دبس السكر ، وهو منتج ثانوي للسكر ، لتغذية الميكروبات المنتجة للصبغة ، واستبدال التثبيت. المواد الكيميائية مع علم الأحياء نفسه. غالبًا ما تحدث عملية صباغة المنسوجات العادية في درجات حرارة عالية جدًا - تزيد عن 100 درجة مئوية - مما يستهلك قدرًا كبيرًا من الطاقة. يمكن لميكروبات Colorifix أن تصبغ عند 37 درجة ثم تعطل الحرارة عند أقل من 100 درجة ، مما يوفر الطاقة. لكن الشركة لا تخطط للتوقف عند هذا الحد.

عينة من المنسوجات الملونة من عملية الصباغة الحيوية في Colorifix. الصورة مجاملة من Colorifix.

قال ياركوني: "فيما يتعلق بالمياه ، يسعدنا أن نقول إننا نجحنا الآن في تجربة كل من التخمير والصباغة باستخدام المياه المالحة حصريًا ، لذلك لا نحتاج الآن إلى لمس المياه العذبة في هذه العملية".

هذه قفزة هائلة لصناعة النسيج ويمكن أن توفر آلاف الجالونات من المياه العذبة خلال عملية الصباغة. أفضل جزء هو أنه على الرغم من وفورات الطاقة والمياه هذه ، فإن عملية صباغة المنسوجات لم تتغير إلى حد كبير.

يقول ياركوني: "يذهب سائل الصبغة بشكل أساسي إلى آلة الصبغ الموجودة لديهم - وكلها متوافقة & # 8211 ، لذا كل ما يحتاجون إليه هو تغيير سائل الصبغة الذي يدخل في أجهزتهم" ، في إشارة إلى المحلول المائي للمواد الكيميائية المستخدمة في تلطيخ ملابس. "الاختلاف الوحيد هو أن [منشأة الصباغة] يمكنها التخلص من جميع المواد الكيميائية الأخرى الخاصة بها ، حيث يقوم الكائن الحي بإصلاح الصبغة وتلطيخ النسيج بدون تلك المواد الكيميائية."

من الدنيم إلى الأصباغ وكل شيء بينهما ، تستجيب شركات البيولوجيا التركيبية لنداءات صناعة مهدرة. تبحث شركات مثل Tinctorium و PILI و Colorifix عن طرق بديلة لإنتاج نفس الألوان النابضة بالحياة التي تجذب المستهلكين دون السمية المضافة والمواد الكيميائية والتلوث.

نحن ندخل لحظة محورية في صناعة الأزياء ، حيث ستكون البدائل الحيوية والمستدامة هي الموضة الجديدة.

نيكو مكارتي

نيكو طالب دكتوراه في الهندسة الحيوية في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا. وقد أكمل سابقًا درجة الماجستير في الأنظمة والبيولوجيا التركيبية في جامعة إمبريال كوليدج بلندن بصفته باحثًا في برنامج فولبرايت.


النتائج

نظرة عامة على نظام DocMF وتحسينه

يقيس نظام DocMF الجديد تفاعلات البروتين والحمض النووي من خلال فحص تغيير إشارة التألق عبر التصوير المتسلسل على الرقاقة قبل وبعد تفاعل البروتين مع DNBs التي تحتوي على أهداف الحمض النووي (الشكل 1 والفيلم S1). تتكون DNBs من محولات التسلسل وإدراج التسلسلات العشوائية لتغطية النطاق الكامل لمواقع ربط البروتين. يتم أولاً تحميل مئات الملايين من DNBs على شرائح BGISEQ500 في مصفوفة منقوشة ، ويتم تسلسل مناطق الإدراج بطول ثابت باستخدام سير عمل DNBSeq (16). بعد الحصول على معلومات التسلسل الفريدة لكل DNB ، نقوم بإصلاح DNBs أحادي الجديلة (ssDNBs) عن طريق تجريد الخيط المسمى بالصباغة المركب في التسلسل. في وقت لاحق ، يتم إعادة تصنيع حبلا مكمل أصلي لتشكيل dsDNA ويتم تسميته بأصباغ الفلورسنت. بالنسبة لبروتينات شق الحمض النووي ، يتم الحصول على الصورة الأولى لتسجيل الموقع وشدة إشارة DNBs الفردية ، أي يقرأ. يرتبط بروتين الفائدة بأهداف dsDNA الخاص به ويقطع DNBs المقابلة ، مما يؤدي إلى تقليل الإشارة أو القضاء على DNBs خلال الجولة الثانية من التصوير (الشكل 1 أ). يمكن التعرف على الأشكال المحددة من تسلسلات DNBs المحددة مع إزالة الإشارة أو تقليلها أكبر من عتبة (الشكل 1 ب) والتحقق منها في فحوصات جزيئية لاحقة. يتم استخدام سير عمل DocMF تم تعديله بشكل طفيف لتوصيف تفضيلات ربط البروتين والحمض النووي. في هذا البروتوكول ، يتم تصوير DNBs لأول مرة بعد احتضان dsDNA المسمى نهاية ببروتينات ربط الحمض النووي لكثافة الإشارة الأولية. في الخطوة التالية ، يتم إجراء تفاعل بوليميريز إضافي يسمى MDA لاستبدال الخيط المسمى. يؤدي MDA إلى فقدان الإشارة أثناء خطوة التصوير الثانية كما هو موضح في الشكل. S1. ومع ذلك ، إذا ارتبط بروتين مهم بأهداف الحمض النووي الخاص به ويثبط MDA ، فإن الإشارة من DNBs التي تحتوي على مواقع ربط البروتين ستظل دون تغيير أو تكون أقل تأثراً من تلك الموجودة في مسار التحكم ، والذي لا يتضمن حضانة البروتين ولكنه يحتفظ بالخطوات الأخرى .

للتأكد من أن التصوير المتسلسل ممكن ، فمن الأهمية بمكان ألا تؤثر خطوة التجريد على المعلومات المكانية أو تضر بهيكل DNB. شرائح BGISEQ500 المستخدمة في هذه التجربة عبارة عن مصفوفات منقوشة. لذلك ، لا يؤثر التصوير المتسلسل على تسجيل مواقع DNB بنفس القدر الذي تتأثر فيه طريقة CHAMP باستخدام شرائح Miseq (11). بالإضافة إلى ذلك ، قمنا باختبار مجموعة متنوعة من المخازن المؤقتة للتجريد ووجدنا أن المخزن المؤقت للفورماميد كان له أقل تأثير على سلامة DNB ، فقط كسر روابط الهيدروجين بين dsDNA دون التأثير على استقرار DNB أو فصل DNB عن السطح. يوضح الشكل S2 أن درجات جودة التسلسل ، بما في ذلك Q30 (92.83 مقابل 90.32) ، والتأخر (0.15 مقابل 0.15) ، و RunOn (0.15 مقابل 0.12) ، ظلت غير متأثرة بعد التجريد باستخدام المخزن المؤقت للفورميد. وبالمقارنة ، فإن المخزن المؤقت للتعرية مع هيدروكسيد الصوديوم أدى إلى انخفاض كبير في Q30 من أكثر من 90٪ إلى ما يقرب من 0.

بعد الحصول على صورتين قبل وبعد تفاعل البروتين والحمض النووي ، قمنا مباشرة بمقارنة التغير في شدة الإشارة الأولية لكل DNB. إذا شق البروتين الحمض النووي ، يمكن استرداد DNBs التي لها تقليل كبير للإشارة (الشكل 1 ب) ، ويتم تحليل التسلسلات المقابلة لتحديد الشكل (المواد والطرق). لقياس تفاعلات ربط البروتين والحمض النووي ، حصلنا على معلومات تسلسل الربط من DNBs مع الحد الأدنى من تغيير طية الإشارة مقارنةً بالتحكم.

يمكن أن تميز DocMF مجموعة واسعة من مواقع تقييد نوكلياز (RS)

بعد إنشاء النظام ، اختبرنا ستة نوكليازات مقيدة (Eco RI و Bpu 10I و Age I و Nme AIII و Mlu I و Bgl I) بميزات RS مختلفة. تشق إنزيمات التقييد من النوع الثاني الحمض النووي بجوار أو داخل مواقع التعرف عليها (21) ، والتي تمت دراستها على نطاق واسع. تحتوي الإنزيمات المختارة على مواقع تقييد (RS) تتراوح من 6 إلى 11 زوجًا أساسًا وتشتمل على متواليات متناظرة طبيعية ، وتتابعات غير متجانسة ، وقواعد متدهورة. تحتوي مكتبة DNB على مجموعة من شظايا DNA العشوائية الاصطناعية بطول 50 nt. تمت قراءة أربعين من 50 نيوكليوتيد من هذه التسلسلات العشوائية باستخدام مجموعة التسلسل عالي الإنتاجية BGISEQ-500RS (SE100). تم التقاط الصور قبل وبعد حضانة هذه الإنزيمات على الرقاقة لمدة ساعتين أو بين عشية وضحاها. تم تحديد DNB مع عتبة FFI & gt 2 (قراءات إيجابية) لفحص الأشكال (انظر المواد والطرق).

الطول الدقيق لمواقع التقييد (RS) (إل) من خلال طريقة "تجميع البذور" (المواد والطرق). ثم قمنا بحساب معدلات الموقع للجميع إل- القراءات الإيجابية (المواد والطرق). باستخدام هذه الطريقة ، حصلنا على معدلات الموقع للجميع لكل من نوكليازات التقييد الستة إل-مرز (إل هو الطول المتوقع لـ RS) ورسم مخطط boxplot لـ إل- أكبر 50 موقعًا من حيث الأسعار (الشكل 2 أ). تم اعتبار الأشكال (البرتقالية الملونة في الشكل 2 أ) المقابلة للقيم المتطرفة في مخطط الصندوق ، مع مجموع تردد الموقع لهذه القيم المتطرفة (الملونة باللون الأخضر في الشكل 2 أ) و gt80٪ ، مواقع تقييد تنبأ بها DocMF (RS) . وهكذا ، بالنسبة إلى Eco RI و Bpu 10I و Age I و Nme AIII و Mlu I ، حصلنا على مواقع التقييد الخاصة بهم (RSs) من القيم المتطرفة الموضحة في الشكل 2 أ ، لأن مبالغ معدل الموقع لهذه القيم المتطرفة كانت كلها أكبر من 80٪ . بالنسبة إلى Bgl I ، كان مجموع معدل الموقع للقيم المتطرفة 7.65 ٪ فقط ، وهو صغير جدًا بحيث لا يمكن توقعه كمواقع تقييد (RS) باستخدام DocMF. وهكذا ، بالنسبة لـ Bgl I ، استخدمنا 11 mers (لأن 11 هو الطول المتوقع لـ RS) مع أعلى 372 موقعًا لأكبر معدلات للتنبؤ بمواقع التقييد (RS) ، كان مجموع معدل الموقع لهذه الأشكال الـ 372 أكبر من 80 ٪ (الشكل 2 ب). تسلسل تدرج (19) كشف التمثيل (الشكل 2C) لهذه المتتاليات البالغ عددها 372 أن RS لـ Bgl I كانت GCCNNNNNGGC ، والتي اتفقت مع RS المبلغ عنها. أظهرت هذه النتائج أن نظامنا مقترنًا بطريقة المعلومات الحيوية المحسنة يمكنه تحديد موقع التعرف على الحمض النووي بشكل موثوق لأنواع مختلفة من إنزيمات التقييد.

(أ) قطع مربعة للزخارف مع أعلى 50 جذعًا10(أسعار الموقع). يتم عرض تسلسل الحمض النووي للقيم المتطرفة (باللون البرتقالي) ومجموع معدلات موقع القيم المتطرفة (باللون الأخضر). (ب) معدلات الموقع التراكمية لـ Bgl I. (ج) تمثيل شعار متسلسل ل 372 زخارف لـ Bgl I.

يمكن لـ DocMF تحديد 5′-NGG-3 PAM بدقة من SpCas9

مؤثرات CRISPR-Cas هي نوكليازات داخلية موجهة من RNA تستخدم PAM كإشارة ربط DNA. إن PAM عبارة عن تسلسل قصير للحمض النووي ، عادةً أقل من 7 نقطة أساس ، يقع بالقرب من الحمض النووي المستهدف (يسمى بروتوسفاسر) لنظام CRISPR-Cas (22, 23). أحد أساليب تحديد PAM المستخدمة على نطاق واسع يحول البلازميدات التي تحمل تسلسلات PAM العشوائية إلى بكتريا قولونية في وجود أو عدم وجود موضع CRISPR-Cas. يكون تكرار تسلسل PAM الوظيفي أقل بشكل ملحوظ عند وجود بروتين Cas (24وبالتالي ، فإن اختبار استنفاد PAM هذا (24) يتطلب مجموعتين من المكتبات لتحديد إما 5 ′ أو 3 PAM وعناصر التحكم السلبية المقابلة. يجب أن يكون حجم المكتبة كبيرًا أيضًا لتغطية معظم ، إن لم يكن كل ، تسلسلات PAM. بالإضافة إلى ذلك ، فإن فحص نضوب البلازميد (24) تستغرق وقتًا طويلاً وتتميز بإنتاجية منخفضة. في المقابل ، يمكن لنظام DocMF فحص متواليات 5 ′ و 3 في وقت واحد لـ PAMs في تجربة واحدة ، مما يولد تغطية بأحجام متعددة أكبر من الطريقة التقليدية. يتم استخدام إحدى منطقتي PAM التي لا يتعرف عليها البروتين كعنصر تحكم سلبي داخلي.

في دراسة إثبات المفهوم ، قمنا بتقييم دقة DocMF من خلال تقييم متطلبات PAM لـ SpCas9 ، وهو نظام CRISPR-Cas الأكثر استخدامًا ، من S. المقيحة. يشق SpCas9 dsDNA بعد الارتباط بـ RNA المقابل ، ويتم الإبلاغ عن هذا الانقسام من فحوصات استنفاد PAM ليكون معتمدًا على تسلسل 5′-NGG-3 PAM (25). تظهر مكتبة PAM DNB المستخدمة في DocMF في الشكل 3 أ. احتوت منطقة oligo الاصطناعية على تسلسل بروتوسفاسر معروف 23-nt SpCas9 (برتقالي ملون في الشكل 3 أ) محاطًا بمناطق 5 ′ و 3 PAM مع 15 نيوكليوتيدًا عشوائيًا لكل منهما (باللون الأخضر في الشكل 3 أ). تم الحصول على معلومات التسلسل لكل من منطقتي PAM من خلال تسلسل أحادي الطرف قدره 50 nt.

(أ) رسم توضيحي لإعداد مكتبة PAM DNB. تحتوي منطقة oligo الاصطناعية على تسلسل بروتوسفاسر معروف 25-nt SpCas9 (برتقالي) محاط بمناطق 5 ′ و 3 PAM مع 15 نيوكليوتيد عشوائي لكل منهما (أخضر). يتم دمج مئات النسخ من كل بروتوسباكر عشوائي محاط بـ PAM لكل DNB ، ويتم عرض نسخة فقط. (ب) تردد القراءة النسبي في كل من 5 و 3 نهاية لـ SpCas9. ال X المحور هو كل مجموعات من متواليات 7-nt مرتبة حسب الاختلاف بين طرفين بترتيب تنازلي. (ج) تسلسل PAM لـ SpCas9.

تمت مقارنة تغيير طية الإشارة قبل وبعد حضانة SpCas9 على الرقاقة لمدة 4 ساعات. من بين 494،866،059 قراءة (DNBs) ، حصلنا على 366،913 DNB التي أظهرت تغييرًا أضعافًا أكبر من 3 ويمكن قصها بواسطة SpCas9. تم استرجاع التسلسلات 7-nt في منطقتي 5 ′ و 3 PAM من DNBs لمزيد من التحليل. تم حساب تردد جميع تركيبات PAM البالغ عددها 16384 (4 7) لكل من 5 ′ و 3 PAMs ورسمها مقابل التسلسل الفردي في الشكل 3 ب. تم الإبلاغ عن أن نوكلياز SpCas9 يرتبط فقط بالنهاية 3 للتسلسل المستهدف. لذلك ، تم استخدام متواليات 7-nt العشوائية 5′ كعنصر تحكم سلبي داخلي. طبقنا قاعدة سيجما الثلاثة (26) إلى متواليات 5 ′ لتحديد القطع لإشارات PAM الإيجابية. بمعنى آخر ، عند قطع 0.11 ، سقط ما يقرب من 99.7 ٪ من البيانات من منطقة 5 PAM في ضوضاء الخلفية. نتج عن هذا القطع الإحصائي 944 3 ′ تسلسل PAM الذي يفضل قطعه بواسطة SpCas 9. شعار تسلسل (19) كشف تمثيل التسلسلات أن SpCas9 فضلت فكرة 5′-NGG-3 ، على الرغم من أن حوالي 5.8 ٪ (55 من 944) من 5′-NAG-3 و 1.6 ٪ (15 من 944) من 5′-NGA- يمكن أيضًا التعرف على 3 (الشكل 3C) ، وهو ما يتماشى مع النتائج السابقة (2729).

يتيح DocMF الكشف الدقيق في المختبر عن PAMs في أنظمة CRISPR-Cas المختلفة

لإثبات فائدة DocMF في العثور على تسلسل PAM ، قمنا بتوسيع دراستنا لتشمل نظامي CRISPR-Cas غير معهود سابقًا ، VeCas9 من فيلونيلا جنس و BvCas12 من بوتيريسيموناس فيروسا (24). يحتوي VeCas9 على بروتين مؤثر Cas9 مكون من 1064 من الأحماض الأمينية ، بينما يبلغ طول بروتين BvCas12 1245 من الأحماض الأمينية. تم التعبير عن كلا البروتينين وتنقيتهما كما هو موضح في المواد والطرق التكميلية. تم تحديد crRNA و tracrRNA لـ VeCas9 من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي الصغير ، في حين تم التنبؤ بـ crRNA لـ BvCas12 في السيليكو استنادًا إلى أخصائي تقويم العظام Cas12a / Cpf1 الذي تم الإبلاغ عنه مسبقًا (الشكل S3). لاستجواب تنوع تسلسلات PAM الخاصة بهم ، أجرينا DocMF على VeCas9 و BvCas باستخدام نفس مكتبة DNB PAM (الشكل 3 أ) المستخدمة في دراسة SpCas9. بالنسبة لتجارب VeCas9 ، قمنا بتضمين ثلاثة تصاميم فردية لـ gRNA ، crRNA: tracrRNA ، sgRNA-1 بهيكل SpCas9 ، و sgRNA-2 مبتور (الشكل S3).

قبل استخدام DocMF ، اختبار نضوب PAM (24) لأول مرة على VeCas9 لمقارنة المنهجية (المواد والطرق التكميلية). كما يظهر في الشكل. S4 (A و B) ، مع 4.62 جيجا بايت من بيانات التسلسل ، لاحظنا 508 تسلسلًا بحد أدنى 3 لـ Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1 (AacC2c1) ، عنصر تحكم إيجابي في مقايسة النضوب ، وحدد بشكل صحيح PAM المبلغ عنه ، 5′-TTN-3 (24). ومع ذلك ، مع المزيد من بيانات التسلسل (7.33 جيجا بايت) لـ VeCas ، تم العثور على 0 و 74 تسلسلًا متميزًا مع عتبات 3 و 0.8 ، على التوالي (الشكل S4 و C و D). كانت نتائج VeCas9 مشابهة تمامًا لمجموعات التحكم السلبية (البيانات غير معروضة) ، وبالتالي ، فشلنا في اكتشاف تسلسل PAM الصحيح لـ VeCas9 باستخدام طريقة الاستنفاد التقليدية. يمكن أن يُعزى الفشل إما إلى ضعف تعبير بروتين VeCas9 أو وظيفته بكتريا قولونية الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحساسية المنخفضة (

20 × تغطية لكل تسلسل 7-nt PAM) من بكتريا قولونية يمكن أن يؤدي الاستنفاد فقط إلى تفاقم المشاكل.

باستخدام DocMF ، تم اختيار DNBs مع تغيير طية الإشارة فوق العتبة لمزيد من التحليل. في مخطط تردد القراءة (الشكل 4 و A و B) ، لم تظهر منطقة 5 PAM من VeCas9 (مع sgRNA-1) ومنطقة 3 PAM من BvCas12 أي نمط ربط بروتين ، و 3 SDs المقابلة (0.09 لـ تم استخدام VeCas9 و 0.075 لـ BvCas12) لتعيين خطوط القطع. نتيجة لذلك ، تم تحديد 4947 و 5580 تسلسل PAM فريدًا ليتم قطعه بواسطة VeCas9 و BvCas ، على التوالي. نقل كلا نظامي CRISPR-Cas عائلات PAM كبيرة كما هو موضح في تسلسل الإجماع وشعار التسلسل ، وهما مخططان شائعان لإعداد التقارير PAM (الشكل 4 ، C إلى E و G) (22, 23). تم الكشف عن تسلسل الإجماع لـ VeCas9 على أنه 5′-NNARRNN-3 ، أو NYARRMY لمجموعة أكثر هيمنة من متواليات PAM بواسطة مخطط التردد (الشكل 4 ج) ، بينما أبلغ شعار التسلسل عن تسلسل 5′-NNNRR-3 PAM ( الشكل 4E). أظهر VeCas9 مع gRNAs الأخرى نمطًا مشابهًا (الشكل S5). تم العثور على أكثر من 99 ٪ من PAMs مع sgRNA-2 القصير مع واحد على الأقل من الرناين الآخرين ، مما يشير إلى قابلية استنساخ عالية لطريقة DocMF. ولوحظ أيضًا اختلاف طفيف في PAM لـ BvCas بين طرق إعداد تقارير PAM. تم الإبلاغ عن تسلسل الإجماع وشعار التسلسل 5′-TYTN-3 (الشكل 4D) أو YYN (الشكل 4G) ، على التوالي. ومع ذلك ، فقد تجاهل نظاما الإبلاغ هذين الارتباط بين جميع المواضع السبعة وقد يقدمان بعض PAMs النشطة غير الصحيحة إذا تم الجمع بين كل موقع بشكل عشوائي.

(أ) تردد القراءة النسبي في كل من نهاية 5 و 3 نهاية لـ VeCas9. (ب) تردد القراءة النسبي في كل من نهاية 5 و 3 نهاية لـ BvCas. توافق تسلسل PAM حسب مخطط التردد مع جميع التسلسلات 7-nt المكتشفة لـ VeCas9 (ج) و BvCas12 (د). تسلسل PAM حسب تسلسل شعار VeCas9 الذي تم إنشاؤه بواسطة جميع التسلسلات 7-nt المكتشفة (ه) وبأعلى 1000 تسلسل 7-nt من تحليل FET (F). تسلسل PAM حسب شعار التسلسل لـ BvCas12 الذي تم إنشاؤه بواسطة جميع التسلسلات 7-nt المكتشفة (جي) وبأعلى 1000 تسلسل 7-nt من تحليل FET (ح). (أنا) في المختبر التحقق من صحة تسلسل VeCas9 PAM. تم اختيار تسعة متواليات 7-nt كل منها أعلى / أسفل القطع. تظهر أرقام ترتيب FET باللون الأحمر. NC ، تحكم سلبي. (ي) في المختبر التحقق من صحة تسلسل BvCas12 PAM. تم اختيار خمسة متواليات 7-nt فوق القطع وتسلسلان 7-nt أسفل القطع.

لاستجواب النشاط النسبي لكل PAM ، تم تطبيق طريقتين ، FET وعجلة PAM. تم تقديم FET لفرز تسلسلات PAM. FET هو اختبار يستخدم على نطاق واسع لتحديد ما إذا كان الفرق بين مجموعتين مهمًا. لذلك ، واحد PAM معين مع أصغر ص أشارت القيمة وفقًا لـ FET إلى أن تردد القراءة النسبي ، أو كفاءة القطع ، كان أكثر أهمية مقارنةً بتكرار أكبر ص القيمة. بعد ترتيب PAMs بالترتيب ، قمنا بفحص متواليات PAM المتفق عليها لأعلى 1000 تسلسل (الشكل 4 و F و H). تمت ملاحظة تسلسل إجماع PAM متميز قليلاً ، 5′-NNARR-3 لـ VeCas9 و 5′-TTTN-3 لـ BvCas12 ، وفقًا لمعايير الاختيار الصارمة هذه ، والتي ارتبطت بشكل أفضل بنتائج تخطيط التردد (الشكل 4 ، C و D ). لمزيد من التحقق من صحة تنبؤ FET ، تم إجراء فحص نوكلياز في المختبر باستخدام تسلسل PAM المختار عشوائيًا. تم تحضين منتجات PCR التي تحتوي على PAMs الفردية و protospacer المشترك مع بروتينات Cas9 أو Cas12 / Cpf1 عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تم تشغيل التفاعلات مع 50 نانوغرام من المدخلات على المواد الهلامية TAE ، واستخدمت كمية المدخلات المتبقية لحساب كفاءة الانقسام. كما هو موضح في الشكل 4 (G و H) ، كان لدى PAMs ذات أرقام ترتيب FET أعلى (باللون الأحمر) مدخلات أقل متبقية ، مما يشير إلى كفاءة قطع أفضل. أعطت PAM الأقل مرتبة قطعًا ضئيلًا ، لم يكن منتجها مرئيًا تقريبًا على مواد هلامية agarose التي تكون حساسيتها أقل بعدة مرات من NGS. اقترح الاتساق أنه يمكننا استخدام تنبؤنا FET لاختيار PAMs الأكثر نشاطًا لتحرير الجينات في الجسم الحي.

تم استخدام عجلة PAM أيضًا لفهم تسلسل PAM بشكل شامل واعتمادها الأساسي. عجلة PAM ، المشتقة من مؤامرات Krona التفاعلية ، تلتقط تسلسل PAM الفردي ونشاطها النسبي ، بما في ذلك تلك ذات التخصيب المنخفض (20). يمكن أيضًا توسيعه في أي قطاع من العجلة لعرض مجموعة فرعية من التسلسلات بشكل أفضل ودراسة وظيفة تلك PAMs. يوضح الشكل 5 (A و B) عجلات PAM الخاصة بكل من VeCas9 و BvCas. بالنسبة إلى VeCas9 ، هناك اعتماد قوي على القاعدة بين الموضعين 3 و 4. إذا كان الموضع 3 له قاعدة R (A أو G) ، فإن الموضع 4 يميل إلى أن يكون R (& gt80٪ شكل S6) ومستوى صغير لكن ملحوظ من C ( & GT0٪). إذا كان الموضع 3 هو Y (T أو C) ، فإن الموضع 4 يفضل R فقط (

99٪). T هي القاعدة الأقل تفضيلاً في الموضع 4 أو 5 ، والتي تتفق مع نتائج القطع في المختبر من الشكل 5C (الممران 9 و 10). أظهر الهلام أيضًا أن NYARRMY (الإجماع PAM استنادًا إلى حارة تسلسل الإجماع الأكثر شيوعًا 1 في الشكل 4C) و NNARRNN (الممرات 2 إلى 4) و ACAAGCC (التسلسل المرتبة 58 كحارة تحكم إيجابية 11) تم قطعها بشكل أكثر كفاءة من NNCRRNN (الممر 5) ، NNTRRNN (الممر 6) ، أو NNGRRNN (الممر 7) ، وهو ما يفسر سبب احتواء A على 47٪ في الموضع 3 ، بينما كانت القواعد الثلاث الأخرى بين 16 و 19٪ (الشكل 5A والشكل S6) ). بالنسبة لعجلة BvCas12 PAM الموضحة في الشكل 5 ب ، وجدنا أن الموضع −4 كان عشوائيًا عندما كان كلا الموضعين 2 و 3 هما Y (T / C). لذلك أنتجت PAM YYN منتجات قطع أكثر من YRN في الشكل 5D (الممران 1 و 2). ومع ذلك ، فإن الموضع −4 يميل إلى أن يكون T إذا كان أحد المواضع −2 أو 3 ليس Y. ونتيجة لذلك ، لاحظنا قطعًا أكثر بقليل مع T من V في الموضع −4 ، عندما يكون الموضعان 2 و 3 إما RY أو YR (الشكل 5D الممرات من 7 إلى 10). تملي R في الموضع 2 أيضًا أن الموضع 3 سيكون Y (100٪ شكل S6). كما هو مبين في الشكل 5D ، أظهر نظام BvCas12 قطعًا واضحًا على 5′-TTTN-3 أو TYTN (الشكل 5D). تشير بياناتنا إلى أن كلاً من VeCas9 و BvCas 12 يحتويان على مجموعة من تسلسلات PAM المريحة التي تم التقاطها بشكل شامل بواسطة DocMF.

(أ) عجلة PAM لـ VeCas9. يعطي المربع الأصفر العلوي إشارة إلى كل موضع في تسلسل PAM ، ويوضح السهم اتجاه كل قاعدة. تمثل مساحة قطاع الحلقة لقاعدة واحدة في موضع معين ترددها في هذا الموضع. (ب) عجلة PAM لـ BvCas12. (ج) في المختبر التحقق من نتائج عجلة PAM VeCas9. NYARRMY هو التسلسل الإجماعي على أساس التردد الموضعي ، بينما يحتل ACAAGCC المرتبة 58 في الترتيب FET المتضمن كعنصر تحكم إيجابي. (د) في المختبر التحقق من نتائج عجلة بام. NNNTTTN أو NNNTYTN هو التسلسل الإجماعي على أساس التردد الموضعي ، بينما AATTTTG هو التسلسل 70 المرتبة FET المضمّن كعنصر تحكم إيجابي. NC (التحكم السلبي): PAMs إيجابية حضنت مع البروتين المقابل ولكن بدون أي sgRNA.

يمكن لـ DocMF تحديد مواقع ربط البروتين بدقة

تم تمييز تفاعلات البروتين والحمض النووي في العديد من المنصات عالية الإنتاجية بما في ذلك المصفوفات الدقيقة و HT-SELEX و CHAMP (4, 11). قمنا بتعديل سير عمل DocMF المذكور أعلاه لاكتشاف أشكال ربط البروتين والحمض النووي. ظلت الخطوات دون تغيير حتى تم إعادة تصنيع الخيط التكميلي الطبيعي لتشكيل 50-bp dsDNA والنهاية الموصوفة بأصباغ الفلورسنت. بعد ربط البروتين المعني بأهداف dsDNA الخاصة به وإزالة أي فائض ، حصلنا على الصور الأولى لتسجيل شدة الإشارة. بعد هذا التصوير الأول ، تم إجراء حضانة على الرقاقة مع المخزن المؤقت لتفاعل MDA و dNTPs والبوليميراز مع إزاحة حبلا قوية عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتجميع حبلا تكميليًا ثانيًا باستخدام ssDNB كقالب (الشكل S1). وبالتالي ، سيتم استبدال حبلا الفلورسنت الأصلي وإزاحته من DNB ، مما يؤدي إلى انخفاض الإشارة عندما لا يكون هناك ارتباط بالبروتين لمنع MDA. لاختبار هذه الفكرة ، استخدمنا بروتينًا مدروسًا جيدًا ، dCas9 ، وأزلنا نشاط نوكليازه الداخلي من خلال الطفرات النقطية في مجالات نوكليازه الداخلي HNH و RucV (17). غيرت الطفرات النقطية D10A و H840A اثنين من البقايا الهامة لنشاط نوكلياز داخلية ، مما أدى في النهاية إلى تعطيله. على الرغم من أن dCas9 يفتقر إلى نشاط نوكلياز داخلي ، إلا أنه يظل قادرًا على الارتباط بـ gRNA الخاص به وخيط DNA الذي يتم استهدافه لأن الارتباط يتم توسطه من خلال مجالات REC1 و BH و PI (30). علاوة على ذلك ، سبق أن تبين أن dCas9 لا يرتبط بالتسلسل المستهدف عندما لا يكون هناك PAM (NGG) موجود (31). على عكس الدراسات المذكورة أعلاه ، اعتبرت القراءات مع تغيير طية التألق أقل من العتبة إيجابية ، مما يشير إلى DNBs التي يمكن لـ dCas9 التعرف عليها وربطها. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتضمين ممر تحكم سلبي بدون حضانة dCas9 في نفس العملية ، نظرًا لأن BGISEQ-500 به ممران على شريحة واحدة. ما يقرب من 95٪ من إجمالي 253 مليون قراءة من حارة التحكم السلبية فقدت نصف شدة الإشارة (البيانات غير معروضة). اخترنا تغيير إشارة عند 0.5 كعتبة (الصورة 2 / صورة 1) واسترجعنا 14371.289 من 335497.075 و 15.647.574 من 337.529.837 قراءة من الممرات التجريبية والتحكمية ، على التوالي. قدمنا ​​مفهوم قوة الربط النسبية الموثوق به لتقييم قوة الربط لكل تسلسل 7-nt. وبالمثل ، تم اعتبار البيانات الموجودة في الطرف 5 المناسب للتوزيع الطبيعي بمثابة ضوضاء في الخلفية ، وتم اعتماد قاعدة سيجما الثلاثة لتحديد القطع عند 0.135. بعد استبعاد الضوضاء ، لاحظنا أن تسلسل NGG كان ضروريًا لربط dCas9 (الشكل 6) ، بما يتوافق مع النتائج السابقة. يشير هذا إلى أنه باستخدام DocMF المعدل ، يمكن تسخير سير العمل كأداة عامة لتحديد أشكال ربط الحمض النووي.

(أ) قوة الربط النسبية عند كل من الطرف 5 و 3 نهاية لـ dCas9. ال X المحور عبارة عن مجموعات من متواليات 7-nt ويتم فرزها تلقائيًا حسب الحرف باستخدام Excel. (ب) تم إنشاء شعار التسلسل لـ dCas9 بواسطة جميع المتواليات 7-nt المكتشفة بناءً على تلك التي تتمتع بأعلى قوة ربط نسبية.


تلطيخ الميثيل الأزرق على الخميرة

يتم استخدام إجراء تلطيخ الميثيلين الأزرق لقياس صلاحية الخميرة بناءً على افتراض أن الميثيلين الأزرق سيدخل الخلايا ويتم تفتيته بواسطة خلايا الخميرة الحية التي تنتج الإنزيمات التي تكسر الميثيلين الأزرق ، تاركة الخلايا عديمة اللون. لا تنتج الخلايا غير القابلة للحياة هذا الإنزيم (أو الإنزيمات) وبالتالي فإن لون الميثيلين الأزرق الذي يدخل الخلايا لا يتحلل مما يتسبب في بقاء الخلايا ملونة (يتركز الشكل المؤكسد داخل الخلايا).

ثم يتم حساب الخلايا الملونة وعديمة اللون باستخدام مقياس الدم وعدد الخلايا القابلة للحياة وغير القابلة للحياة المحددة في منطقة معينة ، ثم تُستخدم النتيجة لتقدير عدد الخلايا في العينة الأصلية.

هذه طريقة سهلة وسريعة ورخيصة لتحديد كمية الخميرة القابلة للحياة الموجودة في العينة على الرغم من أن هذه ليست أفضل طريقة لعدد من الأسباب. A major reason is that methylene blue rapidly becomes toxic to the yeast and as such preparations should be examined within 10 minutes of preparation.

The older the cells become, the less likely that they are to take up the methylene blue dye from solution since as the yeast age, they deposit lipid and/or sugar in their cell membrane (in the form of free sterols[predominantly ergosterol and zymosterol with minor portions of lanosterol and fecosterol] and phospholipids[phosphotidylcholine and phosphotidylethanolamine with minor portions of phosphotidylinositol, phosphotidylserine and phosphotidyl-glycerol]) as a survival mechanism to protect their internal mechanisms from the buildup of waste in the external environment.

This means that cells which are not viable would not take up the dye and due to their age and not their ability to break down the methylene blue (as a result of their viability) would remain colourless and be determined to be viable (a false positive). The test itself is also not very accurate since yeast might not be evenly distributed in the original sample and depending on the sample taken for determination , may yield higher or lower viability counts than are really present in the original sample.

This viability count and cell count is absolutely essential since the yeasts are the producers of the ethanol through the breakdown of sugars (catabolism of sugars by glycolysis to pyruvate, which is then converted to CO2 and ethanol) present in the wort/must (the pitching rate is a measure of the number of viable yeast present in a particular stock being used for fermentation). These processes can only be performed by viable yeast cells and consequently the greater the umbers of viable yeasts in the sample, the higher the rate of ethanol production. The expected yield of ethanol (alcohol) can also be calculated based on the number of viable yeast present in a particular stock being used for fermentation (along with the sugar present in the wort). This is very important in industrial alcohol production to determine the required alcohol content of the final product and the viability of the yeast pitched must be greater then 85% or it is not used.


Pioneering technique paves way for fast and cheap fabrication of rapid medical diagnostic tools

Example 100-micron wide 3D-printed microchannel scaffolds, shown next to a 20p coin - the cost to print 1000 of these channels. Credit: University of Bristol

New technology developed by the University of Bristol has the potential to accelerate uptake and development of on-chip diagnostic techniques in parts of the world where rapid diagnoses are desperately needed to improve public health, mortality and morbidity.

Microfluidic devices underpin lab-on-a-chip (LOC) technologies which are developed to provide the rapid diagnoses at that are needed at point of care (POC) for the swift and effective treatment of many diseases.

Researchers at Bristol have developed a fast, reliable and cost-effective alternative for producing the soft-lithographic moulds used for fabricating microfluidic devices, published in the journal PLOS ONE. This discovery means fabrication of microfluidic devices (with channel dimensions

width of a human hair) is now both accessible and affordable using simple, low-cost 3-D-printing techniques and the open-source resources developed by the team.

"Previously, techniques for producing the soft-lithographic scaffolds/moulds (microfluidic channel patterns) were time-consuming and extremely expensive, while other low-cost alternatives were prone to unfavourable properties. This development could put LOC prototyping into the hands of researchers and clinicians who know the challenges best, in particular those in resource-limited settings, where rapid diagnostics may often have the greatest impact," said lead author of the study, Dr. Robert Hughes.

Dye-mixing inside a microfluidic chip made using 3D-printed interconnecting channel scaffolds. Credit: University of Bristol

"This technique is so simple, quick & cheap that devices can be fabricated using only everyday domestic or educational appliances and at a negligible cost (

0.05% of cost of materials for a single microfluidic device). This means researchers and clinicians could use our technique and resources to help fabricate rapid medical diagnostic tools, quickly and cheaply, with minimal additional expertise or resources required," said co-author, Mr Harry Felton.

"The simplicity and minimal cost of this technique, as well as the playful click-and-connect approach developed, also makes it suitable for hobbyists and educational use, to teach about microfluidics and the applications of lab-on-a-chip technology," said co-author Ms Andrea Diaz Gaxiola.

"It is our hope that this will democratise microfluidics and lab-on-a-chip technology, help to advance the development of point-of-care diagnostics, and inspire the next generation of researchers and clinicians in the field," said Dr. Hughes.

Simplified flow-diagram of the low-cost technique for fabricating microfluidic devices. Resulting channels can be applied directly to a glass surface with no additional treatment. Credit: University of Bristol

The next step for the team is to identify potential collaborators in both research and education to help demonstrate the impact this technology could have in both settings by developing and supporting outreach activities and applications for on-chip diagnostic testing.


Science works in strange ways. The experiment, which requires a few basic metal materials and a small digital clock, also calls for an uncooked spud and America's least expensive coin -- the penny. After setting up an electrical circuit with the objects, the potato's natural acidity interacts with the penny's copper to complete one half of this natural "battery's" circuit.

Science fair students, like real scientists, should work to gain consent from people before including them in an experiment.


الانتماءات

Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Scott Sherrill-Mix, Young Hwang, Aoife M. Roche, Abigail Glascock, Susan R. Weiss, Yize Li, Louis J. Taylor & Frederic D. Bushman

Department of Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Scott Sherrill-Mix, Jevon Graham-Wooten & Ronald G. Collman

Department of Genetics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Leila Haddad, Peter Deraska, Caitlin Monahan, Andrew Kromer & Arupa Ganguly

Department of Emergency Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Department of Biochemistry and Biophysics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA


Be safe and follow some simple rules

  • Never use the same pots and utensils for dyeing that you use for cooking.
  • Wear rubber gloves and use a face mask when measuring mordants and dyes.
  • Work in a well ventilated area.
  • Dispose of used mordants and dye baths safely.

Well there you have it. A simple and practical guide to the use of mordants and fixitives in your natural dyeing products!

Whilst all this talk may seem a little off-putting at first, hopefully you now see how simple and fun the whole affair really is!

But… if you’re still feeling a bit shell shocked, do consider my Natural Dyeing Bootcamp. I cover 4 stunning natural dyeing projects in detail that don’t require mordants or fixatives at all!

Not sure where to get started? Check out my 30 day Natural Dyeing Boot Camp! Try It Now


شاهد الفيديو: طريقة سهلة و ذكية للقضاء على حشرة الارضة النمل الابيض (أغسطس 2022).