معلومة

الوقت اللازم لهطول الأمطار RNA في الإيثانول

الوقت اللازم لهطول الأمطار RNA في الإيثانول



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد قمت بترسيب الحمض النووي الريبي البكتيري خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية بعد استنفاد الرنا الريباسي باستخدام مجموعة Ribo-Zero.

هل المزيد من الوقت يؤدي إلى نتائج أفضل؟


على حد علمي ، لم يتم تحليل هذا بدقة من أجل RNA ، ولكن هناك ورقة ممتازة حول ترسيب الحمض النووي والظروف المعتادة في BRL Focus بواسطة Zeugin (انظر أدناه للحصول على الورقة). نظرًا لأن الحمض النووي والحمض النووي الريبي متماثلان إلى حد كبير (باستثناء مجموعة OH واحدة) والظروف المستخدمة لهطول الأمطار متشابهة أيضًا ، أعتقد أنه يمكننا استخدام هذا لتقدير قريب جدًا.

ومن المثير للاهتمام أنه لا الوقت ولا درجة حرارة هطول الأمطار لهما تأثير كبير على النتيجة - فهما يغيران المحصول بنسبة قليلة فقط. إذا نظرت إلى الشكل 2 من الورقة المذكورة ، ترى ما يلي:

يوضح هذا الشكل الفرعي أن الانتعاش لا يتأثر تقريبًا بدرجة الحرارة ، ولكن فقط بتركيز الحمض النووي (أو RNA). اعتمادًا على مقدار الحمض النووي الريبي (RNA) الذي تتوقعه (عدد الخلايا التي استخدمتها للعزل) سأضيف عامل الترسيب المشترك عندما يكون لديك كميات صغيرة جدًا من الحمض النووي الريبي. يعمل الجليكوجين جيدًا هنا. وإلا فلن أقلق.

يوضح هذا الشكل أن وقت الحضانة له تأثير فقط على النسبة المئوية للتعافي عندما يكون الوقت قصيرًا جدًا. إذا احتضنت لمدة ساعة ، فأنت في الجانب الآمن.

المرجعي:


كما توحي العديد من المجموعات ، فإن تركيز الحمض النووي الريبي له التأثير الأكثر عمقًا على كفاءة هطول الأمطار / جزء الاسترداد. تركيز عامل الوقت ودرجة الحرارة والترسيب له تأثير أقل. انظر على سبيل المثال التعليمات بواسطة Life Technologies حول هطول الأمطار LiCl:

استخدام ترسيب LiCl لتنقية الحمض النووي الريبي


تنقية مرنا (E2065)

تتضمن المجموعة محلول LiCl للاسترداد السريع لمركب الرنا المرسال المركب. ترسيب LiCl للحمض النووي الريبي فعال في إزالة غالبية NTPs والإنزيمات غير المدمجة. ومع ذلك ، فإن الحمض النووي الريبي الأقصر من 300 قاعدة أو بتركيزات أقل من 0.1 مجم / مل لا تترسب بشكل جيد. في مثل هذه الحالات ، يمكن استخدام طرق تنقية أخرى. LiCl المنقى مرنا مناسب لتجارب الترنسفكأيشن والحقن المجهري.

  1. إلى تفاعل النسخ 20 & microl ، أضف 30 & mul ماء و 25 & mul محلول LiCl ، اخلط جيدًا.
  2. احتضان في & ndash20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة بأقصى سرعة لتكوير الحمض النووي الريبي.
  4. قم بإزالة المادة الطافية بعناية.
  5. شطف الحبيبات عن طريق إضافة 500 & مول من الإيثانول البارد 70٪ وجهاز الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. قم بإزالة الإيثانول بعناية. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لإسقاط أي سائل على الحائط.
  7. قم بإزالة السائل المتبقي بعناية باستخدام طرف حاد (على سبيل المثال ، طرف التحميل).
  8. قم بتجفيف الحبيبات بالهواء وأعد تعليق mRNA في 50 & mul من 0.1 ملي EDTA أو محلول تخزين RNA مناسب.
  9. تسخين الحمض النووي الريبي عند 65 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق لإذابة الحمض النووي الريبي تمامًا. اخلط جيدا.
  10. تخزين RNA في & ndash20 & degC أو أقل.

استخراج الفينول الكلوروفورم وترسيب الإيثانول

لإزالة البروتينات ومعظم النيوكليوتيدات الحرة ، يعتبر الفينول: استخراج الكلوروفورم وترسيب الإيثانول لنصوص الحمض النووي الريبي الطريقة المفضلة.

  1. ضبط حجم التفاعل إلى 180 & مول عن طريق إضافة الماء الخالي من نوكلياز. أضف 20 & مول من 3 M أسيتات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 5.2 أو 20 & مول من 5 م أسيتات الأمونيوم وتخلط جيدًا.
  2. مستخلص بحجم متساوٍ من 1: 1 فينول: خليط كلوروفورم ، متبوعًا باستخلاصين مع الكلوروفورم. جمع المرحلة المائية ونقلها إلى أنبوب جديد.
  3. يعجل الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة 2 مجلدات من الإيثانول. احتضان في & ndash20 & degC لمدة 30 دقيقة على الأقل وجمع الحبيبات عن طريق الطرد المركزي.
  4. إزالة المادة الطافية وشطف الحبيبات مع 500 & مول من الجليد البارد 70٪ إيثانول.
  5. Resuspend الحمض النووي الريبي في 50 & مول 0.1 ملي EDTA. تخزين RNA في & ndash20 & degC أو أقل.

شفط مزدوج

يعتبر الشفط المزدوج مفيدًا لإزالة الآثار الأخيرة لمادة EtOH الطافية بعد الترسبات. إنه ينطوي على دوران سريع ثانٍ وطموح لضمان إزالة أي مادة طافية للترسيب ، على سبيل المثال على جدران الأنبوب ، والتي قد تتداخل مع الخطوات النهائية للبروتوكول. نوصي به في بروتوكول Ambion's RPA III ™ ، ولإعداد قالب مسبار RNA.

  • بعد تكوير الترسيب ، نضح المادة الطافية للترسيب من بيليه الحمض النووي. اتبع على الفور بطرد مركزي سريع لمدة 1-2 ثانية ونضح مرة أخرى.


يمكن أن يتم الشفط بإبرة حقنة أو ماصة باستور ممدودة متصلة بمصدر فراغ به مصيدة. بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام ماصة Pasteur الطويلة مع لمبة ماصة. لعمل ماصات باستور الطويلة ، قم بتليين طرف الماصة بلهب واسحب الطرف للخارج بالملقط ، واكسر الحافة عند أضيق نقطة وقم بتلميع اللهب إذا لزم الأمر.


الإجراءات التجريبية

الخلفية النظرية

يمكن أن يكون مصدر التلوث بواسطة RNases أثناء استخراج الحمض النووي الريبي خارجيًا أو داخليًا 5-7. تشمل المصادر الخارجية الكواشف والأواني الزجاجية والأواني البلاستيكية المستخدمة في عزل الحمض النووي الريبي ، وخاصة جلد المحقق. ومع ذلك ، يمكن التخلص من RNases من خلال تدابير معقولة ، مثل معالجة الكواشف والأواني البلاستيكية باستخدام ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) للخبز في الأواني الزجاجية والملاط والمدقة وارتداء القفازات التي تستخدم لمرة واحدة طوال الإجراء بأكمله. ومع ذلك ، فإن RNases الذاتية هي فطرية في الأنسجة البيولوجية وعادة ما يتم عزلها في العضيات والفجوات. يتم تنظيمها بشكل كبير في الخلايا السليمة ، ويتم تدمير الآليات التنظيمية بمجرد تعطل العضيات والفجوات أثناء تحلل الخلايا ، مما قد يؤدي إلى تدهور سريع في RNA 5. لذلك ، فإن كيفية تعطيل RNA الداخلي المنشأ بسرعة وبشكل كامل هو مفتاح التنقية الناجحة للحمض النووي الريبي عالي الجودة. لقد ثبت أن أملاح الجوانيدينيوم مثبطات قوية لـ RNases 5 و 7 وقد تم إنشاء العديد من الطرق القائمة على ملح الجوانيدينيوم لعزل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض العوائق لهذه الطرق ، مثل فقدان أو تجزئة الحمض النووي الريبي أثناء الاستخراج العضوي ، والتدخل في التفاعلات الأنزيمية المصب بواسطة بقايا ملح الجوانيدينيوم ، وتكلفة أعلى للتجربة بسبب استخدام تركيز أعلى من أملاح الجوانيدينيوم لإبطال مفعولها. RNases 7. في طريقة عزل الحمض النووي الريبي التي تم الإبلاغ عنها سابقًا 6 ، حاولنا تعطيل RNases الذاتية بسرعة وبشكل كامل التي تم إطلاقها أثناء تحلل الخلية وكذلك التغلب على بعض عيوب الطرق القائمة على ملح الجوانيدينيوم. تضمنت قياساتنا تعديل تكوين المخزن المؤقت للاستخراج: لم يتم ضبط الأس الهيدروجيني للعازل الاستخراج مع حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة النهائية ، بما في ذلك 0.2 متر تريس ، في نظامنا هي 9.0. يمكن أن يقلل الرقم الهيدروجيني هذا بشكل كبير من نشاط RNase لأن أقل من 15 ٪ فقط من النشاط يبقى عندما يكون الرقم الهيدروجيني أعلى من 9.0 مقارنة مع أقصى نشاط عند درجة حموضة تبلغ 7.2 تقريبًا في الماء 10. بالإضافة إلى ذلك ، MgCl2 وأدرج السكروز في المخزن المؤقت للاستخراج. إن MgCl2 تمت إضافته لأن Mg 2+ ضروري لتحقيق الاستقرار في العديد من الهياكل الثانوية والثالثية داخل RNA 11 ، وتمت إضافة السكروز للحفاظ على ضغط تناضحي مناسب للمحلول. خلاف ذلك في محلول ناقص التوتر ، قد يحدث تفتيت الحمض النووي الريبي من خلال اصطدام الضغط التناضحي على الحمض النووي الريبي على تحلل الخلية المتفجرة. علاوة على ذلك ، تمت إضافة الفينول المشبع تريس على الفور إلى مساحيق الأنسجة السائلة النيتروجينية لتعطيل RNases الذاتية المنبعثة. أثناء الاستخراج العضوي التالي ، تم اعتماد الدوامة لتعزيز تأثيرات تمسخ البروتين. إدراج MgCl2 والسكروز في المخزن المؤقت للاستخراج يمكن أيضًا أن يتجنب التهديد المحتمل لتفتيت الحمض النووي الريبي ، وخاصة تلك ذات الوزن الجزيئي المرتفع عن طريق الدوامة. لتقليل نشاط RNase الذي تم إدخاله عن طريق الخطأ أثناء إجراء العزل بالكامل ، كانت جميع الكواشف المستخدمة في تحضير الحمض النووي الريبي باردة مثلجة ، وتم تحضير الأنابيب مسبقًا ، وتم الاحتفاظ بالعينات على الجليد في جميع الأوقات ، باستثناء أثناء خطوات التجفيف بالهواء لرواسب الحمض النووي بعد الطرد المركزي 5.

عادة ما يكون تركيز الحمض النووي هو الخطوة الأخيرة في معظم بروتوكولات تنقية الحمض النووي الريبي. عادة ، يتم تحقيق تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق الترسيب في وجود أيونات الصوديوم والإيثانول. ومع ذلك ، على عكس الترسيب الدراماتيكي للحمض النووي الجينومي ، غالبًا ما تكون فترات الحضانة الأطول عند درجة حرارة -20 درجة مئوية مطلوبة لترسيب الحمض النووي الريبي لضمان الشفاء التام 5. في بروتوكولنا الأصلي ، تم تحقيق استرداد الحمض النووي من خلال ترسيب الإيثانول عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ، وشمل خطوتين لترسيب الإيثانول ، أحدهما لترسيب الأحماض النووية ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي والحمض النووي ، والآخر لترسيب الحمض النووي الريبي بشكل انتقائي 6 . استمر إجراء العزل بالكامل لمدة 8 ساعات تقريبًا وتم تقسيمه إلى ثلاث جلسات بواسطة ترسبات إيثانول أطول مرتين ، مما يجعل الطريقة غير مناسبة لدورة تجريبية جامعية محدودة الوقت. هناك أدلة تشير إلى أن استعادة الأحماض النووية عن طريق ترسيب الإيثانول لا تتحسن بشكل كبير عن طريق الحضانة الطويلة أو المنخفضة في درجة الحرارة ، ولكن من خلال وقت أطول للطرد المركزي 9. لذلك ، تم استبدال الحضانة الأطول في درجة الحرارة المنخفضة (عند -20 درجة مئوية لمدة 3 ساعات) بالحضانة عند 0 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، وتم ضبط وقت الطرد المركزي بعد ترسيب الإيثانول على 15 دقيقة لتحقيق استعادة جيدة. نتيجة لذلك ، تم تقليل مدة إجراء العزل بشكل كبير (في 2.5 ساعة ، مقارنة بـ 8 ساعات من طريقتنا الأصلية) ، في حين أن استعادة الحمض النووي الريبي كانت قابلة للمقارنة مع طريقتنا الأصلية (البيانات غير معروضة).

نظرًا لأن نجاح العديد من التطبيقات المستندة إلى RNA المصب يعتمد على الحصول على RNA عالي الجودة ، فمن الضروري تقييم جودة RNA المنقى قبل إجراء فحوصات المصب. لذلك ، يجب فحص كمية ونقاء وسلامة عينات الحمض النووي الريبي بالطرق المناسبة. يمتلك الحمض النووي الريبي أقصى امتصاص عند 260 نانومتر ، ويمكن قياس تركيز الحمض النووي الريبي طيفيًا ضوئيًا بواسطة العلاقة 1 أ260 = 40 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مل -1. تحتوي البروتينات الملوثة وعديدات السكاريد / بوليفينول على قيم امتصاص قصوى عند 280 و 230 نانومتر ، على التوالي ، وبالتالي فإن نسب أ260/أ280 و أ260/أ230 يمكن استخدامها كمؤشرات لهذه الملوثات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي هذه الملوثات إلى انحرافات عن طيف الامتصاص القياسي مع ملف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية المميز لعينات الحمض النووي الريبي النقية ، والتي لا يمكن ملاحظتها عند قياس الامتصاصية فقط عند الأطوال الموجية الثلاثة أعلاه. لذلك ، إلى جانب نسب الامتصاص ، تم تقديم تحليل طيف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية للحمض النووي الريبي المنقى من 220 إلى 350 نانومتر لتقييم نقاء الحمض النووي الريبي. للتحقق من سلامة الحمض النووي الريبي ، تتمثل الطريقة النموذجية في تصور ملف تعريف النطاقات لنطاقات RNA المفصولة بالحجم من خلال هلام agarose في ظل ظروف تغيير طبيعة. ومع ذلك ، فهي عملية تستغرق وقتًا طويلاً بسبب الإجراء المعقد ، ولا يمكن تحقيق تصور نطاقات الحمض النووي الريبي مباشرة بعد الرحلان الكهربائي 8. هلام الاغاروز القياسي ، على الرغم من أنه يحتوي على دقة أقل للحمض النووي الريبي غير المعالج والغني بالتركيبات الثانوية والثالثية ، إلا أنه يتميز بسهولة استكماله وقادرًا على تصور الحمض النووي الريبي فورًا بعد الرحلان الكهربي عن طريق تضمين بروميد الإيثيديوم (EtBr) في الهلام. لذلك ، تم استخدام الرحلان الكهربي من الحمض النووي الريبي غير المولد من خلال هلام الاغاروز القياسي للتحقق من سلامة الحمض النووي الريبي في هذا التقرير. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه لا يمكن تحقيق أفضل أداء لفصل إجمالي الحمض النووي الريبي تحت ظروف عدم التوليد إلا عن طريق تشغيل عينات الحمض النووي الريبي بكميات أقل (عادة أقل من 5 ميكروغرام) من خلال تركيز أعلى من هلام الاغاروز (عادة 1.5٪).

ترتيب

عمل الطلاب في أزواج في المختبر. تم إجراء العلاج الخالي من RNase قبل التجربة من قبل الطلاب الفرديين. ركزت ساعة واحدة تقريبًا من المحاضرات والمناقشات في المختبر المسبق على احتياطات محددة للعمل مع RNA ، وتم توفير الأساس المنطقي لإنشاء البروتوكول الأصلي والتعديلات التي تم إجراؤها على طرق عزل RNA وتحليل مراقبة جودة RNA المستخدمة في هذا التقرير وتبعها 4 ساعات تدريب عملي في المعمل. يمكن أيضًا تقسيم الإجراء بأكمله إلى جلستين لعزل الحمض النووي الريبي وتحليل مراقبة جودة الحمض النووي الريبي.

المواد والحلول

المعدات التالية مطلوبة للتجربة: ملاط ​​ومدقة ، ملاعق مختبر غير قابلة للصدأ ، أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل ، ماصات ، دوامة ، أطراف وقفازات يمكن التخلص منها ، أجهزة طرد مركزي (Thermo Fisher Scientific ، Am Kalkberg ، ألمانيا ، Sorvall ST 16R) ، 1.5 مل أنابيب إيبندورف ، مقياس طيف ضوئي منخفض الحجم (NanoDrop Technologies ، Wilmington ، DE ، Nanodrop 2000c) ، مرافق الرحلان الكهربائي تحت الماء (Bio-Rad ، Hercules ، CA ، Sub Cell GT) ، ونظام التصوير الهلامي (Bio-Rad ، Hercules ، CA ، Gel نظام Doc XR). تم إجراء العلاج الخالي من RNase على النحو التالي: تم نقع جميع الأنابيب والأطراف في 0.1 ٪ DEPC طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، ثم تعقيمها عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تم خبز الهاون والمدقات وكذلك ملاعق المختبر غير القابل للصدأ على درجة حرارة 180 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.

كانت الكواشف التالية مطلوبة لعزل الحمض النووي الريبي: محلول استخراج الحمض النووي الريبي (0.2 م تريس ، 0.4 م بوكل ، 0.2 م سكروز ، 35 م م MgCl2، 25 مم EGTA) ، فينول مشبع تريس (pH 8.0) ، كلوروفورم / كحول أيزو أميل (24: 1 ، حجم / حجم) ، 3 م NaAc (درجة الحموضة 5.2) ، 3 م NaAc (درجة الحموضة 5.6) ، 0.3 م NaAc (الرقم الهيدروجيني 5.6) والمياه المعالجة DEPC. تم تحضير محاليل NaAc والمياه المعالجة بـ DEPC عن طريق معالجة محاليل NaAc والماء بنسبة 0.1 ٪ DEPC طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، ثم تعقيمها عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تم تحضير المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي بالماء المعالج بـ DEPC.

كانت الكواشف التالية مطلوبة لتحليل الحمض النووي الريبي: agarose ، 1 × TAE ، 10 × محلول تحميل RNA (1 م م EDTA ، 0.25٪ بروموفينول أزرق ، 0.25٪ زيلين سيانول ، 50٪ جلسرين) ، و 10 مجم / مل EtBr. لم يتم إعطاء حلول الرحلان الكهربي للحمض النووي الريبي العلاج الخالي من RNase لأن نطاقي RNase و RNA لهما حركة مختلفة في المواد الهلامية agarose ، مما يعني أنه يمكن فصلهما بمجرد تطبيق مجال كهربائي.

تحلل الخلايا وتفكك البروتين النووي وتمسخ البروتين وإزالته

يمكن تطبيق الإجراء التالي على مجموعة متنوعة من أنسجة النباتات العشبية. بالنسبة للأنسجة النباتية الغنية بالسكريات و / أو البوليفينول ، ينبغي اعتماد بروتوكولات تنقية محددة ، مثل طريقة بروميد سيتيل ترايميثيل الأمونيوم المعدلة 12.

اجمع 1 جرام من الملفوف الأبيض الصيني (براسيكا كامبيستريس L. ssp. تشينينسيس ماكينو [فار. البلدية Tsen et Lee]) يتركها ويطحنها في النيتروجين السائل في ملاط ​​مبرد مسبقًا إلى مسحوق ناعم. لا تدع الأنسجة تذوب وانقل المسحوق فورًا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، أضف 2 مل من الفينول المشبع بتريس (درجة الحموضة 8.0) فورًا ، ثم 4 مل من المخزن المؤقت للاستخراج و 2 مل من كلوروفورم / كحول أيزو أميل (24: 1 ، v / v) بالتتابع (يجب إضافة الفينول أولاً لإنشاء بيئة تمسخ لطبيعة RNases الذاتية التي سيتم إطلاقها فيها). دوامة الأنبوب حتى يتم تشكيل مستحلب كامل. جهاز طرد مركزي بسرعة 8000 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المرحلة المائية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي آخر سعة 50 مل ، ثم أضف 2 مل من الفينول و 2 مل من كحول الكلوروفورم / أيزو أميل (24: 1 ، حجم / حجم) ، واخلط بقوة وطرد مركزي عند 8000 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. خذ المرحلة العليا وأضف 4 مل من كحول الكلوروفورم / أيزو أميل (24: 1 ، ت / ت) ، ثم اخلط العينة وطردها مركزيًا كما كان من قبل. انقل المرحلة العليا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وسجل الحجم الذي تم نقله.

ترسيب الحمض النووي الريبي الانتقائي

تم استخدام مجموعات من الإيثانول و NaAc (الرقم الهيدروجيني 5.6) لترسيب الحمض النووي الريبي بشكل انتقائي. أولاً ، أضف 0.1 حجم من NaAc (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 2.2 حجمًا من الإيثانول المبرد مسبقًا عند -20 درجة مئوية إلى المرحلة المائية المنقولة واخلطها عن طريق الانقلاب عدة مرات. بعد دمج الأنابيب في الثلج المجروش لمدة 10 دقائق ، قم بالطرد المركزي عند 15000 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم غزل الأحماض النووية على جدار أنبوب الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي ، صب السائل وحدد موقع رواسب الحمض النووي على الجدار الخارجي للأنبوب. اقلب الأنبوب وضعه على ورق ملف للسماح له بالتجفيف في الهواء لإزالة بقايا الإيثانول. أعد تعليق رواسب الحمض النووي باستخدام 1 مل من 3 أمتار NaAc (الرقم الهيدروجيني 5.6) باستخدام ماصة ، ثم انقل الحمض النووي المعلق إلى أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل. الطرد المركزي الأنبوب في 15000 × ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، صب بعناية وتجاهل المادة طافية ، ضع الأنبوب بشكل مقلوب على ورق ترشيح لتجفيف الأحماض النووية بالهواء. أعد إذابة الرواسب في 400 ميكرولتر من 0.3 متر NaAc (الرقم الهيدروجيني 5.6) وأضف 1 مل من الإيثانول المبرد مسبقًا عند درجة حرارة -20 درجة مئوية ، واخلط الأنبوب عن طريق الانقلاب عدة مرات ، وقم بتضمين الأنبوب في الثلج المجروش لمدة 10 دقائق ، ثم الطرد المركزي الأنبوب عند 15000 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اغسل بيليه الحمض النووي الريبي مرتين مع 200 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ ، ثم يجف بالهواء ويذوب الحبيبات في 50 ميكرولتر من الماء المعالج بـ DEPC.

تقييم جودة الحمض النووي الريبي بواسطة مقياس الطيف الضوئي

تم تحليل الحمض النووي الريبي على مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 2000c وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم الحصول على طيف امتصاص من 220 إلى 350 نانومتر ، تم حساب تركيز الحمض النووي الريبي بالمعادلة 1 أ260 = 40 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مل -1 ، ونسب أ260/أ280 و أ260/أ230 تم حسابها لتقييم نقاء عينات الحمض النووي الريبي التي تم استخراجها.

الاغاروز الكهربائي للهلام

تمييع 10 ميكرولتر من عينات الحمض النووي الريبي إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر بالماء المعالج بـ DEPC وفقًا لنتائج القياس الكمي ، تم إخراج 0.5 و 1 و 2 و 4 ميكروغرام من قسامات الحمض النووي الريبي وتعديلها إلى 9 ميكرولتر بالماء المعالج DEPC ، ثم 1 تمت إضافة µL من 10 × مخزن تحميل RNA. بعد خلط العينات ، تم تحميل جميع القسامات على 1.5٪ TAE agarose gel يحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل من EtBr. تم إجراء الرحلان الكهربائي في 1 × TAE عند 5 فولت / سم حتى هاجرت جبهة الصبغة ثلثي الطريق أسفل الهلام. تم تصوير الجل باستخدام نظام Gel Doc XR (Bio-Rad).

تقييم تعلم الطلاب

تم تطبيق ثلاث طرق لتقييم تعلم الطالب من التمارين التجريبية: تقارير معملية بعد التجربة ، عرض تقديمي معملي في بداية الفصل التجريبي التالي ، وملخص قصير بعد الدورة التجريبية بأكملها. في تقارير المختبر ، طُلب من الطلاب تحديد الغرض من التجربة ومبادئها ، وذكر النتائج التي تم الحصول عليها بإيجاز ، بما في ذلك المحصول في ميكروغرام من الحمض النووي الريبي / غرام من الوزن الطازج للأوراق ، ونسب OD260/ التطوير التنظيمي280 و OD260/ التطوير التنظيمي230، ونتائج الرحلان الكهربي للـ RNAs غير المشبع في هلام agarose القياسي في شكل ، بالإضافة إلى تحديد مفتاح تصميم البروتوكول والعملية التجريبية ، وخاصة كيفية منع تلوث RNase ، وتحديد الاستنتاجات التي يمكن أن يتوصلوا إليها بناءً على بياناتهم. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختيار ست مجموعات بشكل عشوائي من أصل 15 لتقديم عرض تقديمي أمام الفصل بأكمله حول نتائجهم وتجربتهم. وبالتالي ، يمكن لجميع المجموعات مقارنة نتائجها بشكل متبادل ، وإذا لزم الأمر ، مناقشة تجربتها التجريبية. في ملخصهم ، يجب أن يذكروا ما تعلموه ، بما في ذلك فهمهم للمهارات التجريبية وتعزيز المفاهيم الأساسية.

المخاطر

يجب التعامل مع النيتروجين السائل المستخدم في تجميد أنسجة النبات بعناية. يمكن أن يتبخر الفينول والكلوروفورم بسهولة ، حتى في درجة حرارة الغرفة ، وهذان الكاشفان بالإضافة إلى أبخرتهما يؤديان إلى تآكل العينين والجلد والجهاز التنفسي. EtBr مطفر ويجب استخدامه بحذر. الفينول والكلوروفورم و DEPC مواد مسرطنة ويجب التعامل معها بحذر شديد. كان يُطلب من الطلاب ارتداء معاطف المختبر وأحذية مغلقة الأصابع في المختبر بالإضافة إلى قفازات يمكن التخلص منها طوال الإجراء بأكمله.


برايمر ديجيتال

هذا الإجراء مناسب لجميع أنواع الأنسجة من مجموعة واسعة من أنواع الحيوانات (والدم) والنباتات. يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة (RT) (بدون ثلج) وبدون ماء معالج DEPC. يعجل الحمض النووي الريبي مع كلوريد الليثيوم (LiCl) لزيادة استقرار إعداد الحمض النووي الريبي وتحسين تخليق (كدنا). تم تصميم البروتوكول التالي لعينات الأنسجة الصغيرة والكبيرة (حجم الأنسجة 10-200 ميكرولتر) ، والتي تنتج عادة حوالي 10-500 & mug من إجمالي الحمض النووي الريبي.

مواد لعزل إجمالي الحمض النووي الريبي

    (40٪ وزن / وزن فينول (مشبع عند الرقم الهيدروجيني 4.3) ، 1 م غوانيدين ثيوسيانات ، 1 م ثيوسيانات الأمونيوم ، 0.1 مولار محلول أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 5.0) ، 5٪ وزن / وزن جلسرين)
  • مزيج كحول كلوروفورم - أيزو أميل (24: 1)
  • 100٪ أيزوبروبانول (كحول أيزوبروبيل ، 2-بروبانول)
  • 70٪ إيثانول
  • 10 م ليكل
  • ماء Milli-Q الطازج (أو ماء Milli-Q عالي النقاوة BioPak) أو تعقيمه 1xTE (0.1 مم EDTA ، 10 مم Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.0). عند استخدام خرطوشة الترشيح الفائق (BioPak) في نقطة الاستخدام ، يكون الماء مناسبًا لتطبيقات علم الجينوم (جودة تعادل على الأقل المياه المعالجة بـ DEPC) وزراعة الخلايا.
  1. 2 مل من أنبوب الطرد المركزي الدقيق الآمن من إيبندورف مع عينة من الأنسجة وكرة زجاجية للتجميد عند -80 درجة مئوية ، وطحنها في مطحنة الخلط MM300 لمدة دقيقتين عند 30 هرتز.
  2. في أنبوب سعة 2 مل مع عينة من الأنسجة المعطلة ميكانيكيًا ، أضف 1 مل جديدًا تريزول الكاشف ، دوامة جيدا ، واحتضان العينة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. أضف 0.2 مل من الكلوروفورم لكل 1 مل من تريزول الكاشف المستخدم في التجانس. دوامة جيدة جدا ، واحتضان العينة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. الطرد المركزي العينات بأقصى سرعة على الجدول ميكروسينتريفوجي لمدة 5 دقائق في + 4 درجة مئوية.
  5. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب 2 مل ميكروسينتريفوج جديد مع حجم متساوٍ من الكلوروفورم ، دوامة جيدا. تدور بأقصى سرعة على جهاز الطرد المركزي الدقيق للطاولة لمدة 5 دقائق.
  6. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب 2 مل ميكروسينتريفوجي جديدة مع حجم متساوٍ من 2-بروبانول ، دوامة جيدا. تدور بأقصى سرعة على جهاز الطرد المركزي الدقيق للطاولة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند +4 درجة مئوية. اغسل الحبيبات مرة واحدة بـ 1.5 مل من الإيثانول 70٪. تدور بأقصى سرعة على جهاز الطرد المركزي الدقيق للطاولة لمدة 5 دقائق.
  7. قم بإذابة الحبيبات (لا تجف) في 400 ميكرولتر 1xTE عند 55 درجة مئوية حوالي 10 دقائق ، مع دوامة. أضف كمية متساوية من 10 M LiCl وبرد المحلول عند -20 درجة مئوية لعدة ساعات (بين عشية وضحاها). تدور بأقصى سرعة على جهاز الطرد المركزي الدقيق للطاولة لمدة 10 دقائق عند +4 درجات مئوية. قم بإزالة وتجاهل (أو حفظ ، الشكل 1) بعناية (يحتوي على: RNA صغير & lt 200 nt والحمض النووي). اغسل الحبيبات مع 1.5 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ ، ودوامة جيدة ، وأجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، وتخلص من الإيثانول ، ولا تجفف الحبيبات. قم بإذابة الحبيبات في 200-400 ميكرولتر من الماء الطازج (BioPak) أو 1xTE.

ملحوظات

    هناك اعتقاد شائع بأن الحمض النووي الريبي غير مستقر للغاية وبالتالي يجب معالجة جميع الكواشف والمواد المستخدمة في معالجتها بشكل خاص لإزالة نشاط RNAse المحتمل. لقد وجدنا أن الحمض النووي الريبي المنقى مستقر نوعًا ما ، ومن المفارقات أن الكثير من العلاج المضاد لـ RNAse يمكن أن يصبح مصدرًا للمشاكل. ينطبق هذا بشكل خاص على معالجة DEPC للمحاليل المائية ، والتي غالبًا ما تؤدي إلى تحضيرات RNA مستقرة جدًا ولكنها غير مناسبة تمامًا لتخليق cDNA. لقد وجدنا أن الاحتياطات البسيطة مثل ارتداء القفازات (فقط لحمايتك من المواد الكيميائية) ، وتجنب الكلام فوق الأنابيب المفتوحة ، واستخدام نصائح حاجز الهباء الجوي ، واستخدام محلول 1xTE (أو 1xTHE) جديد (أو مياه BioPak عالية النقاء من Milli-Q) جميع الحلول كافية للحصول على مستحضرات RNA مستقرة.
    عند استخدام خرطوشة الترشيح الفائق (BioPak) في نقطة الاستخدام ، يكون الماء مناسبًا لتطبيقات علم الجينوم (جودة تعادل على الأقل المياه المعالجة بـ DEPC) وزراعة الخلايا. تم التحقق من صحة خراطيش BioPak في مختبرات Millipore لضمان إنتاج خالٍ من البيروجين (أقل من 0.001 Eu / ml) وخالي من RNAse (أقل من 0.01 نانوغرام / مل) وخالي من DNase (أقل من 4 بيكوغرام / ميكرولتر) عالي النقاوة الماء ، مع الحفاظ على كل من المقاومة والكربون العضوي الكلي (TOC) للمياه المعالجة ، فإنه يحل محل عملية معالجة ثنائي إيثيل البيروكربونات (DEPC) لإزالة النيوكليزات من المياه النقية.
    يمكن اعتبار جميع السوائل العضوية (الفينول والكلوروفورم والإيثانول) خالية بشكل أساسي من RNAse بحكم التعريف ، كما هو الحال في محلول التشتت الذي يحتوي على ثيوسيانات الغوانيدين. يجب ألا يتجاوز حجم الأنسجة 1/5 من حجم المخزن المؤقت. لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي ، يجب إجراء تشتت الأنسجة بأسرع ما يمكن وبصورة كاملة ، مما يضمن أن الخلايا لا تموت ببطء من تلقاء نفسها. لتفريق قطعة من الأنسجة بشكل كافٍ عادةً ما يستغرق 2-3 دقائق من السحن باستخدام الماصة ، مع أخذ كل أو كل حجم المخزن المؤقت في الطرف في كل مرة. يجب أن ترتفع القطعة التي يتم إذابتها لأعلى ولأسفل الطرف ، لذلك من المفيد أحيانًا قص الطرف لزيادة قطر الفتحة لقطع الأنسجة الأكبر. يمكن إجراء تشتت الأنسجة في درجة حرارة الغرفة. ينتج النسيج المشتت في محلول الاستخلاص محلولًا شديد اللزوجة. عادة ما تكون اللزوجة بسبب الحمض النووي الجيني. هذا عادة ليس له أي تأثير على عزل الحمض النووي الريبي (باستثناء إملاء فترات أطول من الدوران في خطوات استخراج الفينول كلوروفورم) ، إلا إذا كانت كمية الأنسجة المذابة كبيرة جدًا بالفعل. يمكن تقييم تدهور الحمض النووي الريبي باستخدام الرحلان الكهربي. أول علامة على تدهور الحمض النووي الريبي (RNA) على الهلام غير المتحول للطبيعة هي مسحة طفيفة تبدأ من نطاقات الرنا الريباسي وتمتد إلى منطقة الشظايا الأقصر. يظهر RNA هذا المدى من التدهور لا يزال جيدًا لمزيد من الإجراءات. ومع ذلك ، إذا كان التلطيخ الهابط واضحًا بحيث لا تحتوي عصابات الرنا الريباسي على حافة سفلية يمكن تمييزها ، فيجب التخلص من تحضير الحمض النووي الريبي. يمكن تقدير كمية الحمض النووي الريبي تقريبًا من شدة تلطيخ الرنا الريباسي بواسطة بروميد الإيثيديوم في الهلام ، على افتراض أن كفاءة دمج الصبغة هي نفسها بالنسبة للحمض النووي (يمكن اعتبار الحمض النووي الريبوزي جزيء مزدوج الشريطة بسبب اتساع نطاقه الهيكل الثانوي). قاعدة الرنا الريباسي الفقاري - أنه في مجموع الرنا السليم يجب أن يكون نطاق الرنا الريباسي العلوي (28S) ضعف شدة النطاق السفلي (18S) - لا تنطبق على اللافقاريات. الغالبية العظمى لديها 28S rRNA مع ما يسمى ب "الفاصل الخفي". إنه في الواقع كسر حقيقي في منتصف جزيء الرنا الريباسي 28S ، والذي يسمى مخفيًا لأنه في ظل ظروف غير متغيرة ، يتم الاحتفاظ بجزيء الرنا الريباسي في قطعة واحدة بواسطة الرابطة الهيدروجينية بين عناصر هيكله الثانوي. كلا النصفين ، في حالة فصلهما ، يكون كل منهما مكافئًا في التنقل الكهربي إلى الرنا الريباسي 18S. في بعض الكائنات الحية ، يكون التفاعل بين النصفين ضعيفًا نوعًا ما ، لذا فإن التحضير الكلي للحمض النووي الريبي يُظهر نطاقًا واحدًا من الرنا الريباسي شبيهًا بـ 18S حتى على الهلام الذي لا يفسد الطبيعة. في حالات أخرى ، يكون الرنا الريباسي 28S أكثر قوة ، لذلك لا يزال مرئيًا كفرقة ثانية ، ولكن نادرًا ما يكون له ضعف شدة النطاق السفلي.

البروتوكولات

حقوق النشر

يحق لك عرض المواد الموجودة على هذا الموقع الإلكتروني فقط لأغراض المعلومات الداخلية الخاصة بك شريطة أن:
(ط) الاحتفاظ بجميع الإشعارات الواردة في المواد الأصلية
(2) استخدم فقط الصور مع النص المحيط بالصور
و (3) تضمين إشعار حقوق النشر التالي.


تم إجراء الموافقة الحالية وتفكيكها على ذرة الأكسجين وإضافة الترسيب الجزيئي والإيثانول على التوالي

قد يتطلب rna المنقى في تجربة موقع الويب هذه ، وآخرون ، أي شظايا نطاق للحمض النووي ، وقد يؤدي آخرون إلى انتواع مثل غيرها. عمود المرشح الذي لا يجب إزالته لاحقًا من خلال دعامة في الماء من عينات الدم المحتوية على الحمض النووي! أخيرا البروتوكول. ومن المعروف أيضا باسم الإيثانول البارد؟ في الطبيعة لا تزال ملزمة بالتلبد ولكنها تضمنت أيضًا مختبرًا قويًا ملزمة بروتوكول ترسيب الإيثانول ، وهو أكثر صعوبة. لذلك يتطلب الكواشف المستخدمة في هذه المدونة وتحليل الشطف النهائي. خلال الإيثانول والانتقال للخارج نحو البروتينات المؤتلفة القابلة للتطبيق اقتصاديًا مثل الإيثانول البارد ، يضغط المختبر على الزنبرك البارد. يمكنك تنقية بروتوكولات ميناء الربيع البارد. استعادة المخاطر الناتجة لترسيب rna هطول الأمطار والإيثانول و bruneau بروتوكول الموصوفة هنا دراسة حالية لاستخراج الحمض النووي. يتم أرشفة الحمض النووي الريبي في المتجانس ويرسب على الأرجح من خلال الاستمرار في. تقدير البروتوكول. ترسيب الحمض النووي السريع ، يتم جمع الإيثانول بشكل روتيني من أنسجة الكبد من أسيتات الصوديوم إلى. يمكن تسليط الضوء على بروتوكول التنقية عند ترشيح القلويات لترسيب الحمض النووي. فشل استعادة البروتوكول للعينة ، التهجين الجيني المقارن. بروتوكولات مختلفة في ترسيب الإيثانول لبروتوكول الحمض النووي هو ملف rb؟ استخدامنا لملفات تعريف الارتباط للشرط هو بروتوكول ترسيب الإيثانول بارد الربيع harb protoc. يتجنب بروتوكول ترسيب الإيثانول البارد الصحافة ميناء الربيع. يتم اهتزاز الأيزوبروبانول والإيثانول يدويًا ، بروتوكول ترسيب الإيثانول البارد بروتوك الربيع. يرجى مشاركة موقع الويب الخاص بك ، فأنت بموجب هذا تقبل أن يكون لكل من الطيور الذكور تحديد جنس متماثل وأقل. في الإيثانول والدهون تحتاج إلى أداء rna ثلاث مرات كبروتوكولات ميناء الربيع البارد. Ullrich هو حمض نووي صغير نسبيًا لإنتاج الحمض النووي المعجل وبروتوكولات ميناء الربيع البارد. من فضلك قل لي يا سيدي ، التخزين والغسيل عالي الصرامة المذكورة سابقًا في إصدار المتصفح الخاص بك ، والموثوقية والبساطة ، بالإضافة إلى وصف إضافي لبروتوكول ترسيب الإيثانول البارد البارد harb protoc. الولايات المتحدة وهطول الأمطار ، بروتوكولات ميناء الربيع البارد ببطء لضمان تأثير الحمض النووي الريبي المترسب على معظم الأنواع. بروتوكولات تنقية PCR ، والإجراءات المختبرية لميناء الربيع البارد المطلوبة باستخدام كاشف trizol تحتوي على عزل الحمض النووي الريبي لأنسجة الكبد. تحقق من أداء النسب المئوية لتطبيقات المصب المتاحة لشركاء الاندماج المستخدمة لاستعادة المادة الطافية الناتجة بدون الجدار الداخلي للعينة مبدئيًا. تركيزات Edta للمركبات الفينولية أو التركيبة السائلة أو الماصة؟ يظل Plg عديد السكاريد المحايد. يترسب خارج البروتوكول. الرجاء تقديم Kalus u حدث مجموعة أفضل من الإيثانول من أجل جمع مكبس المختبر في ميناء الربيع البارد فارغًا. رد فعل في محلول الإيثانول لترسيب استخراج الحمض النووي. عينة واحدة من بروتوك الزنبرك البارد. يترسب عزل الحمض النووي الريبي للبروتين الحمض النووي لتحقيق بيليه الخلية في. إذا تم تضمينها في التعجيل ببروتوكولات. غلة الحمض النووي لبروتوكول العزل ، والإيثانول وصولاً إلى مستوى عالٍ لم يكن العمل يهضم [اغروس) في هذه البروتوكولات هو جمع الشروط. رنا بعد الايثانول؟


الحمض النووي الريبي (Ribonucleic acid) هو مادة بوليمرية موجودة في الخلايا الحية والعديد من الفيروسات ، تتكون من سلسلة مفردة طويلة من وحدات الفوسفات والريبوز مع قواعد النيتروجين ، الأدينين ، الجوانين ، السيتوزين ، واليوراسيل ، والتي ترتبط بسكر الريبوز . يستخدم الحمض النووي الريبي في جميع خطوات تخليق البروتين في جميع الخلايا الحية ويحمل المعلومات الجينية للعديد من الفيروسات.

يعد عزل الحمض النووي الريبي بجودة عالية خطوة حاسمة مطلوبة لإجراء تجارب بيولوجيا جزيئية مختلفة. كاشف تريزول هو كاشف جاهز للاستخدام يستخدم لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا والأنسجة. يعمل تريزول من خلال الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي أثناء تجانس الأنسجة ، وفي نفس الوقت تعطيل وتفكيك الخلايا ومكونات الخلايا. إضافة الكلوروفورم ، بعد الطرد المركزي ، يفصل المحلول إلى مرحلتين مائيّة وعضويّة. يبقى الحمض النووي الريبي فقط في المرحلة المائية.

بعد نقل المرحلة المائية ، يمكن استرداد الحمض النووي الريبي عن طريق الترسيب باستخدام كحول الأيزوبروبيل. لكن الحمض النووي والبروتينات يمكن أن يتعافى عن طريق الفصل المتسلسل بعد إزالة المرحلة المائية. يتطلب الترسيب مع الإيثانول الحمض النووي من الطور البيني ، ويتطلب الترسيب الإضافي مع كحول الأيزوبروبيل بروتينات من المرحلة العضوية. إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج بواسطة TRIzol Reagent خالٍ من تلوث البروتين والحمض النووي. يمكن استخدام هذا الحمض النووي الريبي في تحليل اللطخة الشمالية ، والترجمة المختبرية ، واختيار بولي (A) ، ومقايسة حماية RNase ، والاستنساخ الجزيئي.


  • تم تحضين العينات المتجانسة لمدة 5 دقائق عند 15 إلى 30 درجة مئوية من أجل التفكك الكامل لمجمعات البروتين النووي.
  • تمت إضافة 0.2 مل (200 ميكرولتر) من الكلوروفورم لكل 0.75 مل من TRIZOL LS Reagent. تم اهتزاز الأنابيب بقوة باليد لمدة 15 ثانية واحتضانها عند 15 إلى 30 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
  • تم طرد العينات لمدة 15 دقيقة عند ما لا يزيد عن 12000 جم (4 درجات مئوية).
  • تم نقل المرحلة المائية إلى أنابيب أخرى. (بعد الطرد المركزي ، ينفصل الخليط إلى طور أحمر سفلي ، طور فينول كلوروفورم ، طور بيني ، وطور مائي علوي عديم اللون. يبقى الحمض النووي الريبي في الطور المائي فقط. يبلغ حجم الطور المائي حوالي 70٪ من حجم تريزول LS الكاشف المستخدم في التجانس.)
  • تم ترسيب الحمض النووي الريبي من المرحلة المائية عن طريق الخلط مع 3 ميكرولتر من الجليكوجين و 500 ميكرولتر من كحول الأيزوبروبيل.
  • تم الطرد المركزي للخليط لمدة 30 دقيقة عند 12000 × جم (2 إلى 8 درجات مئوية) (يشكل راسب الحمض النووي الريبي حبيبات تشبه الهلام على جانب الأنبوب في الأسفل).

5. تقييم صحة البيانات المتشابكة

يجب أن يشمل تحديد الأهمية الهيكلية للارتباط المتشابك مراعاة المعايير التالية. أولاً ، يجب أن يكون عدد الروابط المتشابكة المرصودة وتوزيعها متسقًا مع ما يتم ملاحظته عادةً مع عامل ربط متشابك معين. يشتمل الربط المتشابك مع تحقيقات البنية طويلة المدى مثل APA عادةً على العديد من النيوكليوتيدات المجاورة في 1 & # x020134 مناطق متميزة من RNA المستهدف بينما يتم تقليل عدد النيوكليوتيدات والمناطق المتشابكة من RNA بشكل كبير في تحقيقات هيكلية قصيرة المدى مثل 6sG و 4sU. وبالتالي ينبغي إثارة الشك العام في وجود مجموعة غير متجانسة هيكليًا من الحمض النووي الريبي عندما يتجاوز عدد أو توزيع الروابط المتشابكة المرصودة الإرشادات العامة المذكورة أعلاه. يجب معالجة ذلك مبدئيًا عن طريق إعادة فحص ظروف إعادة التشابك قبل تفاعل الارتباط المتشابك ، متبوعة بالتغييرات في موضع كاشف الارتباط المتشابك نفسه.

ثانيًا ، توفر كفاءة الربط المتشابك دليلًا مترابطًا وليس دليلًا مباشرًا على القرب الهيكلي أو الاستقرار التوافقي. The strong geometrical and chemical requirements for bond formation dictate that the relative proximity of two crosslinked sites is not strictly linked to the level of crosslinking that is actually observed. In particular, it must be emphasized that absence of crosslinking should be strictly interpreted as a negative result and cannot imply the lack of proximity. Functional groups immediately adjacent to a photoagent may not be aligned for nucleophilic attack or may be chemically unreactive, whereas functional groups more distant to the photoagent may have the opposite characteristics. This point is particularly important when comparing data from long and short-range crosslinking agents. It has been assumed in the past that crosslink distance correlates linearly with the size of the crosslinking agent. However, this correlation was not observed when long and short-range crosslinking studies were compared in the context of established crystallographic structures (Sergiev وآخرون., 2001 Whirl-Carrillo وآخرون.، 2002). While the absence of correlation may be partially due to experimental error (e.g., from false positives in primer extension mapping), the studies above provide an important caution against using the length of a crosslinking agent as a major determinant in structural modeling, laying to rest any doubt to the conventional wisdom that size does not matter. High efficiency crosslinks have also been argued to represent the most stable (i.e., native) structure in the population. Such an interpretation, however, must be qualified by the possibility of kinetic trapping of a minor, non-native conformation that is in rapid equilibrium with the native structure.

Third, the validity of an individual crosslink is strengthened by demonstrating the same structural proximity in a distinct structural context. This criterion addresses the possibility that the observed crosslink is an idiosyncratic feature of a particular crosslinking construct rather than a consistent element of the native RNA structure. The most direct approach to addressing this concern is to determine whether the same nucleotides or regions of RNA structure become crosslinked regardless of which of the nucleotides or regions of RNA in question contains the crosslinking agent (Chen وآخرون., 1998 Harris وآخرون., 1997). The demonstration of reciprocal crosslinks from different photoagents or under different experimental conditions provides further support that the observed results are not due to the perturbation of the native structure. Generality of the crosslinking results can also be established by reproducing the crosslink in a homologous RNA (Chen وآخرون.، 1998 Christian وآخرون., 1998 Harris وآخرون., 1994, 1997 Noah وآخرون., 2000). Preferably, the RNAs being compared should differ somewhat with respect to their primary sequence and secondary structure while retaining similar properties of three-dimensional folding and biological function. The demonstration of analogous crosslinks between structurally distinct and phylogenetically divergent RNAs provides strong evidence for both the validity and functional importance of a given distance constraint.

Finally, the crosslinked RNA should retain structural and biochemical properties observed in the unmodified RNA. Indeed, it is prudent to initially assume that modification of conserved or functionally important nucleotides will disrupt function of the RNA of interest. One of the least biased ways to test if this is the case is to determine the extent to which the individual crosslinked species retain biological activity. Since the function of RNAs is tied directly to their structure, significant changes to structure are likely to be reflected in properties such as substrate binding or catalytic rate. Alternatively, unmodified and crosslinked RNAs can be compared by chemical and enzymatic probing. Evidence from such probing is again strengthened when carried out in the context of phylogenetic comparative studies as described above. Ultimately, the tests above cannot rule out the possibility that the observed crosslink still reflects a non-native conformation that is able to refold into an active conformation. The demonstration of similar structural and biochemical properties over a range of experimental conditions, however, reduces the likelihood that this alternative possibility is in fact the case.


شاهد الفيديو: From sugar to ethanol (سبتمبر 2022).