معلومة

CRISPR دليل تصميم RNA والتوليف التمهيدي

CRISPR دليل تصميم RNA والتوليف التمهيدي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أحاول إخراج جين هنتنغتين من خلايا هيلا (الخلايا الظهارية البشرية). لقد استخدمت CRISPR explorer و benchling.com لتحديد أفضل تسلسل دليل للحمض النووي الريبي الذي من شأنه أن يرتبط بتسلسل الحمض النووي المستهدف ويمكن لـ cas9 بعد ذلك إجراء القطع. جرنا لدي هو كما يلي:

جاجكككتكجككجاكتكج ستراند (-)

الخطوة التالية بالنسبة لي هي تصميم البرايمر بالنهايات اللاصقة التالية

التمهيدي الأمامي: 5'-TTGTTGN (19) -3 'التمهيدي الخلفي: 3'-ACN (19) AAA-5'

المشكلة التي أواجهها هي كتابة تسلسل قليل النوكليوتيد للبادئات. نظرًا لأن حبلا جرنا سلبي ، أفترض أنه تسلسل 3'-5 '، وبالتالي سيكون عكسه هو التسلسل 5'-3' ، والذي يمكنني استخدامه بعد ذلك فقط كتمهيدي للأمام. بالتتابع ، يمكنني أخذ عكس ومكمل هذا التسلسل التمهيدي الأمامي لتحديد التمهيدي الخلفي. هل هذا صحيح؟ مشكور على مساعدتك.

شكرا لك عبد الله تشودري


أرجع الفحص السريع مع BLAST النتيجة التالية:

Homo sapiens Huntingtin (HTT) ، معرّف تسلسل mRNA: NM_002111.7 الطول: 13669 عدد المطابقات: 1 معلومات ذات صلة تفاصيل الجينات المرتبطة بالجينات ملفات تعريف GEO - بيانات تعبير ميكروأري PubChem BioAssay - نطاق فحص النشاط الحيوي 1: 267 إلى 286GenBankGraphics المطابقة التالية للمطابقة الرقم 1 النتيجة توقع فجوات الهويات العنصر 40.1 بت (20) 0.017 20/20 (100٪) 0/20 (0٪) زائد / ناقص الاستعلام 1 GGAGGCCTCGGCCGACTCG 20 |||||||||||||| |||| سبجكت 286 جاجككتكججككجاكتكج 267

التسلسل الذي لديك هو 5'-3 'وهو يتطابق مع سلسلة ناقص على الجينوم البشري. لا تحتاج إلى عكس التسلسل!


كيفية تصميم تسلسل sgRNA

يتطلب استهداف الجينات CRISPR / Cas9 توجيهًا فرديًا مخصصًا من الحمض النووي الريبي (sgRNA) يحتوي على تسلسل استهداف (تسلسل crRNA) وتسلسل تجنيد نوكلياز Cas9 (tracrRNA). منطقة crRNA (الموضحة باللون الأحمر أدناه) عبارة عن تسلسل مكون من 20 نيوكليوتيد وهو متماثل مع منطقة في جين اهتمامك وسيوجه نشاط نوكلياز Cas9.

شاهد الفيديو لتتعلم اكثر.

استخدم الإرشادات التالية لتحديد منطقة DNA الجينومية التي تتوافق مع تسلسل crRNA لـ sgRNA:

يجب أن يكون للنهاية الثالثة لتسلسل الحمض النووي الهدف تسلسل عزر مجاور (PAM) لفاصل أولي (5'-NGG-3 '). سيكون 20 نيوكليوتيد في بداية تسلسل PAM هو تسلسل الاستهداف الخاص بك (crRNA) ، وسيقوم نوكلياز Cas9 بشق ما يقرب من ثلاث قواعد في الجزء العلوي من PAM.

  1. تسلسل PAM نفسه مطلوب تمامًا للانقسام ، لكنه ليس جزءًا من تسلسل sgRNA وبالتالي لا ينبغي تضمينه في sgRNA.
  2. يمكن أن يكون التسلسل المستهدف على خيط DNA.

هناك العديد من الأدوات عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، CRISPR Design أو CHOPCHOP) التي تكتشف تسلسل PAM وتدرج تسلسلات crRNA المحتملة داخل منطقة DNA معينة. تتنبأ هذه الخوارزميات أيضًا بالتأثيرات غير المستهدفة في أماكن أخرى من الجينوم ، مما يسمح لك باختيار crRNA الأكثر تحديدًا لتطبيق البحث الخاص بك. يرجى زيارة صفحتنا حول أدوات تصميم sgRNA لمعرفة المزيد.


العديد من الأدوات على شبكة الإنترنت المتاحة

تتطلب أدوات تصميم sgRNA المستندة إلى الويب عادةً أن يقوم المستخدمون بإدخال تسلسل الحمض النووي أو الموقع الجيني أو اسم الجين لكل جين مهم ، والإشارة إلى نوع. تقوم خوارزمية خاصة بكل أداة بإخراج قائمة من تسلسل الدليل المرشح مع مواقع غير مستهدفة متوقعة مقابلة لكل مدخل (Wu et al. 2014). تهدف معظم الأدوات إلى توفير تسلسلات إرشادية تقلل من احتمالية حدوث تأثيرات بعيدة عن الهدف ، لكن الأساليب التي تستخدمها تختلف. على سبيل المثال ، يستخدم Chop Chop بيانات تجريبية من منشورات حديثة متعددة (مثل Doench et al. 2016) لحساب درجات الكفاءة. بدلاً من ذلك ، يدمج CasFinder (Aach et al. 2014) و E-CRISP (Heigwer et al. 2014) عقوبات محددة يحددها المستخدم بناءً على عدد حالات عدم التطابق وموضعها بالنسبة إلى تسلسل الدليل من أجل ترتيب احتمالية الخروج عن الهدف. تأثيرات.


نتائج

تصميم وتحسين SBH-sgRNAs

ال Spيتكون Cas9 sgRNA من تسلسل فاصل مكون من 20 نيوكليوتيدات (nt) مكمل للحمض النووي المستهدف ، متبوعًا بسقالة crRNA المنشطة عبر ∼ 80 nt (tracrRNA) 9،10. يحدث الارتباط بأهداف محددة من الحمض النووي عندما يواجه مجمع sgRNA-Cas9 تسلسلًا مطابقًا للفاصل في الجزء العلوي من نموذج مجاور لـ NGG protospacer 11. نظرًا لأن هذه العملية تعتمد على الاقتران بقاعدة Watson-Crick ، ​​فقد استنتجنا أن إلحاق امتداد "طي خلفي" مكمل للفاصل عند نهاية 5 ′ من sgRNA من شأنه أن يولد `` دبوس شعر يمنع المباعد '' ، وبالتالي إسكات نشاط CRISPR-TR بشكل فعال (الشكل 1 ب). لتقييم إمكانات الأنظمة القائمة على SBH للتحكم في نشاط CRISPR-TR ، اعتمدنا أولاً اختبار مراسل تم تطويره مؤخرًا ، والذي يعرض تنشيطًا قويًا للجينات المحورة باستخدام sgRNA واحد 12 (الشكل التكميلي 1). يعتمد هذا النظام على استهداف بروتين اندماج مستجيب dCas9 (dCas9-VP64) إلى منطقة "شبيهة بالمُحسِّن" تحتوي على موقع مستهدف 8 × CRISPR (CTS) يكرر وضعه في مقدمة جين مراسل الفلورسنت (الشكل التكميلي 1). كشفت التجارب التي قارنت sgRNAs الأصلية (nv-CTS) مع SBH-sgRNAs المقابلة التي تحتوي على امتدادات الطية الخلفية التي تغطي مقطع الفاصل بأكمله (0 نيوكليوتيدات مباعدة حرة ، SBH (0) CTS ، الشكل 1 ج) أن SBHs تلغي نشاط CRISPR-TR تمامًا بغض النظر عن من تسلسل فاصل الدليل (CTS1 أو CTS2) (الشكل 1 د). للتحقق من صحة اقتران قاعدة الطيات الخلفية / الفاصل كسبب للإسكات ، قمنا بتصميم بنيات تحكم تلخص طول و / أو هيكل امتداد SBH دون الاقتران بالنيوكليوتيدات الفاصلة. جميع عناصر التحكم SBH-sgRNAs (إزاحة 10 bp دبوس الشعر ، SBH (ctrl-1) CTS offset 20 bp hairpin ، SBH (ctrl-2) CTS التمديد الطي الخلفي ، SBH (ctrl-3) CTS) عرضت تنشيط المراسل لكلا CTS1 والفواصل CTS2 (الشكل 1 د والشكل التكميلي 2 أ ، ب).

يوفر القمع القوي بوساطة SBH وبنيته المعيارية إطارًا مثاليًا لتطوير الأنظمة المحفزة (iSBH) عن طريق استبدال حلقة التوصيل بوحدات شق المشغل الحساس القابلة للتبديل (الشكل 1 ب). لتفضيل انقسام ما بعد إزالة الطيات الخلفية ديناميكيًا مع الحفاظ على الإسكات الكامل في حالة إيقاف التشغيل ، قمنا بتصميم واختبار هياكل SBH المنتفخة (الشكل التكميلي 3 أ). أدى إدخال انتفاخين 2 nt في الساق (SBH (0B) CTS1 ، حيث 0 = تغطية المباعدة الكاملة و B = ساق الانتفاخ) إلى الحفاظ على تثبيط CRISPR-TR الكامل مع زيادة الطاقة الهيكلية الحرة المتوقعة من .38.4 إلى .23.7 ​​كيلو كالوري مول - 1 (الشكل التكميلي 3 ب ، ج). على النقيض من ذلك ، أدى وجود انتفاخ قاعدي إضافي (SBH (0B *) CTS1 G = −15.0 كيلو كالوري مول 1) إلى زعزعة استقرار الجذع مما أدى إلى فقدان الإسكات بوساطة SBH (الشكل التكميلي 3 ب ، ج). لذلك ، تم استخدام تصميم SBH (0B) CTS كمصدر افتراضي لتطبيقات iSBH اللاحقة.

التنشيط بوساطة البروتين لـ iSBH-sgRNAs

لإثبات تنشيط CRISPR-TR المشروط ، قمنا أولاً بتكييف منصة SBH لربط الناتج النسخي للجينات المستهدفة بالمحفزات القائمة على البروتين. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتصميم iSBH يستجيب لـ الزائفة الزنجارية نوكلياز Csy4 الداخلي 13 عن طريق تطعيم عزر الحمض النووي الريبي المشابه له على SBH (0B) CTS (iSBH (0B) Csy4 (ممتلئ) CTS1) (الشكل 2 أ ، ب). كما هو متوقع ، تم إسكات CRISPR-TR تمامًا في الحالة OFF (شرك البلازميد الفارغ) ، بينما كشف تحليل تعبير مراسل ON-state عن تنشيط CRISPR-TR قوي بوساطة Csy4 (الشكل 2 ج). تأكيدًا لخصوصية هذا التأثير ، تغيير زوج أساسي واحد في تسلسل التعرف على Csy4 (iSBH (0B) Csy4م (كامل) CTS1) ، الذي تم الإبلاغ عنه مسبقًا لمنع الانقسام 13 ، جعل نظام iSBH غير حساس للتحريض (الشكل 2 ب ، ج).

(أ) الإطار المفاهيمي الكامن وراء إطلاق المباعد الشرطي باستخدام محرضات مشفرة وراثيًا (إندوريبونوكلياز). يسمح تطعيم عزر Csy4 RNA على جذع SBH بالانتقال من وضع التشغيل إلى حالة التشغيل في وجود نوكلياز داخلي Csy4 المرتبط بـ CRISPR. (ب) التسلسل والهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي لـ Csy4 (كامل) CTS1 المستجيب لـ Csy4 ومتغير متحولة التحكم iSBH (0B) Csy4م (كامل) CTS1 (تغيير زوج القاعدة (أصفر) يجعل تسلسل التعرف غير حساس لانقسام Csy4). يشير السهم الأحمر إلى موقع انشقاق Csy4. (ج) مخططات مبعثر التدفق الخلوي التمثيلي (مضان مراسل EYFP ضد تعداء iBlue sgRNA) تكشف عن إسكات كامل في غياب محفز (شرك = بلازميد فارغ). يتم فقد التنشيط القوي للمراسل الذي لوحظ في وجود Csy4 عند تحور Csy4-iSBH. (دF) تحسين تصميمات Csy4-iSBH. الهياكل الثانوية للحمض النووي الريبي (موقع انشقاق السهم الأحمر CTS1 فاصل Csy4) (د) ومخططات مبعثر التدفق الخلوي لمقايسة CRISPR-TR التمثيلية (+ Csy4 ON-state) (ه) لـ iSBH (0B) Csy4 سيقان كاملة ومتوسطة ومتناهية الصغر. القياس الكمي لدرجة تنشيط EYFP (انظر الطرق) باستخدام متغيرات iSBH الثلاثة في وجود بلازميد شرك أو محفز Csy4 من ثلاثة مكررات بيولوجية (ن= 3 ، يعني ± sd. a.u. ، وحدات تعسفية) (F). تُظهر الأشكال الداخلية لمؤامرة قياس التدفق الخلوي٪ من الخلايا المنشطة (مزدوج iBlue + ve و EYFP + ve ، أخضر) وشدة مضان مراسل متوسط ​​لهذه المجموعة (برتقالي).

قمنا بعد ذلك بإجراء تحسين تكراري لتصميم iSBH ، والذي يهدف إلى زيادة خفض الطاقة الخالية من فصل الجذع وتقليل عدد النيوكليوتيدات المتبقية غير المهيكلة 5 ′ غير المرتبطة بـ dCas9 بعد انقسام Csy4. تم تحقيق ذلك عن طريق دمج عزر Csy4 RNA إما مع انتفاخ CTS البعيد أو القريب (الشكل 2 د والشكل التكميلي 4 أ). التصميمات الناتجة ، iSBH (0B) Csy4 (متوسط) CTS1 و iSBH (0B) Csy4 (نانو) CTS1 ، كان لها انخفاض متوقع في استقرار الجذع ، وبالتالي ، عرضت زيادة في كل من عدد المراسل الذي يعبر عن الخلايا ومستويات مضان في وجود Csy4 (على الدولة) (الشكل 2 هـ). تم بعد ذلك دمج هاتين المعلمتين (٪ الخلايا المنشطة وكثافة تألق المراسل) في درجة التنشيط التعسفي لتسهيل المقارنة المباشرة بين تكرارات التصميم (انظر الطرق). كشف هذا التحليل عن زيادة في تغييرات طية ON / OFF من 3.2e2 التي لوحظت لـ iSBH (0B) Csy4 (ممتلئ) CTS1 إلى 5.6e2 و 1.9e3 للتصميمات المتوسطة والنانوية ، على التوالي (الشكل 2f). ولوحظ أيضًا تأثير مماثل بالنسبة لـ CTS2 التي تستهدف sgRNAs (الشكل التكميلي 4 ب ، ج) وكان متسقًا مع الملاحظة التي تشير إلى أن فواصل sgRNA الأقصر (حتى 10 نانومتر) يمكن أن تعزز تنشيط CRISPR-TR القوي (الشكل التكميلي 5 أ-ج). توضح هذه النتائج أن endoribonucleases هي محفزات iSBH-sgRNA فعالة يمكن ترميزها وراثيًا لإنشاء دوائر اصطناعية مبرمجة مسبقًا في الخلايا الحية.

التحكم في CRISPR-TRs من خلال iSBH-sgRNAs المستجيبة لـ ASO

لتوسيع نطاق مجموعة أدوات iSBH ، سعينا بعد ذلك إلى هندسة آليات إطلاق المباعد التي تستجيب لأوليغنوكليوتيدات قصيرة مضادة للاندماج (ASOs) ، وبالتالي توفير وسيلة للتحكم الخارجي الزمني في CRISPR-TR. من الناحية المفاهيمية ، تعتمد هذه الإستراتيجية على قدرة ASOs أحادية السلسلة على ربط حلقات استشعار iSBH التكميلية وإشراك الانقسام النووي بوساطة RNase-H لخيط الحمض النووي الريبي في DNA / RNA المختلط 15 الناتج ، وبالتالي إطلاق الطيات الخلفية بوساطة إسكات CRISPR-TR (الشكل 3 أ). تعد ASOs محفزات جذابة بشكل خاص لأنها ظهرت مؤخرًا كفئة متعددة الاستخدامات للغاية من المركبات التي يمكن توصيلها بأمان وكفاءة في كل من الخلايا والكائنات الحية لتغيير التعبير الجيني والتداخل مع معالجة الحمض النووي الريبي بعد النسخ. بالإضافة إلى ذلك ، استنتجنا أن تنوع التسلسل المتاح لتصميمات ASO سيوفر ذخيرة واسعة من مجموعات المحرض / الهدف الممكنة. لإثبات جدوى هذا النهج ، تم تسليم محرضات ASO على مدار 24 ساعة بعد تعداء مكونات النظام الأساسية (dCas9-VP64 ، sgRNA ، مراسل) ، وتم تقييم تعبير المراسل الناجم عن CRISPR-TR بعد يوم واحد (الشكل 3 أ).

(أ) تنفيذ تصميمات iSBH المستجيبة لـ ASO للتحكم الزمني في نشاط CRISPR-TR. تتيح هذه المنصة التنشيط المتأخر لـ sgRNA عن طريق ASOs التي يتم تسليمها خارجيًا. (ب) مقايسة CRISPR-TR (قياس التدفق الخلوي لتعبير مراسل ECFP) في وجود iSBH (0B) ASOα-CTS2 وفخ ASO مع تسلسل مخلوط (أرجواني ، إقران قاعدة غير متوافق مع حلقة الاستشعار). (ج,د) تأثير طول ASO على تنشيط iSBH (0B) ASOα-CTS2 sgRNA (حالة التشغيل). مخططات مبعثر التدفق الخلوي التمثيلي ومخططات الاقتران ASO / iSBH المقابلة باستخدام 14 و 20 و 25 نيوكليوتيد (nt) محرضات ASO طويلة (أحمر) (ج). التحديد الكمي لدرجة تنشيط مراسل على الحالة للظروف الموضحة في ب,ج (ن= 3 ، يعني ± sd. a.u. ، وحدات تعسفية) (د). (ه,F) تحليل التنشيط على الحالة وتثبيط الحالة خارج الحالة باستخدام التصميم الأمثل لمحفز ASO 20 nt على جينين مستهدفين (CTS1-EYFP و CTS2-ECFP). تمت مقارنة ثلاث حالات تجريبية لكل CTS: شرك ASO و iSBH-sgRNA المطابقان لـ ASO و iSBH-sgRNA ومطابقة ASO و iSBH-sgRNA (حلقة الاستشعار غير المطابقة) (ه). التحديد الكمي لدرجات تنشيط المراسل من ثلاث مكررات بيولوجية لكل حالة. لم يتم اكتشاف أي تنشيط فوق الخلفية في ظروف التحكم (شرك ASO أو مطابقة ASO + iSBH (0B) ASOم-CTS) ، بينما تم التعبير عن تعبير المراسل القوي بوساطة CRISPR-TR من خلال وجود ASOs النشط (F). تُظهر الأشكال الداخلية لمؤامرة قياس التدفق الخلوي٪ من الخلايا المنشطة (مزدوج iBlue + ve و ECFP + ve ، أخضر) وشدة مضان مراسل متوسط ​​لهذه الفئة من السكان (برتقالي).

أظهرت الدراسات السابقة أن كفاءة انشقاق RNase-H بوساطة ASO ترتبط بشكل إيجابي بإمكانية الوصول إلى الموقع المستهدف. بناءً على هذه الاعتبارات ، تم تصميم iSBH-sgRNAs المستجيب لـ ASO للحد من التفاعلات الهيكلية داخل مجال الاستشعار ، وبالتالي تقييد الحلقة في التشكل المفتوح. لإنشاء iSBH-sgRNA مستجيب لـ ASO ، قمنا بتطعيم حلقة استشعار 14 nt ASO على SBH (0B) CTS (الشكل 3 ب ، iSBH (0B) ASOα-CTS2). كما هو متوقع ، احتفظ هذا البناء بإسكات حالة إيقاف التشغيل الكامل في وجود شرك مشوشة ASO (الشكل 3 ب). إظهار تنشيط CRISPR-TR المشروط ، أدى توصيل 14 nt ASO المكمّل لحلقة الاستشعار (ASOα-14) إلى زيادة بمقدار 30 ضعفًا في درجة تنشيط المراسل (الشكل 3 ج ، د). كشف التمديد الإضافي لطول ASO وبصمة التهجين التي تهدف إلى تفضيل فصل الخيوط عن زيادة كبيرة في نشاط CRISPR-TR على الحالة مع 20 nt ASO (تغيير ASOα 113 ضعفًا) ، بينما قدم 25 nt ASO كسبًا أكثر اعتدالًا (ASOα - 25 تغييرًا بمقدار 81 ضعفًا) (الشكل 3 ج ، د). تمشيا مع التأثير الملحوظ عند استخدام ASO شرك ، تجارب التحكم التي تستخدم حلقة استشعار مختلطة (iSBH (0B) ASOم-CTS2) جعل النظام غير حساس للمحفز ، والتحقق من صحة خصوصية تفاعل حلقة استشعار ASO (الشكل 3 هـ ، و). تم الحصول على نتائج مماثلة عند تطبيق نفس الأساس المنطقي للتصميم على iSBH-sgRNA مع فاصل مختلف (CTS1) وتسلسلات حلقة الاستشعار (الشكل 3 هـ ، و). ومن المثير للاهتمام ، على عكس تصميمات Csy4-iSBH ، أن دمج حلقة الاستشعار في الانتفاخ البعيدة SBH (0B) CTS قلل من نشاط CRISPR-TR ، ويفترض أن dCas9 يتداخل مع ASO / تهجين حلقة الاستشعار (الشكل التكميلي 6 أ-ج).

تنفيذ وحدات الجينات المستجيبة للبروتين

يمكن من حيث المبدأ تقليل دوائر الجينات الاصطناعية المعقدة إلى وحدتين أساسيتين لشبكة الجينات: (1) وحدة متفرعة حيث يتحكم حدث علوي واحد في وقت واحد في نشاط العقد النهائية المتعددة (2) وحدة متعامدة تسمح بالتحكم غير المتزامن في أهداف المصب باستخدام محفز مستقل / أزواج الجينات (الشكل 4 أ). بالاستفادة من تنوع وبساطة تصميم iSBH ، سعينا بعد ذلك إلى تأسيس إمكاناته كإطار لتجميع شبكات الجينات. يمكن تقييم تنفيذ التحكم المتفرّع والمتعامد لكل من تصميمات iSBH المستجيبة للبروتين و ASO باستخدام نظام الإبلاغ المزدوج ([8 × CTS1-EYFP] - [8 × CTS2-ECFP]). علاوة على ذلك ، قمنا بتكييف نظام وسيط التنشيط التآزري (SAM) 6 لإثبات قدرة iSBH-sgRNAs على برمجة التنشيط المشروط للجينات الذاتية (الشكل التكميلي 7 أ ، ب).

(أ) تمثيل تخطيطي لوحدات شبكة الجينات المتفرعة والمتعامدة باستخدام iSBH-sgRNAs. تمكن iSBH-sgRNAs المبرمجة مع حلقات استشعار محددة (أرجوانية وبرتقالية) و / أو فواصل (زرقاء وخضراء) من التوليد السريع لأزواج المحرض / الجينات المستهدفة المتوازية والمتعامدة ، مما يسهل التحكم المتزامن أو غير المتزامن في برامج النسخ. (ب) التنشيط المتزامن لاثنين من جينات المراسل باستخدام iSBH-sgRNAs المستجيب للبروتين (وحدة المتفرعة). تم نقل iSBH (0B) Csy4 (نانو) CTS1 و iSBH (0B) Csy4 (نانو) CTS2 المتجاوب مع Csy4 في غياب أو وجود المحرض. لتأكيد التنشيط المحدد بوساطة Csy4 للجينات المستهدفة CTS1 و CTS2 ، تم نقل كل من iSBH-sgRNA المقابل باستخدام عنصر تحكم iSBH-sgRNA يحمل فاصل التدافع (iSBH (0B) Csy4 (نانو) SCR). (ج) الإفراط في التعبير المتزامن لجينين داخليين (HBG1 و IL1B) باستخدام iSBH-sgRNAs المستجيب لـ Csy4 (وحدة متفرعة). يُحدث ترنسفكأيشن iSBH (0B) SAM-Csy4 (نانو) HBG1 ، iSBH (0B) SAM-Csy4 (نانو) IL1B زيادة في مستويات نسخ الجينات المقابلة في وجود Csy4 مقارنة مع عناصر تحكم nv-SCR أو محفز الشرك . (د) التنشيط المتعامد لجينين مستهدفين باستخدام iSBH-sgRNAs المستجيب للبروتين (وحدة متعامدة). Csy4- و Cas6A مستجيب لـ iSBH (0B) Csy4 (نانو) CTS1 و iSBH (0B) Cas6A (متوسط) CTS2 ، على التوالي ، تم نقلهما معًا في حالة عدم وجود أي محرض ، أو وجود كل محفز فردي أو مزيج من اثنين. (ه) الأسلاك HBG1 و IL1B ناتج الجين مع محرضات مستقلة (Csy4 و Cas6A ، على التوالي). يؤدي تعبير iSBH (0B) SAM-Csy4 (nano) HBG1 و iSBH (0B) SAM-Cas6A (متوسط) IL1B إلى تنظيم متعامد خاص بالمحفز لإخراج الجين النسخي مقارنةً بالتحكم في nv-SCR. ل (ب,د) تُظهر الرسوم البيانية النسبة المئوية للخلايا المنشطة (EYFP و / أو ECFP إيجابية) بين السكان المنقولين بواسطة sgRNA بالكامل (إيجابي iBlue) (ن= 3 مكررات بيولوجية لكل حالة تعني ± sd). التحديد الكمي لكسور الخلايا التي تعبر عن EYFP أو ECFP أو كليهما EYFP / ECFP ذات الصلة بالظروف في ب,د 8. يشير nv-SCR إلى عنصر تحكم sgRNA أصلي مع تسلسل مباعد التدافع. تم نقل dCas9-VP64 وبلازميد نظام مراسل مزدوج ([8 × CTS1-EYFP] - [8 × CTS2-ECFP]) بشكل افتراضي في جميع الظروف. ل (ج,ه) تعرض البيانات تغيير أضعاف في مستويات النسخ المقاسة بواسطة RT-qPCR (ن= 3 مكررات بيولوجية (× 3 مكررات تقنية) ، يعني ± sd.). تم نقل Cas9-VP64 و MCP-p65-HSF1 بشكل افتراضي في جميع الظروف.

لتجميع وحدة متفرعة باستخدام iSBH-sgRNAs المستجيبة للبروتين وإثبات التنشيط المتزامن لأهداف متعددة مشروطة بوجود Csy4 ، قمنا أولاً بتصميم iSBH (0B) Csy4 (نانو) CTS1 و iSBH (0B) Csy4 (نانو) CTS2 sgRNAs و شارك في نقلهم مع dCas9-VP64 ونظام المراسل المزدوج. في كلتا الحالتين ، لوحظ تعبير متوازي قوي بوساطة CRISPR-TR في وجود Csy4 ، بينما لم يلاحظ أي تنشيط يمكن اكتشافه في غياب المحرض (الشكل 4 ب والشكل التكميلي 8 أ). علاوة على ذلك ، أدى الخلط التسلسلي لتسلسل المباعد لكل iSBH-sgRNA إلى التعبير عن جين مستهدف واحد ، والتحقق من اعتماد التنشيط المتفرّع على وجود كلا الدليلين (الشكل 4 ب). بتطبيق نفس إطار التصميم ، قمنا بعد ذلك بتصميم SAM sgRNAs (التي تحتوي على حلقتين MS2) لاستيعاب iSBHs المستجيب لـ Csy4 وبرنامج التنشيط الشرطي الموازي للبرامج الداخلية. HBG1 و IL1B الجينات 6. أظهر تسليم التركيبات الناتجة (iSBH (0B) SAM-Csy4 (nano) HBG1 و iSBH (0B) SAM-Csy4 (نانو) IL1B ، على التوالي) إلى خلايا HEK293T ، جنبًا إلى جنب مع نظام SAM ، تنظيمًا متزامنًا لكلا الجينين بالنسبة إلى المستويات الداخلية في وجود Csy4 (الشكل 4 ج).

لتصميم وحدات الجينات المتعامدة القائمة على iSBH والتي تنفذ محفز البروتين المستقل / الأزواج المستهدفة ، قمنا بعد ذلك بإنشاء iSBH-sgRNAs كاملة ومتوسطة ومتناهية الصغر تستجيب لشكل Cas6A endoribonuclase ثيرموفيلوس 20 (الشكل التكميلي 9 أ). على غرار Csy4-iSBH-sgRNAs ، أظهرت دبابيس الشعر المستجيبة لـ Cas6A إسكات CRISPR-TR كاملًا في حالة إيقاف تنشيط الجين المستهدف والقوي على الحالة (الشكل التكميلي 9 ب ، ج). تم اختيار تصميمات iSBH (0B) الأمثل Csy4 و iSBH (0B) Cas6A (أفضل خصائص التشغيل / الإيقاف) لتكييف التعبير عن التركيبات (EYFP ، ECFP) والداخلية (HBG1, IL1B) على وجود Csy4 و Cas6A. إظهار التنفيذ الناجح لوحدة متعامدة ، تم تنشيط كل جين مستهدف حصريًا من خلال المشغل المقابل (Csy4 أو Cas6A) ، مع عدم وجود تداخل يمكن اكتشافه بين الفروع المستقلة (الشكل 4 د ، هـ). كما هو متوقع ، تم تحقيق التعبير المتزامن لكلا الجينين عندما تم تسليم Csy4 و Cas6A معًا (الشكل 4 د ، هـ ، الشكل التكميلي 8 ب).

تنفيذ وحدات الجينات المستجيبة لـ ASO

شرعنا بعد ذلك في تنفيذ الوحدات المتفرعة والمتعامدة المقابلة التي يتم التحكم فيها خارجيًا بواسطة مشغلات ASO. يتطلب التفرع بوساطة ASO تطور حلقة استشعار مشتركة ، والتي يجب أن تعرض خصائص الطي المثلى (إمكانية الوصول إلى اقتران ASO) عبر متواليات مباعدة متعددة iSBH-sgRNA. لأتمتة هذه العملية التي أنشأناها iSBHfold (http://apps.molbiol.ox.ac.uk/iSBHfold/cgi-bin/iSBHfold.cgi) ، وهو برنامج مخصص يجمع بين الخوارزمية الجينية مع تنبؤات البنية الثانوية للحمض النووي الريبي 21 (انظر البرنامج التكميلي). باستخدام هذا البرنامج ، قمنا بتصميم iSBH (0B) ASO-sgRNAs (محفز ASOδ) و iSBH (0B) SAM-ASO-sgRNAs (محفز ASO) الذي يستهدف التركيبات (EYFP ، ECFP) والداخلية (HBG1, IL1B) أزواج الجينات ، على التوالي (الشكل 5 أ والشكل التكميلي 10). عرضت الوحدات المقابلة سلوك المتفرعة ON-state بعد التسليم (24 ساعة بعد ترنسفكأيشن) لمحفزهم المشابه ASO ، وإسكات تام في وجود ASOs شرك (تسلسل التدافع) (الشكل 5 ب ، ج والشكل التكميلي 8 ج). علاوة على ذلك ، تهدف تجارب التحكم إلى فصل كل جين مستهدف عن المحرض عن طريق التحور المتسلسل لحلقات الاستشعار عن الفقد المتوقع لتنشيط الجين في الفرع المقابل (الشكل 5 ب).

(أ) تخطيطي ل iSBHfold الخوارزمية. استنادًا إلى تسلسلات المباعدة المحددة من قبل المستخدم والبنية الثانوية المرغوبة لـ iSBH ، يستخدم البرنامج خوارزمية جينية لتطوير مجموعة من حلقات استشعار ASO المحتملة. تتوافق التسلسلات الناتجة مع هياكل iSBH المثلى عبر فواصل متعددة. (ب) التنشيط الموازي للجينات المستهدفة باستخدام ASO-response iSBH-sgRNAs (وحدة المتفرعة). تم نقل iSBH (0B) ASOδ-CTS1 و iSBH (0B) ASOδ-CTS2 التي تحتوي على حلقة استشعار مشتركة مع dCas9-VP64 ونظام المراسل المزدوج. تم تسليم شرك ASO أو الزناد ASOδ إلى الخلايا على مدار 24 ساعة بعد تعداء الجسم. أجريت تجارب موازية باستخدام iSBH-sgRNAs مع حلقات استشعار متحولة (iSBH (0B) ASOm-CTS1 و iSBH (0B) ASOm-CTS2) لتأكيد خصوصية التأثيرات المرصودة. (ج) الإفراط في التعبير الشرطي HBG1 و IL1B باستخدام ASO واحد. تم استخدام iSBH (0B) SAM-ASOɛ-HBG1 و iSBH (0B) SAM-ASOɛ-IL1B استجابة لمشغل مشترك ASOɛ لتنفيذ وحدة تفريعية. أدى تسليم ASOɛ في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن إلى زيادة في مستويات النسخ لكلا الجينين مقارنةً بالتحكم في nv-SCR ، أو شرك ASO أو iSBH-sgRNAs التي تحتوي على حلقات استشعار متحولة (iSBH (0B) SAM-ASOm-HBG1 ، iSBH (0B ) SAM-ASOm-IL1B). (د) تنفيذ وحدة تنشيط الجينات المتعامدة باستخدام iSBH-sgRNAs المستجيبة لـ ASO. تم استكمال iSBH (0B) ASOβ-CTS1 و iSBH (0B) ASOα-CTS2 التي تحتوي على حلقة استشعار مميزة بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن مع شرك ASO أو ASOβ أو ASOα أو مزيج من ASOβ + ASOα. (ه) تم استكمال iSBH (0B) SAM-ASOλ-HBG1 و iSBH (0B) SAM-ASOτ-IL1B التي تحتوي على حلقات استشعار ASO مختلفة بشرك ASO أو ASOλ أو ASOτ أو مزيج من ASOλ + ASOτ. تنظيم متعامد HBG1 و IL1B وقد لوحظ النسخ في وجود ASOs مطابقة مقارنة مع تحكم nv-SCR sgRNA. ل (ب,د) ن= 3 مكررات بيولوجية لكل حالة (يعني ± sd). التحديد الكمي لكسور الخلايا التي تعبر عن EYFP أو ECFP أو كل من EYFP و ECFP ذات الصلة بالظروف في ب,د يتم عرضه في الشكل التكميلي 8. بالنسبة لـ (ج,ه) ن= 3 مكررات بيولوجية (× 3 مكررات تقنية) (يعني ± sd).

يوفر توافر مجموعة محرضات واسعة النطاق لـ iSBH-sgRNAs المستجيبة لـ ASO إطارًا مثاليًا لبناء وحدات الجينات المتعامدة القائمة على CRISPR-TR في خلايا الثدييات. لتوضيح هذه الإمكانية ، قمنا بإنشاء سلسلة من أزواج ASO / iSBH الفردية التي تقارن محرضات ASO المتميزة مع التنشيط المشروط للأهداف الاصطناعية (ASOβ / EYFP ، ASOα / ECFP) أو الجينات الذاتية (ASOλ /HBG1، ASOτ /IL1B). أدى الحث الزمني لـ iSBH (0B) ASO أو iSBH (0B) SAM-ASO sgRNAs الهادئ مع تسليم ASO المنفصل أو المتزامن إلى ملفات تعريف تنشيط الجين المستهدفة المتوقعة دون أي تداخل واضح بين الفروع الفردية (الشكل 5 د ، هـ والشكل التكميلي 8 د ). توضح هذه النتائج معًا أهمية إطار عمل iSBH في تسهيل تجميع الوحدات الأساسية لبناء دوائر الجينات الاصطناعية.

تفعيل Ribozyme بوساطة من SBH-sgRNAs

بالإضافة إلى الذخيرة الغنية من المحرضات المشفرة وراثيًا والتي يتم تسليمها خارجيًا والتي توفرها نوكليازات و ASOs ، يمكن تطوير وحدات استشعار iSBH للاستجابة للفئات الأخرى من الروابط باستخدام ريبوزيمات رأس المطرقة الخيفي ذاتية الانقسام (aHHRz) (الشكل التكميلي 11 أ) 22 . أظهرت الدراسات السابقة أنه يمكن استخدام aHHRz بشكل فعال لبناء الدوائر الاصطناعية التي تسيطر عليها يجند 22،23،24. لإثبات جدوى الاستفادة من تصميم HHRz كآلية تحرير فاصل قائمة بذاتها ، قمنا بدمج بنية HHRz في سقالة SBH (0B) CTS (الشكل التكميلي 11 ب). أظهر التحليل المقارن لـ SBH-sgRNAs التي تحتوي على HHRz النشط تحفيزيًا (SBH (0B) HHRz-CTS1) أو HHRz غير النشط (SBH (0B) mHHRz-CTS1) تنشيطًا قويًا بوساطة HHRz للتعبير الجيني للمراسل وإسكات تام في حالة إيقاف التشغيل ( الشكل التكميلي 11 ج). يمكن أن تستفيد التكرارات المستقبلية لسقالة HHRz-SBH العامة من المنشأة في الجسم الحي أو في المختبر استراتيجيات تطوير أبتامر الحمض النووي الريبي لهندسة iSBHs تستجيب لمجموعة متنوعة من البروتينات والنيوكليوتيدات وروابط الجزيئات الصغيرة 25،26،27،28.


CRISPR RNA المخصص الخاص بك

قم بتحسين سير عمل CRISPR وكفاءة تحرير الجينوم باستخدام CRSIPRevolution RNA الاصطناعية من Synthego. يمكنك طلب CRISPRevolution RNA المخصص الخاص بك عبر Biolegio وسنكون شريكك في الخدمة على سبيل المثال. الطلب والشحن والجمارك من الولايات المتحدة.

قم بتنزيل المستند التقني الخاص بنا لمعرفة المزيد حول تقنية كريسبر.

سجرنا (Cas9 / S. pyogenes)

1.5 أو 3 أو 10 نانومول بواسطة OD260
التسلسل المستهدف 17-20 nts الخاص بك
لا تلدين المطلوبة
المخزن المؤقت Te Incl.
نوكلياز الماء الخالي مدفوع.
شحن في 5-7 أيام عمل

متوفر مع تعديلات كيميائية لزيادة مقاومة نوكلياز خارجي.
شحن في 10-15 يوم عمل

RNA مخصص

مخصص RNA 50

5 نانومول بواسطة OD260
10-50 nts من تسلسل RNA المخصص الخاص بك
المواد لـ 25-50 transfections

مخصص RNA 75

مخصص RNA 100

سجرنا (Cas9 / S. pyogenes)

حقق كفاءة تحرير تصل إلى 90٪ بجودة عالية ونقاوة عالية من sgRNA الاصطناعية

احصل على sgRNA كامل الطول الخاص بك والذي يتكون من التسلسل المستهدف 17-20 nts و Cas9 المحسن S. بيروجينات تسلسل سقالة

لا حاجة لتصلب crRNA & amp tracrRNA قبل تشكيل RNP أو تعداء

100٪ خالية من الحمض النووي: لا يوجد خطر من دمج الحمض النووي في الجينوم

حل مباشر وفعال من حيث التكلفة لأبحاث تحرير الجينوم

جرب sgRNA المعدل كيميائيًا لزيادة مقاومة نوكلياز خارجية

CrRNA & amp tracrRNA (Cas9 / S. pyogenes)

توقف بسبب انخفاض الطلب

RNA مخصص

مخصص RNA 50

مخصص RNA 75

مخصص RNA 100

متوفر الآن: RNA مخصص معدّل كيميائيًا لزيادة مقاومة نوكلياز خارجية

جودة CRISPRevolution

تأسست Synthego من قبل مهندسي SpaceX السابقين وتتكون من فريق محترف ومتعدد التخصصات يضم موظفين سابقين في منظمات مثل SpaceX و NASA ، بالإضافة إلى قدامى المحاربين ذوي الخبرة في صناعات التكنولوجيا الحيوية والتصنيع والتكنولوجيا الفائقة - ضمان أعلى مستوى من الاحتراف والجودة لـ تطبيق CRISPR الخاص بك.

احصل على جميع منتجات CRISPRevolution ذات الجودة المثبتة. كل CRISPRevolution RNA هو

على عكس على سبيل المثال في بنيات الحمض النووي الريبي المنسوخة في المختبر (IVT) ، يكون Synthego sgRNA نقيًا للغاية وبالتالي يقلل من احتمالية حدوث تأثيرات "خارج الهدف" وله تأثيرات إيجابية على كفاءة التحرير.

أثر كتلة المواصفات لجين AAVS1 الاصطناعي 100nt sgRNA (Synthego). يمثل الذروة المفردة الكبيرة منتجًا كامل الطول.

أثر كتلة المواصفات لجين AAVS1 105nt sgRNA المشتق من IVT. الأنواع الكبيرة n-1 و n + 1 و n + 2 موجودة.

فهم فوائد كريسبر و أمبير للحمض النووي الريبي الاصطناعي

ملصق: استخدام جرنا اصطناعي لتحسين تحرير جينوم كريسبر

الدليل: كيفية إجراء تجارب CRISPR الناجحة

ندوة عبر الويب: حقق كفاءة بنسبة 90٪ مع تحرير CRISPR

بروتوكولات تعداء

التثقيب الكهربائي لـ Cas9 / مجمعات بروتين نوكليوبروتين RNA الاصطناعية (RNP) من أجل تحرير جينوم CRISPR / Cas9 (نظام Thermo Neon ™)

Nucleofection (electroporation) لـ Cas9 / omplexes RNA Ribonucleoprotein الاصطناعية (RNP) لتحرير الجينوم CRISPR / Cas9 (نظام Lonza Nucleofection ™)

Lagelandseweg 56 6545 CG Nijmegen هولندا


ترميز البلازميدات Cpf1 و crRNAs

ترميز البلازميدات AsCpf1 (Acidaminococcus sp. Cpf1) و LbCpf1 (Lachnospiraceae جرثومة Cpf1) تم تحسين بروتينات الكودون البشري. كان البلازميد تعبير crRNA قائمًا على المروج U6 وتم تعديله من بلازميد تعبير sgRNA الموصوف سابقًا [15]. باختصار ، تم استبدال منطقة تكرار sgRNA بتسلسلات تكرار crRNA (AATTTCTACTCTTGTAGAT). تم إدخال crRNAs في بلازميدات تعبير crRNA التي تم هضمها بشكل منفصل بواسطة الإنزيم بس أنا (NEB). يتم سرد تسلسل crRNAs في الجدول التكميلي S1.


الملخص

هناك اهتمام متزايد باستخدام الكائنات الدقيقة غير النموذجية كمضيفين لتصنيع المستحضرات الصيدلانية الحيوية. يحتاج هؤلاء المضيفون إلى هندسة الجينوم للوفاء بصفات المنتج ذات الصلة سريريًا والعيار ، لكن تكييف الأدوات لتحرير الجينوم ، مثل CRISPR-Cas9 ، كان بطيئًا للمضيفين ضعيفي التوصيف. على وجه التحديد ، أدى نقص التوصيف الكيميائي الحيوي لنسخ RNA polymerase III إلى إعاقة التعبير الموثوق به عن توجيه RNAs في المضيفين الجدد. هنا ، نقدم إستراتيجية قائمة على التسلسل لتصميم أشرطة خاصة بالمضيف للتعبير المعياري والموثوق به عن دليل RNAs. باستخدام هذه الإستراتيجية ، حققنا ما يصل إلى 95٪ من كفاءة تحرير الجينات في الخميرة الميثيلوتروفيكية Komagataella phaffii. طبقنا هذا النهج للهندسة السريعة متعددة الإرسال لنمط ظاهري معقد ، وتحقيق الارتباط بالجليكوزيل المنتج المتوافق مع البشر في خطوتين متتاليتين من الهندسة. إن التمديد الموثوق به لأدوات تحرير الجينات البسيطة لمضيفي التصنيع غير النموذجيين سيمكن من الهندسة السريعة لسلالات التصنيع المضبوطة لملفات تعريف المنتج المحددة ويحتمل أن يقلل التكاليف والجداول الزمنية لتطوير العملية.


المعالجة الذاتية للـ RNAs المحاط بالريبوزيم في توجيه الحمض النووي الريبي في المختبر و في الجسم الحي لتحرير الجينوم بوساطة كريسبر

يستخدم CRISPR / Cas9 جزيء RNA (gRNA) الإرشادي لتنفيذ انقسام الحمض النووي الخاص بالتسلسل ، وقد تم استخدامه على نطاق واسع لتحرير الجينوم في العديد من الكائنات الحية. غالبًا ما تؤدي التعديلات في أي من طرفي الجرنا إلى جعل Cas9 / gRNA غير نشط. So far, production of gRNA في الجسم الحي has only been achieved by using the U6 and U3 snRNA promoters. However, the U6 and U3 promoters have major limitations such as a lack of cell specificity and unsuitability for في المختبر النسخ. Here, we present a versatile method for efficiently producing gRNAs both في المختبر و في الجسم الحي. We design an artificial gene named RGR that, once transcribed, generates an RNA molecule with ribozyme sequences at both ends of the designed gRNA. We show that the primary transcripts of RGR undergo self-catalyzed cleavage to generate the desired gRNA, which can efficiently guide sequence-specific cleavage of DNA targets both في المختبر and in yeast. RGR can be transcribed from any promoters and thus allows for cell- and tissue-specific genome editing if appropriate promoters are chosen. Detecting mutations generated by CRISPR is often achieved by enzyme digestions, which are not very compatible with high-throughput analysis. Our system allows for the use of universal primers to produce any gRNAs في المختبر, which can then be used with Cas9 protein to detect mutations caused by the gRNAs/CRISPR. In conclusion, we provide a versatile method for generating targeted mutations in specific cells and tissues, and for efficiently detecting the mutations generated.


أساليب

Plasmid design

بالنسبة إلى الإشريكية القولونية assay, the pLlacO-1 promoter 34 was combined with sfGFP 35 within a pSC101-E93K plasmid 36 containing a kanamycin resistance marker. This was further modified using a BioBrick 37 pJ23119-igRNA-HDV ribosome 38 gBlock to create one of the parental plasmids used in this study. The second parental plasmid (Addgene, 46569), 39 containing the dCas9 coding sequence (p15A, chloramphenicol resistance marker). All plasmids used in this study were generated from these two plasmids. For the cell-free transcription-translation (TXTL) assay, the P70a-deGFP plasmid 40 was modified to generate the reporter constructs expressing the deGFP fluorescent protein with the addition of the same CRISPR target sequence used in the بكتريا قولونية assay at the N-terminus of the deGFP coding sequence. The TX1 reporter carries the target sequence within the deGFP template strand, while the TX4 carries the target in the same position but reverted (non-template strand). The constructs expressing igRNAs, trRNA, or targeting and non-targeting gRNA controls (AJ1–AJ8) were constructed by Golden Gate cloning of each fragment into the receiving vector PAJ486 containing two copies of the J23119 promoter for the co-expression of igRNA and corresponding trRNA (AJ1 and AJ5), targeting gRNA (AJ2 and AJ6) as positive control, non-targeting gRNA (AJ4 and AJ8), and igRNA with the non-corresponding trRNA as negative controls. A detailed description of plasmids, primers, and methods used for their generation is provided in the Supplementary Material (Supplementary Methods and Supplementary Tables S2 and S3).

بكتريا قولونية assay

بكتريا قولونية MG1655Z1 cells 41 were grown overnight to early stationary phase at 37°C with shaking in M9 minimal media 21 with the addition of appropriate antibiotics (anhydrotetracycline at a concentration of 100 ng/mL). Cells were then diluted 1:200 in 2 mL of M9 minimal media with the addition of antibiotics and anhydrotetracycline and grown at 37°C with shaking for 2 h before being added to a black-wall clear-bottom 96-well plate. The plates were incubated in a Tecan F500 fluorescent plate reader at 37°C with shaking. A time series of optical density (600 nm) and fluorescence (480/20 nm excitation and 530/25 nm emission for sfGFP, 580/20 nm excitation 635/35 nm emission for mKate2 42 ) readings were taken at 15 min intervals. An average of measurements taken from three biological repeats, each with three technical repeats, was calculated and reported together with the relative standard deviations. All measurements were blanked against M9 media (containing antibiotics and supplements) and against MG1655Z1 cells containing empty plasmids with the appropriate antibiotic markers without igRNA/trRNA/dCas9/sfGFP components to acquire basal fluorescence levels.

Flow cytometry measurements were performed using a BD LSRFortessa (BD Biosciences). Single colonies were grown overnight in LB supplemented with 17.5 μg/mL kanamycin, 50 μg/mL spectinomycin, and 17.5 μg/mL chloramphenicol. The next day, cultures were diluted on a 96-well plate (5 μL in 195 μL), grown (4 h, 37°C, 200 × ز), and then diluted for a second time following the same procedure. Once a cell density corresponding to OD600 = 0.3 had been reached, 10 μL of the culture was diluted in 190 μL phosphate-buffered saline (with 2 mM kanamycin to block further protein synthesis). Samples were kept on ice and measured the same day. Flow cytometer voltage settings were: FSC, 632 SSC, 237 B485-530/30, 509. For all the samples tested, FCS data were gated to remove cell debris, and fluorescence histograms were plotted with the Flow Cytometry GUI for Matlab.

Quantitative polymerase chain reaction analysis

Total RNA was extracted from 1.5 mL bacterial cells (OD600 نانومتر = 0.6) using a standard Trizol (Thermo Fisher Scientific) protocol. Extracted RNA was precipitated with isopropanol, washed in 70% ethanol, and stored in DEPC-water. The RNA was then treated with DNase I for 1 h at 37°C, re-extracted with Trizol and resuspended in DEPC-water. RNA was tested for DNA contamination using the primers used for quantitative polymerase chain reaction (qPCR). No PCR products were found, indicating the absence of DNA contamination. cDNA (20 μL final volume) was produced from 1 μg of RNA (ReadyScript cDNA synthesis mix Sigma–Aldrich) and diluted 1:10 with DEPC-water. Diluted cDNA (0.5 μL) was used to confirm cDNA integrity. A qPCR master mix was created according to the manufacturer's specifications (KiCqStart SYBR Green qPCR ReadyMix Low ROX Sigma–Aldrich) by adding the premixed primer pairs and cDNA (or samples containing no cDNA, and non-retrotranscribed RNA as controls). The qPCR reactions were performed on a Stratagene MX3005p qPCR machine with the following protocol: 1 min at 94°C followed by 40 cycles (15 s at 94°C, 10 s at 57°C, and 20 s at 72°C), melt analysis, and cooling to 30°C. Results were normalized to the expression of the chloramphenicol resistance gene present in the plasmid.

Gel-shift assay

The 3A igRNA RNA fragment was في المختبر transcribed (TranscriptAid T7 High-Yield Thermo Fisher Scientific) from a PCR product containing the T7 promoter upstream of the 3A igRNA. The resulting RNA was extracted with Trizol, precipitated with isopropanol and ethanol, washed and re-suspended in DEPC-water. This RNA (1 μg) was mixed with 1 μg of synthesized 3A or 2A trRNA oligonucleotides (Integrated DNA Technologies), incubated at room temperature for 10 min, and run on a 12% polyacrylamide gel for 2.5 h. The RNA was visualized on a UV transilluminator after staining with ethidium bromide for 20 min.

Cell-free automated assay

Cell-free reactions were performed using 5 nM of each construct in a total volume of 4 μL per reaction. Each reaction contains a combination of three constructs: (1) TX1 or TX4 deGFP reporter (2) Cas9 or dCas9 plasmid and (3) plasmid carrying both igRNA (replaced with targeting or non-targeting gRNAs as positive or negative control) and trRNA (2A or 3A). After purification with magnetic beads (AMPure XP Beckman Coulter), plasmids at standard concentrations were added to 3 μL myTXTL master mix (507024 Arbor Biosciences) and distilled water to a final volume of 4 μL. Each component was transferred from 384-Echo microplates (PPL-0200 Labcyte) into Greiner black small-volume low-base 384-well plates (788876 Greiner) using the acoustic liquid handler (Echo 525 Labcyte) as per the manufacturer's instructions. The Synergy Mx microplate reader (BioTek) was used to analyze deGFP fluorescence (485/20 nm excitation and 528/20 nm emission) every 3 min for 234 acquisitions (∼12 h) at 29°C. A total of 12 replicates were performed for each combination of plasmids.


الملخص

Efficient guide RNA expression often limits CRISPR-Cas9 implementation in new hosts. To address this limitation in fungal systems, we demonstrate the utility of a T7 polymerase system to effectively express sgRNAs. Initially, we developed a methodology in خميرة الخميرة using a modified version of the T7 P266L mutant polymerase with an SV40 nuclear localization signal to allow guide RNA expression immediately downstream of a T7 promoter. To improve targeting efficiency, guide RNA design was found to be tolerant to three mismatches or up to three additional bases appended to the 5′ end. The addition of three guanines to a T7-based guide RNA improved guide RNA expression 80-fold and achieved transcriptional output similar to the strong Pol III snr52 المروجين. Resulting gene editing and dCas9-guided gene regulation with a T7-based guide RNA was on par with the commonly used snr52 نظام في S. cerevisiae. Finally, 96% and 60% genome editing efficiencies were achieved in Kluyveromyces lactis و Yarrowia lipolytica respectively with minimal optimization of this system. Thus, T7-based expression of sgRNAs offers an orthogonal method for implementing CRISPR systems in fungal systems.


شاهد الفيديو: First Genome edited Tomato by CRISPR-CAS9 gene editing, launched by Japan. #biotechnology (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Falakee

    تهانينا ، تواصل ممتاز

  2. Daijon

    هذا أمر مشكوك فيه.

  3. Athelstan

    الجواب المتعاطف

  4. Brazilkree

    آسف لمقاطعتكم.

  5. Osmond

    في رأيي ، هم مخطئون. نحن بحاجة إلى مناقشة. اكتب لي في PM ، إنه يتحدث إليك.

  6. Carlin

    في رأيي فأنتم مخطئون.اكتب لي في PM ، سنتواصل.

  7. Aziz

    انا اظن، انك مخطأ. يمكنني إثبات ذلك. اكتب لي في رئيس الوزراء ، سنناقش.

  8. Dalon

    أنا لا أوافق تمامًا



اكتب رسالة