معلومة

7.12: أدوات الهندسة الوراثية - علم الأحياء

7.12: أدوات الهندسة الوراثية - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

7.12: أدوات الهندسة الوراثية

أفضل 4 أدوات في الهندسة الوراثية

يتضمن إنشاء مكتبة الجينوم استنساخ الحمض النووي الجيني الكامل. لذلك ، فإن مكتبة الجينوم عبارة عن مجموعة من جزيء الحمض النووي المؤتلف (البلازميدات ، العاثيات) بحيث يمثل المجموع الكلي لإدراج الحمض النووي في هذه المجموعة الجينوم الكامل للكائن الحي. اعتمادًا على حجم الجينوم ، بدائية النواة أو حقيقية النواة ، يمكن اختيار ناقل. بهذه الطريقة يمكن تقطيع الجينوم بأكمله إلى قطع واستنساخه في ناقلات أو عن طريق تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن الإشارة إلى هذا باسم الاستنساخ الجيني.

يتضمن تكوين مكتبة الجينوم الخطوات التالية:

1. عزل الكروموسومات DNA

2. يتم تجزئة الحمض النووي عن طريق القص الميكانيكي أو الصوتنة أو باستخدام نوكلياز داخلي مناسب للهضم الجزئي للحمض النووي (الشكل 15.1). يولد القص الميكانيكي نهايات حادة بينما ينتج نوكلياز داخلي نهايات متماسكة. يتم تجنب الهضم الكامل لأنه يولد شظايا غير متجانسة في الحجم بحيث لا يمكن استخدامها.

3. ربط شظايا الحمض النووي - يخضع الهضم الجزئي للحمض النووي الجيني للرحلان الكهربي لجيل الاغاروز لفصل الأجزاء بالحجم المطلوب. يتم التخلص من شظايا الحجم المناسب من الجل. ثم يتم إدخال هذه الأجزاء في ناقل مناسب. يتم قطع هذه النواقل بنفس إنزيمات التقييد. بعد ذلك يتم ربط شظايا الحمض النووي إلى ناقلات باستخدام DNA ligase (الشكل 15.2). من خلال هذه التقنية يمكن إدخال حوالي 25 كيلو بايت من شظايا الحمض النووي في النواقل.

4. تحديد المستنسخة المرغوبة - تحديد المستعمرة البكتيرية التي تحتوي على جزء الحمض النووي المطلوب عن طريق استخدام مسبار تهجين مناسب في تهجين المستعمرة. قد يكون المسبار هو mRNA للجين ، أو cDNA من mRNA الخاص به ، أو جين متماثل من كائن حي آخر ، أو oligonucleotide اصطناعي يمثل تسلسل جزء من جزء الجين / DNA المطلوب. من أجل الكشف عن التهجين ، يجب تسمية المسبار عادة بنظير مشع.

نظم النواقل البديلة لصنع مكتبة الجينوم:

بالنسبة إلى بدائيات النوى (الجينومات الأصغر) قادرة على تكوين مكتبات جينية في البلازميدات. يُدرج البلازميد بشكل طبيعي -5-10 كيلو بايت ، لذلك تحتاج فقط إلى بضعة آلاف من المؤتلف لمكتبة تمثيلية. حقيقيات النوى (جينومات أكبر) ، تحتاج حقًا إلى نواقل يمكنها حمل شظايا DNA أكبر بكثير (الجدول 15.1).

يُظهر Bacteriophage lambda عدوى أكثر فاعلية للإشريكية القولونية مما يمكن تحقيقه عن طريق التحول البلازميدي. يرتبط Phage lambda بالمستقبلات الموجودة على سطح الإشريكية القولونية ويحقن الحمض النووي. تعد الإصابة بلمدا أكثر فاعلية من التحول البلازميدي ويمكن الحصول على # 8211

10 9 لويحات لكل ميكروجرام من الحمض النووي ، مقابل

10 6 مستعمرات لكل ميكروجرام من DNA البلازميد.

عندما تتلاشى الخلايا البكتيرية ، تتشكل لوحة ، والتي تنتشر مع إصابة المزيد من الخلايا بالعدوى. تحتوي اللويحة على الجسيمات الفيروسية المعدية أو الفيروسات ويمثل كل منها استنساخًا فرديًا من لامدا (على غرار مستعمرة بكتيرية تمثل استنساخ بلازميد فردي).

المظهر هو دائرة واضحة في & # 8216 كلاود & # 8217 من الخلايا البكتيرية (البكتيريا & # 8216lawn & # 8217) (الشكل 15.3). إذا حضنت لفترات طويلة ، ستستمر هذه الدوائر في النمو (تحتوي على المزيد والمزيد من الجزيئات الفيروسية) وتنتشر حتى يتم القضاء على جميع الخلايا البكتيرية. لاختيار نسخة واحدة من لامدا ، تكون اللوحة & # 8216 مثقوبة & # 8217 من لوحة أجار وتخزينها في محلول قابض. يمكن بعد ذلك استخدام هذا لإصابة المزيد من الخلايا البكتيرية ولتكرار المزيد من الحمض النووي لامدا المؤتلف.

نواقل لعمل مكتبات ذات إدخالات أكبر:

تُستخدم مكتبات Cosmid لاستنساخ الجينات ذات الإنترونات الكبيرة ولتسلسل أجزاء أكبر من الجينوم. نواقل Cosmid هي هجينة من البلازميد والعاثية lambda λ DNA (صغير

5 كيلو بايت بلازميد يحتوي على أصل البلازميد للتكاثر (أوري) ، وجين مقاوم للمضادات الحيوية مثل أمبير وموقع تقييد مناسب للاستنساخ جنبًا إلى جنب مع تسلسل COS من phage DNA). بسبب تسلسل COS ، يمكن تعبئة المؤتلفات الكونية في جزيئات فيروسية (مما يسمح بتحويل عالي الكفاءة).

نظرًا لأن معظم المكتبات الجينومية في ناقل كوزميد ، فقد تم التخلص من DNA DNA ويمكن استبداله بالحمض النووي ذي الأهمية ، طالما أنه لا يتجاوز حد 50 كيلو بايت للتعبئة في الرأس الفيروسي. أحجام الإدخال من 35-45 كيلو بايت. نظرًا لأن الحمض النووي المؤتلف لا يشفر أي بروتينات لامدا ، فإن الكوسميدات لا يشكلون جزيئات فيروسية (أو لويحات) بل يشكلون بلازميدات دائرية كبيرة ويمكن اختيار المستعمرات التي تنشأ على ألواح المضادات الحيوية ، مثل غيرها من محولات DNA البلازميد.

يمكن التلاعب بالمستنسخات الكونية بطريقة مماثلة ، مما يتيح سهولة عزل البلازميد. نظرًا لأن العديد من الجينات حقيقية النواة بترتيب 30 & # 8211 40 كيلو بايت ، تزداد احتمالية الحصول على استنساخ DNA يحتوي على التسلسل الجيني بأكمله بشكل ملحوظ عند استخدام مكتبة cosmid.

تُستخدم مكتبات YAC لاستنساخ أجزاء كبيرة جدًا من الحمض النووي (أكثر من 1 ميجا بايت) ، وهي مفيدة لاستنساخ الجينات الكبيرة (مثل جين التليف الكيسي 250 كيلو بايت) ولإنشاء مكتبات من النسخ الكبيرة المتداخلة ، مثل الكروموسومات الفردية المعزولة من الكائنات الحية (مكتبات الكروموسومات). تم استخدام هذه على نطاق واسع لرسم خرائط جينومات الكائنات الحية المعقدة (مثل الإنسان العاقل).

YACs هي كروموسومات خميرة اصطناعية وهجينة من DNA البلازميد البكتيري و DNA الخميرة. تم دمج المكونات المطلوبة لتكرار / فصل كروموسومات الخميرة الطبيعية مع DNA E. coli plasmid. تزرع YACs في الخميرة Saccharomomyces cerevesiae وبالتالي تحتوي على علامات قابلة للتحديد ومناسبة للنظام المضيف. بدلاً من اختيار المضادات الحيوية ، تمكن الواسمات التي يمكن تحديدها من الخميرة من نمو المحول على وسائط انتقائية تفتقر إلى مغذيات محددة. (غير المتحولة غير قادرة على النمو). سلالات الخميرة المستخدمة هي مساعدة التغذية & # 8211 أي أنها غير قادرة على صنع مركب معين.

على سبيل المثال ، يمكن لطفرات Trpl & # 8217t أن تصنع التربتوفان ، لذلك لا يمكن أن تنمو إلا على الوسائط المكملة بالتريبتوفان. إذا تم تحويل السلالة الطافرة باستخدام YAC الذي يحتوي على جين Trpl سليم ، فإن هذا سيعوض الجين غير النشط (المتمم) وتكون الخلية المنقولة قادرة على النمو على الوسائط التي تفتقر إلى التربتوفان.

لم يعد يتم استخدام YACs على نطاق واسع بعد الآن بسبب المشاكل المتأصلة. على سبيل المثال ، يمكن أن تحتوي استنساخ YAC على أجزاء غير متجاورة من الجينوم. هذا يعني أنه يمكن دمج 2 أو أكثر من شظايا الحمض النووي من أجزاء منفصلة من الجينوم في YAC فردي (لأنها قادرة على دعم إدخالات كبيرة إلى حد ما). المشكلة الثانية هي أن YACs غير مستقرة وكثيراً ما تفقد أجزاء من الحمض النووي أثناء التكاثر.

تُستخدم مكتبات BAC أيضًا في استنساخ أجزاء كبيرة جدًا من الحمض النووي ، وكانت مفيدة بشكل خاص في تسلسل الجينومات الكبيرة. BACs هي كروموسومات اصطناعية بكتيرية ، وتعتمد على بلازميد بكتيري كبير يحدث بشكل طبيعي ، وهو العامل F. يمكن أن تستوعب نواقل BAC إدخالات الحمض النووي حتى 300 كيلو بايت ، ولا تزال محترمة إلى حد ما عند الحاجة إلى استنساخ جينات كبيرة أو خريطة وتسلسل الجينومات المعقدة. تتمتع BACs بالعديد من المزايا مقارنة بـ YACs ، مما يعني أنها تُستخدم على نطاق واسع الآن. تم ترتيب معظم الجينوم البشري باستخدام BAC بدلاً من استنساخ YAC.

أداة # 2. [كدنا] و [كدنا]المكتبة:

الحمض النووي التكميلي (cDNA) هو DNA اصطناعي مصنوع من mRNA باستخدام إنزيم خاص يسمى النسخ العكسي (بوليميراز DNA المعتمد على RNA الذي اكتشفه Temin و Baltimore في عام 1970). في الأصل تم عزل هذا الإنزيم من فيروسات reterovirus. يقوم هذا الإنزيم بتفاعلات مماثلة مثل بوليميريز الحمض النووي ويتطلب برايمر مع طرف حر 3 & # 8242 OH. باستخدام mRNA كقالب ، يقوم إنزيم النسخ العكسي بتركيب جزيء DNA واحد مجدول يمكن استخدامه بعد ذلك كقالب للحمض النووي مزدوج الشريطة (الشكل 15.4). نظرًا لأنه مصنوع من mRNA ، فإن (كدنا) يخلو من كل من التسلسل التنظيمي المنبع والمصب ومن الإنترونات.

هذا يعني أنه يمكن ترجمة cDNA من حقيقيات النوى إلى بروتين وظيفي في البكتيريا ، وهي ميزة مهمة عند التعبير عن جينات حقيقية النواة في المضيف البكتيري. يتم تهجين سلسلة oligo قصيرة (dT) إلى ذيل poly (A) من حبلا mRNA. يعمل مقطع oligo (dT) كتمهيدي لعمل النسخ العكسي ، والذي يستخدم mRNA كقالب لتخليق حبلا cDNA. ينتهي [كدنا] الناتج في حلقة دبوس الشعر. عندما يتحلل mRNA ، من هجين RNA-DNA ، عن طريق العلاج مع NaOH أو RNase H ، يتم ترك قطعة قصيرة من RNA. تصبح حلقة دبوس الشعر هذه أساسًا لبوليميراز الحمض النووي I ، الذي يكمل خيط الحمض النووي المقترن.

ثم يتم شق الحلقة بواسطة نوكلياز SI (الذي يعمل فقط على الحلقة المفردة المجدولة) لإنتاج جزيء cDNA مزدوج تقطعت به السبل. يمكن إدخال هذا الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل في نواقل البلازميد ، والكونسميد ، والعاثية لامدا ، وناقلات الاستنساخ عن طريق الربط غير الحاد.

مكتبة (كدنا) عبارة عن مجموعة من المتحولات البكتيرية أو محللات الملتهمة حيث يتم تمثيل كل مرنا معزول من كائن أو نسيج كإدخال (كدنا) في بلازميد أو ناقل فج. يعتمد تواتر cDNA المحدد في مثل هذه المكتبة على تواتر mRNA المعني في هذا النسيج.

أداة # 3. تحليل الجينات ونصوص الجينات:

تتضمن تقنية الحمض النووي المؤتلف توطين الجين محل الاهتمام. يمكن عزل هذا الجين أو تصنيعه قبل التلاعب به واستخدامه للتحول الذي يؤدي إلى إنتاج نباتات وحيوانات معدلة وراثيًا. تم استخدام تقنيات مختلفة لعزل أنواع مختلفة من الجينات مثل جين RNA الريبوسومي ، وجين الصفات المظهرية مع منتج جيني غير معروف ، لمنتجات بروتينية معينة ، والجينات التي تنطوي على وظائف تنظيمية ، على سبيل المثال جينات المروج إلخ.

عزل جينات RNA الريبوسوم:

يصنع الحمض النووي الريبوزي 80 ٪ من إجمالي الحمض النووي الريبي ويتم تصنيعه على الجين الريباسي الذي يمكن عزله. كان عزل هذا الجين سهلاً نظرًا لبعض خصائص خصائص الرنا الريباسي (أ) توجد جينات الريبوم في نسخ متعددة (ب) الفرق بين الجينات الريبوزومية والجينات الأخرى ، نظرًا لمحتوى G + C المرتفع نسبيًا في الرنا الريباسي. تم عزل الجين الريبوزومي لأول مرة في عام 1965 من قبل إتش والاس و M.L. بيرنستيل في برمائي يدعى Xenopus.

الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها عزل جينات الرنا الريباسي هي كما يلي:

1. يتم عزل الرنا الريباسي من الريبوسومات ويتم تسميتها إشعاعيًا عن طريق السماح لها بالتكاثر في وسط يحتوي على يوريدين ثلاثي.

2. يتم عزل الحمض النووي الريبوزومي عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة (محتوى G + C العالي من rDNA يجعل من السهل فصله عن طريق الطرد المركزي عن باقي الحمض النووي) متبوعًا بتمسخه.

3. يتم بعد ذلك تثبيت الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل على ورق الترشيح ويتم إضافة الحمض النووي الريبي المسمى إلى الورق.

4. الآن يحدث تهجين DNA و RNA ويتم غسل الحمض النووي الريبي الزائد المسمى.

5. يتم قياس النشاط الإشعاعي والهجين المزدوج الذي عند التمسخ سيعطي الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل والذي يمكن جعله مزدوج الشريطة. هذه هي الطريقة التي يمكن بها عزل جين الرنا الريباسي.

عزل جين بروتينات معينة:

هذا ممكن عن طريق استخدام إنزيم النسخ العكسي. يمكن لهذا الإنزيم أن يصنع نسخة / مكملة من الحمض النووي (كدنا) من الحمض النووي الريبي. لذلك من الضروري أن تكون تقنيات عزل الرنا المرسال متاحة.

الخطوات المختلفة المتبعة هي كما يلي:

1. يتم تنقية منتج البروتين من الجين.

2. يتم إنتاج الأجسام المضادة ضد هذه المنتجات البروتينية عن طريق تحصين الحيوانات مثل الأرانب والفأر.

3. يتم ترسيب polysomes التي تشارك في تصنيع بروتينات معينة. يتم ذلك بمساعدة الأجسام المضادة المنتجة.

4. يتم عزل مرنا وتنقيته من الكسور المتعددة. يستخدم هذا مرنا لتوليف [كدنا].

5. يتم بعد ذلك إدراج هذه (كدنا) في نواقل الاستنساخ لإعداد مكتبة (كدنا). بعد ذلك ، يتم إجراء التحليل المناعي والكهربائي لمنتجات الترجمة لاستنساخ cDNA ، لتحديد استنساخ cDNA المحدد ، الذي يحتوي على جين لبروتين معين ذي أهمية.

6. ثم يتم اختيار مجسات (كدنا) محددة لتحديد وعزل الجين من الحمض النووي الجيني من خلال فحص مكتبة جينومية كاملة أو جزئية.

عزل جين من منتجات غير معروفة (بتعبير خاص بالأنسجة):

من السهل عزل منتجات الجينات الخاصة بالأنسجة. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن جينات تخزين البروتينات فقط في تنمية البذور ، ويتم التعبير عن جين الغلوبين في كريات الدم الحمراء. يمكن عزل هذه الجينات بسهولة لأن mRNA المستخرج من مثل هذه الأنسجة سيكون إلى حد كبير الجين محل الاهتمام. يمكن القضاء على mRNA الأخرى ، والتي يمكن تحديدها عن طريق عزل ومقارنة mRNA من الأنسجة حيث لا يتم التعبير عن هذا الجين. ثم يتم استخدام هذا الرنا المرسال المعزول لتخليق (كدنا) باستخدام إنزيم النسخ العكسي. ثم تكون العملية هي نفسها الموصوفة في عزل الجينات لبروتينات معينة معروفة.

عزل الجينات باستخدام مجسات DNA و RNA:

إذا كانت المجسات الجزيئية المحددة (مجسات DNA و RNA) متوفرة ، فيمكن استخدامها لعزل جينات معينة. يمكن الحصول على هذه المجسات إما من أنواع نباتية أخرى أو يمكن تصنيعها بشكل مصطنع باستخدام جزء من تسلسل الأحماض الأمينية لمنتج البروتين للجين المعني. تسمى المجسات التي تم الحصول عليها من أحد الأنواع النباتية والمستخدمة لأنواع نباتية أخرى بالمسابير غير المتجانسة.

تم العثور على هذه المجسات غير المتجانسة لتكون فعالة في تحديد استنساخ الجينات أثناء تهجين المستعمرة أو تهجين اللويحات أو على لطخة جنوبية. على سبيل المثال ، تم عزل جين سينسيز chalcone من Antirrhinum majus و Petunia hybrida باستخدام مسبار غير متجانس من البقدونس. تستخدم المجسات غير المتجانسة بشكل عام مع مكتبة (كدنا).

الآن مع معرفتنا بتوليف مجسات (كدنا) ، يمكن أن تكون هذه المجسات مفيدة في تركيب المجسات الاصطناعية. في هذا الإجراء ، يتم استخدام البروتين المنقى باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد للتسلسل الدقيق لـ 5-15 من الأحماض الأمينية المتتالية ، ويمكن استخدام هذه المعلومات لتخليق قليل النيوكليوتيدات المقابلة باستخدام مُصنِّع الحمض النووي المؤتمت. يمكن بعد ذلك استخدام قليل النوكليوتيدات مباشرة لفحص (كدنا) أو مكتبة الجينوم لعزل الجين محل الاهتمام.

أداة # 4. تهجين المستعمرات:

تهجين المستعمرات هو فحص مكتبة مع مسبار مُصنَّف (مشع ، مضيء حيوي ، إلخ) لتحديد تسلسل معين من الحمض النووي ، أو الحمض النووي الريبي ، أو الإنزيم ، أو البروتين ، أو الجسم المضاد (الشكل 15.5).

للتهجين سمتان مهمتان:

1. تفاعلات التهجين هي مجسات محددة سترتبط فقط بالمواقع التي تحتوي على تسلسلات مكملة.

2. تحدث تفاعلات التهجين في وجود كميات كبيرة من الجزيئات المتشابهة ولكن غير المتطابقة مع الموقع. هذا يعني أن المسبار يمكنه العثور على جزيء واحد من الهدف في خليط من ملايين الجزيئات ذات الصلة ولكن غير المكملة.

تسمح هذه الخصوصية للفرد بالعثور على تسلسل محدد في خليط معقد مليء بالتسلسلات المتشابهة. تسمح تقنية التهجين أيضًا للعلماء باختيار الجزيء ذي الأهمية من خلائط معقدة للغاية ودراسة الجزيء بمفرده.

طريقة تهجين المستعمرة:

الخطوات التالية مطلوبة:

1. عزل وتنمو الثقافات في وسط مناسب (أجار).

2. نقل عينة من المستعمرات على مصفوفة صلبة مثل النيتروسليلوز أو غشاء النايلون.

3. يتم تحليل الخلايا الموجودة على الغشاء ثم يتم تغيير طبيعة الحمض النووي.

4. يضاف مسبار ذو علامة إلى المصفوفة ويحدث التهجين.

5. يتم شطف القالب لإزالة جزيئات المسبار غير المهجنة.

6. بالنسبة للتحقيقات المشعة ، يستخدم المرء التصوير الشعاعي الذاتي ويتم وضع المصفوفة على فيلم الأشعة السينية.

7. لوحظ الفيلم للبقع السوداء التي تتوافق مع المستعمرات المهجنة بالمسبار.

8. قارن فيلم الأشعة السينية باللوحة الرئيسية لمعرفة المستعمرات التي بها مسبار تهجين. هذه هي المستعمرات التي احتوت على التسلسل المحدد الذي تم تهجينه بالفعل مع المسبار.

9. يمكن تربية المستعمرات الموجودة على اللوحة الرئيسية التي لها التسلسل المطلوب إذا رغبت في ذلك.

مزايا:

1. يسمح لك باختيار جزيء واحد من بين ملايين الجزيئات.

2. لا يتطلب عزل الأحماض النووية.

3. من الممكن استزراع وتحديد الكائنات الدقيقة التي تحتوي على التسلسل المهجن.

سلبيات:

1. تستغرق الطوائف وقتًا طويلاً ، وتستغرق وقتًا في احتضانها وظهور التهجين على فيلم الأشعة السينية.

2. عند تحديد الكائنات الحية الدقيقة ، لن ينجح الإجراء إلا إذا كانت الكائنات الحية تنمو وتشكل مستعمرة يمكن اكتشافها.


فيما يلي قائمة بالأدوات / الإنزيمات الجزيئية للمهندس الوراثي الأكثر شيوعًا في تجارب الهندسة الوراثية:

1. تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو عملية تكرار نسخ متعددة من الجينات ذات الأهمية. اكتشاف بوليمرات الحمض النووي بالحرارة ، مثل طق البوليميراز ، جعل من الممكن معالجة تكرار الحمض النووي في المختبر. يضخم كميات قطع الحمض النووي. يتم استخدام مواد التمهيدي لتحديد الجين المعني وتكرارها. يمكن بعد ذلك فصل هذه النسخ وتنقيتها باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام.

2. إنزيمات التقييد (مقص جزيئي)

كان اكتشاف الإنزيمات المعروفة باسم نوكليازات التقييد ضروريًا لهندسة البروتين. بناءً على تسلسل النوكليوتيدات ، تقطع هذه الإنزيمات الحمض النووي في مواقع محددة. ينتج الحمض النووي المقطوع باستخدام إنزيم تقييد العديد من الأجزاء الصغيرة ذات الأحجام المختلفة. يمكن فصلها باستخدام الهلام الكهربائي أو اللوني.

3. الرحلان الكهربائي الهلامي

إن تنقية الحمض النووي من زراعة الخلايا ، أو قطعه باستخدام إنزيمات تقييدية لن تكون ذات فائدة كبيرة إذا لم نتمكن من تصور الحمض النووي. يساعد الفصل الكهربائي للهلام في تصور حجم ونوع الحمض النووي المستخرج باستخدام PCR وإنزيمات التقييد. كما أنها تستخدم للكشف عن إدخالات الحمض النووي والضربة القاضية.

4. DNA Ligase

يمكن لـ DNA ligase إنشاء روابط تساهمية بين سلاسل النيوكليوتيدات. يتم ذلك لإنشاء خيوط مؤتلفة أو إغلاق حبلا دائري تم قطعه بواسطة إنزيمات التقييد. إن إنزيمات DNA polymerase I و polynucleotide kinase مهمة أيضًا لملء الفجوات أو الفسفرة في نهايات 5 ′ ، على التوالي.

5. البلازميدات

البلازميدات عبارة عن قطع دائرية صغيرة من الحمض النووي ليست جزءًا من الجينوم البكتيري ولكنها قادرة على التكاثر الذاتي. يتم استخدامه كناقلات لنقل الجينات بين الكائنات الحية الدقيقة. بمجرد تضخيم الجين المعني باستخدام PCR ، يتم قطع الجين والبلازميد بواسطة إنزيمات التقييد وربطهما معًا. يُعرف المزيج الناتج باسم الحمض النووي المؤتلف. يمكن أيضًا استخدام الحمض النووي الفيروسي (عاثيات البكتيريا) كناقل ، كما يمكن استخدام الكوسميدات ، وهي بلازميدات مؤتلفة تحتوي على جينات البكتيريا.

6. التحول / التحويل

تحويل هي عملية نقل المادة الجينية في ناقل ، مثل البلازميد ، إلى الخلايا المضيفة. تتعرض الخلايا المضيفة لتغير بيئي ، مثل التثقيب الكهربائي ، مما يجعلها "مؤهلة" أو قابلة للاختراق مؤقتًا للناقل. كلما زاد حجم البلازميد ، قلت الكفاءة التي تمتصها الخلايا.

يتم استنساخ مقاطع الحمض النووي الأكبر حجمًا بسهولة أكبر باستخدام العاثيات أو الفيروسات القهقرية أو غيرها من النواقل الفيروسية أو الكوسميدات بطريقة تسمى التوضيح. غالبًا ما تُستخدم العاثيات أو النواقل الفيروسية في الطب التجديدي ، ولكنها قد تتسبب في إدخال الحمض النووي في أجزاء من الكروموسومات لدينا حيث لا نريدها ، مما يتسبب في حدوث مضاعفات وحتى السرطان.

7. تحديد الكائنات المعدلة وراثيا

لن تأخذ كل الخلايا الحمض النووي أثناء التحول. لذلك ، من الضروري تحديد الخلايا التي خضعت للتحول وتلك التي لم تخضع للتحول. بشكل عام ، تحمل البلازميدات جينات لمقاومة المضادات الحيوية ، ويمكن اختيار الخلايا المعدلة وراثيًا بناءً على تعبير تلك الجينات وقدرتها على النمو على الوسائط التي تحتوي على هذا المضاد الحيوي. تعتمد الطرق البديلة للاختيار على وجود بروتينات مراسلة أخرى مثل x-gal /لاكز النظام ، أو بروتين الفلورة الخضراء ، والذي يسمح بالاختيار على أساس اللون والفلورة ، على التوالي.


تطبيقات الهندسة الوراثية [عودة إلى الأعلى]

يحتوي هذا القسم على معلومات إضافية لم يتم تضمينها مباشرة في AS Biology. ومع ذلك ، قد يكون من المفيد المساعدة في دعم تقنيات جنرال إلكتريك وتوحيدها.

لقد نظرنا الآن في بعض التقنيات العديدة التي يستخدمها مهندسو الجينات. ما الذي يمكن عمله بهذه التقنيات؟ إلى حد بعيد ، لا تزال التطبيقات الأكثر عددًا تستخدم كأدوات بحث ، والتقنيات المذكورة أعلاه تساعد علماء الوراثة على فهم الأنظمة الجينية المعقدة. على الرغم من كل هذا الضجيج ، لا يزال للهندسة الوراثية عدد قليل جدًا من التطبيقات التجارية الناجحة ، على الرغم من أن هذه التطبيقات تتزايد كل عام. يمكن اعتبار الطلبات المقدمة حتى الآن بشكل مفيد في ثلاث مجموعات.

استخدام الكائنات المعدلة وراثيا (الميكروبات عادة) لإنتاج المواد الكيميائية ، عادة للتطبيقات الطبية أو الصناعية.

استخدام تكنولوجيا الجينات لتغيير خصائص الكائنات الحية (عادة حيوانات المزرعة أو المحاصيل)

استخدام تكنولوجيا الجينات على البشر لعلاج مرض ما

منتجات الجينات [عودة إلى الأعلى]

أكبر وأنجح أنواع الهندسة الوراثية هو إنتاج المنتجات الجينية. هذه المنتجات ذات قيمة طبية أو زراعية أو تجارية. يوضح هذا الجدول بعض الأمثلة على المنتجات المعدلة وراثيًا المتوفرة بالفعل.

الهرمون البشري المستخدم في علاج مرض السكري

هرمون النمو البشري المستخدم في علاج التقزم

هرمون النمو البقري ، الذي يستخدم لزيادة إنتاج الحليب للأبقار

عامل تخثر الدم البشري ، يستخدم لعلاج مرضى الهيموفيليا

عامل مضاد لتخثر الدم يستخدم في الجراحة

مضاد حيوي ، يستخدم لقتل البكتيريا

مستضد التهاب الكبد B ، للتطعيم

إنزيم يستخدم لعلاج التليف الكيسي وانتفاخ الرئة

الإنزيم المستخدم في علاج مرض بومبي

الانزيم المستخدم في صناعة الجبن

الانزيم المستخدم في انتاج الورق

المنتجات هي في الغالب بروتينات ، يتم إنتاجها مباشرة عند التعبير عن الجين ، ولكن يمكن أيضًا أن تكون منتجات غير بروتينية تنتجها إنزيمات معدلة وراثيًا. الفكرة الأساسية هي نقل الجين (غالبًا ما يكون بشريًا) إلى كائن حي مضيف آخر (عادة ما يكون ميكروبًا) بحيث يصنع الجين منتجًا سريعًا ورخيصًا وأخلاقيًا. من الممكن أيضًا صنع بروتينات مُصممة عن طريق تغيير تسلسل الجينات ، ولكن في حين أن هذه أداة بحث مفيدة ، لا توجد تطبيقات تجارية حتى الآن.

نظرًا لأن المنتج النهائي هو مجرد مادة كيميائية ، فمن حيث المبدأ يمكن استخدام أي نوع من الكائنات الحية لإنتاجه. تعد البكتيريا المجموعة الأكثر شيوعًا من الكائنات المضيفة المستخدمة في صنع منتجات الجينات ، حيث يمكن نموها بسرعة ويمكن تنقية المنتج من خلاياها. لسوء الحظ ، لا تستطيع البكتيريا دائمًا صنع بروتينات بشرية ، وقد تم مؤخرًا استخدام الحيوانات وحتى النباتات أيضًا في إنتاج الجينات. في كلتا الحالتين لا يكون من المناسب استخراج المنتج من خلاياهما ، لذلك يجب إفراز المنتج في الحيوانات في اللبن أو البول ، بينما في النباتات يجب إفراز المنتج من الجذور. يوضح هذا الجدول بعض مزايا وعيوب استخدام الكائنات الحية المختلفة لإنتاج منتجات الجينات المعدلة وراثيًا.

لا توجد نواة لذا فإن الحمض النووي سهل التعديل يحتوي على بلازميدات جينات جينوم صغيرة مفهومة جيدًا لاجنسيًا لذا يمكن استنساخها صغيرة وسريعة النمو سهلة النمو تجاريًا في المخمرات ستستخدم الكربوهيدرات الرخيصة مشاكل أخلاقية قليلة.

لا يمكن لصق الإنترونات أي تعديل لاحق للترجمة بحجم الجين الصغير

يمكن لصق الإنترونات يمكن أن تفعل تعديلات ما بعد الترجمة يمكن أن تقبل جينات كبيرة

لا تحتوي على بلازميدات (باستثناء الخميرة) غالبًا ما تكون ثنائية الصبغة ، لذا قد يلزم إدخال نسختين من الجينات للتحكم في التعبير غير المفهومة جيدًا.

لاجنسي لذلك يمكن استنساخه أحادي العدد ، لذلك يمكن زراعة نسخة واحدة فقط في أحواض

لا يمكن دائمًا صنع منتجات جينية للحيوانات

التمثيل الضوئي لذلك لا يحتاج إلى الكثير من التغذية يمكن استنساخه من الخلايا المفردة يمكن إفراز منتجات من الجذور أو في النسغ.

يجب أن تنمو جدران الخلايا التي يصعب اختراقها بواسطة ناقل النمو البطيء في الحقول متعددة الخلايا

على الأرجح أن تكون قادرة على صنع بروتينات بشرية يمكن إفرازها في الحليب أو البول

بطيء النمو متعدد الخلايا

سنلقي نظرة على بعض الأمثلة بالتفصيل

الأنسولين البشري [عودة إلى الأعلى]

الأنسولين هو هرمون بروتيني صغير ينتجه البنكرياس لتنظيم تركيز السكر في الدم. في المرض مرض السكري المعتمد على الأنسولين لا تنتج خلايا البنكرياس ما يكفي من الأنسولين ، مما يتسبب في هزال الأعراض والموت في النهاية. يمكن علاج المرض بنجاح عن طريق حقن الأنسولين المستخرج من بنكرياس الأبقار والخنازير المذبوحة. ومع ذلك ، فإن الأنسولين من هذه الأنواع له تسلسل مختلف قليلاً من الأحماض الأمينية عن الأنسولين البشري وهذا يمكن أن يؤدي إلى رفض الجهاز المناعي والآثار الجانبية.

تم عزل جين الأنسولين البشري واستنساخه وتسلسله في السبعينيات ، وبالتالي أصبح من الممكن إدخال هذا الجين في البكتيريا ، والتي يمكنها بعد ذلك إنتاج الأنسولين البشري بكميات كبيرة. لسوء الحظ لم يكن الأمر بهذه البساطة. في البشر ، تصنع خلايا البنكرياس أولاً المؤيد للأنسولين، والذي يخضع بعد ذلك لتعديل ما بعد الترجمة لصنع الأنسولين الوظيفي النهائي. لا تستطيع الخلايا البكتيرية إجراء تعديل لاحق للترجمة. في النهاية تم تصنيع جين اصطناعي (كدنا) وإدخاله في البكتيريا بكتريا قولونية، التي صنعت الأنسولين ، وتم إجراء التحويل بعد التحويل إلى الأنسولين كيميائيًا. تم تطوير هذه التقنية من قبل شركة Eli Lilly and Company في عام 1982 وأصبح المنتج "هومولين" أول منتج معدل وراثيًا معتمدًا للاستخدام الطبي.

في التسعينيات تم تحسين الإجراء باستخدام الخميرة خميرة الخميرة بدلا من بكتريا قولونية. الخميرة ، باعتبارها حقيقيات النوى ، قادرة على تعديل ما بعد الترجمة ، وبالتالي فإن هذا يبسط إنتاج الأنسولين البشري. ومع ذلك ، طورت شركة أخرى طريقة لتحويل أنسولين الخنازير إلى أنسولين بشري عن طريق تغيير بعض الأحماض الأمينية كيميائيًا ، وتبين أن هذا أرخص من طرق الهندسة الوراثية. كل هذا يظهر أنه لا يزال لدى مهندسي الجينات الكثير لنتعلمه.

هرمون النمو البشري (HGH) [عودة إلى الأعلى]

هرمون النمو هو هرمون بروتيني تفرزه الغدة النخامية ، مما يحفز نمو الأنسجة. ينتج عن انخفاض إنتاج هرمون النمو في الطفولة القزامة النخامية. يمكن علاج هذا باستخدام هرمون النمو المستخرج من البشر المتوفين ، ولكن نظرًا لأن العلاج تسبب في بعض الآثار الجانبية ، مثل مرض كروتزفيلد جاكود (CJD) ، فقد تم إيقاف العلاج. تم استنساخ جين HGH وإدخال جين اصطناعي (كدنا) فيه بكتريا قولونية. تمت إضافة تسلسل إشارة لا يتسبب فقط في ترجمة الجين ولكن يتسبب أيضًا في إفراز البروتين من الخلية ، مما يجعل التنقية أسهل بكثير. يتم إنتاج هرمون النمو هذا المعدل وراثيًا بواسطة Genentech ويمكنه بنجاح استعادة الطول الطبيعي للأطفال الذين يعانون من نقص هرمون النمو.

Bovine Somatotrophin (BST) [عودة إلى الأعلى]

هذا هو هرمون النمو الذي تنتجه الماشية. تم استنساخ الجين في البكتيريا بواسطة شركة Monsanto ، التي يمكنها إنتاج كميات كبيرة من BST. غالبًا ما يتم حقن الماشية في الولايات المتحدة بـ BST كل أسبوعين ، مما يؤدي إلى زيادة بنسبة 10٪ في كتلة الأبقار وزيادة إنتاج الحليب في الأبقار الحلوب بنسبة 25٪. تم اختبار BST في المملكة المتحدة في عام 1985 ، ولكن لم تتم الموافقة عليه وحظر استخدامه حاليًا في الاتحاد الأوروبي. ويرجع ذلك جزئيًا إلى المخاوف العامة وجزئيًا بسبب وجود فائض بالفعل في إنتاج الحليب ولحم البقر في الاتحاد الأوروبي ، لذلك ليس من الضروري زيادة الإنتاج.

رينين [عودة إلى الأعلى]

رينين هو إنزيم يستخدم في إنتاج الجبن. يتم إنتاجه في معدة الثدييات الصغيرة (بما في ذلك البشر) ويساعد على هضم بروتين الحليب الكيزين عن طريق ترسيخه بحيث يبقى لفترة أطول في المعدة. تقليديا ، استخدمت صناعة الجبن الرينين الذي يتم الحصول عليه من معدة العجول الصغيرة عندما يتم ذبحها من أجل لحم العجل ، ولكن هناك اعتراضات أخلاقية وعملية على هذا المصدر. الآن تم تصنيع جين cDNA الاصطناعي لـ rennin من mRNA المستخرج من خلايا معدة العجل ، وتم إدخال هذا الجين في مجموعة متنوعة من الميكروبات مثل البكتيريا بكتريا قولونية والفطر رشاشيات النيجر. لقد كان الرينين المستخرج من هذه الميكروبات ناجحًا للغاية ، و 90٪ من جميع أنواع الجبن الصلب في المملكة المتحدة مصنوعة باستخدام الميكروبات رينين. في بعض الأحيان (وإن لم يكن دائمًا) يتم تصنيف هذه المنتجات على أنها "جبن نباتي".

AAT (أ -1-أنتيتريبسين) [عودة إلى الأعلى]

AAT هو بروتين بشري يصنع في الكبد ويوجد في الدم. كما يوحي الاسم ، فهو مثبط لأنزيمات البروتياز مثل التربسين والإيلاستاز. هناك طفرة نادرة في جين AAT (بديل أساسي واحد) تتسبب في أن تكون AAT غير نشطة ، وبالتالي تكون إنزيمات البروتياز غير مقيدة. وكان أبرز تأثير لهذا في الرئتين حيث الإيلاستاز يهضم النسيج المرن للحويصلات الهوائية ، مما يؤدي إلى الإصابة بأمراض الرئة انتفاخ الرئة. يمكن علاج هذه الحالة عن طريق استنشاق رذاذ يحتوي على AAT بحيث يصل إلى الحويصلات الهوائية ويثبط الإيلاستاز هناك.

يمكن استخراج AAT لهذا العلاج من التبرعات بالدم ، ولكن بكميات صغيرة جدًا. تم العثور على جين AAT واستنساخه ، ولكن لا يمكن إنتاج AAT في البكتيريا لأن AAT موجود بروتين سكري، مما يعني أنه يحتاج إلى إضافة السكريات عن طريق التعديل الترجمي اللاحق. لا يمكن إجراء هذا النوع من التعديل إلا بواسطة الحيوانات ، ويتم إنتاج AAT الآن بواسطة الأغنام المعدلة وراثيًا. من أجل تسهيل استخلاص AAT ، تم إقران الجين بمحفز لبروتين الحليب B -lactoglubulin. نظرًا لأن هذا المحفز يتم تنشيطه فقط في خلايا الغدة الثديية ، فسيتم التعبير عن جين AAT فقط في خلايا الغدة الثديية ، وبالتالي سيتم إفرازه في حليب الأغنام. هذا يجعل من السهل جدًا الحصاد والتنقية دون الإضرار بالأغنام. كان أول خروف معدل وراثيا ينتج AAT يسمى Tracy ، وقد تم إنتاجه بواسطة PPL Pharmaceuticals في إدنبرة في عام 1993. هكذا كانت تريسي وا صنع:

يتم إعطاء أنثى الخروف دواء الخصوبة لتحفيز إنتاج البويضات ، ويتم جمع العديد من البويضات الناضجة من مبيضها.

يتم تخصيب البويضات في المختبر.

يتم تحضير البلازميد إد يحتوي على الجين الخاص بـ AAT البشري وتسلسل المروج لـ b-lactoglobulin. يتم حقن مئات النسخ من هذا البلازميد في نواة الملقحات الملقحة. سيتم تحويل عدد قليل فقط من البيئات الملقحة ، لكن في هذه المرحلة لا يمكنك تحديد أي منها.

تنقسم البيضة الملقحة في المختبر حتى تصل الأجنة إلى مرحلة 16 خلية.

يتم زرع الأجنة المكونة من 16 خلية في رحم الأم البديلة. فقط عدد قليل من عمليات الزرع تؤدي إلى حمل ناجح.

اختبر جميع النسل من الأمهات البديلات لإنتاج AAT في لبنهن. هذه هي الطريقة الوحيدة لمعرفة ما إذا كانت البيضة الملقحة قد تناولت جين AAT بحيث يمكن التعبير عنها. حوالي 1 من كل 20 بيضة ناجحة.

جمع الحليب من الأغنام المعدلة وراثيا لبقية حياتهم. يحتوي حليبهم على حوالي 35 جرامًا من AAT لكل لتر من الحليب. تزاوج منها أيضًا من أجل بناء قطيع من الأغنام المعدلة وراثيًا.

تنقية AAT ، والتي تبلغ قيمتها حوالي 50000 جنيه لكل مجم.

أنماط ظاهرية جديدة [عودة إلى الأعلى]

هذا يعني تغيير خصائص الكائنات الحية عن طريق الهندسة الوراثية. تعد الكائنات الحية عمومًا من المحاصيل ذات الأهمية التجارية أو حيوانات المزرعة ، والهدف هو تحسين جودتها بطريقة ما. يمكن اعتبار هذا إصدارًا عالي التقنية من التربية الانتقائية، التي استخدمها البشر لتغيير وتحسين محاصيلهم وحيواناتهم لما لا يقل عن 10000 عام. ومع ذلك فقد تحولت الكائنات المعدلة وراثيًا إلى تطور مثير للجدل إلى حد كبير. لا نحتاج إلى دراسة أي من هذه التفاصيل بالتفصيل ، ولكن هذا الجدول يعطي فكرة عما يتم عمله.

تم استنساخ جين بروتين غلاف الفيروس وإدخاله في نباتات التبغ والبطاطس والطماطم. يبدو أن بروتين الغلاف "يمنع" النباتات التي تكون أكثر مقاومة للهجوم الفيروسي.

المحاصيل المقاومة لمبيدات الأعشاب

ميكروبات تنظيف البيئة

العلاج الجيني [عودة إلى الأعلى]

ربما يكون هذا هو النوع الأكثر أهمية والأكثر إثارة للجدل من الهندسة الوراثية. كما أنها الأقل تطوراً. فكرة العلاج الجيني هي تغيير البشر وراثيا من أجل علاج مرض ما. قد يمثل هذا أول فرصة لعلاج الأمراض المستعصية. لاحظ أن هذا يختلف تمامًا عن استخدام الميكروبات المعدلة وراثيًا لإنتاج دواء أو لقاح أو هرمون لعلاج مرض بالوسائل التقليدية. العلاج الجيني يعني تغيير النمط الجيني للنسيج أو حتى الإنسان بأكمله.

التليف الكيسي [عودة إلى الأعلى]

التليف الكيسي (CF) هو أكثر الأمراض الوراثية شيوعًا في المملكة المتحدة ، حيث يصيب حوالي 1 من كل 2500. وينتج عن طفرة في جين البروتين المسمى CFTR (منظم غشاء التليف الكيسي). يقع الجين على الكروموسوم 7 ، وهناك بالفعل أكثر من 300 طفرة مختلفة معروفة ، على الرغم من أن الطفرة الأكثر شيوعًا هي حذف ثلاث قواعد ، وإزالة حمض أميني واحد من 1480 حمض أميني في البروتين. CFTR هو بروتين قناة أيون كلوريد موجود في غشاء الخلية لخلايا الأنسجة الظهارية (البطانة) ، وتوقف الطفرة عمل البروتين ، لذلك لا يمكن لأيونات الكلوريد عبور غشاء الخلية.

تتراكم أيونات الكلوريد داخل هذه الخلايا ، مما يؤدي إلى دخول أيونات الصوديوم لموازنة الشحنة ، كما أن زيادة تركيز هذه الأيونات داخل الخلايا الظهارية يقلل من الجهد التناضحي. لذلك يتم الاحتفاظ بالماء داخل الخلايا ، مما يعني أن المخاط الذي تفرزه هذه الخلايا يكون أكثر جفافاً وأكثر لزوجة من المعتاد. يسد هذا المخاط اللزج الأنابيب التي يفرز فيها ، مثل الأمعاء الدقيقة ، وقناة البنكرياس ، والقناة الصفراوية ، وقناة الحيوانات المنوية ، والقصيبات ، والحويصلات الهوائية.

تؤدي هذه الانسدادات إلى ظهور أعراض التليف الكيسي: ضيق التنفس ، والتهابات الرئة مثل التهاب الشعب الهوائية والالتهاب الرئوي ، وسوء الهضم والامتصاص ، والعقم. من بين هذه الأعراض تكون التأثيرات الرئوية هي الأكثر خطورة مسببة 95٪ من الوفيات. دائمًا ما يكون التليف الكيسي مميتًا ، على الرغم من ارتفاع متوسط ​​العمر المتوقع من عام واحد إلى حوالي 20 عامًا بسبب العلاجات الحديثة. تشمل هذه العلاجات العلاج الطبيعي عدة مرات كل يوم لطرد المخاط من الرئتين ، والمضادات الحيوية لمكافحة الالتهابات ، وأدوية DNAse لتخفيف المخاط ، والإنزيمات للمساعدة في هضم الطعام وحتى زرع القلب والرئة.

بالنظر إلى هذه العلاجات المعقدة (وغير الناجحة في النهاية) ، يُعد التليف الكيسي مرشحًا جيدًا للعلاج الجيني ، وكان من أوائل الأمراض التي تم التعامل معها بهذه الطريقة. تم تحديد جين CFTR في عام 1989 وتم استنساخ cDNA بعد فترة وجيزة. تكمن الفكرة في توصيل نسخ من هذا الجين الجيد إلى الخلايا الظهارية في الرئة ، حيث يمكن دمجها في الحمض النووي النووي وإنشاء قنوات كلوريد CFTR وظيفية. إذا أمكن تصحيح حوالي 10٪ من الخلايا ، فإن هذا سيعالج المرض.

تتم تجربة طريقتين للتوصيل: الجسيمات الشحمية والفيروسات الغدية ، وكلاهما يتم توصيلهما بجهاز استنشاق الهباء الجوي ، مثل تلك المستخدمة من قبل مرضى الربو. التجارب السريرية جارية حاليًا ، ولكن حتى الآن لم يثبت نجاح أي علاج.

SCID [عودة إلى الأعلى]

مرض نقص المناعة المشترك الشديد (SCID) هو مرض وراثي نادر يؤثر على جهاز المناعة. يحدث بسبب طفرة في جين الإنزيم ديميناز الأدينوزين (ADA). بدون هذا الإنزيم ، لا يمكن تصنيع خلايا الدم البيضاء ، لذلك لا يمتلك المصابون تقريبًا جهازًا مناعيًا فعالًا ويمكن أن يصابوا بسرعة بعدوى قاتلة ما لم يقضوا حياتهم في عزلة معقمة (يُعرف SCID أيضًا باسم "الطفل في متلازمة الفقاعة"). تمت محاولة العلاج الجيني مع عدد قليل من الأطفال في الولايات المتحدة الأمريكية والمملكة المتحدة عن طريق إزالة خلايا نخاع العظم جراحيًا (التي تصنع خلايا الدم البيضاء في الجسم) من المريض ، وإعادتها بفيروس معدّل وراثيًا يحتوي على جين ADA ، ثم العودة مرة أخرى. الخلايا المحولة للمريض. الأمل هو أن تتكاثر هذه الخلايا المحولة في نخاع العظام وتنتج خلايا الدم البيضاء. لا تزال المحاكمات جارية ، وبالتالي فإن النجاح غير معروف.

مستقبل العلاج الجيني [عودة إلى الأعلى]

لا يزال العلاج الجيني في مراحله الأولى ، ولا يزال مجالًا للبحث وليس التطبيق. لم يتم علاج أي شخص حتى الآن عن طريق العلاج الجيني ، لكن الاحتمالية تظل جذابة. لا يلزم حتى أن يقتصر العلاج الجيني على علاج الأمراض الوراثية ، بل يمكن أن يساعد أيضًا في علاج العدوى والأمراض البيئية:

قد يكون علاج الخط الجرثومي فعالًا للغاية ، ولكنه قد يكون خطيرًا أيضًا (نظرًا لأن الآثار طويلة المدى للتغييرات الجينية غير معروفة) وغير أخلاقي (نظرًا لأنه يمكن أن يؤدي بسهولة إلى تحسين النسل) وغير أخلاقي (لأنه قد يتضمن تغيير وتدمير الإنسان. الأجنة). إنه غير قانوني حاليًا في المملكة المتحدة ومعظم البلدان الأخرى ، وتركز الأبحاث الحالية على العلاج بالخلايا الجسدية فقط. يجب أن تتم الموافقة على جميع تجارب العلاج الجيني في المملكة المتحدة من قبل اللجنة الاستشارية للعلاج الجيني (GTAC) ، وهي هيئة حكومية تقوم بمراجعة الأسس الطبية والأخلاقية للتجربة. يُسمح بتعديل الخط الجرثومي مع الحيوانات ، وهو بالفعل الأساس لإنتاج الكائنات المعدلة وراثيًا.


التقنيات الهندسية الوراثية الناشئة

بالإضافة إلى التقنيات التي تمت مناقشتها أعلاه ، تم تطوير مناهج جديدة للهندسة الوراثية ويتم صقلها وتحسينها. على الرغم من أنها لم يتم تطبيقها على المنتجات التجارية حتى الآن ، إلا أنها تحمل قيمة عملية للمحاصيل المعدلة وراثيًا في المستقبل. تشمل التقنيات تحرير الجينوم ، ومكونات الحمض النووي الاصطناعية والكروموسومات الاصطناعية ، والتعديلات اللاجينية المستهدفة.

تحرير الجينوم

يستخدم تحرير الجينوم نوكليازات موجهة للموقع (نوكليازات محددة التسلسل SSN) لتحور تسلسل الحمض النووي المستهدف في كائن حي. باستخدام أنظمة SSN ، يمكن للعلماء حذف أو إضافة أو تغيير قواعد معينة في مكان معين. تقوم SSNs بشق الحمض النووي في مواقع محددة وتترك فاصلًا واحدًا (يُعرف باسم النك) أو فاصلًا مزدوجًا. يمكن إصلاح كسر الحمض النووي بطريقتين (الشكل 7-1):

  • من خلال عملية الانضمام إلى النهاية غير المتجانسة الأصلية للخلية و rsquos (NHEJ) ، مما يؤدي إلى حدوث طفرة في الموقع.
  • إذا تم توفير جزيء DNA المتبرع في نفس الوقت الذي يتم فيه تحرير الحمض النووي بواسطة nucleases ، من خلال آلية إصلاح DNA الأصلية الخاصة بالخلية و rsquos و mdash المعروف باسم الإصلاح الموجه للتماثل (HDR) و mdash الذي يدمج الجزيء المتبرع في موقع الانقسام.

تُستخدم أربع فئات رئيسية من SSNs في تحرير جينوم النبات (تمت مراجعته في Voytas and Gao ، 2014): الميغانوكليازات ، نوكلياز إصبع الزنك (ZFNs) ، نوكليازات المستجيب الشبيه بمنشط النسخ (TALENs) ، والتكرارات المتناوبة المتباعدة المنتظمة (CRISPR) / نظام نوكلياز Cas9 (الشكل 7-2).ازدهر مجال تقنيات تحرير الجينوم وتطبيقه ، خاصة منذ ظهور نظام CRISPR / Cas9 ، وتتوقع اللجنة اكتشافات إضافية لتسهيل تحرير الجينوم في العقد القادم.

تحدث Meganucleases بشكل طبيعي في البكتيريا والعتائق وحقيقيات النوى وكانت أول SSNs تم فحصها لتحرير الجينوم. Meganucleases عبارة عن بروتينات مفردة تتعرف على تسلسل في الحمض النووي يبلغ طوله 12 نيوكليوتيدًا على الأقل ويقطع الحمض النووي المستهدف ، تاركًا فاصلًا مزدوجًا يمكن إصلاحه من خلال NHEJ أو HDR باستخدام جزيء مانح (تمت مراجعته في Silva et al. ، 2011). تم عرض تحرير الجينوم بوساطة Meganuclease في الذرة (زيا ميس) والتبغ (نيكوتيانا spp.) (تمت المراجعة في Baltes and Voytas ، 2014). من الصعب تغيير خصوصية التسلسل المستهدف للنيوكليازات الضخمة ، لذا فهي لا تُستخدم على نطاق واسع لتحرير الجينوم.

ترتبط البروتينات المحتوية على أصابع الزنك و ndashdomain بالحمض النووي وهي منتشرة في الطبيعة ، وغالبًا ما تعمل كعوامل نسخ (بروتينات تنظم التعبير الجيني عن طريق الارتباط بشكل مباشر أو غير مباشر بتسلسل الحمض النووي التنظيمي الموجود عادة في مناطق المحفز للجينات 3). يمكن التلاعب بمجالات أصابع الزنك لربط تسلسلات معينة من الحمض النووي عند دمجها في مجال نوكلياز قطع الحمض النووي لبروتين FokI ، فإن ZFN هو الجزيء الهجين الناتج. زوج من ZFNs يعمل بالترادف

3 أمثلة على الهندسة الوراثية باستخدام عوامل النسخ معطاة في الفصل 8.

الشكل 7-1 عواقب انقسام الحمض النووي عن طريق تقنيات تحرير الجينوم في الخلية.
المصدر: Sander and Joung (2014).
ملحوظة: بعد انقسام الحمض النووي مزدوج السلسلة بواسطة نوكليازات خاصة بالتسلسل مثل الميغانوكلياز ، وأصابع الزنك ، والمؤثرات الشبيهة بمنشط النسخ ، وتكرارات متناظرة متباعدة بشكل منتظم / Cas9 (يمثلها صاعقة البرق) ، ينكسر الشريط المزدوج في يمكن إصلاح جزيء الحمض النووي من خلال آليات الانضمام الأصلية غير المتجانسة (NHEJ) للخلية ، مما يؤدي إلى تغيير تسلسل الحمض النووي إما بحذف (خط أحمر منقط) أو إدخال (خط أخضر متصل). إذا تم توفير قالب DNA للمانح (انظر جزء الحمض النووي الأزرق) ، فإن آليات الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) داخل الخلية ستدرج جزيء المتبرع في الموضع ، وهذا يؤدي إلى تعديل الجين أو المنطقة المستهدفة (المنطقة الزرقاء مع a إدخال أو تعديل دقيق).

لقطع الحمض النووي في الموقع المستهدف المطلوب (تمت المراجعة في Urnov et al. ، 2010). كما هو الحال مع meganucleases ، يتم استخدام ZFNs لإدخال الطفرات من خلال NHEJ و HDR. تم استخدام ZFNs في هندسة العديد من أنواع النباتات (تمت المراجعة في Baltes and Voytas ، 2014). كانت ZFNs أول أداة مصممة على نطاق واسع لتعديل الجينوم في علم الأحياء.

تم اكتشاف مؤثرات تشبه المنشط (TALEs) في مسببات الأمراض النباتية البكتيرية زانثوموناس ويمكن هندستها لربط أي تسلسل DNA تقريبًا. أحدثت سهولة تصميمها لتسلسل الحمض النووي المستهدف ثورة في تحرير الجينوم. في الطبيعة، زانثوموناس تفرز الأنواع TALEs في الخلايا النباتية لتمكين الإمراضية. ترتبط TALEs بالمحفزات في جينات النبات لقمع مقاومة النبات ومقاومة rsquos للعوامل الممرضة. تقوم البكتيريا بتشفير TALEs من خلال رمز بسيط أو تشفير

الشكل 7-2 تقنيات تحرير الجينوم: Meganucleases ، و nucleases zinc finger nucleases (ZFNs) ، و nucleases المستجيب الشبيه بمنشط النسخ (TALENs) ، والتكرارات المتجانسة المنتظمة المتباعدة (CRISPR) / Cas.
المصدر: Baltes and Voytas (2014).

تم استغلالها لهندسة بروتينات ذات خصوصية موقع مخصصة في أي جينوم مستهدف (Boch et al.، 2009 Moscou and Bogdanove، 2009). مثل ZFNs ، يمكن دمج TALEs مع مجال نوكلياز FokI ثم يشار إليها باسم TALENs. يتم استخدام TALENs في أزواج مثل ZFNs للتأثير على الطفرات المستهدفة. تم استخدام TALENs لتحرير الجينوم في العديد من النباتات ، بما في ذلك الأرز (اوريزا spp.) والذرة والقمح (تريتيكوم spp.) وفول الصويا (جلايسين ماكس) (تمت المراجعة في Baltes and Voytas ، 2014).

كانت CRISPR هي أحدث أداة تم تطويرها لتعديل الجينوم عند كتابة تقرير اللجنة و rsquos. تؤوي البكتيريا كريسبر كآلية دفاع فطرية ضد الفيروسات والبلازميدات التي تستخدم نوكليازات موجهة من الحمض النووي الريبي لاستهداف انشقاق تسلسلات الحمض النووي الغريبة. في الوقت الذي كانت تتم فيه كتابة تقرير اللجنة و rsquos ، كان نظام CRISPR / Cas المستخدم في تحرير الجينوم هو النوع الثاني CRISPR / Cas9 ، من الأبراج العقدية، حيث يتم دمج تسلسلات الحمض النووي الأجنبية بين التسلسلات المتكررة في موضع CRISPR ثم نسخها إلى جزيء RNA المعروف باسم crRNA (راجعه Sander and Joung ، 2014). ثم يتم تهجين الـ crRNA مع الحمض النووي الريبي الثاني ، وهو tracrRNA ، ويرتبط المركب بنوكلياز Cas9. يوجه crRNA المركب إلى الحمض النووي المستهدف ، وفي حالة المناعة الفطرية للبكتيريا ، فإنه يرتبط بالتسلسل التكميلي في الحمض النووي المستهدف الذي يتم بعد ذلك شقّه بواسطة نوكلياز Cas9. قام العلماء بتشريح نظام CRISPR / Cas9 الفطري وأعادوا تصميمه بطريقة تتطلب وجود RNA واحد ، وهو الدليل RNA ، من أجل الانقسام بوساطة Cas9 للتسلسل المستهدف في الجينوم. تقتصر متطلبات تصميم الدليل RNA على تسلسل فريد من حوالي 20 نيوكليوتيد في الجينوم (لمنع التأثيرات خارج الهدف) وهي مقيدة بالقرب من تسلسل الحافز المجاور لـ protospacer ، وهو خاص بنظام CRISPR / Cas. تتضمن التطبيقات الأحدث لـ CRISPR استخدام اثنين من الحمض النووي الريبي (RNAs) الفريدين مع نوكلياز معدل والذي & ldquonicks & rdquo حبلا واحدًا من الحمض النووي ، مما يوفر خصوصية أكبر لعمليات الحذف المستهدفة. أدت سهولة التصميم وخصوصية دليل RNA وبساطة نظام CRISPR / Cas9 إلى إظهار سريع لفائدة هذه الطريقة في تحرير الجينوم في النباتات والكائنات الأخرى (تمت المراجعة في Baltes and Voytas ، 2014). يتغير تحرير الجينوم ، وخاصة كريسبر ، بسرعة. في الوقت الذي كانت تتم فيه كتابة تقرير اللجنة و rsquos ، تم وصف نوكلياز غير Cas9 (على سبيل المثال ، Cpf1) مؤخرًا لتحرير جينوم CRISPR (Zetsche et al. ، 2015).

عندما كانت اللجنة تكتب تقريرها ، تم استخدام تطبيقات SSN في تحرير الجينوم في الغالب لإدخال طفرات في الموقع المستهدف من خلال NHEJ لإنتاج الضربات الجينية. كما هو مبين في الشكل 7-1 ، يمكن أيضًا استخدام نوكلياز لاستبدال التسلسل عبر HDR (أو ربما NHEJ) إذا تم إدخال DNA المتبرع بشكل مشترك في الخلية. يمكن استخدام أنواع متعددة من الجزيئات المانحة. أولاً ، يمكن إدخال أليل بديل للموضع المستهدف بطريقة تجعل الجين المعدل يشفر بروتينًا يمنح سمة جديدة أو محسّنة. على سبيل المثال ، يمكن أن يمنح تعديل نيوكليوتيد مفرد معين في جين أسيتولاكتات سينسيز (ALS) مقاومة لمبيدات الأعشاب التي تستخدم تثبيط ALS كطريقة عملها (Jander et al. ، 2003). ثانيًا ، يمكن استخدام إعادة التركيب المتماثل لإدخال تسلسل جديد في هذا المكان. إن إدخال الجينوم هذا & ldquoprecision & rdquo عن طريق هندسة موقع الهبوط من شأنه القضاء على الإدراج شبه العشوائي للجينات المحورة في الأجرعيةطرق التحول بوساطة والجينات بوساطة بندقية. سيسمح أيضًا بدمج المعدل أو

الجينات المعدلة في موضع واحد ، تسمى منصات الهبوط ldquotrait & rdquo في الجينوم بدلاً من الجينوم بشكل عشوائي ، لذلك سيكون من الأسهل إضافة سمات جديدة إلى محصول GE المرتبط ماديًا في الجينوم (Ainley et al. ، 2013 ). ستمكّن هذه الاستراتيجية أيضًا من إزالة الجينات المُدخلة عند الرغبة.

يمكن إجراء تحرير الجينوم عبر كريسبر وتقنيات أخرى في النباتات عن طريق التعبير العابر للجينات المحورة (Clasen et al. ، 2016) أو بدون الحمض النووي الخارجي على الإطلاق (Woo et al. ، 2015) مما يؤدي إلى نباتات جنرال إلكتريك تفتقر إلى الجينات المحورة. كلاسين وآخرون. (2016) استخدم زوج TALEN المشفر وراثيًا لإنتاج طفرات معينة في بروتوبلاستس البطاطس. احتوت نباتات البطاطس المستعادة من البروتوبلاست مع أليلات مستهدفة متحولة على سمة جودة جديدة ، ولم تحتوي سبعة من خطوط GE الـ 18 على أي تركيبات TALEN المتحولة في جينوم البطاطس. وو وآخرون. (2015) المستخدمة في المختبر و ndashtranslated Cas9 بروتين مقترن لتوجيه RNA لتحور الجينات في أرابيدوبسيس، والتبغ ، والخس ، والأرز بروتوبلاستس ، والتي تم انتشال النباتات الطافرة منها. وبالتالي ، يبدو أنه يمكن إجراء تحرير الجينوم في المحاصيل دون ترك أي أثر للحمض النووي المعدل وراثيًا في الجينوم. في حالة عدم وجود أي طفرات خارج الهدف ، وهو ما يتضح من التسلسل العميق المستهدف في تجربة البطاطس (Woo et al. ، 2015) ، فإن كواشف تحرير الجينوم 4 التي لا تترك جينًا متحورًا في الجينوم قد تبدو قيمة. نهج تربية المحاصيل.

تركز الأمثلة المذكورة أعلاه على استخدام SSNs لشق الحمض النووي وإدخال تغييرات دائمة في تسلسل الحمض النووي المزدوج الشريطة من خلال NHEJ أو HDR. ومع ذلك ، هناك تطبيقات أخرى يمكن من خلالها استغلال البروتينات التي ترتبط بالحمض النووي بطريقة محددة التسلسل لتعديل الجينات ونشاط الجينات. وهي تشمل اندماج ميزات ربط الحمض النووي لبروتينات أصابع الزنك (ZFP) أو TALEs لتنشيط المجالات لإنتاج منشطات النسخ الاصطناعية. بدون اندماج المنشط ، يمكن استخدام ZFPs أو TALEs كمثبطات نسخ. تتيح ميزات تصميم ZFPs و TALEs إنتاج عوامل النسخ الاصطناعية (TFs) لتنظيم التعبير عن أي جين مستهدف عمليًا (الشكل 7-3). في الواقع ، تم استخدام TALE-TFs جنبًا إلى جنب لإنتاج تنشيط الجينات المضافة في النباتات المعدلة وراثيًا (Liu et al. ، 2014). بالنسبة لنظام CRISPR / Cas9 ، يمكن دمج مجموعة من الجزيئات مع نوكلياز Cas9 غير نشط تحفيزيًا (dCas9) للسماح بمجموعة واسعة من التعديلات على تنظيم الجينات ، والمعروفة باسم تداخل CRISPR (تمت مراجعته في Doudna و Charpentier ، 2014 الشكل 7- 3). ربما يكون أبسط تطبيق هو اندماج dCas9 في منشط النسخ أو مثبط النسخ عند إدخاله في خلية باستخدام دليل RNA ، يمكن لمنشط النسخ أو القامع تعديل عدد النصوص

4 يُشار إلى نوكليازات التي تم تخصيصها لاستهداف تسلسل معين على أنها كواشف.

من الجين المستهدف بطريقة مشابهة لـ ZFPs و TALEs. يمكن دمج جينات dCas9 مع جينات تعديل الكروماتين وتوجيهها إلى منطقة مستهدفة بواسطة دليل RNA لتعديل الحالة اللاجينية للموضع وبالتالي التأثير على النسخ (Doudna and Charpentier ، 2014).

الاستنتاج: استغلال العمليات البيولوجية المتأصلة وبروتينات إصبع الزنك المرتبطة بـ mdashDNA (ZFNs) ، والنسخ الموجه لمسببات الأمراض للجينات المضيفة (TALEs) ، والتدهور المستهدف لتسلسل الحمض النووي (CRISPR / Cas) و mdashnow يسمح بمعالجة دقيقة ومتعددة للحمض النووي في النباتات.

الكروموسومات الاصطناعية والاصطناعية

لن تؤدي زيادة المعرفة بالعمليات البيولوجية وأدوات البيولوجيا الجزيئية المتقدمة إلى تسهيل هندسة جينات متعددة في النباتات فحسب ، بل ستجعل من الممكن أيضًا إدخال مسارات أو عمليات كيميائية حيوية كاملة ومبتكرة. كانت تراكيب الحمض النووي المستخدمة في الهندسة الوراثية النباتية صغيرة (أقل من 20 و ndash40 كيلو قاعدة) واستخدمت تقنيات الاستنساخ الجزيئي التقليدية البطيئة والشاقة. ومع ذلك ، فقد تم تطوير طرق جديدة وغير مكلفة لتوليف جزيئات الحمض النووي وتجميعها في جزيئات أكبر من الحمض النووي. تسمح الطرق ببناء سريع وسهل لمسارات متعددة الجينات على جزيء DNA واحد (للمراجعة ، انظر Ellis et al. ، 2011). تم إثبات جدوى التقنيات من خلال تخليق جينوم بكتيري كامل (Gibson et al. ، 2010) وإنشاء كروموسوم خميرة اصطناعي (Annaluru et al. ، 2014). يود الباحثون أن يكونوا قادرين على إدخال عشرات إلى مئات الجينات في النباتات. تتمثل إحدى الطرق المتوخاة لتحقيق مثل هذه التطورات في استخدام الكروموسومات المصطنعة أو الكروموسومات الاصطناعية. الكروموسوم المصطنع هو كروموسوم يضاف إلى النبات و rsquos مركب طبيعي من الكروموسومات في النواة. الكروموسوم الاصطناعي (Annaluru et al. ، 2014) هو توليفة كاملة من الحمض النووي لاستبدال كروموسوم طبيعي أو حتى جينوم عضوي كامل ، مثل جينوم البلاستوم.

تسمح الكروموسومات والجينومات الاصطناعية أو الاصطناعية بتجميع عدد كبير من الجينات في جزيء ذاتي التكاثر. في حقيقيات النوى ، الكروموسومات عبارة عن جزيئات DNA خطية مع التسلسل المناسب للتكرار (أصول النسخ المتماثل) ، والسلامة (التيلوميرات) ، والفصل في الخلايا المنقسمة (السنتروميرات). سيسمح استخدام الكروموسومات الاصطناعية أو الاصطناعية بإدخال الجينات في النباتات بطريقة لا تنطوي على إمكانية تعطيل الجينات الموجودة في الكروموسومات النباتية الأصلية في مواقع الإدخال.

لم يتم إنشاء كروموسومات أو جينومات اصطناعية في النباتات ، ولكن الطرق المستخدمة لصنع كروموسوم خميرة اصطناعي (Annaluru et

الشكل 7-3 الاستخدامات البديلة لتقنيات تحرير الجينوم.
المصدر: رسم توضيحي مقدم من C.R Buell.
ملاحظة: يمكن دمج A ، إصبع الزنك أو المستجيب الشبيه بمنشط النسخ (TALE) (الأزرق) في المنشط النسخي (الأخضر) لزيادة نسخ الجين محل الاهتمام. يمكن دمج B أو إصبع الزنك أو TALE (الأزرق) في مثبط نسخي (أحمر) لمنع نسخ الجين محل الاهتمام. C ، يمكن دمج نوكلياز Cas9 غير النشط تحفيزيًا (أرجواني) في منشط نسخي (أخضر) ، وفي وجود دليل RNA (برتقالي وأصفر) ، يوجه المركب إلى محفز الجين المعني ويزيد نسخ الجين المستهدف. D ، A تحفيزيًا

الشكل 7-3 واصلت

يمكن دمج نوكلياز Cas9 غير النشط (أرجواني) في مثبط نسخي (أحمر) ، وفي وجود دليل RNA (برتقالي وأصفر) ، يوجه المركب إلى محفز الجين المعني ويقلل نسخ الجين المستهدف. E ، يمكن دمج نوكلياز Cas9 غير الفعال حفزيًا (أرجواني) مع إنزيم ميثيل الحمض النووي ، وفي وجود دليل RNA (برتقالي وأصفر) ، يوجه المركب إلى محفز الجين المعني ، ويستهدف هذا الجين من أجل المثيلة ، ونتيجة لذلك ، قمع النسخ.

، 2014) قابلة للتحويل إلى النباتات. تم استبدال كروموسوم الخميرة الثالث ، والذي يتكون من 316.617 قاعدة ، بصبغي مختبري مكون من 272871 قاعدة. يمكن تصنيع جينوم البلاستيدات الخضراء ، الذي يبلغ حجمه من نصف إلى ثلث حجم كروموسوم الخميرة الثالث ، وإدخاله في نبات ، مثل التبغ ، قابل بالفعل للتحول الجسيمي. تستمر تكلفة تخليق الحمض النووي في الانخفاض ، لذا فإن التطوير التجريبي في هذا المجال سيكون مجديًا اقتصاديًا.

اتخذت الأبحاث حول الكروموسومات المصطنعة للنباتات عمومًا نهجين (تمت المراجعة في Gaeta et al. ، 2012 Birchler ، 2015). في نهج & ldquobottom-up & rdquo ، تم تجميع الأجزاء الرئيسية للكروموسوم و mdashs مثل السنترومير والتيلومير وأصل النسخ المتماثل والجينات ذات الأهمية و mdashare ، وينتج عن ذلك صغر كروموسوم de novo الصغير. على الرغم من إحراز تقدم في هذا النهج ، إلا أن الخصائص الإضافية ، مثل التعديل الوراثي لنيوكليوتيدات الحمض النووي ، يمكن أن تؤثر على التعبير الجيني (انظر أدناه) وقدرة الكروموسوم الصغير على التكاثر في الخلية وقد حالت دون استخدام هذا النهج بشكل روتيني. يستخدم نهج & ldquotop-down & rdquo أساسًا الكروموسومات الموجودة و mdas لتقريب نهج كروموسوم الخميرة الاصطناعية و mdash لبناء كروموسوم صناعي باستخدام قالب موجود. أدى هذا النهج إلى انتقال الكروموسوم الصغير من خلال الانقسام الاختزالي ولكن ليس بكفاءة مثل تلك الخاصة بالكروموسومات الأصلية. لم يؤد أي من النهجين إلى وجود ميني كروموسومات قابلة للنشر عمليًا. وبالتالي ، فإن استخدام نهج تركيبي لاستبدال الحمض النووي بشكل منهجي ، على غرار النهج المتبع في مشروع الخميرة ، قد يكون ممكنًا في المستقبل (بيرشلر ، 2015). قد يكون من الممكن أيضًا أن تعمل المقاربات التصاعدية أو التنازلية الحالية في المحاصيل المستنسخة ، مثل البطاطس ، نظرًا لأن الانقسام الاختزالي غير مطلوب (بيرشلر ، 2015).

من خلال قاعدة معرفية قوية للجينات الكامنة وراء الكيمياء الحيوية للنبات ، يمكن تصنيع التركيبات الدقيقة في المختبر وإدخالها في الأنواع غير المتجانسة من خلال الأجرعيةبوساطة أو تحويل جيني بوساطة بندقية أو إدخال يستهدف نوكلياز في موقع واحد محدد. على سبيل المثال ، الشيح الحلو (شيح أنوا) ينتج مادة الأرتيميسينين ، وهو مركب مضاد للملاريا. مع خمسة جينات من الخميرة ومن أ. annua، تم تصميم التبغ لتصنيع مادة الأرتيميسينين (فارهي وآخرون ، 2011). على الرغم من أن إنتاج مادة الأرتيميسينين في التبغ كان أقل من ذلك في أ. annua، أثبتت دراسة إثبات المفهوم هذه جدوى هندسة مسارات التخليق الحيوي غير المتجانسة في النباتات. مع مزيد من التنقيح للمحفزات ، وتحسين فهم تقسيم المستقلبات ونقلها وتدفقها في الخلايا والأنسجة ، وتطوير نواقل مثل الكروموسومات الاصطناعية القادرة على نقل أجزاء كبيرة من الحمض النووي إلى الخلايا النباتية ، والهندسة الوراثية للنباتات لصفات معقدة ، مثل غير المتجانسة أو مسارات كيميائية حيوية جديدة ، وفيزيولوجي متخصص

والعمليات التنموية ، مثل التمثيل الضوئي لـ C4 ، قد تكون ممكنة (انظر الفصل 8 للحصول على التفاصيل).

تعديلات جينية مستهدفة

كما هو موضح سابقًا في هذا الفصل ، يمكن أن تنتج التغييرات المستقرة نسبيًا والقابلة للوراثة في التعبير عن جينات معينة من التغيرات في الإبيجينوم. من المرجح أن تؤدي التغييرات في مثيلة الحمض النووي على وجه الخصوص إلى تغييرات وراثية في التعبير الجيني في النباتات. مع زيادة فهم الكيمياء الحيوية للأنظمة التي تغير أنماط مثيلة الحمض النووي ، تزداد أيضًا القدرة على استهداف جينات معينة من أجل التعديلات اللاجينية. قد يتضمن هذا الاستهداف التعبير عن البروتينات وربما أيضًا الأحماض النووية المحددة (على سبيل المثال ، RNA الإرشادي) التي من شأنها توجيه مثيلة الحمض النووي إلى موضع معين. يمكن إزالة نظام الاستهداف بعد إنجاز التعديل الوراثي المتوالي و [مدش] على سبيل المثال ، باستخدام تربية نباتية تقليدية لفصل نظام الاستهداف.

فيما يتعلق بالقضية الرئيسية للسلامة ، فإن تغيير التعديلات اللاجينية لجينات نباتية معينة لا يمثل أي مشاكل أساسية لأن جينومات النباتات مليئة بالتعديلات اللاجينية ، والحمض النووي المعدل وراثيًا موجود في البيئة ويستهلكه البشر منذ آلاف السنين. وبالتالي ، فإن مسألة السلامة هي نفسها التي تنطوي عليها أي تقنية ، سواء كانت هندسة وراثية أو هندسة غير وراثية ، تؤدي إلى زيادة أو نقصان في التعبير عن جينات معينة في النبات وفي تعديلات السمات المحددة.

تجدر الإشارة إلى أنه بالإضافة إلى الأساليب المستهدفة ، هناك عدة طرق لتغيير الإيبيجينوم للنبات على نطاق واسع وعشوائي ، مثل الإفراط في التعبير عن إنزيم يغير مثيلة الحمض النووي. بالطبع ، الأساليب الواسعة والعشوائية لتغيير جينوم النبات ليست جديدة: الطفرات هي طريقة واسعة وعشوائية لتعديل الجينوم. فائدة الأساليب الواسعة والعشوائية لتعديل الجينوم أو الإيبيجينوم هي أنه إذا كانت الكيمياء الحيوية أو الجينات لعملية ما غير مفهومة بشكل كافٍ للسماح بنهج مستهدف و mdash سواء كان أسلوب الهندسة الوراثية أو نهج الهندسة الوراثية (مثل التربية بمساعدة الواسمات) و mdasha قد يؤدي النهج العشوائي إلى نتيجة مرغوبة.كما نوقش أعلاه ، ستؤدي الأساليب الواسعة والعشوائية إلى تغييرات غير معروفة أكثر من الأساليب المستهدفة.

الاتساق هو عادة سمة مرغوبة لأنواع النباتات الجديدة. بالنظر إلى أن التغييرات الوراثية اللاجينية يمكن أن تعود إلى الحالة الأولية عند ترددات متنوعة ، فقد لا يكون التعديل اللاجيني نهجًا مثاليًا لإنتاج أنواع نباتية جديدة. ومع ذلك ، إذا كان صنف نباتي جديد مشتق من تغيير وراثي فوق جيني متفوقًا على البدائل المستقرة ، فإن احتمالية درجة معينة من الارتداد قد لا تكون عقبة أمام التسويق.


تتطلب شيخوخة الأوراق التي يسببها تقدم العمر والظلام عوامل نسخ bHLH PIF3 و 4 و 5

يمكن تحفيز شيخوخة الأوراق وتعزيزها من خلال عدد كبير من العوامل التنموية والبيئية. اقترحت العديد من الأدلة تورط فيتوكرومات في تنظيم شيخوخة الأوراق ، لكن مسارات الإشارات والآليات الفسيولوجية ذات الصلة غير مفهومة جيدًا. في هذه الدراسة ، حددنا في البداية العوامل المتفاعلة مع الفيتوكروم (PIFs) 3 و 4 و 5 كوسيط مفترض لشيخوخة الأوراق. أدت الطفرات في جينات PIF إلى إطالة عمر الأوراق بشكل كبير في الشيخوخة التي يسببها العمر والظلام ، في حين أن الإفراط في التعبير عن هذه الجينات أدى إلى تسريع الشيخوخة الناتجة عن الشيخوخة والظلام في الأرابيدوبسيس. على الدوام ، أدى فقدان وظيفة PIF4 إلى إضعاف التغييرات النسخية التي يسببها الظلام المرتبطة بتدهور البلاستيدات الخضراء وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). أظهرت فحوصات ChIP-PCR و Dual-Luciferase أن PIF4 يمكن أن ينشط الجين التنظيمي لتدهور الكلوروفيل NYE1 وقمع الجين المعين لنشاط البلاستيدات الخضراء GLK2 من خلال الارتباط بمناطق المروج. أخيرًا ، تم تخفيف كل من التخليق الحيوي للإيثيلين الناجم عن الظلام والشيخوخة التي يسببها الإيثيلين في pif4 ، مما يشير إلى مشاركة PIF4 في كل من التخليق الحيوي للإيثيلين ومسار الإشارة. تقدم دراستنا دليلًا على أن PIF3 و 4 و 5 هم وسطاء شيخوخة إيجابية جديدة وتكتسب نظرة ثاقبة على آلية إشارات الضوء المشاركة في تنظيم شيخوخة الأوراق.

الكلمات الدالة: GLK2 NYE1 / SGR1 تدهور الإيثيلين بالبلاستيدات الخضراء. عامل تفاعل فيتوكروم لشيخوخة الأوراق (PIF).

© المؤلف 2014. تم النشر بواسطة مطبعة جامعة أكسفورد نيابة عن CSPB و IPPE و SIBS و CAS.

الأرقام

تعزز PIF3 و 4 و 5 شيخوخة الأوراق التي يسببها العمر والظلام. (أ) الأنماط الظاهرية لـ ...

تحليل النسخ بيف 4 متحولة ...

تحليل النسخ بيف 4 متحولة. (أ) تمثيلات Box-plot لـ 791 شيخوخة منظمة و ...

PIF4 ينظم بشكل سلبي نشاط البلاستيدات الخضراء ...

ينظم PIF4 بشكل سلبي نشاط البلاستيدات الخضراء. (أ) التعبيرات النسبية ل NYE1 , GLK1 ,…

ينظم PIF4 كلا من التخليق الحيوي للإيثيلين ...

ينظم PIF4 كلا من التخليق الحيوي للإيثيلين والتشوير. (أ) التعبيرات النسبية ل ACS2 ,…


أفضل 4 تطبيقات للهندسة الوراثية

توضح النقاط التالية أهم أربعة تطبيقات للهندسة الوراثية. التطبيقات هي: 1. التطبيق في الزراعة 2. التطبيق على الطب 3. إنتاج الطاقة 4. التطبيق على الصناعات.

الهندسة الوراثية: التطبيق رقم 1. التطبيق في الزراعة:

من التطبيقات المهمة لتقنية الحمض النووي المؤتلف تغيير النمط الجيني لنباتات المحاصيل لجعلها أكثر إنتاجية وتغذية وغنية بالبروتينات ومقاومة للأمراض وأقل استهلاكًا للأسمدة. يمكن لتقنية الحمض النووي المؤتلف وتقنيات زراعة الأنسجة أن تنتج حبوبًا وبقولًا ومحاصيل نباتية عالية الغلة.

تمت برمجة بعض النباتات وراثيًا لإنتاج حبوب عالية البروتين يمكن أن تظهر مقاومة للحرارة والرطوبة والأمراض.

قد تقوم بعض النباتات بتطوير الأسمدة الخاصة بها ، وقد تم تحويل بعضها وراثيًا لصنع مبيدات حشرية خاصة بها. من خلال الهندسة الوراثية ، تم إنتاج بعض الأصناف التي يمكنها إصلاح النيتروجين في الغلاف الجوي بشكل مباشر وبالتالي لا يوجد اعتماد على الأسمدة.

طور العلماء بذور البطاطس المعدلة وراثيا ، والتبغ ، والقطن ، والذرة ، والفراولة ، وبذور الاغتصاب المقاومة للآفات الحشرية وبعض مبيدات الأعشاب الضارة.

تنتج بكتيريا Bacillus thurenginesis بروتينًا سامًا للحشرات. باستخدام تقنيات الهندسة الوراثية ، تم عزل الترميز الجيني لهذا البروتين السام المسمى جين Bt من البكتيريا وتم هندسته في نباتات الطماطم والتبغ. أظهرت مثل هذه النباتات المعدلة وراثيًا ديدان قرن التبغ وديدان فاكهة الطماطم. هذه الأنماط الجينية تنتظر إطلاقها في الولايات المتحدة الأمريكية.

هناك بعض أنواع مبيدات الأعشاب التي تم تطويرها وراثيًا والتي لا تقتصر على الحشائش وحدها ولكنها تقتل المحاصيل المفيدة أيضًا. الغليفوسات هو مبيد حشائش شائع الاستخدام والذي يثبط ببساطة إنزيمًا أساسيًا معينًا في الأعشاب ونباتات المحاصيل الأخرى. يوجد جين مستهدف من الغليفوسات في بكتيريا السالمونيلا تيفيموريوم. تقاوم طفرة S. typhimurium الغليفوسات.

تم استنساخ الجين المتحور t إلى E. coli ثم إعادة تربيته إلى Agrobacterium tumifaciens من خلال Ti Plasmid. أدت إصابة النباتات ببلازميد Ti المحتوي على الجين المقاوم للجليفوسات إلى إنتاج محاصيل مثل القطن وذرة التباكو ، وكلها مقاومة للغليفوسات.

هذا يجعل من الممكن رش حقول المحاصيل بالغليفوسات الذي سيقتل الحشائش فقط وتبقى المحاصيل المعدلة وراثيًا ذات الجينات المقاومة غير متأثرة.

قامت شركة Calogene مؤخرًا ، وهي شركة تكنولوجيا حيوية ، بعزل الجين البكتيري الذي يزيل سموم الآثار الجانبية لمبيدات الأعشاب. تم تطوير نباتات التبغ المعدلة وراثيًا المقاومة لفيروس الفسيفساء T MV والطماطم المقاومة لفيروس الفسيفساء الذهبي عن طريق نقل جينات بروتين غلاف الفيروس - النباتات الحساسة. هذه لم يتم الافراج عنهم بعد.

يمكن أن تلعب تقنية نقل الجينات أيضًا دورًا مهمًا في إنتاج مجموعة متنوعة جديدة ومحسنة من أشجار الأخشاب.

تم إنتاج العديد من أنواع الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن أن تحلل المواد الكيميائية السامة ويمكن استخدامها لقتل مسببات الأمراض الضارة والآفات الحشرية.

لاستخدام تقنيات الهندسة الوراثية لنقل الجينات الأجنبية إلى الخلايا النباتية المضيفة ، تم بالفعل استنساخ عدد من الجينات وأصبحت الآن مكتبات كاملة من DNA و mt DNA للبازلاء معروفة الآن.

تتضمن بعض الجينات المستنسخة ما يلي:

(ط) جينات الطورولين من الفاصوليا الفرنسية ،

(2) قليل من الهيموغلوبين في أرجل الفرجولين لفول الصويا ،

(3) جينات الوحدة الفرعية الصغيرة RUBP carboxylase من البازلاء ، و i جينات لتخزين البروتين في بعض الحبوب.

يتم بذل الجهود لتحسين العديد من المحاصيل الزراعية باستخدام تقنيات الهندسة الوراثية المختلفة والتي تشمل:

(ط) نقل جينات تثبيت النيتروجين (جينات nif) من النباتات البقولية إلى الحبوب.

(2) نقل المقاومة ضد مسببات الأمراض والآفات من النباتات البرية إلى نباتات المحاصيل.

(3) تحسين نوعية وكمية بروتينات البذور.

(4) نقل الجينات للبروتينات الحيوانية إلى نباتات المحاصيل.

(5) القضاء على الجينات غير المرغوب فيها للتأثر بأمراض مختلفة من السلالات المعقمة للذكور السيتوبلازمية في المحاصيل مثل الذرة ، حيث يوجد عقم الذكور السيتوبلازمي وقابليتهم للإصابة في بلازميد الميتوكوندريا.

(6) تحسين كفاءة التمثيل الضوئي عن طريق إعادة تجميع الجينات النووية والبلاستيدات الخضراء والتحويل المحتمل لـ C3 النباتات في C.4 النباتات.

(7) تطوير خطوط الخلايا التي قد تنتج طعامًا مغذيًا في المفاعلات الحيوية.

الهندسة الوراثية: التطبيق # 2. التطبيق على الطب:

اكتسبت الهندسة الوراثية أهمية على مدى السنوات القليلة الماضية وستصبح أكثر أهمية في القرن الحالي حيث أصبحت الأمراض الوراثية أكثر انتشارًا وتناقصت المساحة الزراعية. تلعب الهندسة الوراثية دورًا مهمًا في إنتاج الأدوية.

يتم الآن التلاعب بالكائنات الحية الدقيقة والمواد ذات الأصل النباتي لإنتاج كمية كبيرة من الأدوية واللقاحات والإنزيمات والهرمونات المفيدة بتكلفة منخفضة. تهتم الهندسة الوراثية بالدراسة (النمط الوراثي للأمراض في الإنسان ومجموعة الجينات البشرية التي يمكن أن توفر خريطة كاملة لوراثة الأفراد الأصحاء.

ربما يكون العلاج الجيني الذي يمكن بواسطته إدخال الجينات السليمة مباشرة إلى شخص يعاني من خلل في الجينات هو الجانب الأكثر ثورية والأكثر واعدة في الهندسة الوراثية. تمت الموافقة على استخدام العلاج الجيني في أكثر من 400 تجربة سريرية لأمراض مثل انتفاخ الرئة بالألياف الكيسية ، وضمور العضلات ، ونقص الأدينوزين ديميناز.

قد يتم استغلال العلاج الجيني يومًا ما لعلاج الأمراض البشرية الوراثية مثل الهيموفيليا والتليف الكيسي التي تسببها الجينات المفقودة أو المعيبة. في أحد أنواع العلاج الجيني ، يتم إدخال جينات وظيفية جديدة بواسطة فيروسات معدلة وراثيًا إلى خلايا الأشخاص غير القادرين على إنتاج هرمونات أو بروتينات معينة لوظائف الجسم الطبيعية.

يؤدي إدخال جينات جديدة إلى كائن حي من خلال تقنية الحمض النووي المؤتلف بشكل أساسي إلى تغيير تركيبة البروتين وأخيراً خصائص الجسم.

تستخدم تقنية الحمض النووي المؤتلف أيضًا في إنتاج لقاحات ضد الأمراض. يحتوي اللقاح على شكل من أشكال الكائنات الحية المعدية التي لا تسبب مرضًا شديدًا ولكنها تسبب في قيام الجهاز المناعي للجسم بتكوين أجسام مضادة واقية ضد الكائنات الحية المعدية. يتم تحضير اللقاحات عن طريق عزل المستضد أو البروتين الموجود على سطح الجزيئات الفيروسية.

عندما يتم تطعيم الشخص ضد مرض فيروسي ، تنتج المستضدات أجسامًا مضادة تعمل ضد البروتينات الفيروسية وتعطلها. باستخدام تقنية الحمض النووي المؤتلف ، تمكن العلماء من نقل جينات بعض بروتينات الغمد الفيروسي إلى فيروس اللقاح الذي تم استخدامه ضد الجدري الصغير.

اللقاحات التي ينتجها الاستنساخ الجيني خالية من التلوث وآمنة لأنها تحتوي فقط على بروتينات الغلاف التي تصنع الأجسام المضادة ضدها. يتم إنتاج عدد قليل من اللقاحات عن طريق استنساخ الجينات ، على سبيل المثال ، لقاحات ضد التهاب الكبد الفيروسي ، وفيروس الهربس البسيط ، ومرض الحمى القلاعية الذي يسببه الفيروس في الحيوانات.

حتى وقت قريب ، كان هرمون الأنسولين يُستخرج بكميات محدودة فقط من بنكرياس الأبقار والخنازير. لم تكن العملية مكلفة فحسب ، بل تسبب الهرمون أحيانًا في حدوث ردود فعل تحسسية لدى بعض مرضى السكري.

بدأ الإنتاج التجاري للأنسولين في عام 1982 من خلال تقنية الحمض النووي الوراثي أو المؤتلف وتمت الموافقة على الاستخدام الطبي لهرمون الأنسولين من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) بالولايات المتحدة الأمريكية في عام 1982.

تم استنساخ جين الأنسولين البشري بكميات كبيرة في بكتيريا E. coli التي يمكن استخدامها لتخليق الأنسولين. الأنسولين المعدل وراثيًا متوفر تجارياً على شكل هوميلين.

Lymphokines هي بروتينات تنظم جهاز المناعة في جسم الإنسان ، α -Interferon هو أحد الأمثلة. يستخدم الإنترفيرون لمكافحة الأمراض الفيروسية مثل التهاب الكبد والهربس ونزلات البرد وكذلك السرطان. يمكن تصنيع هذه الأدوية في خلايا بكتيرية بكميات كبيرة.

يمكن أن تكون اللمفوكينات مفيدة أيضًا لمرضى الإيدز. الإنترلوكين II المعدل وراثيًا ، وهو مادة تحفز تكاثر الخلايا الليمفاوية ، وهو متاح أيضًا ويتم اختباره حاليًا على مرضى الإيدز.

تم الحصول على أربعة عشر هرمون عديد الببتيد الأميني تم تصنيعه بواسطة ما تحت المهاد بكمية صغيرة فقط من جثث بشرية. يبدو أن السوماتوستاتين المستخدم كدواء لبعض التشوهات المرتبطة بالنمو يكون خاصًا بنوع معين ، كما أن عديد الببتيد الذي تم الحصول عليه من الثدييات الأخرى ليس له أي تأثير على الإنسان ، وبالتالي استخراجه من منطقة تحت المهاد من الجثث.

ساعدت تقنية الهندسة الوراثية في التخليق الكيميائي للجين المرتبط بـ pBR 322 DNA البلازميد واستنساخه في بكتيريا. يتم تحويل البكتيريا المحولة إلى مصنع تخليق السوماتوستاتين. نقص ADA (أدينوزين ديميناز) هو مرض مثل نقص المناعة المشترك الذي قتل الطفل الفقاعي ديفيد في عام 1984.

يموت الأطفال المصابون بنقص ADA قبل بلوغهم عامين. تم غزو خلايا نخاع عظام الطفل بعد إزالتها من الجسم بواسطة فيروس غير ضار تم إدخال ADA فيه.

يستخدم الإريثروبويتين ، وهو هرمون معدّل وراثيًا ، لتحفيز إنتاج خلايا الدم الحمراء لدى الأشخاص الذين يعانون من فقر الدم الحاد.

إنتاج عوامل تخثر الدم:

تحدث النوبة القلبية عادةً نتيجة انسداد الشرايين التاجية بسبب الكوليسترول أو الجلطة الدموية. البلازمينوجين مادة موجودة في جلطات الدم. يعمل إنزيم منشط البلازمينوجين النسيجي المعدّل وراثيًا (tPA) على إذابة جلطات الدم لدى الأشخاص الذين عانوا من النوبات القلبية. يتم إنتاج بروتين منشط البلازمينوجين من قبل شركة التكنولوجيا الوراثية وهو قوي ومحدّد لدرجة أنه قد يوقف النوبة القلبية الجارية.

السرطان مرض مخيف. أثبتت الأجسام المضادة المستنسخة من مصدر واحد والموجهة لمستضد معين (الأجسام المضادة وحيدة النسيلة) أنها مفيدة جدًا في علاج السرطان. تم استهداف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بالعناصر المشعة أو السموم الخلوية مثل الريسين من بذور الخروع لجعلها أكثر فتكًا. تبحث هذه الأجسام المضادة عن الخلايا السرطانية وتقتلها على وجه التحديد بنشاطها الإشعاعي أو السم.

الهندسة الوراثية: التطبيق # 3. إنتاج الطاقة:

تتمتع تقنية الحمض النووي المؤتلف بنطاق هائل في إنتاج الطاقة. من خلال هذه التقنية ، أصبح من الممكن الآن إجراء هندسة حيوية لمحاصيل الطاقة أو الوقود الحيوي الذي ينمو بسرعة لإنتاج كتلة حيوية ضخمة تستخدم كوقود أو يمكن معالجتها إلى زيوت أو كحول أو ديزل أو منتجات طاقة أخرى.

يمكن تحويل النفايات من هذه إلى غاز الميثان. يحاول المهندسون الوراثيون نقل جين السليلاز إلى الكائنات الحية المناسبة التي يمكن استخدامها لتحويل النفايات مثل نشارة الخشب وسيقان الذرة أولاً إلى سكر ثم إلى كحول.

الهندسة الوراثية: التطبيق # 4. التطبيق على الصناعات:

يتم استخدام البكتيريا المصممة وراثيًا لتوليد المواد الكيميائية الصناعية. يمكن تصنيع مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية العضوية على نطاق واسع بمساعدة الكائنات الحية الدقيقة المعدلة وراثيًا. يمكن تصنيع الجلوكوز من السكروز بمساعدة الإنزيمات التي تم الحصول عليها من الكائنات الحية المعدلة وراثيًا.

الآن بمساعدة سلالات الهندسة الوراثية للبكتيريا والبكتيريا الزرقاء ، تم تطويرها والتي يمكنها تصنيع الأمونيا على نطاق واسع والتي يمكن استخدامها في تصنيع الأسمدة بتكاليف أرخص بكثير. يجري تطوير الميكروبات التي ستساعد في تحويل السليلوز إلى سكر ومن السكر إلى الإيثانول.

يمكن أيضًا استخدام تقنية الحمض النووي المؤتلف لرصد تدهور القمامة والمنتجات البترولية والنفتالين والنفايات الصناعية الأخرى.

على سبيل المثال ، البكتيريا الزائفة الفلورية المعدلة وراثيًا عن طريق نقل الإنزيم المنتج للضوء المسمى luciferase الموجود في بكتيريا vibrio fischeri ، ينتج ضوءًا يتناسب مع مقدار نشاط تحطيم النفثالين الذي يوفر طريقة لمراقبة كفاءة العملية.

تتضرر الذرة وفول الصويا بشدة بسبب الدودة القارضة السوداء. تم العثور على Pseudomonas fluorescens بالاشتراك مع الذرة وفول الصويا. تحتوي بكتيريا Bacillus thuringiensis على جينات مسببة للأمراض للآفة. على مر السنين ، لم تصبح الآفة خطرة على المحاصيل فحسب ، بل طورت مقاومة لعدد من مبيدات الآفات.

عندما تم استنساخ الجين من بكتيريا B. thuringiensis (Bt) في مضان الزائفة الزائفة وتلقيحها في التربة ، وجد أن Pseudomonas fluorescens المعدلة وراثيًا يمكن أن تسبب موت الديدان القارضة.


مجموعة أدوات CRISPR-dCas للهندسة الوراثية والبيولوجيا الاصطناعية

يعد التحكم القابل للبرمجة في التعبير الجيني أمرًا ضروريًا لفهم وظيفة الجينات وهندسة السلوكيات الخلوية وتطوير العلاجات. إلى جانب تطبيقات تحرير الجينات التي تم تمكينها بواسطة nuclease CRISPR-Cas9 و CRISPR-Cas12a ، فإن اختراع جزيئات nuclease-dead Cas (dCas9 و dCas12a) يوفر منصة للتحكم الدقيق في وظيفة الجينوم دون تحرير الجينات. تم تطوير أدوات dCas المتنوعة ، والتي تشكل مجموعة أدوات شاملة تسمح باستجواب وظيفة الجينات وتعديل السلوكيات الخلوية. تلخص هذه المراجعة التطبيقات الحالية لأدوات dCas لتنظيم النسخ ، والهندسة اللاجينية ، وتصوير الجينوم ، والشاشات الجينية ، والترسيب المناعي للكروماتين. نسلط الضوء أيضًا على المزايا والتحديات الحالية لأدوات dCas الحالية في الهندسة الوراثية والبيولوجيا التركيبية ، ونقدم وجهات نظر حول الاتجاهات والتطبيقات المستقبلية.

الكلمات الدالة: الفحص الجيني لتنظيم الجين CRISPRi / a dCas9.


تطبيقات جديدة لأدوات البيولوجيا التركيبية لهندسة التمثيل الغذائي للبكتيريا الزرقاء

تعد البكتيريا الزرقاء كائنات دقيقة واعدة لتقنيات حيوية مستدامة ، ومع ذلك فإن إطلاق إمكاناتها يتطلب إعادة هندسة جذرية وتطبيق تقنيات البيولوجيا التركيبية المتطورة. في السنوات الأخيرة ، ازدادت الأجهزة والاستراتيجيات المتاحة لتعديل البكتيريا الزرقاء ، بما في ذلك التطورات في تصميم المحفزات الجينية ، ومواقع ربط الريبوسوم ، والمفاتيح الريبية ، والبروتينات المراسل ، وأنظمة النواقل المعيارية ، وأنظمة الاختيار بدون علامات. بسبب هذه الأدوات الجديدة ، تم تصميم البكتيريا الزرقاء بنجاح للتعبير عن مسارات غير متجانسة لإنتاج مجموعة متنوعة من المركبات القيمة. ستتطلب سلالات البكتيريا الزرقاء التي يمكن استخدامها في تطبيقات العالم الحقيقي صقل الدوائر الجينية المستخدمة للتعبير عن المسارات غير المتجانسة وتطوير نماذج دقيقة تتنبأ بكيفية دمج هذه المسارات بشكل أفضل في شبكة التمثيل الغذائي الخلوي الأكبر. هنا ، نستعرض التقدم الذي تم إحرازه لترجمة أدوات البيولوجيا التركيبية إلى كائنات نموذجية للبكتيريا الزرقاء وتلخيص التجارب و في السيليكو الاستراتيجيات التي تم توظيفها لزيادة إمكانات الإنتاج الحيوي. على الرغم من التقدم في البيولوجيا التركيبية والهندسة الأيضية خلال السنوات الماضية ، فمن الواضح أنه لا تزال هناك حاجة إلى مزيد من التحسينات إذا أريد للبكتيريا الزرقاء أن تكون قادرة على المنافسة مع الكائنات الدقيقة غيرية التغذية من أجل الإنتاج الحيوي لمركبات القيمة المضافة.

الكلمات الدالة: نماذج مقياس الجينوم البكتيريا الزرقاء الهندسة الأيضية البناء الضوئي علم الأحياء الاصطناعية.

الأرقام

الآليات التنظيمية للمروجين المحرضين ...

تم إدخال الآليات التنظيمية للمروجين المحرضين مؤخرًا في البكتيريا الزرقاء. (أ) التعبير الجيني الذي يحفزه أرابينوز ...

كريسبر- كاس التقنيات المستخدمة في ...

كريسبر- كاس التقنيات المستخدمة لتحرير الجينوم لجينوم البكتيريا الزرقاء. (أ) كريسبر- كاس ...

تمثيل تخطيطي للاستراتيجيات الهندسية ...

تمثيل تخطيطي للاستراتيجيات الهندسية التي تزيد من نشاط التمثيل الضوئي في البكتيريا الزرقاء. باستخدام ATP ...

تطوير GSMs الزرقاء البكتيريا. مبكرا…

تطوير GSMs الزرقاء البكتيريا. تم تطوير نظام GSM في وقت مبكر من البكتيريا الزرقاء بناءً على البيانات البيوكيميائية ...


تطور الهندسة الوراثية

هيكل بلوري كرتوني لتقنية تحرير الجينات TALEN. (الائتمان: Gersbach Lab). الائتمان: جامعة ديوك

تشارلز جيرسباخ ، الأستاذ المساعد لعائلة روني في الهندسة الطبية الحيوية بجامعة ديوك ، يقود مختبرًا يركز على تطوير أدوات هندسة الجينوم وتطبيقها - وعلى الأخص التكنولوجيا القائمة على كريسبر. CRISPR-Cas هو نظام دفاع بكتيري يسمح للبكتيريا باستخدام جزيئات RNA وبروتينات (Cas) المرتبطة بـ CRISPR لاستهداف وتدمير الحمض النووي للفيروسات الغازية. أثار اكتشاف هذه التقنية ثورة في تحرير الجينوم حيث اكتشف الباحثون كيف يمكن استخدام الأداة لاستهداف وتحرير الحمض النووي في الخلايا البشرية على وجه التحديد.في السنوات التي تلت اكتشافها ، استخدم غيرسباخ ومختبره هذه التقنية لدراسة الأمراض الوراثية مثل الحثل العضلي الدوشيني ، والتحكم بدقة في التعبير الجيني وحتى تطوير الأدوات التي يمكن أن تجعل تقنية كريسبر أكثر دقة.

كيف أصبحت الهندسة الوراثية مجال بحثك؟

كنت أعرف أنني أريد السير في مسار وظيفي أكاديمي حيث يمكنني المساعدة في تطوير الطب التجديدي وعلاجات الجينات والخلايا. أردت العمل على شيء يمكن أن يؤثر على الكثير من المجالات المختلفة في الهندسة الحيوية ، وأدركت أن التعبير الجيني كان مكونًا أساسيًا لمجموعة متنوعة من الأبحاث.

كانت هناك أجنحة مختلفة في المبنى حيث عملت في كلية الدراسات العليا ، كل منها يركز على الطب التجديدي من حيث ارتباطه بنظام أعضاء معين. في أجزاء مختلفة من المبنى ، يمكنك إلقاء نظرة على ملصقات لأبحاث القلب والأوعية الدموية أو أبحاث الجهاز العضلي الهيكلي ، أو الأشياء المتعلقة بمرض السكري أو العمل العصبي. تضمنت كل هذه الموضوعات بشكل أساسي محاولة جعل الخلايا تفعل شيئًا مثيرًا للاهتمام. كمثال مبسط للغاية ، إذا أردنا أن تتصرف الخلايا مثل الخلايا الغضروفية ، فإننا نطرق عليها بشكل أساسي باستخدام القوة الميكانيكية ونأمل أن تقوم بتشغيل جينات الغضروف ، وإذا أردنا أن تتصرف الخلايا مثل الخلايا العصبية ، فإننا نصدمها كهربائيًا ونأمل أن يركل الجينات العصبية في حالة تأهب. في كل هذه الحالات ، تقوم بتطبيق محفزات خارجية وتأمل أن يتم التعبير عن الجينات الصحيحة داخليًا. إذا كان الهدف عبر كل هذه المجالات هو تشغيل الجينات الصحيحة وإيقافها ، فقد كنت أشعر بالفضول لمعرفة ما إذا كانت هناك تقنية أفضل أو أكثر مباشرة للدخول إليها وبرمجة التعبير الجيني.

كريسبر هي تقنية جديدة نسبيًا. كيف انتهى الأمر إلى أن أصبح هذا هو محور عمل مختبرك في Duke؟

نُشرت الورقة الأولى التي وصفت استخدام كريسبر في الخلايا البشرية في عام 2013 ، لذلك كنا نعمل باستخدام التقنيات التي سبقتها. الأول كان عبارة عن بروتينات إصبع الزنك المهندسة ، والتي يمكن استخدامها لتعديل منطقة معينة من الجينوم. في ذلك الوقت ، كان الناس يستخدمون أصابع الزنك لعمل عوامل النسخ التي يمكن أن تعمل على تشغيل الجينات وإيقافها وتنظيم التعبير الجيني ، ولكن كان من الصعب حقًا العمل بهذه التقنية ، لذا لم يتم إطلاقها بالفعل ، ولم يكن هناك سوى عدد قليل من المختبرات في العالم الذي كان يعمل معها. اعتقدت أنه إذا تدربت مع أحدهم ، فسيكون العالم هو المحار الخاص بي ، لذلك تدربت في سان دييغو لمدة ثلاث سنوات واستخدمت هذه الخبرة كنقطة انطلاق لبدء مختبر في ديوك في عام 2009.

بعد عامين من بدء دراستي في Duke ، ظهرت تقنية جديدة تسمى TALENs ، وهي أداة أخرى يمكنها صنع بروتينات لاستهداف تسلسلات معينة في الجينوم. كان استخدامه أسهل بكثير من استخدام أصابع الزنك ، ولكن قبل أن تتاح لها فرصة الإقلاع ، ظهرت تقنية كريسبر.

إن تقنية CRISPR سهلة الاستخدام للغاية ، لذا فإن حلمي القديم بأنني سأكون واحدًا من الأشخاص الوحيدين في العالم الذين يعرفون كيفية القيام بهذه الأشياء قد خرج من الباب. في ذلك الوقت كنت أفكر ، "رائع ، لقد عفا عليّ تمامًا بعد أربع سنوات فقط من مسيرتي الأكاديمية." باستثناء أننا بنينا الكثير من الخبرات وأنظمة النماذج لاستخدام هذه الأدوات ، وكنت محظوظًا لوجود بعض الطلاب والزملاء اللامعين والمجهدين حقًا في المختبر ، لذلك تمكنا من الحصول بسرعة على كواشف CRISPR واستخدامها لهم لعملنا الخاص. في الثالث من كانون الثاني (يناير) 2013 ، تم نشر أول ورقتين بحثيتين تستخدمان تقنية كريسبر في الخلايا البشرية على الإنترنت في مجلة Science ، وبعد ثلاثة أسابيع حصلنا بالفعل على البلازميدات وأجرينا تجارب تعتمد على تقنية كريسبر في مختبرنا الخاص بنا. جاءت أول ورقة CRISPR لدينا بعد ستة أشهر.

لماذا اخترت التركيز على استخدام تقنية كريسبر لدراسة الحثل العضلي الدوشيني؟

كان أول مشروع بدأه مختبري في عام 2009 هو تعديل الجينات لضمور العضلات الدوشيني باستخدام تقنية أصابع الزنك. DMD هو المرض الجيني الوراثي الأكثر شيوعًا ، ولكن في عام 2009 لم يكن هناك أي علاجات أو خيارات متاحة لمساعدة الأشخاص المصابين بهذا المرض ، والذي يتسبب في تدهور عضلاتهم بشكل تدريجي. كنت أيضًا أستاذًا مساعدًا جديدًا ، لذلك أردت أن أفعل شيئًا يتقدم بخطوتين عما كان ينظر إليه أي شخص آخر ، ولكن كان يجب أن يكون هدفًا ملموسًا بدرجة كافية حتى نتمكن من إحراز تقدم واضح ، وتحرير الجينات للعضلات كان الحثل يتماشى مع تلك المعايير.

في السابق ، كان الناس قد درسوا طرقًا لتعديل الخلايا الجذعية وإعادتها إلى العضلات ، لكن استبدال جميع خلايا العضلات في الجسم ليس بالأمر المجدي حقًا. كان لديهم أيضًا فيروسات معدلة لإيصال الجينات إلى العضلات ، لكن الجين الذي تحور في هذه الحالة هو أيضًا أحد أكبر الجينات في الجينوم البشري ، لذا فهو لا يتناسب مع نواقل العلاج الجيني النموذجية. وبدلاً من ذلك ، بدت فكرة إصلاح نسخة الجين الموجودة بالفعل في الجينوم ، بدلاً من محاولة إيصالها ، بمثابة فرصة جذابة. لذلك عملنا على هذا النهج ، واستخدمنا بالفعل أصابع الزنك و TALENs حتى تم اكتشاف تحرير الجينات المستند إلى CRISPR ورأينا مدى سهولة استخدامه.

عملنا مع الحثل العضلي الدوشيني مستمر. نشرنا مؤخرًا بحثًا في طب الطبيعة التي أظهرت أن علاجًا جهازيًا واحدًا يمكن أن يصحح طفرة DMD لأكثر من عام في الفئران.

ما الأشياء التي لا يمكنك فعلها اليوم باستخدام تقنية CRISPR والتي تريد أن تكون قادرًا على القيام بها؟

أعتقد أنه سيكون من المفيد القيام بتعديل الجينات دون قطع الجينوم. قد يتضمن حل هذه المشكلة إصدارًا جديدًا من CRISPR ، أو قد يتضمن شيئًا مختلفًا تمامًا. لكننا نتعلم المزيد عن هذه الأنظمة كل يوم - قبل عشر سنوات استغرق الأمر عامين للقيام بمشروع يتضمن تحرير الجينات ، والآن يمكنك القيام بذلك في غضون أسبوع أو أسبوعين. هناك الكثير من نكهات CRISPR ، حيث يعتبر Cas9 هو البروتين الأكثر استخدامًا ، لكن الباحثين اكتشفوا العشرات من الأنواع الأخرى من Cas9s وحتى بروتينات ومجمعات CRISPR الأخرى ، بما في ذلك Cas12 و Cas13 و Cas14 و Cas3 وحتى Cascade وكل من هذه الأنظمة تفسح المجال لاستخدام فريد.

بالنظر إلى تقنية كريسبر ، ما أكثر شيء أنت متحمس بشأنه؟

بدأت أولى التجارب السريرية لـ CRISPR على البشر هذا العام. نحن نشهد التجارب الأولى للسرطان ، ومرض الخلايا المنجلية ، وللأشكال النادرة الموروثة من العمى. وستحصل على نتائج تلك التجارب في العام أو العامين المقبلين ، لذلك هذا مثير للغاية وبالتأكيد بالقرب من أعلى القائمة.

أعتقد أيضًا أننا في مكان الآن تم فيه دمج تقنية كريسبر بشكل كامل في عملية تطوير الأدوية. ليس فقط كريسبر كعلاج ، ولكن كريسبر لصنع أنظمة نموذجية وخطوط خلوية للمساعدة في تصميم أدوية أفضل. أعتقد أن تقنية CRISPR ستؤثر بشكل كبير على الطب بطريقة تتجاوز استخدام تقنية CRISPR مباشرةً كعلاج. في الواقع ، أنشأنا شركة ، Element Genomics ، للقيام بذلك من خلال تسهيل تطوير الأدوية باستخدام هذه الأدوات ، وليس بالضرورة استخدام CRISPR كعلاج. هذا دقيق ، لذلك لا يقدر الناس بالضرورة أن أشياء مثل كريسبر تعمل في الخلفية لجعل البحث البيولوجي أكثر تقدمًا للمساعدة في ابتكار عقاقير جديدة.


شاهد الفيديو: انزيمات القطع Restriction Enzyme (شهر نوفمبر 2022).