معلومة

تأثير حذف أو إدخال نوكليوتيد مفرد على التلدين التمهيدي

تأثير حذف أو إدخال نوكليوتيد مفرد على التلدين التمهيدي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

كيف يتم التلدين التمهيدي ، وبالتالي تضخيم PCR تتأثر بحذف النوكليوتيدات المفردة أو إدخالها داخل التمهيدي؟

تخيل برايمر مثل هذا:
GCGTCATAAAGGGGACGTG (التمهيدي)
والجزء المقابل من قالب الحمض النووي به حرف G مفقود ، لذلك يبدو كالتالي:
GCGTCATAAAGGGACGTG (نموذج).

يمكن أن يكون الاقتران المحتمل
GCGTCATAAAGGGGACGTG التمهيدي
نموذج GCGTCATAAA_GGGACGTG
أو
GCGTCATAAAGGGGACGTG التمهيدي
نموذج GCGTCATAAAGGG_ACGTG
أو أي شيء بينهما.

هل من الممكن أن يتم تعطيل التضخيم باستخدام مثل هذا التمهيدي تمامًا في الوقت الحقيقي العادي PCR عند التلدين عند 60 درجة مئوية؟ هل يمكن أن يؤدي هذا إلى تعطيل التضخيم تمامًا؟

إذا كان عدم التطابق الاستبدال-مثل ، سأكون واثقًا جدًا من أن التمهيدي سيظل يعمل وسيحدث التضخيم. في الحالة القصوى ، سيكون على الأقل تضخيمًا متبقيًا في أواخر Ct. هناك الكثير من البيانات ، كيف تؤثر حالات عدم التطابق على البادئات ولدي أيضًا الكثير من الخبرة الشخصية في ذلك.

لسوء الحظ، ال حذف يتم دراسة عدم التطابق بدرجة أقل بالإضافة إلى الحماية من Google. المؤشر الوحيد الذي وجدته هو هذا العمل:
Lipsky RH و Mazzanti CM و Rudolph JG و Xu K و Vyas G و Bozak D وآخرون. تحليل ذوبان الحمض النووي للكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة. كلين تشيم. 2001 ؛ 47: 635-44.
في هذا العمل ، كان لحذف النوكليوتيدات المفردة تأثير مماثل أو أقل على درجة حرارة الانصهار من عدم تطابق الاستبدال. لكنها كانت تدور حول oligos أطول. أمثلة:
تأثير الحذف:
جزء 133 نقطة أساس ، 67٪ GC ، حذف SNP في الموضع 43 ، دلتا Tm (مزدوج متماثل) = 1.2 درجة مئوية
آثار البدائل:
جزء 152 نقطة أساس ، 43 ٪ GC ، الاستبدال من T إلى C في الموضع 68 ، دلتا Tm (ثنائي الاتجاه متماثل) = 0.9 درجة مئوية
جزء 100 نقطة أساس ، 41٪ GC ، الاستبدال من T إلى C في الموضع 42 ، دلتا Tm (مزدوج متماثل متماثل) = 1.4 درجة مئوية
جزء 163 نقطة أساس ، 60٪ GC ، الاستبدال من C إلى T في الموضع 86 ، دلتا Tm (ثنائي الاتجاه متماثل) = 2.2 درجة مئوية
جزء 110 bp ، 59٪ GC ، الاستبدال G إلى A في الموضع 66 ، دلتا Tm (homo-hetero duplex) = 3.8 درجة مئوية

أسئلة:
1. هل يمكنك أن تنصحني بمطبوعات حول كيفية تأثير عدم تطابق الحذف داخل البادئات (وليس في نهاية !!!) على التلدين و PCR؟
2. هل تعتقد أن التمهيدي في المثال الخاص بي سيظل يعمل ، جزئيًا على الأقل ، أم أنك لا تتوقع أي تضخيم على الإطلاق؟


تحرير بعد المدخلات الخاصة بك:
يعتقد هذا التطبيق عبر الإنترنت "mfold.rna.albany.edu/؟q=DINAMelt/Two-state-melting" أن عدم تطابق الحذف أكثر زعزعة للاستقرار من البدائل ، على الأقل بالنسبة للأشعال القصيرة. على سبيل المثال الخاص بي ، فقد حسبت دلتا Tm (homo-hetero duplex) = 12.9 درجة مئوية. إذا حاولت استبدال عدم التطابق بدلاً من ذلك ، فإن دلتا Tm (homo-hetero duplex) تقع في الفاصل الزمني 3،8 درجة مئوية إلى 5،7 درجة مئوية.

سؤال جديد
إذا كانت لديك تجربة مشابهة قدر الإمكان لحالتي ، وهي عبارة عن أساس تمهيدي بطول 19 nt مع حذف نوكليوتيد واحد في القالب التكميلي في الموضع cca 6-9 من نهاية التمهيدي 3 '، ودرجة حرارة التلدين المستخدمة عند 60 درجة مئوية ، فيرجى إبلاغي بذلك إذا حققت التضخيم أم لا. من فضلك ، أعطني مرجعًا خاصًا ، إذا كان لديك ، لذلك سأقتبس ذلك في مراجعتي :-).

أيضًا ، ما زلت مهتمًا بالمعلومات العامة ، طالما أن الموضوع ضيق بدرجة كافية ليكون حول عمليات حذف النيوكليوتيدات المفردة أو عمليات الإدراج في الاشعال. (عدم تطابق الاستبدال).


استخدمنا هذا النوع من البادئات لتوليد طفرات خارج الإطار أو لإضافة قواعد إضافية. من واقع خبرتي ، سيعمل PCR الخاص بك (ربما يكون بكفاءة أقل) وستحصل على منتج بقاعدة إضافية. استخدمنا مواد أولية ذات اختلافات أكبر في الطفرات الموجهة للموقع المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل للبلازميدات ، وهناك ما يصل إلى 10 قواعد لم تتطابق ولكن البادئات كانت أطول أيضًا. بالنسبة لعدم تطابق النوكليوتيدات الأحادية (إما + أو - قاعدة واحدة) ، استخدمنا مواد أولية حول هذا الحجم.

فيما يتعلق بالأدبيات ، قد تكون هذه المنشورات مفيدة:

يحتوي المنشور الأول بشكل خاص على الكثير من مراجع الاهتمامات الأخرى.


إضافة مرجع آخر. تبحث هذه المجموعة في تأثير حالات عدم التطابق المختلفة (على سبيل المثال A> T vs A> G) وتبحث أيضًا في التأثيرات الموضعية.

تظهر نتائجنا أن عدم التطابق الفردي يحرض على مجموعة متنوعة من التأثيرات ، تتراوح من الحد الأدنى (<1.5 دورة ، على سبيل المثال ، AC ، CA ، TG ، GT) إلى تأثير شديد (> 7.0 دورة عتبة ، على سبيل المثال ، AA ، GA ، AG ، CC ) على تضخيم PCR. تم العثور على علاقة واضحة بين أنواع عدم التطابق المحددة والموضع والتأثير.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2797725/


عملية الحذف والإدراج الفعالة والموجهة للموقع بخطوة واحدة وبروتوكول طفرات البلازميد الأحادي والمتعدد الموقع

تلعب الطفرات دورًا أساسيًا في البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية. كما تم استخدامه في علم الإنزيمات والبروتينات لتوليد بروتينات أكثر قابلية للتتبع لتقنيات الفيزياء الحيوية. تعد القدرة على تغيير البقايا (المخلفات) في البروتين بسرعة وبشكل خاص أمرًا مهمًا للدراسات الآلية والوظيفية. على الرغم من تطوير العديد من طرق الطفرات الموجهة بالموقع ، إلا أن طريقة بسيطة وسريعة ومتعددة التطبيقات لا تزال مرغوبة.

نتائج

لقد طورنا بروتوكول طفرات البلازميد الموجه بالموقع والذي يحافظ على الإجراء البسيط من خطوة واحدة لعملية الطفرات الموجهة بالموقع QuikChange ™ ولكنه عزز كفاءته ووسع من قدرته على الطفرات متعددة المواقع. استخدم هذا البروتوكول المعدل تصميمًا تمهيديًا جديدًا عزز تلدين القالب التمهيدي عن طريق القضاء على ثنائي التمهيدي كما سمح باستخدام الحمض النووي المركب حديثًا كقالب في دورات التضخيم اللاحقة. نعتقد أن هذين العاملين هما السببان الرئيسيان لكفاءة التضخيم المعززة ولتطبيقاتها في الطفرات متعددة المواقع.

استنتاج

أدى بروتوكولنا المعدل إلى زيادة كفاءة الطفرة الفردية بشكل كبير ، كما سمح بإدخالات فردية كبيرة سهلة ، وحذف / اقتطاع ، وطفرات متعددة في تجربة واحدة ، وهو خيار غير متوافق مع معيار QuikChange ™. علاوة على ذلك ، يتطلب البروتوكول الجديد أقل بكثير من الحمض النووي للوالدين مما سهل Dpnأنا الهضم بعد تضخيم PCR وتعزيز الكفاءة والموثوقية الشاملة. باستخدام بروتوكولنا ، أنشأنا موقعًا واحدًا ، وطفرات متعددة في موقع واحد وطفرات دمج / حذف مشتركة. أظهرت النتائج أن هذا البروتوكول الجديد لم يفرض أي تكاليف إضافية على الكاشف (بخلاف QuikChange ™ الأساسي) ولكنه زاد من معدلات النجاح الإجمالية.


الملخص

تعد أخطاء إدخال / حذف النوكليوتيدات الصغيرة (indel) أحد أخطاء النسخ الشائعة في تخليق الحمض النووي. كان يُعتقد أن حدوث خطأ indel الأكثر شيوعًا يرجع إلى التسلسلات المتكررة التي تكون عرضة للانزلاق أثناء تكرار الحمض النووي. يعد التدقيق اللغوي وإصلاح عدم تطابق الحمض النووي من العوامل المهمة في تصحيح الخطأ indel للحفاظ على الدقة العالية لمعاملات المعلومات الجينية. استخدمنا تحليل مطياف الكتلة (MS) MALDI-TOF لقياس كفاءة تصحيح Klenow polymerase (KF) لأخطاء indel. هنا ، يتم تلدين مادة أولية نيوكليوتيد غير موصوفة وغير مشعة إلى قالب DNA مكونًا خطأ نيوكليوتيد مفرد وتم تدقيقه بواسطة KF في وجود مزيج من ثلاثي فوسفات ديوكسي ريبونوكليوتيد و / أو ثلاثي فوسفات ثنائي أوكسي ريبونوكليوتيد. تم التعرف على منتجات التصحيح من خلال تغيير الكتلة المعدلة KF من التمهيدي. قمنا بفحص التدقيق اللغوي للحمض النووي الذي يحتوي على أخطاء indel في مواضع مختلفة من تقاطع القالب التمهيدي. لقد وجدنا أن أخطاء indel الموجودة في 1–5-nucleotides (nt) من الطرف التمهيدي يمكن تصحيحها بكفاءة ، بينما يتم تصحيح وتمديد الإدراج / الحذف عند 6-nt من الطرف 3 جزئيًا. يقع Indels 7-9-nt من نهاية التمهيدي هربًا من التدقيق اللغوي ويتم تمديده بواسطة البوليميراز. تتم مناقشة الآليات الأساسية المحتملة لهذه الملاحظات في سياق تفاعلات تقاطع البوليميراز والقالب التمهيدي عبر تحليل الهيكل.


عملية الحذف والإدراج الفعالة والموجهة للموقع بخطوة واحدة وبروتوكول طفرات البلازميد الأحادي والمتعدد الموقع

خلفية: تلعب الطفرات دورًا أساسيًا في البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية. كما تم استخدامه في علم الإنزيمات والبروتينات لتوليد البروتينات التي يمكن تتبعها بشكل أكبر لتقنيات الفيزياء الحيوية. تعد القدرة على تغيير البقايا (المخلفات) في البروتين بسرعة وبشكل خاص أمرًا مهمًا للدراسات الآلية والوظيفية. على الرغم من تطوير العديد من طرق الطفرات الموجهة بالموقع ، إلا أن طريقة بسيطة وسريعة ومتعددة التطبيقات لا تزال مرغوبة.

نتائج: لقد طورنا بروتوكول طفرات البلازميد الموجه بالموقع والذي حافظ على إجراء خطوة واحدة بسيط لعملية الطفرات الموجهة من موقع QuikChange ولكنه عزز كفاءته ووسع من قدرته على الطفرات متعددة المواقع. استخدم هذا البروتوكول المعدل تصميمًا تمهيديًا جديدًا عزز تلدين القالب التمهيدي عن طريق القضاء على ثنائي التمهيدي كما سمح باستخدام الحمض النووي المركب حديثًا كقالب في دورات التضخيم اللاحقة. نعتقد أن هذين العاملين هما السببان الرئيسيان لكفاءة التضخيم المعززة ولتطبيقاتها في الطفرات متعددة المواقع.

استنتاج: أدى بروتوكولنا المعدل إلى زيادة كفاءة الطفرة الفردية بشكل كبير ، كما سمح بإدخالات فردية كبيرة سهلة ، وحذف / اقتطاع وطفرات متعددة في تجربة واحدة ، وهو خيار غير متوافق مع معيار QuikChange. علاوة على ذلك ، تطلب البروتوكول الجديد عددًا أقل من الحمض النووي للوالدين مما سهل عملية هضم DpnI بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وعزز الكفاءة والموثوقية بشكل عام. باستخدام بروتوكولنا ، أنشأنا موقعًا واحدًا ، وطفرات متعددة في موقع واحد وطفرات دمج / حذف مشتركة. أظهرت النتائج أن هذا البروتوكول الجديد لم يفرض أي تكاليف إضافية على الكاشف (بخلاف QuikChange الأساسي) ولكنه زاد من معدلات النجاح الإجمالية.


نتائج

تطوير الفحص

قمنا بتقييم اثنين من البوليمرات المقاومة للحرارة المصممة لإدماج ديديوكسينوكليوتيد لتقييم قدرتها على التمييز الأليلي: Thermo Sequenase (Thermus aquaticus بوليميريز DNA F667Y) و Therminator (المكورات الحرارية 9 ° N-7 DNA بوليميراز A485L). يعرض الشكل 2 دمج المنهي المحدد بواسطة هذه الإنزيمات في سلسلة من G / A SNPs ، كدالة لتركيز المنهي. تم وصف PCR وتنظيف قوالب الحمض النووي الجينومي وفقًا للطرق ، مع التمديد في وجود مخازن مؤقتة مزودة و 10 مم ddNTP. قمنا بتقييم التأسيس المحدد على أنه الفرق بين إشارات التأسيس لأدوات الإنهاء التكميلية وغير التكميلية (غير الصحيحة). في تركيزات عالية من الإنزيم ، يمكن ملاحظة دمج غير محدد. مع هذه الاختبارات الأولية ، لوحظ أكبر دمج محدد عند تركيزات إنزيم التمديد البالغة 0.004 وحدة / ميكرولتر لـ Therminator و 0.02 وحدة / ميكرولتر لـ Thermo Sequenase.

تمديد منحنيات تركيز البلمرة. (أ) التأسيس المحدد كدالة لتركيز Therminator. (ب) التأسيس المحدد كدالة لتركيز Thermo Sequenase.

تمديد منحنيات تركيز البلمرة. (أ) التأسيس المحدد كدالة لتركيز Therminator. (ب) التأسيس المحدد كدالة لتركيز Thermo Sequenase.

أظهر كل من Thermo Sequenase و Therminator تباينًا متوقعًا في أداء الفحص عبر أشكال SNP مختلفة (مثل الشكل التكميلي S2). كمساعدة في تحسين الفحص ، ابتكرنا نظامًا مستهدفًا اصطناعيًا لتوفير التحكم في القالب وسياق الموقع المتغير. تضمنت هذه الأهداف متواليات موقع تمهيد PCR المرافقة بالإضافة إلى تسلسل كافٍ يحيط بموقف متغير للتهجين اللاحق لتمهيدي التمهيدي ، مما يسهل دمج المنهي في الموضع المتغير. يتم عرض أمثلة على أداء اختبار قالب الهدف الاصطناعي في الشكل 3.

نموذج مقايسة لقالب هدف اصطناعي (SynFP_C و SynFP_T) باعتباره SNP مصمم هندسيًا باستخدام Therminator (أ) أو Thermo Sequenase (ب).

نموذج مقايسة لقالب هدف اصطناعي (SynFP_C و SynFP_T) باعتباره SNP مصمم هندسيًا باستخدام Therminator (أ) أو Thermo Sequenase (ب).

لقد بحثنا في تأثير تكوين المخزن المؤقت للتمديد عند دمج المنهي بواسطة Therminator. استخدمنا أهدافًا اصطناعية SynFP_C و SynFP_T (تتضمن ddG-R110 و ddA-TAMRA) ومخزنًا أوليًا يبلغ 2 مم ، 10 ملي مول كلوريد ، 10 ملي مولار (NH4)2وبالتالي4، 0.1٪ Triton X-100 ، و 20 ملم Tris-HCl pH 8.8. كان نهجنا هو اختبار مجموعة من التركيزات لمكون واحد ، كل منها في وجود نطاق من تركيزات المكون الثاني ، مع الحفاظ على متغيرات أخرى ثابتة. اخترنا الأمثل لكل مكون من المكونين المختبرين ، واعتماد الشرط الجديد كتغيير للمخزن المؤقت الأولي. اتبعنا هذا النهج حتى تم اختيار Optima لكل متغير. كان التفاعل الأمثل 0.5 ميكرومتر من التمهيدي و 1 × المخزن المؤقت A: 2 ملي مولار MgSO4، 5 ملم (NH4)2وبالتالي4، و 0.1٪ Triton X-100 ، و 20 ملم Tris-HCl pH 9.3. كان أداء Thermo Sequenase جيدًا أيضًا في هذه الظروف ، على الرغم من أننا قمنا لاحقًا بتحسين المخزن المؤقت B بشكل مماثل (موضح أدناه).

قمنا بعد ذلك بتقييم كفاءة دمج ddU-TAMRA و ddG-R110 و ddC-R110 و ddA-TAMRA بواسطة كل من Therminator و Thermo Sequenase في المخزن المؤقت A باستخدام أربعة أهداف تركيبية مقابلة (الشكل 4). قام Thermo Sequenase فقط بدمج جميع هذه المصطلحات الأربعة بكفاءة ، وبالتالي تم اختياره لجميع التجارب اللاحقة. بالنسبة إلى Thermo Sequenase ، كانت التركيزات المثلى 1 × لإنهاء هذه النهايات الأربعة 35 نانومتر ddA-TAMRA و 4 نانومتر ddC-R110 و 4 نانومتر ddG-R110 و 10 نانومتر ddU-TAMRA (الشكل 5). قمنا أيضًا بتحسين المخزن المؤقت للتمديد خصيصًا لـ Thermo Sequenase باستخدام أهداف تركيبية والنهج العام الموضح أعلاه (الشكل 6). احتوى المخزن المؤقت 1 × B الناتج على: 6 ملي MgSO4، 5 ملم (NH4)2وبالتالي4، 0.05٪ Triton X-100 ، 20 ملم Tris-HCl pH 8.9 ، وإضافة 5٪ جلسرين. كان تركيز Thermo Sequenase الذي كان فيه دمج المُنهي أكثر تحديدًا هو 0.0175 وحدة / ميكرولتر. تم أيضًا تقييم اثنين من أجهزة الإنهاء الإضافية ، واختيار التركيزات المثلى من 4 نانومتر ddU-R110 و 20 نانومتر ddC-TAMRA من أجل Thermo Sequenase (الشكل 7). حتى مع التضمين الفعال والمحدّد للمنتهي ، فإن تراكم التمهيدي المسمى التمهيدي هو دالة لعدد الدورات الحرارية الخطية. مجموع الإشارات المحددة لكل من نواتج التمديد المحتملة (مجموع FP) من SNP الذي تم اختباره استقر عند حوالي 26 دورة تمديد (موضحة في الشكل التكميلي S3).

خصوصية دمج فاصل ddNTP المسمى الفلورسنت بواسطة Therminator و Thermo Sequenase ، تم تقييمه باستخدام أهداف اصطناعية SynFP_A و SynFP_C و SynFP_G و SynFP_T.

خصوصية دمج فاصل ddNTP المسمى الفلورسنت بواسطة Therminator و Thermo Sequenase ، تم تقييمه باستخدام أهداف اصطناعية SynFP_A و SynFP_C و SynFP_G و SynFP_T.

خصوصية دمج المنهي بواسطة Thermo Sequenase كدالة لتركيز ddNTP ، تم تقييمها باستخدام أهداف تركيبية SynFPz_A و SynFPz_C و SynFPz_G و SynFPz_T.

خصوصية دمج المنهي بواسطة Thermo Sequenase كدالة لتركيز ddNTP ، تم تقييمها باستخدام أهداف تركيبية SynFPz_A و SynFPz_C و SynFPz_G و SynFPz_T.

Q73mOKSlOHTtfievrDf5ztBJss6lAjRPNG "/>

خصوصية التضمين النهائي بواسطة Thermo Sequenase كدالة لمكونات العازلة وتركيز الإنزيم. تقدم كل لوحة منحنى مكون رد فعل تم تقييمه لاختيار أفضل.

Q73mOKSlOHTtfievrDf5ztBJss6lAjRPNG "/>

خصوصية التضمين النهائي بواسطة Thermo Sequenase كدالة لمكونات العازلة وتركيز الإنزيم. تقدم كل لوحة منحنى مكون رد فعل تم تقييمه لاختيار أفضل.

خصوصية دمج ddC-TAMRA و ddU-R110 بواسطة Thermo Sequenase كدالة لتركيز ddNTP ، تم تقييمها باستخدام أهداف اصطناعية SynFPz_A و SynFPz_C و SynFPz_G و SynFPz_T.

خصوصية دمج ddC-TAMRA و ddU-R110 بواسطة Thermo Sequenase كدالة لتركيز ddNTP ، تم تقييمها باستخدام أهداف اصطناعية SynFPz_A و SynFPz_C و SynFPz_G و SynFPz_T.

يصبح التضمين غير الصحيح للنهاية مشكلة مع استخدام التركيز المتناقص لـ Exo I أو CIAP لتنظيف ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 8). يمكن أن تسمح بادئات PCR المتبقية و dNTPs المتبقية بدمج فاصل مسمى في موضع آخر غير موقع البديل المقصود الذي تم استجوابه. كان التركيز الأمثل لكل إنزيم لإدماج مادة نهائية محددة 0.95 وحدة لكل تفاعل ، مع عدم وجود فرق بين تعطيل الحرارة عند 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مقابل 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

تأثير تركيز CIAP و Exo I على خصوصية دمج المنهي. يتم توضيح دمج محددات إنهاء ddNTP محددة وغير محددة الفلورسنت لأهداف القوالب الاصطناعية SynFP_G (أ) و SynFP_A (ب).

تأثير تركيز CIAP و Exo I على خصوصية دمج المنهي. يتم توضيح دمج أجهزة إنهاء ddNTP محددة وغير محددة الفلورسنت لأهداف القوالب الاصطناعية SynFP_G (أ) و SynFP_A (ب).

أداء الفحص مع التنميط الجيني الإنتاج

قمنا بتطبيق مقايسة SNuPE المحسّنة بشكل متكرر على مجموعة من 98 SNPs و indels ، وتصميم فحوصات لكل منها على عينات الحمض النووي 2202 النمط الجيني. اخترنا شروط PCR لكل منها باستخدام النهج الموصوف في الطرق 87 المستخدمة AmpliTaq Gold / no betaine ، و 9 تستخدم AmpliTaq Gold / betaine ، و 2 تستخدم Titanium Taq / betaine. لكل اختبار متغير مرغوب فيه ، قمنا بعد ذلك بتضخيم الأهداف الاصطناعية المصممة لتمثيل الأنماط الجينية AA و AB (مختلطة) و BB للمقارنة بين أداء اختبار التمديد الأمامي والعكسي. تم اختيار الإصدار الذي يحتوي على أكبر مبلغ FP للاختبار اللاحق لعينة دراسة الحمض النووي الجينومي التي تم استخلاصها من الدم الكامل. قيمت هذه الشاشة المكونة من لوحين من 96 جيدًا 151 شخصًا (3 موجودة في ثلاث نسخ) ، و 5 عناصر تحكم سلبية ، و 30 هدفًا اصطناعيًا (10 من كل زيجوت متماثل الزيجوت و 10 من الزيجوت المختلط / متغاير الزيجوت). كان هذا الأخير مفيدًا بشكل خاص في إنشاء مواقع مجموعة AA و AB و BB وأداء مقايسة لـ SNPs النادرة (مقابل اختبار اختبار جديد للأداء غير المؤكد على الحمض النووي الجيني لنمط وراثي غير معروف). من بين 98 فحصًا تم تصميمها واختبارها ، أسفر 85 عن تراكيب وراثية نظيفة في الحمض النووي للدراسة (معدل تحويل مقايسة بنسبة 87٪).

شرعنا في إنتاج التنميط الجيني باستخدام 77 من هذه المقايسات SNP و indel (المجموعة الفرعية التي أثبتت أنها ضرورية لعملنا) على 2202 عينة من الحمض النووي لتوليد ∼170.000 من الأنماط الجينية الإجمالية. قمنا بتضمين عناصر تحكم 67 زوجًا مكررًا من الحمض النووي الجيني ، مع ملاحظة نداءين وراثيين غير متطابقين (معدل الخطأ المقدر 0.0004). بصرف النظر عن فحوصات SNuPE ، قمنا أيضًا بتنميط عينات الحمض النووي نفسها بواسطة مجموعة Illumina Infinium MEGA EX. لاحظ أن مسح الصفيف أكثر ملاءمة لتقييم السلالة الجينية من المقايسة المخصصة للمتغيرات المحددة والمطلوبة. على الرغم من أنه ليس من خلال تصميمنا ، فقد تم أيضًا إنشاء أنماط وراثية لـ 12 من المتغيرات الـ 77 التي تم تقييمها بواسطة SNuPE بواسطة المصفوفة ، مما يتيح مقارنة استدعاءات النمط الجيني من طريقة متعامدة. كان أحدها أحادي الشكل بشكل خاطئ حسب المصفوفة. أسفرت الـ 11 SNPs المتبقية عن 17346 نمطًا وراثيًا مكررًا مع 43 تناقضًا ، بمعدل تباين قدره 0.003. تدعم هذه البيانات دقة مقايسة SNuPE بما يتماشى مع أساليب التنميط الجيني للإنتاج الأخرى.

ستة من فحوصات SNuPE التي تم التنميط الجيني في الإنتاج بها مبالغ FP في مراحل تطوير الفحص التي أدركنا أنه يمكن تحسينها عن طريق تغيير التمهيدي التمهيدي Tم. في سياق التنميط الجيني للإنتاج ، قمنا بتقييم التمهيدي Tم كمتغير فحص إضافي مع إمكانية تحسين التأسيس المحدد. قمنا بتحسين ستة فحوصات من خلال تقييم واختيار T أعلىم التمديد التمهيدي (الشكل 9). بشكل عام ، التمديد التمهيدي Tمتراوحت الاختبارات الناجحة بين 52.6 درجة مئوية و 73.1 درجة مئوية ، بمتوسط ​​58.1 درجة مئوية. نحن نقدر التمديد الأمثل التمهيدي T.م هدف التصميم أن يكون بين 60 درجة مئوية و 65 درجة مئوية.

تأثير التمديد التمهيدي T.م على مبلغ FP. لكل متغير ، مجموع FP من الأولي و T الأمثلم يتم تقديمه كخط ممتد.

تأثير التمديد التمهيدي T.م على مبلغ FP. لكل متغير ، مجموع FP من الأولي و T الأمثلم يتم تقديمه كخط ممتد.

عادةً ما تفشل نسبة كبيرة من المتغيرات المحددة المطلوبة في التحويل بنجاح للمقايسة بأي طريقة بديلة معينة. غالبًا ما يكون من الضروري أكثر من نهج واحد. كمثال مستقل ، من بين مجموعة من 26 SNPs التي سعينا من أجلها سابقًا لمقايسات TaqMan ، كان نصفها متاحًا مسبقًا والنصف الآخر مطلوب تصميمًا مخصصًا. من بين المجموعة المخصصة ، ستة تصميم فاشل ، نجح أحدهم في التصميم لكنه فشل في الفحص الفعلي ، وكان أداء الستة الباقي جيدًا. وهكذا ، تم تحويل 19 من 26 (73٪) بنجاح لمقايسة TaqMan ، بمعدل خطأ تقديري 0.004 (أربعة حالات عدم تطابق في النمط الجيني بين 1139 زوجًا من النمط الجيني المكرر).


التصميم التمهيدي باستخدام البرنامج

يتوفر عدد من أدوات التصميم التمهيدي التي يمكن أن تساعد في تصميم PCR التمهيدي للمستخدمين الجدد وذوي الخبرة على حد سواء. قد تقلل هذه الأدوات من التكلفة والوقت اللذين ينطوي عليهما التجريب عن طريق تقليل فرص فشل التجارب.

يتبع Primer Premier جميع الإرشادات المحددة للتصميم التمهيدي PCR. يمكن استخدام Primer Premier لتصميم مواد أولية للقوالب الفردية ، والمحاذاة ، وتصميم التمهيدي المنحل ، وتحليل إنزيم التقييد. تحليل كونتي وتصميم بادئات التسلسل.

تختلف المبادئ التوجيهية لتصميم qPCR التمهيدي قليلاً. يمكن لبرامج مثل AlleleID و Beacon Designer تصميم البادئات وتحقيقات قليل النوكليوتيد لفحوصات الكشف المعقدة مثل المقايسات المتعددة ، وتصميم التمهيدي للأنواع المتقاطعة ، وتصميم التمهيدي الخاص بالأنواع وتصميم التمهيدي لتقليل تكلفة التجربة.

PrimerPlex هو برنامج يمكنه تصميم مواد أولية لمقايسات التنميط الجيني متعدد الإرسال وتعدد أشكال SNP.


الطرق والمواد

C. ايليجانس سلالات تم استزراعها باستخدام الطرق القياسية 1. السلالات المستخدمة لبدء هذه الدراسة هي: CB1033 che-2 (e1033)، CB3329 che-10 (e1809)، IW523 che-10 (iw109) daf-3 (iw108)، CB3241 clr-1 (e1754)، CB1376 daf-3 (e1376)، VC20208 بدون daf-3 (gk269916)، VC20379 daf-3 (iw108)، RB2589 daf-3 (ok3610)، SD378 dpy-17 (e164) unc-79 (e1068) / mpk-1 (ga117)، JN554 dyf-11 (pe554)، PR813 osm-5 (p813)، VC40961 rund-1 (gk901813)، MT7554 sqv-3 (n2842) unc-69 (e587) / qC1، MT9647 unc-29 (e1072) sqv-5 (n3039) / hT2، PR691 tax-2 (p691) che-2 (iw107)، RB1546 tmc-1 (ok1859)، VC40425 tmc-1 (gk631913)، CB4856 عزلة هاواي HA البرية ، وسلالة من النوع البري N2. تم عمل سلالات إضافية باستخدام هذه السلالات.

تم استخراج بيانات المتغير الطبيعي i40-699 indels من WormBase 37 الإصدار WS256 باستخدام البرامج النصية المخصصة R 38 في دراسة منفصلة 39. لقد فحصنا أيضًا بيانات WS276 لإصدار WormBase للتأكد من تحديث بيانات WS256. باستخدام نصوص R مخصصة إضافية ، حددنا أقرب جين مطابق لكل i40-699 indel جنبًا إلى جنب مع الوضع الجيني والمادي للجين باستخدام مجموعة بيانات الجينات المشروحة WormBase. توجد قائمة تضم 11556 مشروحًا i40-699 indels في الجدول التكميلي S1 مع الموضع المادي وحجم indels ، وأقرب جين مع موقعها المادي والوراثي ، وتكرار ظهورها بين 40 عزلة برية ، وعزلات برية مع i40- 699 إنديل.

في تصميم البادئات ، استهدفنا حالة PCR موحدة والتمييز السهل بين N2 و CB4856 HA DNA. على سبيل المثال ، اخترنا i40-699 indels مع DNA N2 أطول من CB4856 للتمييز السهل. بالنسبة لدرجة حرارة التلدين المتطابقة ، تم ضبط درجة حرارة الانصهار المثلى Tm عند 60 & # x000b0C. للحصول على وقت استطالة مماثل ، حافظنا على أحجام منتجات N2 و CB4856 ضمن نطاق ضيق. مع مجموعة البرايمر النهائية ، تتراوح أحجام منتجات N2 بين 500 و 1500 نقطة أساس ، بينما تتراوح أحجام منتجات CB4856 بين 400 و 1300 نقطة أساس. لتسهيل الفصل بين منتجات PCR ، اخترنا عادةً indels تغيير طول & # x02009 & # x0003e & # x02009100 bp ، لكننا اخترنا عددًا قليلاً من indels من & # x02009 & # x0003c & # x02009100 تغيير الطول للحصول على ممثل i40-699 indel في معظم قاعدة الميغابايت (ميغابايت ) فترات. خلاف ذلك ، اخترنا i40-699 indels بشكل تعسفي. لتقليل الخلط بين منتجات PCR التي تم تضخيمها من جزء آخر من الجينوم ، تم إجراء Primer-BLAST 40 مبدئيًا باستخدام ستة C. ايليجانس تسلسل الكروموسوم كقالب مع التحقق من الخصوصية مقابل C. ايليجانس قاعدة بيانات النوكليوتيدات غير الزائدة عن الحاجة. تم اختيار مواد أولية إضافية باستخدام Primer-BLAST مرة أخرى أو باستخدام Primer3 مع تسلسل استنساخ cosmid أو fosmid أو YAC المناسب ، واختبرنا البادئات حتى تم تحديد زوج تمهيدي مرض. تم اختبار ما مجموعه 584 بادئة ، وتم سرد أفضل أزواج التمهيدي في الجدول التكميلي S2 مع الأحجام المتوقعة لمنتجات PCR ، ومعدلات نجاح PCR في ظل حالتين مختلفتين ، وشروح للوضع في لوحة 96-بئر عند الاقتضاء ، والعزلات البرية مع i40-699 indel.

تم تخزين مخزون العمل من أزواج التمهيدي الممزوج مسبقًا في 96 طبقًا مجمدة جيدًا لأن التخزين طويل الأجل عند 4 & # x000b0C أدى إلى التبخر والتدهور المحتمل. ما لم يُذكر خلاف ذلك ، تم فصل الخنثى البالغات بشكل فردي في 10 & # x003bcl من 1 & # x02009 & # x000d7 & # x02009lysis المخزن المؤقت (40 ملي مولار بوكل ، 10 ملي مولار تريس pH 8.3 ، 2.5 ملي MgCl2، 0.45٪ IGEPAL، 0.45٪ Tween 20) مع إضافة بروتيناز K قبل التحلل عند تركيز نهائي 60 & # x003bcg / مل. تم إجراء التحلل عند 65 & # x000b0C لمدة ساعة واحدة مع التعطيل عند 95 & # x000b0C لمدة 15 دقيقة باستخدام أنابيب 8 شرائح. غالبًا ما كانت الديدان المتحللة مختلطة أو مجمعة ، وغالبًا ما تم تخفيف العينات المجمعة بالماء أو 1 & # x02009 & # x000d7 & # x02009lysis عازلة تفتقر إلى بروتيناز K. تم إجراء PCR في حجم 25 & # x000b5l باستخدام الظروف القياسية بدون منظف لـ Taq polymerase. تم استخدام إما أنابيب ذات 8 شرائح أو 96 لوحًا جيدًا لـ PCR مع ختم رقائق الألومنيوم لـ 96 لوحًا جيدًا لتقليل التبخر. كانت حالة دورة درجة حرارة PCR هي: 5 & # x02032 95 & # x000b0C ، 35 دورة من (30 & # x02033 95 & # x000b0C ، 30 & # x02033 60 & # x000b0C ، 2 & # x02032 72 & # x000b0C) ، 5 & # x02032 72 & # x000b0 ج. تم تصور منتجات PCR بعد الفصل بالرحلان الكهربي لمدة 40 دقيقة عند 120 فولت على 2 ٪ هلام الاغاروز مع & # x02009

& # x020091.5 لتر من المخزن المؤقت الذي يعمل Tris & # x02013acetate-EDTA ما لم يُذكر خلاف ذلك. عادةً ما يتم تصحيح نتائج PCR السيئة المتكررة عن طريق إعداد جديد لـ 1 & # x02009 & # x000d7 & # x02009lysis المخزن المؤقت وتجاهل المخزونات القديمة من المخزن المؤقت 1 & ​​# x02009 & # x000d7 & # x02009lysis ، والذي يمكن أن يصبح أقل فعالية بعد عدة أشهر.

للحصول على طفرات F2 لرسم الخرائط ، تم تزاوج ذكور CB4856 مع خنثى متحولة ذات أهمية. بعد ذلك ، تم وضع خنثى متغاير الزيجوت F1 في ألواح جديدة مثل يرقات L4 لتكاثر ذرية F2 عن طريق الإخصاب الذاتي. أخيرًا ، تم تحديد طفرات F2 متماثلة اللواقح من خلال نمطها الظاهري المتحور ، والذي يمكن أن يكون واضحًا (Clr) والجسم المتقرح 42 ، الفرج المسحوق (Sqv) في المرحلة اليرقية L4 43 والعقم المرتبط بتشكيل نمطي للأجنة غير القادرة على التحلل الخلوي 44 ، أو a النمط الظاهري متحولة dauer التأسيسية المعتمدة على درجة الحرارة 45. تضمنت مجموعة من طفرات dauer المعتمدة على درجة الحرارة وضع مجموعة مختلطة من الأجنة ويرقات L1 عند 28 & # x000b0C لمدة 10 أيام في وجود الكثير من بكتريا قولونية تعمل البكتيريا كغذاء قبل العودة إلى 20 & # x000b0C للسماح للناجين من طفرات Dauer بأن يصبحوا بالغين خصبين متحولين.

تم إجراء اختبارات التكميل باستخدام النمط الظاهري للطفرة التأسيسية المعتمدة على درجة الحرارة باستخدام عدة طرق مختلفة. ل iw108 الموجود في الكروموسوم X أيضًا daf-3 (ok3610) أو dyf-11 (pe554) تم تزاوج الخنثى الطافرة مع ذكور N2 ، وتم تزاوج ذكور XO متحولة hemizygous F1 مع أي منهما daf-3 (iw108) أو dpy-17 (e164) unc-79 (e1068) daf-3 (iw108) خنثى متحولة. تم نقل المجموعات المختلطة من ذرية F2 إلى 28 & # x000b0C لمدة 10 أيام ثم تم نقلها بعد ذلك إلى 20 & # x000b0C ، وتم البحث عن خنثى بالغين غير خصيبيين غير Dpy في وجود ذكور أحياء. تم استخدام الناجين من Dauer الذين أصبحوا ذكورًا بالغين لتقييم التزاوج الناجح مع عدم وجود خنثى خصبة مما يشير إلى عدم وجود مكملات. مع الاختبارات باستخدام daf-3 (iw108) المسوخ خنثى بدون dpy-17 أو un-79 تم فحص الطفرات ، الناجين من Dauer الذين أصبحوا خنثى بالغين خصبين باستخدام PCR لتأكيد وجود أو عدم وجود الطفرات ذات الأهمية. تم استخدام نهج مماثل مع iw107 يوجد أيضًا في الكروموسوم X. وهنا أحد che-2 (e1033), daf-3 (ok3610), dyf-11 (pe554), rund-1 (gk901813), osm-5 (p813)، أو iw107 تم تزاوج خنثى متحولة مع ذكور N2 ، وتم تزاوج ذكور متحولة hemizygous F1 مع أحد che-2 (iw107), dpy-17 (e164) unc-79 (e1068) che-2 (iw107), dpy-17 (e164) unc-79 (e1068) che-2 (e1033), dpy-17 (e164) unc-79 (e1068) dyf-11 (pe554)، أو dpy-17 (e164) unc-79 (e1068) osm-5 (p813) خنثى. تم استخدام نهج مختلف مع iw109 يقع في الكروموسوم الثاني. هنا، che-10 (e1809) تم تزاوج الخنثى الطافرة مع ذكور N2 ، وتزاوج ذكور F1 متغاير الزيجوت مع أي منهما che-10 (iw109) أو dpy-17 (e164) unc-79 (e1068) che-10 (iw109) خنثى متحولة. بعد 10 أيام عند 28 & # x000b0C ، تم استخدام وجود الناجين من الداور الذين أصبحوا ذكورًا كدليل على التكامل.

تسلسل الجينوم الكامل che-10 (iw109) تم إجراء سلالة متحولة باستخدام Novogene (en.novogene.com) ، باستخدام خدمة تسلسل الجينوم الكامل للنباتات والحيوان مع إخراج بيانات 2 جيجا بايت لـ 20 & # x02009 & # x000d7 & # x02009 Coverage من الجينوم عن طريق تسلسل مزدوج نهاية 150 نقطة أساس. تم إجراء تسلسل Sanger باستخدام Genewiz (www.genewiz.com).


MCAT - البيولوجيا الجزيئية

1. يجب أن ينفصل الحمض النووي المزدوج المجدول أو ينفصل
• DNA gyrase (class II topoisomerase) مسؤول عن فك ال DNA قبل شوكة النسخ المتماثل
• هليكاز الحمض النووي هو المسؤول عن فك الحمض النووي في مفترق النسخ
• بروتين الربط أحادي الخيط (SSB) هو المسؤول عن الحفاظ على الحمض النووي غير ملتف بعد الهليكاز. تقوم SSBs بتثبيت الحمض النووي أحادي السلسلة من خلال الارتباط به.

2. بعد ذلك ، يتم تصنيع الحمض النووي ليكون مكملاً للحمض النووي المنفصل / المفكوك حديثًا. يحدث كل تخليق الحمض النووي البيولوجي من 5 'إلى 3' نهاية.
• يبدأ Primase في ذلك من خلال وضع مادة أولية قصيرة من الحمض النووي الريبي على الحمض النووي غير الملتوي. يتكون التمهيدي من الحمض النووي الريبي ، ولكنه مكمل لتسلسل الحمض النووي. في وقت لاحق ، يتم استبدال هذا الحمض النووي الريبي بالحمض النووي
• ثم يتولى بوليميراز الدنا ويصنع الدنا المكمل للحمض النووي غير الملتحم
• يحدث تخليق الحمض النووي على كل من خيوط الحمض النووي غير الملفوف. التركيب الذي يستمر في اتجاه شوكة النسخ المتماثل هو الخيط الرئيسي. التركيب الذي يستمر في الاتجاه المعاكس لشوكة النسخ المتماثل هو الخيط المتأخر. يحتوي الشريط المتأخر على شظايا أوكازاكي.


الملخص

تعتبر عمليات الإدراج والحذف (indels) في المناطق غير المشفرة من البلاستيدات الخضراء علامات وراثية شائعة لتقدير بنية السكان وتدفق الجينات ، على الرغم من أنه لا يُعرف سوى القليل نسبيًا عن تطور indel بين السلالات المتباعدة مؤخرًا مثل داخل العائلات النباتية. نظرًا لأن أحداث indel تميل إلى الحدوث بشكل غير عشوائي على طول تسلسل الحمض النووي ، فإن الطفرات المتكررة قد تولد homoplasy للأنماط الفردانية indel. هذه مشكلة محتملة لدراسات السكان ، لأنه يمكن مشاركة الأنماط الفردانية المستقلة بين السكان بعد حدوث طفرة متكررة وكذلك تدفق الجينات. Furthermore, indel haplotypes may differ in fitness and therefore be subject to natural selection detectable as rate heterogeneity among lineages. Such selection could contribute to the spatial patterning of cpDNA haplotypes, greatly complicating the interpretation of cpDNA population structure. This study examined both nucleotide and indel cpDNA variation and divergence at six noncoding regions (psbB-psbH, atpB-rbcL, trnL-trnH, rpl20-5′rps12, trnS-trnG, and trnH-psbA) in 16 individuals from eight species in the Lecythidaceae and a Sapotaceae outgroup. We described patterns of cpDNA changes, assessed the level of indel homoplasy, and tested for rate heterogeneity among lineages and regions. Although regression analysis of branch lengths suggested some degree of indel homoplasy among the most divergent lineages, there was little evidence for indel homoplasy within the Lecythidaceae. Likelihood ratio tests applied to the entire phylogenetic tree revealed a consistent pattern rejecting a molecular clock. Tajima's 1D and 2D tests revealed two taxa with consistent rate heterogeneity, one showing relatively more and one relatively fewer changes than other taxa. In general, nucleotide changes showed more evidence of rate heterogeneity than did indel changes. The rate of evolution was highly variable among the six cpDNA regions examined, with the trnS-trnG and trnH-psbA regions showing as much as 10% and 15% divergence within the Lecythidaceae. Deviations from rate homogeneity in the two taxa were constant across cpDNA regions, consistent with lineage-specific rates of evolution rather than cpDNA region-specific natural selection. There is no evidence that indels are more likely than nucleotide changes to experience homoplasy within the Lecythidaceae. These results support a neutral interpretation of cpDNA indel and nucleotide variation in population studies within species such as Corythophora alta.


For more information about SNPs:

An audio definition of SNPs is available from the National Human Genome Research Institute’s Talking Glossary of Genetic Terms.

How scientists locate SNPs in the genome is explained by the University of Utah Genetic Science Learning Center.

For people interested in more technical data, several databases of known SNPs are available:


شاهد الفيديو: Single Nucleotide Polymorphism: Definition, Meaning, and Examples (شهر نوفمبر 2022).