معلومة

ما الذي يحدد كمية البيانات التي ستحصل عليها من تجربة التسلسل؟

ما الذي يحدد كمية البيانات التي ستحصل عليها من تجربة التسلسل؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

عندما يقوم شخص ما بإجراء تجربة تسلسل ، ما الذي يحدد مقدار بيانات التسلسل التي تحصل عليها من الجهاز (Illumina ، PacBio ، Nanopore ، إلخ). أو ربما ، بعبارة أخرى ، كيف تعرف الآلة أن ذلك قد تم؟


في آلة Illumina ، تقوم الأداة بتشغيل العديد من الدورات كما تخبرها بذلك. إذا طلبت منه تشغيل 150 دورة ، فستحصل على 150 مترًا كناتج.


أساسيات التسلسل

يستخدم التسلسل الفلوري الآلي تنوعًا من بروتوكول إنهاء سلسلة Sanger الذي تم تطويره منذ أكثر من 20 عامًا. في هذه الطريقة ، يعمل الحمض النووي المراد تسلسله كجزيء نموذجي ، حيث يصلب قليل النوكليوتيد التكميلي القصير (التمهيدي) لبدء التمديد الأنزيمي والتضخيم لمنطقة معينة من الحمض النووي المزدوج الشريطة. ستكون الأجزاء التي تم إنشاؤها حديثًا مكملة لقالب الحمض النووي. تحدث هذه العملية أثناء تفاعل تسلسل الدورة ، وهي عملية يجب أن تخضع لها كل عينة نتلقاها من أجل أن يتم تضخيمها وتسميتها الفلورية للكشف عنها على أجهزة التسلسل الخاصة بنا.

في تفاعل تسلسل الدورة هذا ، يتم دمج القالب والتمهيدي مع خليط تفاعل يتكون من dNTPs ، ddNTPs المسمى الفلوريسنت ، إنزيم Amplitaq FS بوليميريز والمخزن المؤقت. يتكون تفاعل تسلسل الدورة من ثلاث خطوات - التمسخ والتليين والتمديد - ويحدث في جهاز تدوير حراري ، وهو أداة تسمح بالتحكم في التسخين والتبريد لتفاعلاتنا. تتكرر هذه الخطوات لمدة 35 دورة لضمان تضخيم كافٍ للحمض النووي المسمى ، وتستغرق حوالي 3 ساعات ونصف لإكمالها.

أثناء خطوة التمسخ ، التي تحدث عند 96 درجة مئوية ، يتم أولاً فصل الحمض النووي للقالب مزدوج السلسلة إلى جزيئات مفردة السلسلة. في مرحلة التلدين ، تنخفض درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية حتى تتمكن جزيئات التمهيدي الصغيرة من العثور على مناطقها التكميلية في قالب الحمض النووي أحادي الجديلة الآن وتهجينها أو تصلبها بشكل صحيح. يتم بعد ذلك رفع درجة الحرارة إلى 60 درجة مئوية (خطوة التمديد) للسماح لإنزيم بوليميريز Taq بالبدء في دمج النيوكليوتيدات في سلاسل متزايدة من الأجزاء التي تم إنشاؤها حديثًا والتي تكون مكملة لقالب الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل. تبدأ منتجات التمديد هذه في نهاية التمهيدي وتمتد في اتجاه 3 بوصات. يحدث إنهاء السلسلة أثناء خطوة التمديد هذه. يحتوي خليط التفاعل الخاص بنا على خليط من ديوكسينوكليوتيدات (dNTPs) وديوكسين نيوكليوتيدات (ddNTPs) ، بتركيزات تخلق احتمالية إحصائية بأن يتم دمج ديوكسينوكليوتيد بدلاً من ديوكسينوكليوتيد في كل موضع نيوكليوتيد في الأجزاء التي تم إنشاؤها حديثًا. عندما يتم دمج dNTP ، سيستمر الجزء الجديد في النمو. يحتوي ddNTP على ذرة هيدروجين بدلاً من مجموعة الهيدروكسيل في نهايته 3 ولا يمكنه المشاركة في مزيد من التمديد. لذلك ، عندما يتم دمج ddNTP ، يتم حظر المزيد من استطالة السلسلة وهذا يؤدي إلى مجموعة من المنتجات المقطوعة بأطوال متفاوتة.

عند الفصل بالرحلان الكهربي ، يتشكل "سلم" من هذه المنتجات المقطوعة ، يختلف كل منها في الحجم بواسطة نيوكليوتيد واحد ، مع تشغيل أصغر الأجزاء المنتهية بشكل أسرع على الهلام. هناك أربعة ddNTPs مختلفة تتوافق مع كل من نيوكليوتيدات الحمض النووي الأربعة ، ولكل ddNTP لون مختلف. وبالتالي ، سيحتوي كل جزء مبتور على ddNTP ذي العلامات الفلورية في نهايته 3 ، وسيتكون سلم التسلسل من نطاقات ملونة. يمكن بعد ذلك تحديد التسلسل من خلال ربط لون الشريط الموجود على الجل مع ddNTP الخاص به ، والترتيب الذي يعمل به على الجل. لذلك ، فإن النطاق الأول والأصغر المرئي سوف يتوافق مع النيوكليوتيدات المسمى الأول المدمج مباشرة بجوار التمهيدي. سيكون النطاق الثاني هو الأجزاء التي تتكون من 1 dNTP غير مسمى و 1 مُسمى ddNTP أنهى تلك السلاسل المتنامية المعينة. ستتكون الفرقة الثالثة من 2 dNTPS غير مسمى متبوعًا بـ 1 ddNTP ، وهكذا فوق الجل.

بمجرد تضخيم العينة وتمييزها ، يجب أن يتم فصلها بالكهرباء لفصل الأجزاء المسمى وتصورها. كما ذكرنا سابقًا ، يتم تمييز ddNTPs بشكل فلوري. الأصباغ المرفقة عبارة عن أصباغ لنقل الطاقة وتتكون من صبغة مانحة للطاقة من الفلورسين مرتبطة بصبغة متقبل للطاقة ثنائي كلورو هودامين. يعد نظام نقل الطاقة هذا أكثر حساسية من نظام الصبغة الواحدة ويسمح لنا باستخدام كميات أقل من الحمض النووي للكشف ، بالإضافة إلى أنه يسمح لنا الآن بتسلسل جزيئات الحمض النووي الكبيرة جدًا ، مثل BACs و PACs وحتى بعض الحمض النووي الجيني البكتيري ، كانت الأساليب الأقل حساسية في السابق غير قادرة على إدارتها.

يتم تحميل هذه الأجزاء ذات العلامات الصبغية على أجهزة التسلسل وخلال الرحلان الكهربائي ، يتم ترحيلها إما من خلال هلام بولي أكريلاميد أو بوليمر سائل ويتم فصلها بناءً على حجمها. نحو نهاية الهلام أو الشعيرات الدموية ، يمرون عبر منطقة تحتوي على نافذة قراءة ، يمر خلفها شعاع الليزر ذهابًا وإيابًا خلف العينات المهاجرة. يقوم هذا الليزر بإثارة الأصباغ الفلورية الملحقة بالشظايا ثم ينبعث منها ضوء بطول موجة محدد لكل صبغة. يتم فصل هذا الضوء المنبعث وفقًا لطول الموجة بواسطة جهاز قياس الطيف على جهاز مبرد ، أو جهاز مقترن بالشحن ، أو كاميرا CCD ، بحيث يمكن الكشف عن جميع انبعاثات الفلورسنت الأربعة بواسطة تمريرة ليزر واحدة. يجمع برنامج جمع البيانات شدة الضوء هذه من كاميرا CCD في نطاقات أطوال موجية معينة ، أو مرشحات افتراضية ، ويخزنها على كمبيوتر جهاز التسلسل كإشارات رقمية للمعالجة. ثم يفسر برنامج التحليل كثافة الفلورسنت في كل نقطة بيانات ويعين تفسيرات دعوته الأساسية.

الأجهزة في مختبرنا

يستخدم معمل تسلسل الحمض النووي في Roswell Park حاليًا اثنين من أجهزة التحليل الوراثي ABI PRISM 3130XL. إنها أجهزة تسلسل الحمض النووي الشعرية المؤتمتة التي تصنعها شركة أبلايد بيوسيستمز. يستخدم كل 3130 مجموعة مكونة من 16 شعريًا ، والتي يمكنها تشغيل 176 عينة في 24 ساعة باستخدام التكوين الحالي لدينا أو ما يصل إلى 384 عينة في غضون 24 ساعة باستخدام بروتوكول يعطي أطوال قراءة أقصر ، ولكنه يسمح بأقصى قدر من الإنتاجية.

مع 3130 ، يعتمد تحميل العينة على الحقن الكهربي. عندما يتم وضع صفيحة من العينات على سطح تحميل الجهاز ، فإن المصفوفة المكونة من 16 شعريًا تنخفض في أول ستة عشر عينة من الآبار ، ويتم تطبيق الجهد والأيونات السالبة الشحنة ، والتي تعد في الأساس منتجات تمديد الحمض النووي ولكنها قد تحتوي أيضًا على مواد متداخلة مثل يتم حقن الأملاح في مجموعة الشعيرات الدموية. هذا هو أحد الأسباب التي تجعل الحمض النووي نظيفًا بشكل خاص للتشغيل على 3130 حيث يتم حقن الأيونات السالبة الشحنة الأصغر ، مثل الأملاح ، بشكل تفضيلي ويمكن أن تتداخل مع هجرة شظايا الحمض النووي.

يمر البوليمر السائل المتدفق عبر 16 شعيرات دموية في الصفيف ليكون بمثابة مصفوفة فصل. يتم دفع قسامة جديدة من البوليمر في الشعيرات الدموية قبل كل جريان ، مما يؤدي إلى طرد البوليمر من التشغيل السابق. في السابق ، استخدم مختبرنا أطول مصفوفة شعيرية متوفرة لطول 3100 و 80 سم ، وبوليمر النظم البيولوجية التطبيقية POP-4 لوسط الفصل. أعطت هذه المجموعة حوالي 900 قاعدة للتسلسل المفيد ، ويمكن الحصول على بيانات لستة عشر عينة في 3 ساعات و 40 دقيقة باستخدام هذه المجموعة والبوليمر. ومع ذلك ، فقد طورنا منذ ذلك الحين بروتوكولات تشغيل معدلة تستخدم أحدث بوليمر من أبلايد بيوسيستمز ، POP-7 ، ومجموعة 50 سم. تم تطوير هذا البوليمر خصيصًا لجهاز التسلسل عالي الإنتاجية من ABI (الطراز 3730) وقد ثبت أنه يوفر أطوال قراءة أطول مقترنة بأوقات تشغيل أقصر ولكن لم يكن مدعومًا للاستخدام في الطراز 3100. قبل الترقية إلى طرازات 3130 ، تمكنت من الحصول ، في المتوسط ​​، على أكثر من 900-950 من قواعد Phred Q20 من خلال بروتوكول "القراءة الطويلة" وقواعد 850-900 Q20 من خلال بروتوكول "القراءة القياسي" الخاص بنا باستخدام بروتوكولاتنا المعدلة. يعمل بروتوكول "القراءة الطويلة" لمدة ساعتين و 45 دقيقة. يكتمل بروتوكول "القراءة القياسي" الخاص بنا في غضون ساعتين و 5 دقائق. تم تقديم بعض من هذا العمل في التقنيات الحيوية. (2004 يونيو 36 (6): 932-3). من خلال ترقيات 3130 ، يمكننا الحصول على أطوال قراءة مماثلة ودرجات جودة مماثلة في فترة زمنية أقصر إلى حد ما.

يتم تسهيل الرحلان الكهربائي بواسطة دائرة كهربائية عالية الجهد في 3130. يتم توصيل الشحنة من خلال الدائرة بواسطة DNA والأيونات في البوليمر ، والأيونات في المخزن المؤقت المستخدم في الأداة ، ومن خلال الأسلاك الكهربائية والأقطاب الكهربائية. يمكن لـ 3130 تبديد الحرارة من هذا الجهد بشكل متساوٍ وفعال بسبب مساحة السطح الكبيرة لشعيرات السيليكا المصهورة. هذه السمة هي التي تسمح بتطبيق الجهد العالي أثناء الرحلان الكهربي ، ونتيجة لذلك ، يساهم في تقليل أوقات التشغيل بشكل كبير دون فقدان الدقة. لم تستطع أجهزة التسلسل الأقدم مثل أبلايد بيوسيستمز 377 ، التي استخدمت جل بلاطة لفصل أجزاء الحمض النووي ، تبديد الحرارة أيضًا ، وكان لابد من تشغيلها بشكل أبطأ وأطول للوصول إلى أطوال قراءة مماثلة لتلك الموجودة في 3130.

تمر أجزاء التسلسل عبر خلية كشف في نهاية الصفيف. تنتقل الأجزاء الأقصر بسرعة أكبر من الأجزاء الأطول وتمر عبر خلية الكشف بهذا الترتيب. يتسبب شعاع ليزر الأرجون-أيون في إثارة الإلكترونات الموجودة على الأصباغ المرتبطة بشظايا الحمض النووي إلى حالة طاقة أعلى. عندما يعودون إلى حالتهم الأرضية ، يتألقون. يتم التقاط الفلورة المنبعثة بواسطة كاميرا جهاز مقترن بالشحن (CCD). تتكون هذه الكاميرا من شريحة سيليكا بآلاف البكسلات التي تخزن شحنة كهربائية تتناسب مع شدة التألق الذي يصل إليها. تقوم كاميرا CCD بعد ذلك بتحويل معلومات الفلورة إلى بيانات إلكترونية يتم نقلها إلى جهاز كمبيوتر للمعالجة. يعالج البرنامج هذه البيانات من أجل إنشاء مخطط كهربية حيث تمثل كل قمة جزءًا واحدًا من منتج تسلسل الحمض النووي.

ما أنواع الحمض النووي التي يمكننا تسلسلها وكم نحتاج؟

يمكن لمختبر تسلسل الحمض النووي تسلسل مجموعة متنوعة من عينات الحمض النووي ، بما في ذلك البلازميدات ، والكونسميدات ، ومنتجات PCR ، والحمض النووي للعاثية أحادية السلسلة ، و BAC أو PAC المستنسخة. عند تقديم الحمض النووي للتسلسل ، وإذا كنت تقدم بادئات التسلسل الخاصة بك ، فيجب تعديل تركيزات الأنواع المختلفة من الحمض النووي على النحو التالي:

نوع الحمض النووي التركيز مطلوب المجموع المستخدم في التفاعل
بلازميد 200-250 نانوغرام / ماي 500-700 نانوغرام
كوزميد 200-250 نانوغرام / ماي 500-700 نانوغرام
منتج PCR 10-20 نانوغرام / ماي 10 نانوغرام / 100 برميل
Phage واحد الذين تقطعت بهم السبل 100-150 نانوغرام / ماي 300 نانوغرام
BAC / PAC 300-400 نانوغرام / ماي 700-900 نانوغرام
التمهيدي المخصص الخاص بك 1 uM = 1 pmol / uL =

* يرجى ضبط تركيزات الحمض النووي والبادئة وفقًا لمتطلبات التركيز الخاصة بنا.

في التركيزات المذكورة أعلاه ، سوف نستخدم حوالي 3-4 ميكرولتر لكل تفاعل. أيضًا ، لا يلزم أن تكون هذه القياسات 200ng / ul بالضبط أو 10 نانوغرام / ul أو أيهما ينطبق - فهذه تقديرات تقريبية للمدى الذي نرغب فيه وإذا كنت بعيدًا قليلاً - قل أو أعط أو خذ 30 نانوغرام / ul للبلازميدات ، 2-3 نانوغرام / ul لمنتجات PCR - من المحتمل أن تظل جيدة حيث توجد مجموعة من التركيزات التي يمكننا استخدامها وما زلنا نحصل على بيانات تسلسل جيدة. وإذا كانت عائداتك أقل بكثير من متطلباتنا ، فلديك خياران. أولاً ، إذا كان لديك وصول إلى جهاز طرد مركزي فراغ ، فقم بقسمة وحدة تخزين تحتوي على إجمالي الكمية التي سنستخدمها ، ثم جففها ثم أعد تعليقها في الماء إلى التركيز الذي نريده. على سبيل المثال ، إذا كان تركيز DNA البلازميد الأولي الخاص بك هو 50 نانوغرام / مايكرولتر ، فقم بإخراج 10-15 ميكرولتر ، وجففها ثم أضف 3 ميكرولتر من الماء. إذا لم يكن لديك وصول إلى جهاز طرد مركزي فراغ ، فقم بتدوين ملاحظة في حقل التعليقات في نموذج الطلب الخاص بك وسنستخدم حجمًا أكبر من عينتك في تفاعل تسلسل الدورة.

ومع ذلك ، ضع في اعتبارك أن الحد الأقصى لحجم الحمض النووي الذي يمكننا إضافته إلى تفاعل التسلسل هو 10 ميكرولتر ، لذلك من أجل الوصول إلى الحد الأدنى من إجمالي كمية الحمض النووي ، لا يمكن أن يكون تركيزك أقل بكثير من 50 نانوغرام / أول بالنسبة للبلازميدات أو الكوسميدات ، 70 -90 نانوغرام / ماي لعينات BAC و PAC. إذا كان تركيز عينتك أقل من ذلك ، ولا يمكنك الوصول إلى جهاز طرد مركزي بالفراغ ، فأخبرنا بذلك ويمكننا تجفيفه لك في جهاز الطرد المركزي لدينا ، أو سنوضح لك كيفية القيام بذلك. بدلاً من ذلك ، يمكنك ترسيب الإيثانول وإعادة التعليق بحجم أصغر لتركيز عيناتك ولكن تذكر إزالة جميع آثار الإيثانول.

بشكل عام ، بالنسبة لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لا يمثل إنتاجية المنتج مشكلة إذا تم تحسين ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل وقويتها. ومع ذلك ، إذا كان لديك منتج PCR كبير يحتاج إلى التسلسل ، فسيتطلب ذلك مزيدًا من الحمض النووي (على سبيل المثال ، يتطلب منتج PCR سعة 2 كيلو بايت 100-150 نانوغرام من الحمض النووي) ، لذلك قد ترغب في زيادة رد فعلك أو تجمعك ردود فعل متعددة معًا. بالإضافة إلى ذلك ، عند تقديم البادئات المخصصة الخاصة بك ، يرجى ضبط تركيزها على 1 ميكرومتر ، أو 10 ميكرومتر لعينات BAC / PAC. في هذه التركيزات ، سوف نستخدم 4 مايكرولتر من التمهيدي لكل تفاعل. نحن نقدم عددًا من البادئات المتجهة الأكثر شيوعًا ، مجانًا ، للتسلسل. يرجى التحقق من الرابط في Primers الذي نقدمه للاطلاع على القائمة الكاملة. وكلما أمكن ، يرجى توفير ما يكفي من الحمض النووي والبادئة لتفاعلين في حال احتجنا إلى تكرار رد فعل لأي سبب من الأسباب.

اختيار سلالة مضيفك

يعد اختيار سلالة مضيفك لإعداد القالب الخاص بك اعتبارًا مهمًا ، حيث ستنتج بعض السلالات حمض نووي أفضل جودة للتسلسل الآلي. قد تطلق سلالات معينة من الإشريكية القولونية عوامل معينة ، مثل نوكليازات داخلية وكميات كبيرة من الكربوهيدرات ، أثناء تحللها الذي يمكن أن يثبط تحضير الحمض النووي وتسلسله. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لبعض المكونات الخلوية ، مثل السكريات الموجبة الشحنة ، أن تتنافس مع الحمض النووي للربط في طرق تحضير الحمض النووي القائمة على السيليكا والتي تُستخدم بشكل شائع في العديد من المجموعات التجارية. يوصى دائمًا بالتحقق من الشركات المصنعة لسلالات معينة لتحديد ما إذا كانت هناك أي صعوبات معروفة قد تنشأ عند استخدام سلالاتهم مع تطبيقاتك. تشمل سلالات المضيف التي تعطي بيانات موثوقة بشكل عام DH5alpha و DH10B و DH1 و C600 و XL1-Blue و XL10-Gold و TOP-10 و NM294. ينمو XL1 Blue بشكل أبطأ من معظم السلالات ويمكن أن يؤدي إلى انخفاض إنتاجية الحمض النووي ، ولكنه لا يزال يعمل بشكل جيد في العادة. لا يُنصح باستخدام سلالات مثل JM101 و JM83 و HB101 و TB1 و TG1 لأنها يمكن أن تطلق كمية كبيرة من العوامل المثبطة أثناء التحلل والتي يمكن أن تؤدي إلى رداءة نوعية الحمض النووي التي تتطلب خطوات تنقية إضافية.

العوامل الأخرى التي يجب مراعاتها عند الاستعداد لنمو الثقافات هي اختيار الوسائط واختيار المضادات الحيوية. يجب تجنب فرط نمو الخلايا حيث تبدأ الخلايا في التحلل سريعًا إلى حد ما بعد الوصول إلى المرحلة الثابتة ، مما يؤدي إلى إطلاق كميات كبيرة من الكروموسومات والبلازميد DNA المتدهورة وكذلك السكريات التي يصعب فصلها بعيدًا عن DNA البلازميد. يوصى عادةً باستخدام وسائط LB القياسية أو الوسائط الغنية المخزنة مؤقتًا ، حيث أن الثقافة الليلية لمدة 10-12 ساعة ستعطي عمومًا كثافة خلية مناسبة للتحميل على الأعمدة أو الأغشية ، بالإضافة إلى أنها ستحتوي على نسبة أقل بكثير من المواد الخلوية المتدهورة وتلوث الحمض النووي . من الأفضل تجنب الوسائط مثل TB أو 2xYT لأنها ستصل إلى المرحلة الثابتة في وقت أقرب بكثير ، وبالتالي فإن الثقافة الليلية ستعطي كثافة خلية عالية بشكل غير مناسب بالإضافة إلى نسبة أكبر من المواد المثبطة. إذا كان يجب عليك استخدام وسائط مثل هذه ، فمن المستحسن مراقبة وقت الثقافة ورقم الخلية لتجنب تلوث الحمض النووي وتحميل العمود الزائد. إحدى الحيل التي يجب تجربتها هي غسل الخلايا المكوّنة بحبيبات بـ 0.5M NaCl قبل التحلل مباشرةً للمساعدة في إزالة السكريات ومواد الوسائط التي قد تتشتت مع الحمض النووي الخاص بك. أعد تعليق الحبيبات في محلول 0.5 كلوريد الصوديوم ، ودوامة جيدًا وتدور مرة أخرى ، وإزالة المادة الطافية عند الانتهاء.

يجب الحفاظ على اختيار المضادات الحيوية طوال الوقت لتجنب نمو الخلايا التي لا تحتوي على البلازميد. في حالة عدم وجود اختيار فعال ، فإن الخلايا التي لا تحتوي على البلازميد سوف تتفوق على الخلايا التي تفعل ذلك ، مما يؤدي إلى ضعف إنتاج الحمض النووي المطلوب. بالإضافة إلى ذلك ، تقوم بعض البلازميدات باستقلاب بعض المضادات الحيوية ، مثل الأمبيسلين ، أثناء نمو الخلايا ، لذلك من المهم توفير تركيزات مناسبة من المضادات الحيوية لتقليل نضوبها. يجب اقتطاع المضادات الحيوية وتجميدها للحفاظ على الفعالية المثلى.

إعداد القالب وتنقيته

نقاء القالب وتركيزه هما العاملان الأكثر أهمية في الحصول على بيانات تسلسل ذات جودة جيدة. نقاء القالب وتركيزه هما أهم عاملين في الحصول على بيانات تسلسل ذات جودة جيدة. لا ، هذا ليس خطأ مطبعي ، إنه فقط أننا لا نستطيع التأكيد على هذا المبدأ بما فيه الكفاية عندما يتعلق الأمر بتسلسل الفلورسنت الآلي ، خاصة في 3130s التي تتطلب أساليب تنظيف أكثر صرامة. يعتبر تسلسل الفلورسنت حساسًا جدًا لبعض الملوثات في عينة الحمض النووي والحمض النووي الذي يعتبر نظيفًا بدرجة كافية للعديد من الإجراءات البيولوجية الجزيئية الأخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو الاستنساخ أو حتى التسلسل الإشعاعي اليدوي ، وهو ليس بالضرورة نظيفًا بدرجة كافية لتسلسل الفلورسنت ويمكن أن يؤدي إلى ضعف جودة البيانات أو في بعض الأحيان لا توجد بيانات على الإطلاق. في هذا القسم ، نسرد توصياتنا بشأن أفضل الطرق لتنظيف وتحديد كمية الحمض النووي الخاص بك ، اعتمادًا على نوع الحمض النووي الذي تحاول تسلسله.

تعد مجموعات Qiagen واحدة من أكثر الطرق المقبولة عالميًا لإعطاء DNA عالي الجودة باستمرار للتسلسل الآلي. هذا لا يعني أنه لا توجد طرق أخرى لا تعمل - لقد قمنا بإدراج بعض البروتوكولات الأخرى الموصى بها - ولكن في تجربتنا ، فإن طرق تنظيف Qiagen لديها فقط أفضل سجل تتبع من حيث الموثوقية والاتساق في منتجها النهائي.

هناك خيار آخر متاح لتنقية الحمض النووي الذي يعطي نموذجًا عالي الجودة لتسلسل الحمض النووي الآلي هو مجموعة Mini-Plasmid DNA Isolation المتاحة من مركز خدمة البحوث الطبية الحيوية (BRSC) في جامعة ولاية نيويورك. هذه المجموعة هي "طريقة تحضير مصغرة معدلة ومبسطة لتحلل قلوي من Sambrook وآخرون. (Molecular Cloning، CSH، NY) تلغي الحاجة إلى معالجة RNase إضافية واستخراج الفينول الكلوروفورم. يمكن تنقية DNA البلازميد بسهولة وسرعة من زراعة الإشريكية القولونية طوال الليل في 15 دقيقة بإنتاجية نموذجية من 1-5 ملغ من الحمض النووي لكل مل من المزرعة. الحمض النووي مناسب لتقييد الهضم وتحضير المسبار وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل. خطوة إضافية مدتها 5 دقائق من ترسيب PEG (PS-4) لإزالة أي كمية ضئيلة من الحمض النووي الريبي (RNA). يمكن الحصول بسهولة على قراءات تسلسل الحمض النووي عالية الجودة (يتم حل ما يقرب من 1000 قاعدة في كل عملية تسلسل) إذا تم عزل DNA البلازميد من E مناسب . coli. العدة (تكفي لـ 300 تحضير صغير) مستقرة لمدة سنة على الأقل إذا تم التعامل معها وتخزينها بشكل صحيح. " (مأخوذ من موقع BRSC الإلكتروني). بسعر 95 دولارًا مقابل 300 قطعة صغيرة من البلازميد ، تعد هذه المجموعة أرخص بكثير من مجموعات Qiagen (حوالي ربع التكلفة) ، وهي سريعة وسهلة الاستخدام للغاية. لقد رأينا بشكل مباشر أن جودة الحمض النووي التي تم الحصول عليها من هذه المجموعة ممتازة للتسلسل وننصح باستخدام هذه المجموعة لتنقية الحمض النووي. BSRC هو مورد محلي لجامعة ولاية نيويورك يعزز البحث الترجمي التعاوني ، ويطور ويسوق المنتجات المبتكرة ، ويصنع كواشف بحثية عالية الجودة لمجتمع علوم الحياة الواسع. لمزيد من المعلومات حول BSRC ومنتجاتها ، يمكنك التحقق من موقع الويب الخاص بهم على: http://www.acsu.buffalo.edu/

يمكن العثور على ارتباط إلى بروتوكول مجموعة عزل DNA البلازميد المصغر على: بروتوكول الإعداد المصغر للبلازميد.

قوالب البلازميد

اعتبارات عند تنظيف مستحضرات البلازميد

تعد جودة القالب الرديئة أحد الأسباب الأكثر شيوعًا لبيانات التسلسل السيئة ، كما ذكر أعلاه ، وهي اعتبار رئيسي عند اختيار طريقة تنظيف البلازميد لإعطاء الحمض النووي النقاء الأمثل للتسلسل الآلي. يمكن أن تتأثر جودة قالب البلازميد بمجموعة متنوعة من العوامل والملوثات بما في ذلك ما يلي:

  • الأملاح أو المواد العضوية المتبقية من إعداد القالب
  • وجود مكونات خلوية مثل RNA أو البروتينات أو السكريات أو الحمض النووي الصبغي
  • الحمض النووي الذي تدهور أثناء التخزين
  • حبيبات السيليكا التي تنتقل من مجموعات إعداد القوالب التي تستخدم حلول الراتنج أو السيليكا السائبة

فيما يلي جدول بالملوثات المسموح بها ونطاقات تركيزها المقبولة التي لا تزال تسمح ببيانات تسلسل جيدة:

ملوث المقدار المتسامح في التفاعل المتسلسل
RNA 1 ميكروغرام
ربط 0.3%
NaOAc 5-10 م
الإيثانول 1.25%
الفينول 0%
CsCl 5 م
EDTA 0.25 ملم

بعض التعليقات حول تأثيرات بعض هذه الملوثات مذكورة أدناه:

RNA - كما ترون من القيمة الموضحة في الرسم البياني أعلاه ، يمكن في الواقع تحمل كمية كبيرة من الحمض النووي الريبي في تفاعل التسلسل. إنه ملوث شائع في minipreps البلازميد ، خاصةً عندما تكون الأعمدة محملة بشكل زائد ويتم تجاوز سعة مخازن التحلل - يمكن أن يكون التحميل الزائد مشكلة في Qiagen minipreps. إحدى الطرق التي يمكن أن يتدخل بها الحمض النووي الريبي هي عند قياس إعدادات الحمض النووي الخاصة بك عن طريق مقياس الطيف الضوئي - يمتص الحمض النووي الريبي أيضًا عند 260 ، وعندما يكون هناك كمية كبيرة ، يمكن أن تتخلص من دقة تركيزك. من الأفضل ، إذن ، معالجة تحضيرات النموذج باستخدام RNase أو ترسيب الملح المرتفع وأيضًا قياس عيناتك عن طريق الهلام وكذلك بالطيف الطيفي.

ربط- يمكن أن يكون لوجود البولي إيثيلين جلايكول المتبقي في إعداد القالب تأثير مثبط على دورة تسلسل إنزيم Taq polymerase ويؤدي إلى ضعف الإشارة.

أملاح- تنخفض عملية معالجة بوليميراز Taq المستخدم في تفاعل تسلسل الدورة في وجود كميات عالية من الأملاح. قد ينتج تلوث الملح في محضرات الحمض النووي عن الترسيب المشترك للأملاح في ترسبات الكحول ، وإزالة غير كافية للمادة الطافية بعد الترسبات أو الغسيل غير الكامل للحبيبات باستخدام 70٪ من الإيثانول. يجب استخدام أسلوب دقيق عند الترسيب بالكحول. وقد ثبت أيضًا أن أيونات الأسيتات ، على عكس أيونات الصوديوم أو البوتاسيوم أو الكلوريد ، هي الأكثر تثبيطًا في تسلسل التفاعلات. عند استخدام أسيتات البوتاسيوم أو أسيتات الصوديوم ، أدت التركيزات التي تزيد عن 20 ملي مولار إلى فشل كامل في تفاعلات التسلسل ، بينما كانت التركيزات 60 ملي مولار من كلوريد الصوديوم مطلوبة قبل التثبيط الكامل. يمكن أن تكون الأملاح مثبطة عندما نقوم بتسلسل العينات على 377 المعتمدة على الهلام ، ولكنها تكون أكثر إشكالية عند تشغيل العينات على نظام الشعيرات الدموية 3100 حيث يتم حقن هذه الأملاح الصغيرة المشحونة بشكل تفضيلي وتتداخل مع هجرة عينات الحمض النووي.

الإيثانول- يمكن أن يحدث تلوث بالإيثانول عندما يتم تجفيف العينة بشكل غير كاف بعد الترسيب أو عند ترحيلها في محلول غسيل يحتوي على الإيثانول المستخدم في بعض إجراءات عزل الحمض النووي. عادةً ما يؤدي التلوث بتركيزات 10٪ أو أكثر من الإيثانول إلى فشل تفاعل تسلسل الحمض النووي. مطلوب تجفيف كامل لعينات الحمض النووي لإزالة هذه الآثار من الإيثانول.

الفينول- يمكن نقل الفينول من طرق التحلل القلوي DNA التي تستخدم الفينول والكلوروفورم لإزالة البروتينات والملوثات الخلوية الأخرى من محللات الخلية. لا يمكن تحمل الفينول في تفاعل تسلسل الدورة لأنه يفسد البروتينات وبالتالي سيحلل إنزيم بوليميريز Taq المستخدم في تفاعل تسلسل الدورة. لا يحتوي الكلوروفورم على خصائص تغيير طبيعة الفينول القوية ولا يبدو أنه يؤثر سلبًا على تفاعل التسلسل.

كلوريد السيزيوم - عند استخدام بروتوكول تدرج كثافة كلوريد السيزيوم فائق التركيز ، يمكن للمرء الحصول على DNA بجودة عالية جدًا ومناسبة للتسلسل الآلي. ومع ذلك ، يوصى بشدة بإجراء غسيل الكلى متبوعًا بترسيب الإيثانول (أفضل طريقة) أو إجراء الحد الأدنى من ترسيب الأيزوبروبانول في درجة حرارة الغرفة لإزالة جميع آثار كلوريد السيزيوم المتبقي لأن السيزيوم يمكن أن يثبط بوليميريز Taq المستخدم في تفاعل تسلسل الدورة.

EDTA - يمكن لـ EDTA أن يخلب المغنيسيوم المطلوب بواسطة بوليميراز Taq في تفاعل تسلسل الدورة ، لذلك عند تقديم العينات ، من الأفضل دائمًا تخفيفها أو إعادة تعليقها في محلول معقم ddH20 أو 1X Tris. لا ينصح بالتعليق في المخزن المؤقت TE ، على الرغم من أن الأشخاص قد فعلوا ذلك وفي كثير من الأحيان لا توجد مشكلة. ومع ذلك ، فإن توفير الحمض النووي للقالب في الماء يعد أمرًا سهلاً ، وإذا كانت هناك مشكلة في جودة التسلسل ، فإن حقيقة عدم وجود EDTA في عينتك هي إحدى المشكلات المحتملة التي يمكننا التخلص منها على الفور.

مبادئ مجموعة Qiagen

كما ذكر أعلاه ، يقوم Qiagen بتصنيع مجموعات لاستخراج وتنقية جميع أنواع الحمض النووي ، بما في ذلك DNA البلازميد. تحتوي مجموعات Qiagen plasmid miniprep على راتنج تبادل الأنيون الذي يتكون من مجموعات DEAE ذات الشحنة الموجبة والتي تربط بشكل تفضيلي العمود الفقري للحمض النووي المشحون سالبًا. بمجرد ارتباط الحمض النووي بالراتنج ، يتم غسل الملوثات الأخرى مثل الأملاح والبروتينات والحمض النووي الريبي والكربوهيدرات في محلول قليل الملح. يتم التخلص من الحمض النووي في الخطوة الثانية ، باستخدام محلول عالي الملح لفصله بعيدًا عن الراتنج. تم تصميم هذه المجموعة لإعطاء أعلى درجة نقاء من الحمض النووي وهي مكلفة إلى حد ما. مجموعة أخرى تقدمها Qiagen هي مجموعة Qiaprep التي تستخدم غشاء أساسه هلام السيليكا لربط الحمض النووي في وجود تركيزات عالية من أملاح Chaotropic. تتم إزالة الأملاح بغسل الإيثانول ثم يتم التصفية من الحمض النووي باستخدام محلول تريس عازل منخفض القوة الأيونية. تأتي هذه الطريقة في شكل عمود دوران يمكن استخدامه إما في جهاز طرد مركزي أو في مشعب فراغ. تمنح هذه المجموعة الحمض النووي نقاءًا مناسبًا للتسلسل وأقل تكلفة أيضًا. ومع ذلك ، هناك بعض العوامل التي يجب على المرء أن يأخذها في الاعتبار عند استخدام مجموعات Qiagen ، أو أي مجموعات miniprep أخرى قائمة على العمود. أولاً ، لا تفرط في تحميل الأعمدة - يمكن أن يتنافس الحمض النووي الريبي والسكريات مع الحمض النووي للالتصاق براتنج العمود ويؤدي إلى عوائد منخفضة من DNA البلازميد المطلوب. اتبع الإرشادات الخاصة بنمو الخلايا واستخدم وسائط LB على النحو الموصى به. ثانيًا ، لا تنس غسل الحمض النووي بنسبة 70 ٪ من الإيثانول بعد ترسيب الأيزوبروبانول لإزالة الأملاح الزائدة. يمكن أن يؤدي الغسل مرتين إلى أربع مرات بالإيثانول إلى تحسين جودة الحمض النووي ، وبالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تساعد عمليات الغسل الإضافية بمحلول الربط في إزالة الملوثات الأخرى. ثالثًا ، يمكن أن يساعد تسخين المخزن المؤقت للشطف في تحسين المحصول. وأخيرًا ، قم بإزالة جميع آثار الإيثانول قبل إعادة تعليق المنتج النهائي في الماء.

طرق التحلل القلوي / PEG

يمكن تحلل البكتيريا لإطلاق DNA البلازميد بعدد من الطرق بما في ذلك المعالجة بالمنظفات أو المذيبات العضوية أو الحرارة أو القلويات. عند محاولة عزل البلازميدات الكبيرة (& gt15kb) الأكثر عرضة للتلف أثناء إجراء التحلل ، يجب استخدام طريقة ألطف ، مثل الطرد المركزي المتوازن أو التحلل الذي يتضمن منظفًا مثل SDS. عند تحلل الخلايا لحصاد البلازميدات الأصغر ، يمكن استخدام طرق أقوى ، مثل العلاج القلوي. تتسبب هذه العلاجات في تغيير طبيعة الحمض النووي الصبغي الخطي للمضيف وتلفه. لا تنفصل خيوط DNA البلازميد الدائرية المغلقة تمامًا لأنها متشابكة طوبولوجيًا وعندما تعود الظروف إلى وضعها الطبيعي ، تتجدد الخيوط بدقة في التشكل الأصلي كجزيئات فوق حلزونية.

يمكن أن تؤدي بروتوكولات التحلل القلوي القياسية ، عند اقترانها بترسيب PEG ، إلى DNA بلازميد صغير ذي نقاء كافٍ لاستخدامه في تسلسل الفلورسنت الآلي. فيما يلي بروتوكول مفصل لمعالجة التحلل القلوي / علاج PEG الموصى به من قبل Applied Biosystems ، مصنعي أجهزة تسلسل الحمض النووي لدينا.

ملاحظة: لتقليل قص الحمض النووي الصبغي الملوث ، لا تستخدم دوامة أثناء هذا الإجراء.

  1. بيليه 1.5 -4.5 مل قسامات من الثقافة لمدة دقيقة واحدة في جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة.
  2. إزالة المادة الطافية عن طريق الشفط.
  3. Resuspend الكرية البكتيرية في 200 ماي من المخزن المؤقت للحصول على بيبيتينج صعودا وهبوطا.
  4. أضف 300 مايكرولتر من 0.2N NaOH / 1٪ SDS المحضر حديثًا. امزج محتويات الأنبوب بالقلب. احضنها على الثلج لمدة 5 دقائق.
  5. تحييد المحلول بإضافة 300 ماي من أسيتات البوتاسيوم 3.0 م ، ودرجة الحموضة 4.8. امزج عن طريق قلب الأنبوب. احضنها على الثلج لمدة 5 دقائق.
  6. قم بإزالة الحطام الخلوي عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي بسرعة قصوى لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف.
  7. أضف RNase A (خالٍ من DNase) إلى تركيز نهائي قدره 20 ميكروغرام / مل. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  8. استخرج المادة الطافية مرتين بالكلوروفورم:
    1. أضف 400 ميكرولتر من الكلوروفورم
    2. امزج الطبقات عن طريق الانقلاب لمدة 30 ثانية
    3. الطرد المركزي الأنبوب لمدة دقيقة واحدة لفصل المراحل
    4. نقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب نظيف.

    تنقية كلوريد السيزيوم

    يمكن أن ينتج عن تنقية DNA البلازميد باستخدام طريقة تدرج الكثافة مثل الطرد المركزي المتوازن في تدرجات بروميد CsCl-ethidium DNA عالي النقاوة وهو مفيد بشكل خاص لتنقية البلازميدات الكبيرة أو البلازميدات الصغيرة التي سيتم استخدامها في تجارب أكثر صرامة ، مثل القياسات الفيزيائية الحيوية. يستفيد هذا البروتوكول من حقيقة أن بروميد الإيثيديوم سوف يقحم بكميات مختلفة عندما يواجه جزيئات DNA دائرية خطية أو مغلقة. بسبب الارتباط التفاضلي لهذه الصبغة ، فإن كثافات الطفو للحمض النووي الخطي والدائري المغلق التي تتشكل بعد الطرد المركزي ستكون مختلفة في تدرجات CsCl التي تحتوي على كميات مشبعة من بروميد الإيثيديوم ، مما يسمح بالفصل الفعال لبلازميد DNA بعيدًا عن تلوث الحمض النووي الصبغي ، DNA البلازميد الدائري ، RNA والبروتينات. لطالما كانت هذه الطريقة هي المعيار الذهبي للحصول على حمض نووي نقي جدًا ، لكنها تستغرق وقتًا طويلاً ومكلفة. توفر المجموعات التجارية أو طرق التحلل القلوي المعدلة الحمض النووي عالي الجودة للتسلسل الآلي ، وبالتالي تقضي على الحاجة إلى مثل هذه الطريقة الصارمة. ومع ذلك ، إذا كانت تنقية كلوريد السيزيوم هي الطريقة التي تختارها ، فيمكن العثور على البروتوكولات في كتيبات Maniatis Molecular Cloning.

    بعض الملاحظات النهائية على تنقية البلازميد

    طرق الغليان لاستخراج الحمض النووي غير مقبولة للتسلسل الآلي ما لم يتم استخراج الفينول / الكلوروفورم لإزالة جميع البروتينات. لا يتم دائمًا تعطيل نوكليازات داخلية تمامًا أثناء إجراء الغليان ويمكن أن يتحلل DNA البلازميد في وجود Mg ++ في إجراءات الحضانة اللاحقة.

    وفي النهاية ، إذا كان إعداد البلازميد الخاص بك لا يزال يفتقر إلى النقاء الأمثل لبيانات التسلسل الجيد من أجهزة التسلسل لدينا ، فإليك بعض التوصيات لمزيد من خطوات التنظيف التي قد تساعد:

    • تنقية الحمض النووي الخاص بك عن طريق الترشيح الفائق ، باستخدام أعمدة Centricon-100 Micro-Concentrator. انظر البروتوكول في أعمدة القطع بالوزن الجزيئي / الترشيح الفائق.
    • تنقية عن طريق مزيد من الاستخراج:
      1. استخرج الحمض النووي مرتين بحجم واحد من الكلوروفورم أو الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي (24: 1 ت / ت)
      2. أضف 0.16 مجلدًا من 5M NaCl وحجم إجمالي واحد بنسبة 13٪ PEG.
      3. احضنها على الجليد لمدة 20 دقيقة ، ثم قم بالطرد المركزي بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي على درجة حرارة 2-6 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      4. اشطف الحبيبات مرتين باستخدام 70٪ من الإيثانول.
      5. Dry the pellet in a vacuum centrifuge for 3-5 minutes or to dryness.
    • Purify using minimal isopropanol precipitations:
      1. Add 0.5 volume of 7.5M ammonium acetate or 0.1 volume of 3M sodium acetate to a dilute DNA solution (<100 ng/ul) and mix well.
      2. To this total volume, add 0.6 volume of room temperature isopropanol and mix well.
      3. Incubate at room temperature for 5 minutes, then centrifuge at maximum speed to pellet the DNA.
      4. Fill tube with 70% ethanol and do a complete wash of the pellet.
      5. Dry the pellet in a vacuum centrifuge for 3-5 minutes or to dryness.

    PCR products

    Considerations when cleaning up PCR products

    When submitting PCR products for direct sequencing, it is essential to separate the PCR product away from potentially interfering substances that may remain in solution after the PCR reaction. These contaminants can sometimes participate, and thus interfere, in the cycle sequencing reaction and lead to poor quality data or no data at all. Most importantly, primers and dNTPS should be removed. If both forward and reverse PCR primers remain in solution, they will both act as sequencing primers, resulting in multiple peaks from beginning to end as each primer can anneal to complementary strands with different nucleotide composition, and thus lead to overlapping fragments and unreadable data. Excess dNTPs should also be removed as they will upset the specific ratios of dNTPs/ddNTPs required for optimal extension and termination in the cycle sequencing reaction.

    Another consideration when choosing your PCR cleanup method is the determination of the presence of a single band or multiple bands that may result from your PCR reaction. Once the PCR reaction is completed, you should run a small aliquot on an agarose gel to assess its quality. If you have a single specific band, then it will be sufficient to remove excess PCR reactants using one of the methods listed below. If your PCR reaction generates multiple bands, an excessive amount of primer-dimers, or low-intensity smearing, it will then be necessary to run your PCR product out on a gel, excise your band of interest, and purify it away from the gel. Alternatively, you may want to spend some time optimizing your PCR reaction to eliminate the presence of these additional bands or artifacts and thus save yourself some downstream time in gel purifying your PCR products for sequencing.

    Regardless of which purification method you choose, you should always quantitate your PCR product after purification as no cleanup method will give 100% recovery. Any quantitative estimates you make when initially running your PCR product out on an analytical gel will be inaccurate as you will inevitably lose some product during purification, especially when gel purifying.

    Single PCR band

    Qiaquick PCR purification kit

    Qiagen makes PCR purification kits that come in either a microcentrifuge or vacuum manifold format, and can process anywhere from one PCR product using spin columns up to 96 samples in a 96 well plate. Fragments ranging in size from 100 bp up to 10 kb can be purified away from primers, dNTPs and salts that can interfere in the sequencing reaction. The protocol is simple and involves binding of DNA to the column or well membrane, washing away of contaminants, and elution of the DNA from the membrane. One nice thing about this kit is there are no extra steps to remove any mineral oil that may be present in the PCR solution.

    Exonuclease I/Shrimp Alkaline Phosphatase

    ExoSAP-IT is a product manufactured by USB Corporation and is an excellent method for purifying PCR reactions that produce one specific band. The Exonuclease I component functions to hydrolyze any residual single-stranded primers and any single-stranded DNA fragments produced in the PCR reaction. The Shrimp Alkaline Phosphatase degrades any excess dNTPS remaining in the reaction. The ExoSAP mixture is added directly to the PCR reaction, incubated at 37ºC for 15 minutes for hydrolysis of single-stranded DNA and dNTPS, and then incubated at 80ºC for 15 minutes to inactivate the enzymes.

    Ultrafiltration/Molecular weight cutoff columns

    Amicon Microcon and Centricon devices, which can be purchased from Millipore, are available with 30,000 and 100,000 molecular weight cut-off [MWCO] membranes and can separate primers from the synthesized PCR product. When purifying smaller PCR products (170 bp or less), choose the Centricon 30. For larger PCR products, the Centricon 100 works well. They will concentrate and desalt the DNA simultaneously, typically removing over 90% of the non-incorporated primers and dNTPs. When using either device, a small sample cup, or reservoir, is fitted into a collection tube. The reservoir contains the size-exclusion membrane at its bottom surface. The PCR product is loaded into the sample reservoir along with a suitable volume of distilled water (400 ul when using the Microcon filter, 2 ml for the Centricon), and then spun in a centrifuge. Salts, dNTPs and primers are spun through into the collection tube. To recover purified DNA, remove the sample reservoir from the vial, invert into a new tube and spin once again. The clean PCR product will then be captured in the second collection vial. Due to the increased wash volume and concentration factor, one spin in a Centricon device removes >95% of a 25 bp primer. A second spin removes up to an additional 4%. The Microcon filter will benefit from additional washes - one wash removes approximately 87% of primers, while three washes will filter away between 95%-99% of standard PCR-size primers.

    Ethanol precipitation

    If performed carefully, ethanol precipitation will yield PCR products of adequate purity for direct sequencing. However, if not done properly, residual primers and dNTPS, as well as any remaining ethanol, will give poor sequence data so be sure to remove supernatant carefully and completely, and keep your eye on the pellet.

    Both protocols listed below are for 50 ul PCR reactions, which tend to give better yields after purification, especially for larger products. For PCR reactions greater than 50 ul, proportionally scale up the reagents listed. For reactions less than 50 ul, add water to bring the volume to 50 ul. If mineral oil is present in the PCR reaction, add 100 ul of chloroform, (do not mix with PCR solution), spin at 10,000 RPM for 30 seconds and then aspirate supernatant into a clean tube. The chloroform/mineral oil component will settle to the bottom.

    • Protocol 1
      Thoroughly mix 25ul of 7.5M ammonium acetate with 190 ul 95% ethanol. Add purified supernatant (if mineral oil was previously used) or your PCR solution to this mixture. Vortex and place on ice, or at -20ºC, for 30 minutes to precipitate PCR products. Centrifuge at 10,000 RPM for 10 minutes at 4ºC. Completely remove supernatant, and dry the pellet, either by air-drying or in a vacuum centrifuge (do not overdry, a few minutes in a vacuum centrifuge will be fine). Resuspend in 20 ul of water.
    • Protocol 2
      Thoroughly mix 5 uL of 3M sodium acetate, pH 4.6, with 100 uL of 95% ethanol. Add purified supernatant or your PCR solution to this mixture. Vortex and place on ice, or at -20ºC, for 30 minutes to precipitate PCR products. Spin tubes in a microcentrifuge at maximum speed for 20 minutes. Completely remove supernatant and discard. Add 300 ul of 70% ethanol to rinse the pellet, vortex briefly, and spin for an additional 5 minutes at maximum speed. Completely remove supernatant and discard, being careful not to lose the pellet. Dry the pellet and resuspend in 50 ul water.

    Multiple PCR bands

    Gel purification

    When purifying a PCR product by gel filtration, either standard or low melting point agarose with TBE or TAE buffer may be used. However, it is important to use a high quality agarose such as FMC SeaPlaque or SeaPrep to minimize carryover of unwanted contaminants that may inhibit the sequencing reaction. When purifying the PCR band, the gel containing the PCR product of interest is first visualized under a UV light source and the band is then excised out of the agarose gel with a clean, sharp razor - minimize the amount of agarose that is cut out with the band, even if it means losing a bit of DNA. Tiny bits of agarose can have an adverse affect in the sequencing reaction. In addition, it is important to remember that UV light is damaging to your DNA - damage can occur in the time it takes you to cut out your band and it’s effect can become apparent when sequencing your DNA as you may see dramatically shortened read lengths. So whenever possible, reduce the intensity of the UV light source, reduce your exposure times or use a 366 nm UV source if available. Placing a glass plate between the light source and your gel can also help lessen the degrading effect of the UV light on your DNA. Once your band of interest has been isolated from the gel, numerous methods can be used to separate the PCR product away from the agarose slice, including the Qiaquick Gel Purification kit (MOST HIGHLY recommended), Millipore Ultrafree kit with modified TAE buffer, Promega PCR Wizard preps and Bio101 Geneclean kits. Follow the manufacturer’s direction carefully.

    PCR products should be examined and quantitated on an agarose gel AFTER gel purification as well, as you will not get 100% recovery and your assumed PCR concentration for sequencing will not be accurate.

    BAC/PAC DNA

    Considerations when cleaning up BAC/PAC DNA

    When attempting to sequence large DNA templates such as bacterial artificial chromosomes (BACs) or P1 derived artificial chromosomes (PACs), the quality of DNA template becomes even more crucial. As with plasmid DNA purification, Qiagen kits give excellent results for purification of BAC DNA for sequencing and they provide a few different methods for cleaning up the template DNA, including Qiafilter cartridges and a Large-Construct kit, the latter being somewhat more involved. One modified protocol of the Qiafilter Plasmid Midi Kit, which has consistently given good quality BAC DNA for sequencing, has been kindly provided to us from Wenjie Wu and we will post his modifications here.

    • use 100 ml of BAC culture
    • P1 buffer: add 10 ml
    • P2 buffer: add 10 ml
    • P3 buffer: add 10 ml
    • after addition of P3 buffer, incubate the sample on ice for 15 min, then centrifuge at 4000 rpm for 30 minutes at 4ºC (no incubation at room temperature).
    • add the supernatant from the centrifuged sample to the cartridge and filter the samples into a clean tube
    • apply the filtered supernatant to the Qiagen-tip for further purification and follow remaining Qiagen protocol.
    • when eluting the DNA, first warm the QF solution to 65ºC and elute 5 x 1ml to maximize yield.

    Other BAC purification methods can be used, including CsCl purification, and some other protocols are available at the following websites:

    University of Oklahoma Advanced Center for Genome Technology:
    http://www.genome.ou.edu/DblAcetateProcV3.html

    Note: BAC DNA prepped on the Autogen instrument generally does not work well for sequencing

    Methods for Quantitation

    There are three methods commonly used for quantitating DNA - spectrophotometry, agarose gel analysis and fluorometry. These methods can also give you a sense of how clean your DNA is, although none of these methods will detect everything. When using the spectrophotometer, you will typically take readings at both A260 and A280, as DNA will absorb at A260 while protein absorbs at A280. These readings will give you an A260/A280 ratio. A good DNA A260/A280 ratio should be between 1.7-1.9. If you find your ratio is smaller, this could indicate contamination of your sample with proteins or organic chemicals. If possible, use a spectrophotometer that is capable of performing a wavelength scan from 220 nm to 330 nm as a scan may be useful in revealing other contaminants such as phenol, which is detectable at 230nm, and particulates in solution that may absorb at 325nm. When calculating your DNA concentration with a spectrophotometer, you will need to know that one A260 O.D. unit (absorbance) of double-stranded DNA contains 50 ng/ul. One O.D. unit is the amount of a substance dissolved in 1 ml that gives an absorbance reading of 1.0 in a spectrophotometer with a 1-cm path length. So to calculate the concentration of DNA you have you will multiply the absorbance value times the conversion factor of 50ng/ul times any dilution factor you may have used and this will give you the concentration of your sample in ng/ul or mg/ml. However, quantitation of your DNA by spec is probably the least accurate of the three methods as both RNA and contaminating DNA will also absorb at 260nm and can potentially lead to inaccurate values. Also, readings greater than 1.0 OD or less than 0.05 are probably not very accurate, limiting the sensitivity and range of this method.

    Quantitating by agarose gel electrophoresis tends to be more accurate as you can visualize any contaminating DNA or RNA. Purified DNA should run as a single band on an agarose gel, while uncut plasmid DNA will show three bands: supercoiled, nicked and linear. This method is also useful when quantitating small amounts of DNA such as PCR products. The DNA sample is run on a gel next to a mass ladder composed of fragments of known and varying concentrations and the intensity of your DNA band is visually compared to the intensities of the bands from the mass ladder to estimate DNA concentration. When using an agarose gel, you can’t detect the presence of proteins or chemicals. To get the most information about the amount and quality of your desired DNA, both spectroscopic and gel quantitation methods should be used together.

    Perhaps the most accurate method of measurement of the three is the use of a fluorometer. Dyes may be added to the DNA such as Hoechst 33258 Dye or Picogreen which intercalate into AT rich regions of double stranded DNA and are thus quite specific to double stranded DNA, avoiding the problems of contaminating RNA seen when using a spectrophotometer. Common contaminants present in DNA preparations such as salts, urea, ethanol, chloroform, detergents, proteins and agarose do not have significant affect on these assays and thus lead to a much more sensitive and precise method for quanititation. Fluorometric measurements can detect DNA levels as low as 5 ng/ul.

    Primer design

    There are many programs on the Internet that can help you choose primers, determine potential primer-dimer formation or hairpin structures, and calculate Tm. These programs can be especially helpful when you need to design multiple sets of primers to ensure coverage of a large region of DNA. Look at our section Useful Links for some primer design programs that we have found helpful. That being said, here are some common rules for sequencing primer design:

    • primer should be 18-24 nucleotides in length - this helps ensure good and specific hybridization to the template DNA. Long primers (>35-40bp) tend not to work quite as well in sequencing due to the increased chances of secondary structure formation
    • G/C content should be approximately 50%, but the range can be 30-80%
    • Tm should be between 50º-60ºC - if your Tm is much below that it may not hybridize properly, as the annealing temperature in our cycle sequencing reaction is 50ºC. If necessary, add a few more bases to your primer to increase its Tm. To calculate the Tm of your primer use the following formula:
      • Tm = 4(G + C) + 2(A + T)º C

      As a last note on ordering primers - while purity of a primer is important, it is generally not necessary to have ultrapure primers, such as those purified by HPLC or OPC cartridge, though that is, of course, optimal. As long as the oligo synthesis efficiency was high and the majority of your primer solution contains full-length primers, then simple desalting of your primers should be fine. Primers of poor synthesis quality will not work well for sequencing because, along with your full-length product, there will be a greater proportion of "failure" primers (i.e. truncated primers of less than full length, in varying sizes) that can also act as sequencing primers. Sequence data from these primers will be poor, ranging from unusable to minor "shadow" peaks under the proper peaks. See more in our Troubleshooting section to see how to recognize this problem. When submitting custom primers for sequencing, dilute them in water to the proper concentration.

      For the do-it-yourselfers

      For those selecting the economical choice of setting up your own sequencing reactions, certain things must be taken into consideration. First, you will need to purchase the kit to perform your cycle sequencing reactions. Cycle sequencing is the method required to amplify and fluorescently label your DNA so that it can be detected on our automated sequencers. Cycle sequencing is very similar to PCR, but with two major differences. In cycle sequencing, one primer is used instead of two, thus giving linear amplification of one labeled strand. In addition, a mixture of labeled and unlabeled dNTPs are used in the reaction mix to allow for fluorescent labeling of the DNA and fragment chain termination. Read our Principles of automated fluorescent DNA sequencing section for more detailed information on the basics of cycle sequencing. Once the reactions have been set up, you will need to run them in a thermal cycler to effect the incorporation of fluorescently labeled ddNTPs and amplification of your desired DNA. Once the cycle sequencing reaction is completed, you will need to purify the reaction to remove salts, unused reactants and, most importantly, unincorporated Dye Terminator molecules. If this step is not performed carefully, these excess dye molecules will migrate along with your DNA and cause what are known as “dye blobs” which can interfere with proper basecalling of your DNA. See out Troubleshooting section for an example of a dye blob.

      With that being said, we’ve provided below our recommendations and protocols, as well as a listing of some supplies and part numbers you’ll need to get started.

      الكواشف

      Cycle sequencing reaction mixes must be purchased from Applied Biosystems, manufacturers of our sequencers. For best sequence quality and read length, we recommend the use of Big Dye Terminator chemistries, which is what we use in our sequencing reactions. Two standard chemistries are available for routine template sequencing, Big Dye Terminator v3.1 and 1.1. Part numbers are listed below:

      BigDye ® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
      (protocol ordered separately p/n 4337035)


      Illumina DNA PCR-Free Support

      Generate end-to-end documentation tailored to your experiment.

      Library Prep and Array Kit Selector

      Determine the best kit for your project type, starting material, and method or application.

      Sequencing Coverage Calculator

      Determine reagents and sequencing runs for your desired coverage.

      تمرين

      Maximize the effectiveness of your Illumina system, train new employees, or learn the latest techniques and best practices. We offer support webinars, online courses, expert video tips, and instructor-led trainings.

      Featured Training

      Illumina DNA PCR-Free Prep, Tagmentation

      Overview of the Illumina DNA PCR-Free Prep, Tagmentation kit and the various steps in the library preparation protocol.

      Sequencing: Fundamentals

      After completing this course you will be able to describe DNA, RNA and the central dogma discuss traditional sequencing methodologies and compare traditional sequencing to sequencing by synthesis.

      Preventing Contamination

      Best practices for minimizing PCR contamination when amplifying DNA.

      Online Community
      Join the Conversation

      The Community at Illumina can help you connect with peers and industry experts, share best practices, exchange tips and tricks, and get the support you need in easy-to-use online forums.

      MyIllumina
      Lab Management Made Simple

      Insight into your entire relationship with Illumina, at a glance. Keep up with instrument runs, product orders, support inquiries, and more through a personalized dashboard.

      Contact Us
      Technical Support
      Share With Tech Support

      Get instructions for sharing your desktop while working with Technical Support.

      Other Support
      Contact Us
      Technical Support
      [email protected]
      Other Support

      Innovative technologies

      At Illumina, our goal is to apply innovative technologies to the analysis of genetic variation and function, making studies possible that were not even imaginable just a few years ago. It is mission critical for us to deliver innovative, flexible, and scalable solutions to meet the needs of our customers. As a global company that places high value on collaborative interactions, rapid delivery of solutions, and providing the highest level of quality, we strive to meet this challenge. Illumina innovative sequencing and array technologies are fueling groundbreaking advancements in life science research, translational and consumer genomics, and molecular diagnostics.

      For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures (except as specifically noted).


      Potential Beyond Drug Discovery

      Such next-generation sequencing approaches are used by pharmaceutical companies such as Novartis, as well as many academic centers, some of them involved in cancer genome sequencing consortiums, to generate lists of genes that are frequently mutated in certain cancer types, explains Barretina. “Once you are armed with that knowledge, you can start designing drugs that will actually target those genetic alterations in particular cancers.”

      As soon as a patient is diagnosed, we should quickly determine what’s driving the cancer and use that information to select an appropriate therapy.

      Wendy Winckler, Executive Director of Next-Generation Diagnostics at Novartis Institutes for BioMedical Research

      Cataloging genetic alterations of cancer cells was one of the principal goals behind the Cancer Cell Line Encyclopedia — a massive undertaking and collaborative project between Novartis and the Broad Institute, also based in Cambridge, Mass. The encyclopedia provides genetic information on approximately 1,000 different cancer cell lines originally derived from patients’ tumors. The data is released publicly so that researchers around the world can mine it. Cell lines are easy-to-use cancer models that allow researchers to investigate cancer biology and test the effectiveness of potential drugs against various types of tumors. The Cancer Cell Line Encyclopedia also contains corresponding data detailing which cell lines respond to which drugs.

      Giordano Caponigro, one of the leaders of the Cancer Cell Line Encyclopedia collaboration, is now senior director in Oncology Translational Research at Novartis. He explains how next-generation sequencing is increasing the value of this resource. “When the Cancer Cell Line Encyclopedia started, next-generation sequencing hadn’t really hit its stride, but as it went on we realized this was an important technology,” he says. “Shortly, whole-genome sequencing of the full set of cancer cell lines will be complete, which will help with the development of highly accurate diagnostic tools and effective new cancer treatments.”


      خيارات الوصول

      احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

      جميع الأسعار أسعار صافي.
      سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
      سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

      احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

      جميع الأسعار أسعار صافي.


      V-pipe has a modular and extensible architecture. Users can design their own fully reproducible and transparent pipelines. Developers can test their own tools in a defined environment and contribute to the establishment of best practices for virus research and clinical diagnostics.

      V-pipe is freely available for download from GitHub. Further details on how to run the pipeline, as well as a test dataset, can be found on the dedicated Wiki pages of the repository, accessible through the V-pipe website’s Usage tab.

      Should you have any further question, please do not hesitate to contact us.


      New Approach to Nanopore Sequencing That Is Sure to CATCH Your Interest

      A group of scientists from Tel Aviv University recently performed an experiment utilizing Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) to isolate a gene typically associated with breast cancer, BRCA1, and used nanopore sequencing to map the gene.

      Experimental Fulcrum

      The team extracted 200kb strands of DNA from primary human peripheral blood cells—containing the 80kb BRCA1 gene and its adjacent sectors—and proceeded to process the strands with long-range amplification. Once the target sequence of 200kb was sufficiently enriched, the team began nanopore sequencing which allowed them to determine the order of nucleotides that comprised the section of interest, and even allowed for the registration of both coding and non-coding areas which may help shed light on less straightforward genetic determinants.

      Being able to extract, amplify, and analyze only 200kb rapidly expedites the ability to sequence a specific area within the human genome as compared to the massive 3 billion base pairs that make up all of our genetic information. “Due to high sequencing costs, cutting out only the region of interest from the genome focuses all your sequencing efforts and money toward this target without ‘wasting’ reads on DNA from the rest of the genome,” explains Yuval Ebenstein, Ph.D., a professor at Tel Aviv University.

      Techniques for mapping the genome are varied, including single-molecule real-time (SMRT) sequencing, nanopore sequencing, and, a little older but still relevant attributable to its higher accuracy, next-generation sequencing (NGS)—an umbrella term for technologies such as Illumina sequencing.

      However, while these methods have proven effective they are not without their limitations. NGS is hindered due to its inability to process structural aberrations greater in size than a few hundred base pairs. Long-read methods such as SMRT and nanopore sequencing are capable of detecting variations that NGS can’t, and both provide real-time viewing of data. Nanopore sequencing takes it a step further and is capable of analyzing native DNA without the need for PCR amplification techniques—which all other sequencing methods depend on. The elimination of prerequisite amplification is a huge advantage because it is often during PCR amplification that more errors and single nucleotide polymorphisms (SNPs) are produced. With that said, nanopore sequencing still has a ways to go in terms of achieving greater accuracy, while NGS has shown itself to be tried and true.

      Dr. Ebenstein points out that while nanopore sequencing is normally able to make use of native DNA, “CATCH isolates only a tiny fraction of the genome which means that very low amounts of DNA are recovered for library preparation. Currently, this implies that the DNA must either be isolated from a very large amount of cells or amplified to achieve the needed amount of material for sequencing.”


      CATCH nanopore sequencing promises to increase our genome mapping capabilities. [Tel Aviv University]

      Finance, Function, and Future

      ماذا يعني كل هذا؟ NGS is incapable of processing reads bigger than a few hundred base pairs, while nanopore technology is capable of processing reads up to several kilo base pairs. However, an intrinsic obstacle to nanopore sequencing is that it can be expensive. It’s true that the upfront cost for Oxford Nanopore Technologies’ MinION retails for only $1,000, but while “the initial capital investment is indeed lower, the price per base on the MinION is still considerably higher than NGS,” notes Dr. Ebenstein, “although [nanopore sequencing] can obtain information that is inaccessible to NGS.”

      By utilizing CATCH, scientists can isolate and enrich smaller portions of the genome, as done in this experiment, by having the Cas9 cut at the sequence of interest’s flanking regions. It is possible to expedite the process, as nanopore sequencing can be used only on the cut-out region of interest rather than the entire genome. That was one of the crucial points that the team wanted to convey with this experiment.

      “CATCH brings nanopore sequencing closer to the clinic by offering targeted, cost-effective sequencing,” explains Dr. Ebenstein. “You only need sequence knowledge for two regions flanking your target, thus enabling the enrichment of large variable regions in the genome that are very complex and challenging for conventional approaches.”

      This is cause for excitement as CATCH furthers the potential of an already impressive technique for DNA sequencing. Nanopore sequencing is already highly valued for its ultra-long reads and real-time analysis capability, but with the incorporation of CATCH the entire process can occur even faster and with greater fiscal efficacy.

      “The long reads provided by nanopore sequencing allow for the characterization of structural variations in conjunction with smaller aberrations such as SNPs. Together, this information is critical for understanding the genetic causes of disease,” states Dr. Ebenstein.

      The results of the experiment were telling as to the capabilities and limitations of both NGS and nanopore sequencing. In their paper, published in بحوث الأحماض النووية as “Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH)”, the team shared data that “NGS discovered 177 SNPs. Nanopore data revealed 62% of the SNPs with only two SNPs not present at all in the nanopore data and the remaining 37% inconclusive.”

      “NGS has a lower error rate compared to nanopore. Therefore, it is more qualified to detect single base mutations,” says Dr. Ebenstein. “On the other hand, sufficient coverage (offered by CATCH) can overcome these errors by averaging over many reads. In addition, nanopore has better access to larger aberrations such as structural and copy number variants.”

      Yael Michaeli, Ph.D., School of Chemistry, Faculty of Exact Sciences at Tel Aviv University, mentions that their team “used a software that is more compatible with NGS reads and this in part may explain the inferior results of the nanopore.”

      It’s clear that there are still some areas of uncertainty surrounding nanopore sequencing and compared to the competition it still has to prove itself a little further in terms of reliability. Still, Dr. Ebenstein believes that “by now it seems quite clear that nanopore sequencing will find its place in routine genomic analysis pipelines. [However,] it is still more expensive than NGS, and should be chosen only when needed.”


      تسلسل الجيل التالي (NGS)

      Next-generation sequencing (NGS) is a massively parallel sequencing technology that offers ultra-high throughput, scalability, and speed. The technology is used to determine the order of nucleotides in entire genomes or targeted regions of DNA or RNA. NGS has revolutionized the biological sciences, allowing labs to perform a wide variety of applications and study biological systems at a level never before possible.

      Today's complex genomics questions demand a depth of information beyond the capacity of traditional DNA sequencing technologies. NGS has filled that gap and become an everyday tool to address these questions.

      Next-Generation Sequencing for Beginners

      We'll guide you through the basics of NGS, with tutorials and tips for planning your first experiment.

      See What NGS Can Do For You

      NGS technology has fundamentally changed the kinds of questions scientists can ask and answer. Innovative sample preparation and data analysis options enable a broad range of applications. For example, NGS allows labs to:

      • Rapidly sequence whole genomes
      • Deeply sequence target regions
      • Utilize RNA sequencing (RNA-Seq) to discover novel RNA variants and splice sites, or quantify mRNAs for gene expression analysis
      • Analyze epigenetic factors such as genome-wide DNA methylation and DNA-protein interactions
      • Sequence cancer samples to study rare somatic variants, tumor subclones, and more
      • Study the human microbiome
      • Identify novel pathogens

      Accessible Whole-Genome Sequencing

      Using capillary electrophoresis-based Sanger sequencing, the Human Genome Project took over 10 years and cost nearly $3 billion.

      Next-generation sequencing, in contrast, makes large-scale whole-genome sequencing (WGS) accessible and practical for the average researcher. It enables scientists to analyze the entire human genome in a single sequencing experiment, or sequence thousands to tens of thousands of genomes in one year.

      NGS Data Analysis Tools

      Explore user-friendly tools designed to make data analysis accessible to any scientist, regardless of bioinformatics experience.

      Broad Dynamic Range for Expression Profiling

      NGS-based RNA-Seq is a powerful method that enables researchers to break through the inefficiency and expense of legacy technologies such as microarrays. Microarray gene expression measurement is limited by noise at the low end and signal saturation at the high end.

      In contrast, next-gen sequencing quantifies discrete, digital sequencing read counts, offering a broader dynamic range. 1,2,3

      Tunable Resolution for Targeted NGS

      Targeted sequencing allows you to sequence a subset of genes or specific genomic regions of interest, efficiently and cost-effectively focusing the power of NGS. NGS is highly scalable, allowing you to tune the level of resolution to meet experimental needs. Choose whether to do a shallow scan across multiple samples, or sequence at greater depth with fewer samples to find rare variants in a given region.

      NGS for COVID-19

      Next-generation sequencing is uniquely positioned in an infectious disease surveillance and outbreak model. Learn which NGS methods are recommended for detecting and characterizing SARS-CoV-2 and other respiratory pathogens, tracking transmission, studying co-infection, and investigating viral evolution.

      How Does Illumina NGS Work?

      Illumina sequencing utilizes a fundamentally different approach from the classic Sanger chain-termination method. It leverages sequencing by synthesis (SBS) technology – tracking the addition of labeled nucleotides as the DNA chain is copied – in a massively parallel fashion.

      Next-generation sequencing generates masses of DNA sequencing data, and is both less expensive and less time-consuming than traditional Sanger sequencing. 2 Illumina sequencing systems can deliver data output ranging from 300 kilobases up to multiple terabases in a single run, depending on instrument type and configuration.

      Sequencing Technology Video

      In-Depth NGS Introduction

      This detailed overview of Illumina sequencing describes the evolution of genomic science, major advances in sequencing technology, key methods, the basics of Illumina sequencing chemistry, and more.

      What Can You Do with Next-Generation Sequencing?

      See how scientists utilize NGS to make breakthrough discoveries.
      Genetics of COVID-19 Susceptibility

      This UK-wide study uses NGS to compare the genomes of severely and mildly ill COVID-19 patients, to help uncover genetic factors associated with susceptibility.

      Exploring the Tumor Microenvironment

      Researchers use single-cell techniques to study cancer microenvironments, to elucidate gene expression patterns and gain insights into drug resistance and metastasis.

      Using NGS to Study Rare Diseases

      Whole-exome and transcriptome sequencing prove beneficial in uncovering mutations and pathways associated with rare genetic diseases.

      Evolution of Illumina NGS

      Recent Illumina next-generation sequencing technology breakthroughs include:

        : The iSeq 100 System combines a complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) chip with one-channel SBS to deliver high-accuracy data in a compact system. : This technology enables faster sequencing than the original 4-channel version of SBS technology, with the same high data accuracy. : This option offers an exceptional level of throughput for diverse sequencing applications. : Learn how the NovaSeq 6000 System offers tunable output of up to 6 Tb in

      History of Illumina Sequencing

      Find out how Illumina SBS technology originated and evolved over time.

      Bring NGS to Your Lab

      The resources below offer valuable guidance to scientists who are considering purchasing a next-generation sequencing system.

      Download Buyer’s Guide

      NGS Experimental Considerations

      Learn about read length, coverage, quality scores, and other experimental considerations to help you plan your sequencing run.

      Use our interactive tools to help you create a custom NGS protocol or select the right products and methods for your project.

      Key Terms in NGS

      Use our next-generation sequencing glossary to clarify key terms and important concepts as you plan your sequencing project.

      Methods Guide

      Access the information you need—from BeadChips to library preparation for genome, transcriptome, or epigenome studies to sequencer selection, analysis, and support—all in one place. Select the best tools for your lab with our comprehensive guide designed specifically for research applications.

      Genomics News

      Illumina and Next Generation Genomic Launch Expanded NIPT in Thailand

      The collaboration will introduce VeriSeq™ NIPT Solution v2 in Southeast Asia

      Using Analytics to Improve Cancer Diagnosis and Therapy Selection

      Developing and automating best-practice workflows that make analyzing, processing, and disseminating genomic data accessible to researchers and clinicians.

      China’s Novogene is a Global Force

      The NGS services provider has completed 1.2 million samples—and they’re just getting started

      Interested in receiving newsletters, case studies, and information from Illumina based on your area of interest? أفتح حساب الأن.

      Related Solutions

      NGS Library Preparation

      Fast, simple NGS library prep and enrichment workflows from Illumina to prepare your samples for sequencing.

      Sequencing Services

      Access fast, reliable next-generation sequencing services that provide high-quality data and offer extensive scientific expertise.

      Illumina NGS & Microarray Training

      Work with expert Illumina instructors and get hands-on training. We also offer online courses, webinars, videos, and podcasts.

      مراجع
      1. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. نات ريف جينيت. 200910:57–63.
      2. Wilhelm BT, Landry JR. RNA-Seq—quantitative measurement of expression through massively parallel RNA sequencing. أساليب. 200948:249–57.
      3. Zhao S, Fung-Leung WP, Bittner A, and Ngo K, Liu X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. بلوس واحد. 2014169(1):e78644.

      Innovative technologies

      At Illumina, our goal is to apply innovative technologies to the analysis of genetic variation and function, making studies possible that were not even imaginable just a few years ago. It is mission critical for us to deliver innovative, flexible, and scalable solutions to meet the needs of our customers. As a global company that places high value on collaborative interactions, rapid delivery of solutions, and providing the highest level of quality, we strive to meet this challenge. Illumina innovative sequencing and array technologies are fueling groundbreaking advancements in life science research, translational and consumer genomics, and molecular diagnostics.

      For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures (except as specifically noted).


      مقدمة

      Initial sequencing of the human genome took more than a decade and cost an estimated $70 million dollars (1). Sequencing for the Human Genome Project (HGP) relied primarily on automation of sequencing methods first introduced by Sanger in 1977 (2). Despite the successful use this technology to generate early maps of the human genome (3–5), the limitations of Sanger sequencing created a high demand for more robust sequencing technologies capable of generating large amounts of data, quickly, and at lower costs.

      Recognizing this need, the National Human Genome Research Institute (NHGRI) initiated a funding program in 2004 aimed at catalyzing sequencing technology development and with a goal of reducing the cost of genome sequencing to ∼$100,000 in 5 years and, ultimately, $1,000 in 10 years (6–8). The initiative has been widely successful to date, and a bevy of new technologies has emerged in the sequencing marketplace over the past 5 years. New technologies offer radically different approaches that enable the sequencing of large amounts of DNA in parallel and at substantially lower costs than conventional methods. الشروط "next-generation sequencing" و "massive-parallel sequencing” have been used loosely to collectively refer to these new high-throughput technologies.


      استنتاج

      This study has proved that RNA ligases derived from T4-phage exhibit significant sequence specificity in their activity. The profiles of small RNAs are strongly dependent on the adapters used for sample preparation. In light of this, the current, popular, sRNA-seq protocols need revision. We find that a mix of adapters, with different sequence ends, permits a more accurate estimation of the amounts of individual miRNA sequences and their isoforms. The use of RNA ligases in other protocols, such as oligoribonucleotide circularization ( 38), should be reviewed for possible effects of the bias discussed in this study.