معلومة

أي تسلسل للحمض النووي سيكون له درجة حرارة انصهار أعلى: CCCCCC ... أو GCGCGC…؟

أي تسلسل للحمض النووي سيكون له درجة حرارة انصهار أعلى: CCCCCC ... أو GCGCGC…؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد جربت هذه الخدمة لحساب درجات الحرارة. تعطي طريقة الجار الأقرب باستمرار نتائج أكبر للتسلسلات مثلGCGCGCعلى متواليات مثلCCCCCأوGGGGG، في حين أن الطرق الأخرى لا تعطي فرقًا. هل هي ميزة أقرب الجيران أم أن هناك بالفعل اختلاف في درجات حرارة الانصهار؟


تم بشكل تجريبي قياس اعتماد درجة حرارة الانصهار على أزواج الديوكليوتيدات المختلفة ؛ تعتمد حاسبة قياس درجة الحرارة على تلك النتائج. بناءً على هذه النتائج ، سترى أن أGCقد يختلف زوج ثنائي النوكليوتيد منGGونسخةأزواج. من المحتمل أن يكون هذا بسبب التأثيرات الفراغية والتشكيلات التراصية.

أشار SantaLucia (1998 ، مؤلف أقرب نموذج جار) إلى دراسات تجريبية مختلفة تم الحصول على القيم منها ، في الجدول 1 من الورقة.


إنزيمات التقييد مع تسلسلات التعرف المتعددة

في دورة برمجة المعلومات الحيوية ، أقوم حاليًا بالتدريس (باستخدام Python ، وتم الاقتراب من خلفية CS في الغالب بدلاً من خلفية علم الأحياء) قمت بتعيين مشروع يتضمن العثور على مواقع حيث ترتبط إنزيمات التقييد بتسلسل الحمض النووي. المشروع متأثر بشدة بالفصل التاسع من النص الكلاسيكي الآن "بداية بيرل للمعلوماتية الحيوية" لجيمس تيسدال. أنا أستخدم قاعدة بيانات REBASE ، ولا سيما تنسيق REBASE رقم 9. في هذا التنسيق ، يكون لكل إنزيم تقييد تسلسل التعرف الذي يشبه على سبيل المثال C ^ YCGRG حيث يعطي ^ معلومات حول الحروف الدقيقة والحروف الكبيرة مثل Y و R بخلاف ACGT هي رموز الغموض. الهدف من المشروع هو تحويل هذه إلى تعبيرات عادية حيث يتم تجاهل معلومات الانقسام ويتم توسيع رموز الغموض إلى فئات أحرف ، ثم استخدام هذه التعبيرات العادية للبحث عن التطابقات.

كلها واضحة إلى حد ما ، لكن طالبًا شديد الملاحظة لاحظ أن بعض الإنزيمات لها تسلسلات متعددة ، على سبيل المثال ، يحتوي M.BssHIII على إجمالي 5 متواليات: ACGCGT و CCGCGG و RGCGCY و RCCGGY و GCGCGC. من السهل أن نرى أن هذه تتوافق مع ما مجموعه 11 تسلسلًا (بعد توسيع Rs و Ys) ، أقل بكثير من 144 تسلسلًا يتطابق مع VSSSSB (وهو أقل تسلسل واحد غامض قادر على مطابقة ما ورد أعلاه).

سؤالي ما الذي يجري هنا؟ هل أنا بأمان في الاستبدال بكل بساطة بـ | (لـ "أو") في التعبير العادي ، أم أن هناك شيئًا أكثر دقة يحدث؟ 8 فقط من ما يقرب من 5000 إنزيم لها مثل هذه التسلسلات المتعددة ، ولم يلقي أي من كتاب Tisdall ولا حتى وصف التنسيق (كلاهما يفترض وجود تسلسلات مفردة) أي ضوء على الموقف.


استقرار الحمض النووي في مراحل الغاز مقابل المحلول: دراسة منهجية لواحد وثلاثين حالة مزدوجة بأطوال وتسلسل ومستوى شحن متفاوت

نورد هنا دراسة منهجية لقياس الطيف الكتلي لسلسلة من واحد وثلاثين نسخة مزدوجة من الحمض النووي غير مكملة ذاتيًا ومتطابقة تتراوح في الحجم من 5 إلى 12 مير. الغرض من هذا العمل هو ثلاثة أضعاف: (1) لإثبات جدوى استخدام مطياف الكتلة كأداة لفحص ثبات طور الحل لمزدوجات الحمض النووي (2) للتقييم المنهجي لثبات الطور الغازي لمزدوجات الحمض النووي و (3) لمقارنة الغاز واستقرار طور الحل في محاولة لفهم كيفية تأثير الوسائط على استقرار الحمض النووي. هذه القضايا الأساسية ذات أهمية في حد ذاتها ، وكذلك لتسخير إمكانات قياس الطيف الكتلي للتطبيقات البيولوجية. لقد وجدنا أن وفرة الأيونات لا تتبع دائمًا مع استقرار طور الحل ، يجب مراعاة محتوى GC. يمكن أن تؤدي وحدتا الطباعة على الوجهين مع نفس Tm ولكن مع اختلاف محتوى GC إلى وفرة أيون مختلفة. بمعنى ، إذا كان هناك نوعان من الدوبلكس لهما نفس درجة حرارة الانصهار بالضبط ، ومع ذلك يحتوي أحدهما على محتوى GC أعلى ، فإن الطباعة المزدوجة ذات المحتوى العالي من GC تنتج وفرة أيون أعلى. وهكذا يبدو أن زوج قاعدة GC ليس فقط أقوى من زوج قاعدة AT ، ولكن القوة النسبية لكل منهما تختلف في الطور الغازي مقابل في المحلول ، بحيث يمكن لعملية الرش الكهربائي التفريق بينهما. نحن نميز أيضًا ثباتات الطور الغازي للوحدات المزدوجة ، باستخدام التفكك الناجم عن التصادم (CID) كطريقة لتقييم الاستقرار. نحن نركز على جانبين من تجربة CID هذه. أولاً ، نقوم بفحص العوامل التي تتحكم في ما إذا كانت الدوبلكس تنفصل إلى خيوط مفردة أو جزء تساهميًا ، فنحن قادرون على استخدام تطبيع حالة الشحن ، حيث نقوم بصنع العملة ومستوى الشحن rdquo لمقارنة نتائجنا بالآخرين وإنشاء العموميات فيما يتعلق بأنماط التفكك مقابل أنماط التجزئة. ثانيًا ، نقوم بفحص تلك الأجهزة المزدوجة التي تنفصل في المقام الأول وتستخدم CID لتقييم ثبات الطور الغازي. وجدنا أن ارتباط الطور الغازي باستقرار طور الحل من المرجح أن يحدث عند فحص الازدواج لمحتوى GC المتغير. تميل الازدواجية التي لها نفس محتوى GC إلى أن يكون لها ثبات لا يوازي تلك الموجودة في الحل. نناقش هذه النتائج في ضوء الأدوار المختلفة التي تلعبها الرابطة الهيدروجينية والتكديس الأساسي في المحلول مقابل الطور الغازي. في النهاية ، نطبق ما تعلمناه لإلقاء نظرة ثاقبة على المشكلة البيولوجية المتعلقة بكيفية تسبب القاعدة النووية O6-methylguanine المسببة للسرطان والتلف في حدوث طفرات.

مجلة

مجلة الجمعية الأمريكية لقياس الطيف الكتلي ومجلات ndash Springer


الوحدة 2 الامتحان

ما هو تسلسل الحمض النووي الريبي الذي يتم إنتاجه باستخدام تسلسل الحمض النووي الموضح كقالب؟

توجد قواعد النوكليوتيدات على السطح الخارجي لجزيء الحمض النووي.

توجد مجموعات فوسفات السكر في داخل جزيء الحمض النووي.

يتم تثبيت القواعد الموجودة على الخيوط التكميلية معًا بواسطة روابط هيدروجينية.

أزواج السيتوزين مع الأدينين.

أ) يختلف جزء السكر من الحمض النووي الريبي والحمض النووي

ب) يتم نسخ الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي الذي يترجم إلى بروتين

ج) الحمض النووي دائم في الخلية ، والحمض النووي الريبي مؤقت

أ) يجب أن تتكون المادة الجينية من العديد من الوحدات المختلفة لمراعاة التباين الملحوظ في الطبيعة.

ب) يجب أن تشفر المادة الوراثية النمط الظاهري.

ج) يجب أن تحتوي المادة الوراثية على معلومات تشفير معقدة

ب) الحمض النووي الجيني من البروتين

ج) RNA من قالب DNA

أ) ينتقل الحمض الريبي النووي النقال الموجود في موقع P إلى الموقع A.

ب) ينتقل الحمض الريبي النووي النقال الموجود في الموقع A إلى الموقع E ويتم تحريره.

ج) ينتقل الحمض الريبي النووي النقال الموجود في الموقع A إلى موقع P.

أ) تسلسل الحمض النووي الذي يشفر البروتين

ب) سلسلة من الأحماض الأمينية التي تحفز التفاعل

ج) تسلسل الحمض النووي الريبي الذي ينظم التعبير

أ) يحتوي الحمض النووي على البيورينات ، بينما يحتوي البروتين على بيريميدين.

ب) يحتوي الحمض النووي على الكبريت ، بينما لا يحتوي البروتين على ذلك.

ج) يحتوي الحمض النووي على الفوسفور ، لكن البروتين لا يحتوي عليه

يمنع وصول RNA polymerase إلى المروج ، حتى يتم إزالته بواسطة عوامل النسخ العامة.

إنها الوحدة الفرعية لبوليميراز الحمض النووي الريبي بدائية النواة المطلوبة للتعرف على المحفزات.

يعدل الهيستونات بحيث يمكن إزالة النيوكليوسومات من الحمض النووي للنسخ.

نسخ جينات الرنا الريباسي

نسخ جينات الرنا المرسال

نسخ جينات الحمض الريبي النووي النقال

أ) غالبًا ما يحمل جينات مفيدة لمضيفه البكتيري.

ب) يتكاثر بشكل مستقل عن الحمض النووي الجيني.

ج) إنه دائمًا أكبر من الحمض النووي الجيني.

أ) عدد الروابط الهيدروجينية بين القواعد المشاركة ثابت دائمًا

ب) البيورين دائمًا يتزاوج مع بيريميدين

ج) تتشكل جسور ثاني كبريتيد بين خيوط DNA

د) أزواج A مع أزواج G و T مع C

أ) يمكن أن توجد المعززات في آلاف النيوكليوتيدات في بداية اتجاه الجين الذي تؤثر عليه.

ب) تحتوي المعززات على متواليات تتعرف عليها عوامل النسخ.

ج) يمكن أن تختلف المعززات لكل جين في خلية حقيقية النواة (على الرغم من أن التداخل ممكن).

د) تمثل المعززات عناصر تحكم تقع بعيدًا عن المروج.


مقدمة

حمض Deoxyribonucleic ، المعروف أكثر باسم DNA ، هو جزيء متطور يحتوي على الكود الجيني للكائنات الحية. كل كائن حي لديه حمض نووي داخل خلاياهم. إنه مهم للوراثة وترميز البروتينات ودليل التعليمات الجينية للحياة وعملياتها. يحمل الحمض النووي تعليمات الكائن الحي أو كل عمليات تطور الخلية والتكاثر والموت في النهاية. على مدى العقود الماضية ، تم اقتراح مناقشات تجريبية لتعديل الجينات في الحمض النووي. تمت مناقشة هذه التغييرات كثيرًا في المجال الطبي من خلال الاعتماد على تطبيقات مثل العلاج أو منع تطور السرطان أو اندلاع عضو (على سبيل المثال ، سن). من ناحية أخرى ، تجدر الإشارة إلى أن 3٪ فقط من سعة الحمض النووي تؤخذ في الاعتبار في المجالات الطبية. في العقدين الماضيين ، أثار العلماء الروس موضوعًا يسمى "جينوم الموجة" ، والذي ينص على أن 97٪ من الحمض النووي الآخر ليس فقط غير قابل للتطبيق ولكن له أيضًا دور أكثر أهمية لأن الحمض النووي يمكن أن يتأثر بالصوتيات والكهرومغناطيسية و موجات عددية. تحت تأثير هذه الموجات ، يمكن قراءة الشفرة الجينية أو إعادة كتابتها. ادعاء آخر للعلماء الروس هو أن الحمض النووي هو شبكة بيولوجية تربط جميع البشر. حول قابلية تأثر الحمض النووي من تردد الموجة ، تم إجراء العديد من الدراسات البحثية التجريبية التي فتحت فرعًا جديدًا في العلم ، يسمى جينوم الموجة. قام كونستانتين ميل بتكييف الموجات العددية التي وصفها نيكولا تيسلا مع علم الأحياء واقترح العلاقة بين الموجات العددية والحمض النووي 1. حقق جريج برادون وزملاؤه في 3 تجارب في قابلية تأثر الحمض النووي من المشاعر البشرية 2. درس رين ومكراتي تأثير الموسيقى على الحمض النووي 3،4،5. أجريت دراسة أخرى حول تأثير الموجات الصوتية على تخليق وجينات الأقحوان 6. أثبت Peter Garjajev ومجموعته البحثية أنه يمكن إعادة برمجة الحمض النووي بالكلمات واستخدام الترددات الرنانة الصحيحة للحمض النووي 7،8. حاول عالم أحياء الكم الروسي بوبونين أن يثبت أن الحمض النووي البشري له تأثير مباشر على العالم المادي باستخدام بعض التجارب 9. اكتشف أيضًا أن حمضنا النووي يمكن أن يسبب أنماطًا مزعجة في الفراغ ، مما ينتج عنه ثقوب دودية مجهرية ممغنطة 10. يزعم العالم لوك مونتانييه الحائز على جائزة نوبل والمعروف بدراسته عن فيروس نقص المناعة البشرية والإيدز ، أنه أثبت أن الحمض النووي يمكن أن يتولد عن طريق النقل الآني من خلال البصمة الكمومية وأظهر أيضًا أن الحمض النووي ينبعث من الإشارات الكهرومغناطيسية التي تنقل الحمض النووي إلى أماكن أخرى ، مثل جزيئات الماء 11،12.

حول النمذجة الرياضية للحمض النووي ، تم اقتراح ثلاثة نماذج رياضية بارزة لوصف الحمض النووي. النموذج الأكثر شهرة الذي تم تقديمه هو نموذج PBD (Peyrard-Bishop-Dauxois) 13 ، على الرغم من أن هذا النموذج قد تم تحديثه من قبل العديد من الباحثين 14،15،16،17،18 ، النماذج المقدمة في هذه الدراسات عادة ما تحتوي على ثلاث نقاط ضعف مهمة على الأقل مثل الانفصال ، وعدم التواجد خارج الطائرة ، وعدم الالتفاف ، وعدم مراعاة موقع القواعد النووية. يتم عرض أمثلة على نموذج PBD في الشكل 1. النموذج الآخر هو نموذج قضيب يبحث في الحمض النووي بمقياس أكبر 19،20،21 ، مع نقاط ضعف كبيرة ، بما في ذلك عدم الاهتمام بمواضع القاعدة النووية ورابطة الهيدروجين ، وكذلك النظر في الحمض النووي بخيط واحد (الشكل 2). هناك نموذج آخر يسمى SIDD (نزع استقرار الحمض النووي المزدوج الناجم عن الإجهاد) وهو رياضي بالكامل ويتم تطبيقه في مجال الديناميات الجزيئية 22،23. تم تصميم هذه النماذج المذكورة في الغالب للتحقيق في اهتزاز الحمض النووي ، وهناك العديد من النماذج المتاحة في مجالات أخرى مثل المرونة الحتمية للحمض النووي 24 وانحناء الحمض النووي 25،26. الحزمة هي عنصر هيكلي يقاوم بشكل أساسي الأحمال المطبقة بشكل جانبي على محور الحزمة. طريقة الانحراف هي في المقام الأول عن طريق الانحناء. تأخذ نظرية شعاع تيموشينكو في الاعتبار تشوه القص وتأثيرات الانحناء الدوراني لوصف سلوك الحزم السميكة. من ناحية أخرى ، تركز جميع الدراسات السابقة المتعلقة بذبذبات الحزمة المنحنية على الاهتزازات الخارجية للحزم المنحنية (ذات الإحداثيات المضمنة) ولا تدرس الاهتزاز المستوي للحزم المنحنية. أ. Leung هو المرجع الوحيد المشتق من المعادلات الحاكمة للحزمة الحلزونية ذات المقاطع العرضية المستطيلة مع الالتواء المسبق 27.

رسم تخطيطي لنموذج PBD (أ) وتحديثاته (ب - د). تم رسم هذه الصور باستخدام Adobe Photoshop CC 2018.


الحمض النووي ، وليس البروتين ، ينتقل إلى النسل

أدرك هيرشي وتشيس (1952) أنه بإمكانهما استخدام تطورين جديدين (في ذلك الوقت) لاختبار صارم لفكرة أن الحمض النووي هو المادة الجينية. تم عزل الجراثيم (أو العاثيات أو الفيروسات التي تصيب البكتيريا) التي من شأنها أن تصيب البكتيريا وتتلاشى عليها ، مما ينتج عاثرة ذرية. من خلال إدخال عناصر مشعة مختلفة في البروتين والحمض النووي للعاثية ، يمكنهم تحديد أي من هذه المكونات تم نقله إلى النسل. يجب أن تمتلك هذه الخاصية فقط المواد الجينية القابلة للتوريث. (كان هذا أحد أقدم استخدامات العلامات المشعة في علم الأحياء).

كما هو موضح في الشكل 2.1 ، تمت تسمية بروتينات الملتهمة T2 بـ 35 S (على سبيل المثال في الميثيونين والسيستين) وتم تمييز الحمض النووي بـ 32 P (في العمود الفقري للسكر والفوسفات ، كما سيتم تقديمه في القسم التالي). البكتيريا بكتريا قولونية بعد ذلك بالعاثية التي تحمل علامة رابيول. بعد فترة وجيزة من الإصابة ، قام Hershey و Chase بإزالة معاطف العاثيات من البكتيريا عن طريق التعطل الميكانيكي في Waring Blender ، وراقبوا أين ذهب النشاط الإشعاعي. بقيت معظم الـ 35 S (80٪) مع معاطف الملتهمة ، ومعظم الـ 32 P (70٪) بقيت مصابة بالبكتيريا المصابة. بعد خلع البكتيريا من العدوى ، وجد أن سلالة الملتهمة تحمل حوالي 30 ٪ من المدخلات 32 P ولكن لا شيء تقريبًا (& lt1 ٪) من 35 S. الحمض النووي ( 32 P) تصرفت مثل المواد الجينية ل- دخلت الخلية المصابة ووجدت في عاثية النسل. بقي البروتين (35 S) إلى حد كبير في الخلف مع معاطف الملتهمة الفارغة ، ولم يظهر أي منها تقريبًا في النسل.

الشكل 2.1. المادة الوراثية للعاثية T2 هي الحمض النووي.


النتائج

ملخص

يعرض الشكل 1 أطياف الأقراص المضغوطة المعتمدة على درجة الحرارة لستة أليغنوكليوتيدات تمثيلية لـ REP ، والتي تعكس عمومًا الأنواع الطيفية المختلفة التي نلاحظها. يتم توفير أطياف القرص المضغوط المعتمد على درجة الحرارة ومنحنيات انصهار الأشعة فوق البنفسجية لجميع النكليوتيدات 23 REP في الجدول SI للمادة الداعمة. تم تلخيص الخصائص الهيكلية الواسعة المستمدة من البيانات التجريبية في دعم جدول المعلومات SII. يسلط الجدول 3 الضوء على ميزات التسلسل العامة البارزة لمجموعة من 203 REPs حددناها من عمليات البحث في الجينوم الكامل ، ويمكن العثور على نسخة أكثر تفصيلاً من الجدول في دعم جدول المعلومات SIII.

جزء من Palindrome أحادي النوكليوتيدات أ العدد الإجمالي للنيوكليوتيدات أحادية وثنائية ورباعية النوكليوتيدات في عينة من 203 تسلسل REP.
جيجابايت ب الترددات المرصودة للتسلسلات الفردية.
سي بي ب الترددات المرصودة للتسلسلات الفردية.
أب ب الترددات المرصودة للتسلسلات الفردية.
السل ب الترددات المرصودة للتسلسلات الفردية.
ثنائي النوكليوتيدات أ العدد الإجمالي للنيوكليوتيدات أحادية وثنائية ورباعية النوكليوتيدات في عينة من 203 تسلسل REP.
جيجا بايت ب الترددات المرصودة للتسلسلات الفردية.
CCb ب الترددات المرصودة للتسلسلات الفردية.
رباعي النوكليوتيد أ العدد الإجمالي للنيوكليوتيدات أحادية وثنائية ورباعية النوكليوتيدات في عينة من 203 تسلسل REP.
GGGGb ب الترددات المرصودة للتسلسلات الفردية.
CCCCb ب الترددات المرصودة للتسلسلات الفردية.
CGCGb ب الترددات المرصودة للتسلسلات الفردية.
GCGCb ب الترددات المرصودة للتسلسلات الفردية.
GAGG + GGAGb ب الترددات المرصودة للتسلسلات الفردية.
AAAA + TTTTb ب الترددات المرصودة للتسلسلات الفردية.
5' 1970 909 458 308 295 1767 319 98 1361 11 4 8 25 10 4
3' 1963 543 864 362 194 1649 97 317 1354 5 11 30 30 1 2
  • يتم عرض التسلسلات التي تحدث بشكل ملحوظ في كثير من الأحيان أكثر من المتوقع في الحمض النووي المكون من خليط متساوي الأضلاع من النيوكليوتيدات G و A و C و T في بالخط العريض، تلك التي تحدث في كثير من الأحيان أقل مائل. تم تفصيل التحليل الإحصائي لتسلسل REP في دعم جدول المعلومات SIII.
  • أ العدد الإجمالي للنيوكليوتيدات أحادية وثنائية ورباعية النوكليوتيدات في عينة من 203 تسلسل REP.
  • ب الترددات المرصودة للتسلسلات الفردية.

تم تحديد تسلسل DNA الجينومي "من النوع البري" الطبيعي جزئيًا على أساس كونها مكونة من متناظر غير كامل يقع بالقرب من جين RAYT. يشير تحليل مبسط للتسلسلات المدرجة في الجدول 2 إلى أن قليل النوكليوتيدات المقابلة قد تنثني في دبابيس شعر تحتوي على سيقان مكونة حصريًا من أزواج Watson-Crick (W-C) المتعارف عليها. ومع ذلك ، تكشف بياناتنا الطيفية أن السلوك التوافقي لهذه الأوليغنوكليوتيدات أكثر تعقيدًا بكثير ، مع وجود أقلية فقط من هذه الجزيئات تظهر خصائص تتفق حصريًا مع الهياكل الحلقية الجذعية. تشير بياناتنا التجريبية إلى أن غالبية قليل النوكليوتيدات في المحلول تشكل مزيجًا من المطابقات الثانوية المتنافسة. حتى قليل النوكليوتيدات المتوقع أن تنثني في الغالب في هياكل دبوس الشعر تظهر أطياف CD ، غير متسقة مع وجود بنية محلول واحد متجانس. تكشف بياناتنا عن السلوك الأكثر تميزًا لممثلي C. hominis، على وجه الخصوص تشوم 22. أطياف القرص المضغوط تشوم 22 والمتغيرات ذات الصلة قليلة النوكليوتيد الموضحة في الشكل 2 ، تعرض الملاحظات التجريبية الفريدة التي من المحتمل أن تعكس تشكيل الحل للهياكل التي تمتلك نواة رباعية. نناقش أدناه تحيزات التركيب والتسلسل في عناصر REP ، وسلوك الحل المعقد الذي نلاحظه لاختيار قليل النوكليوتيدات REP.

مقارنة بين أطياف القرص المضغوط لأوليغنوكليوتيدات ذات الصلة بـ REP تشوم 22, تشوم 38, تشوم 12, تشوم 3 ت, تشوم -3 أ، و Chom-3A / T. من عند كارديوباكتيريوم هومينيس عند 25 درجة مئوية (اللوحة اليسرى) و 95 درجة مئوية (اللوحة اليمنى). تُظهر الأطياف المقاسة عند 25 درجة مئوية فروقًا ذات دلالة إحصائية ، في حين أن أطياف أليغنوكليوتيدات مشوهة الصفات التي تم قياسها عند 95 درجة مئوية متشابهة للغاية. يتم سرد تسلسل جميع قليل النوكليوتيدات في الجدول 2.

تم تمثيل خطوات G-Tracts و GC Dinucleotide المتناوبة بشكل مفرط إحصائيًا في 5 نصف من REP Pseudo Palindromes

حددنا 203 تسلسل REP من 105 أنواع بكتيرية بناءً على معايير التسلسل العامة المدرجة في الجدول 1. تم تحليل هذه المجموعة الفرعية المستخرجة من قواعد البيانات الجينية بمزيد من التفصيل فيما يتعلق بالتركيب الأساسي لكل عضو ، مع تلخيص هذه النتائج في الجدول 3. لمزيد من التفاصيل حول هذه التوزيعات ، بما في ذلك الإحصاء ض تحليل النتيجة ، تتم إحالة القارئ إلى جدول المعلومات الداعمة SIII في المواد الداعمة. قمنا بتحليل مقاطع 5′ و 3′ بشكل منفصل من المجالات المتناظرة التي تشكل سيقانًا مفترضة ، والجزء المركزي القصير عمومًا من المتناظرة يفترض أنه يشكل حلقة دبوس الشعر. تم استبعاد التعرف على رباعي النوكليوتيد GTAG (أو GTGG) المحفوظ عالميًا من التحليل حتى لا يتم تحيز النتائج من خلال ثباتها.

حدد تحليلنا لأنماط التسلسل قواسم مشتركة مثيرة للاهتمام بين البيانات الجينومية المجمعة والتي تتجاوز معايير التناظر غير الكاملة المستخدمة في البداية لتحديد التسلسلات ذات الصلة. على وجه التحديد ، تميل هذه التسلسلات إلى أن تحتوي على شرائح 5′ غنية بالجوانين وشرائح 3′ تكميلية غنية بالسيتوزين مع وجود الأدينوزين والثيمينات أكثر ندرة في كلا الجزأين. في المقابل ، فإن منطقة الحلقة المفترضة ، والتي تمثل حوالي 20٪ من العدد الإجمالي للنيوكليوتيدات في متواليات REP التي تم تحليلها ، لها نفس العدد تقريبًا من جميع النيوكليوتيدات الأربعة. تحدث بعض النوكليوتيدات ، وثلاثي النوكليوتيدات ، ورباعي النوكليوتيدات في نطاقات الجذع المفترضة بشكل متكرر أكثر من المتوقع بالنسبة للحمض النووي ذي التركيبة النوكليوتيدية المتساوية G: A: C: T. ميزة التسلسل الأكثر لفتًا للنظر هي التردد العالي لتمديدات GG و GGG و GRRG في المقطع 5′ من الجذع ، مع متواليات بيريميدين التكميلية في المقطع 3′ المتناوب. الميزة النموذجية الأخرى للمجالات الجذعية هي تكرار خطوات G / C المختلطة. يظهر GCGC بشكل متكرر في كلٍ من الجزء 5 و 3′ من الجذع ، بينما يكون CGCG مكتظًا فقط في المقطع 3′. نتوقع أن السمتين الأخيرتين - المسالك G و C و / أو النوكليوتيدات المتناوبة GC المتناوبة في المجال الجذعي المتوقع - تجعل تسلسل REP معقدًا من حيث التوافق. وبشكل أكثر تحديدًا ، يشير التكرار المتكرر للعديد من الجوانين في صف في المقطع 5′ والعديد من السيتوزينات في المقطع 3′ إلى إمكانية تكوين هياكل DNA مطوية مثل G-tetraplexes أو i-motives.

الخصائص التوافقية لأوليغنوكليوتيدات REP

في الأقسام التالية ، نناقش التفضيلات المطابقة لأوليغنوكليوتيدات مختارة REP من حيث سلوكها المحلول كما يتضح من قياساتنا الطيفية والمسعرية. وترد أوصاف أكثر تفصيلاً للسمات الطيفية المرصودة في نص المعلومات الداعمة والجدول SI.

متواليات REP التي تشكل بشكل أساسي الهياكل الجذعية الحلقية

أطياف القرص المضغوط من أليغنوكليوتيدات REP من بكتريا قولونية و S. maltophilia تكشف عن السمات المميزة للحمض النووي من النوع ب. 22 علاوة على ذلك ، تُظهر منحنيات التمسخ للأشعة فوق البنفسجية انتقالات انصهار تعاونية واضحة ثنائية الحالة ومستقلة عن التركيز. هذه الملاحظات ، مقترنة بتحليل SVD الخاص بنا الذي يكشف عن مكونين طيفيين مهمين ، تتوافق معًا مع بنية حلقة جذعية أحادية الجزيء باعتبارها بنية الحل لهذه قليلات النوكليوتيدات. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لـ إيكولي- TT, إيكولي- TC، و SM4-A / T oligonucleotides ، وجدنا اتفاقًا بين تغيير المحتوى الحراري التمسخ من van't Hoff المحسوب من منحنيات الانصهار الضوئية وتغير المحتوى الحراري المقاس مباشرةً بواسطة القياس الدقيق ، وهو ما يعادل انعكاسًا لانتقال ثنائي الحالة. مجتمعة ، تتوافق بياناتنا مع وجود نوع أحادي الجزيء في محلول في درجات حرارة منخفضة مع عنصر B-form يهيمن على طيف القرص المضغوط. الهندسة المعمارية الظاهر القاسي للثلاثة المقاسة بكتريا قولونية تمت دراسة التسلسلات هنا (كلها تحدث بشكل طبيعي في بكتريا قولونية) يتوافق مع بنية الحلقة الجذعية لـ بلورات بيئية لوحظ في التركيب البلوري لرمز PDB 4er8. 14

ال SM1, SM4, SM8, Hpar2, Hpar2-A / T, Hpar2-T / A, Chom-3AT, تشوم -3 أ تُظهر oligonucleotides خصائص طيفية للقرص المضغوط متوافقة مع وجود بعض الحمض النووي من النوع B في المحلول ، وهما الحد الأقصىان بالقرب من 220 و 275 نانومتر ، والذروة السلبية بالقرب من 245 نانومتر (جدول المعلومات الداعمة SI). علاوة على ذلك ، بالنسبة لمعظم ، وليس كل ، درجات حرارة الانصهار هذه مستقلة عن التركيز ، ومتسقة مع البنية أحادية الجزيء. ومع ذلك ، فإن تحليل SVD لأطياف الأقراص المضغوطة التي تعتمد على درجة الحرارة ، وفحص منحنيات ذوبان الأشعة فوق البنفسجية الخاصة بهم يكشف عن وجود مطابقة إضافية إلى جانب دبوس الشعر المتوقع ، وهو خصم يتوافق مع مجموعة غير متجانسة من المطابقات لهذه oligonucleotides المرتبطة بـ REP.

التغيرات المعتمدة على درجة الحرارة في أطياف القرص المضغوط للأوليغنوكليوتيدات SM1, SM4, SM8، و Hpar2 تشير إلى مجموعة غير متجانسة من هياكل الحل. قد يساهم التحيز في التركيب الملحوظ في سلوك الحل المعقد لهذه المجموعة من REPs. لاختبار هذا الاحتمال ، قمنا بشكل منهجي بتشويش خصائص Hpar2 من خلال استبدال ثلاثة توائم GGG و CCC بثلاثة توائم GAG و CTC في Hpar2-A / T وبواسطة ثلاثة توائم GTG / CAC في Hpar2-T / A. تعمل هذه الطفرات على جعل التسلسل الجذعي عشوائيًا وتعطيل مسارات G / C. من حيث المبدأ ، يجب أن تزيد هذه التغييرات من احتمال تبني متغيرات Hpar2 لقص الشعر. ومع ذلك ، على عكس هذا التوقع ، نقيس الخصائص الطيفية المتطابقة تقريبًا ومنحنيات الانصهار لهذه الثلاثة Hpar2 المتغيرات قليلة النوكليوتيد. نحن نفترض أن هذه النتائج تشير إلى أن أيزومرات التسلسل موجودة كعدة مطابقات في المحلول.

متواليات REP مع ميزات طيفية معقدة

Xanthomonas Campestris

أطياف القرص المضغوط ومنحنيات ذوبان الأشعة فوق البنفسجية لأوليغنوكليوتيدات ذات الصلة بـ REP X. campestris تكشف عن سلوك توافقي معقد. ملامح أطياف القرص المضغوط للتسلسل الطبيعي Xcam تعكس وجود بعض الهياكل الحلزونية اليمنى ، ومع ذلك ، كما يتضح من تحليل SVD ، لا تعكس هذه الميزة تشكلاً فريدًا. توقع Zuker 23 شكل دبوس الشعر الأكثر استقرارًا في Xcam يتم تثبيت قليل النوكليوتيد بواسطة جذع W-C يتكون من hexanucleotide GCGCGC. المساهمة الواضحة لأشكال الحلقة الجذعية الأخرى في أطياف القرص المضغوط Xcam يمكن تفسيره من خلال انزلاق أزواج G-C من هيكسانوكليوتيد مما يؤدي إلى تنافس العديد من المطابقات في المحلول ، وبالتالي ترشيد الأطياف المرصودة. لتعطيل تكرار GC hexanucleotide المنتظم والحث على بنية حلقة جذعية فريدة من نوعها ، X. campestris تم تحور التسلسل إلى Xcam-mod عن طريق استبدال GC بـ TA. لمزيد من تفضيل تشكيل دبوس الشعر ، قمنا أيضًا بإطالة TT المركزي إلى TTTT في Xcam-4T و Xcam-4T- ناقص لتحقيق الاستقرار في مجال الحلقة المتوقعة. في قليل النوكليوتيد الأخير ، حاولنا أيضًا تثبيت الحلقة الجذعية عن طريق إزالة رباعي النوكليوتيد الغني بالبيورين 3′ طرفي بحيث لا يتداخل مع تفاعلات الاقتران الأساسي داخل مجال دبوس الشعر المفترض. كما في حالة التسلسلات التي تمت مناقشتها بالفعل والمتعلقة بـ Hpar2 قليل النوكليوتيد ، لم يؤد أي من هذه التعديلات على التسلسل الطبيعي إلى تغييرات كبيرة في غير المعتاد Xcam أطياف القرص المضغوط. بينما تفسير لا لبس فيه لحل السلوك Xcam ومتغيراته التسلسلية غير ممكنة على أساس بياناتنا الطيفية وحدها ، فمن الواضح أن هذه الأوليغنوكليوتيدات تشكل حالات / مطابقات متعددة في محلول يتجاوز دبابيس الشعر ذات الحلقة الجذعية البسيطة.

سولفوروفوم س

مندوب SNBC-37-1 من المحتمل أن يشكل التسلسل دبوس شعر بساق ممتد يتكون من تسعة أزواج من قاعدة W-C وحلقة مكونة من أربعة سيتوزينات غير مقترنة (أو ثايمينات في التسلسل المعدل لـ SNBC-T4). ومع ذلك ، كما هو الحال في العديد من الحالات السابقة التي تمت مناقشتها ، تتوافق أطياف القرص المضغوط مع توازنات أكثر تعقيدًا في الحل. ال SNBC-37-1 يعرض oligonucleotide مجموعة من الميزات الطيفية التي تشير إلى وجود كل من التشكل B و quadruplex المتوازي في المحلول.

متواليات REP لتشكيل Tetraplexes الغنية بالجوانين

قليل النوكليوتيدات المتعلقة بعناصر REP الخاصة بـ كارديوباكتيريوم هومينيس يُظهر السلوك الأكثر إثارة للاهتمام. التسلسل الطبيعي تشوم 22 يتكون من متناظر متنبأ به لتشكيل بنية حلقة جذعية بثمانية جذع زوج قاعدي W-C مرتبط باثنين من الثايمين في حلقة دبوس شعر مفترضة (المخطط 1 أ). ومع ذلك ، يحتوي الجزء 5′ من المتناظرة أيضًا على مسالك G متتالية مفصولة بـ T. والثاني هو G4-tract المثالي. تُرى أنماط مماثلة من مسالك G ثلاثية أو رباعية النوكليوتيد متتالية مفصولة بواحد أو اثنين من النيوكليوتيدات الأخرى في تسلسلات G الغنية الأخرى ، بما في ذلك Hpar1. طيف القرص المضغوط ذو درجة الحرارة المنخفضة لـ تشوم 22 غير مألوف للغاية ، وتشكل قمتين موجبتين عند 289 و 259 نانومتر ، وسرجًا موجبًا عند 272 نانومتر ، وذروة سلبية عند 236 نانومتر (الشكل 1). يشير طيف القرص المضغوط مع ذروتين موجبتين حول 290 و 260 نانومتر إلى G-tetraplex المضاد للتوازي. 24 ، 25 ومع ذلك ، فإن الطيف الذي نلاحظه لا يتوافق تمامًا مع أطياف الأقراص المضغوطة للرباعية "الكلاسيكية" داخل الجزيئات المضادة للتوازي. السبب الأكثر ترجيحًا هو وجود جزء 3′ الغني بالسيتوزين من التسلسل ، والذي سيساهم بطرق غير معروفة في أطياف القرص المضغوط. أطياف القرص المضغوط لـ REP يحدث بشكل طبيعي Hpar1 من عند H. بارسيوس (لم تتم مناقشته بمزيد من التفصيل هنا) يُظهر أيضًا ميزات طيفية للقرص المضغوط توحي بتشكيل G-tetraplex المضاد للتوازي (جدول معلومات الدعم SI).

بناءً على هذه الملاحظات ، نقترح أن تكون أطياف القرص المضغوط غير عادية تشوم 22 تنشأ في المقام الأول من تفاعلات مسارات الجوانين. لاختبار هذا الاحتمال ، قمنا باقتطاعه تشوم 22 إلى تشوم 12 ، الاحتفاظ فقط بالبيورين الغني بجزء 5′ من التسلسل ، وبالتالي تقليل إمكانية الاقتران بقاعدة W-C. أطياف القرص المضغوط تشوم 12 يكشف عن ميزات مختلفة عن تشوم 22 (الشكل 2) ، مع وجود أوجه تشابه مع الأطياف المبلغ عنها لـ poly (dG) • poly (dC) 26 ولأوليغنوكليوتيدات غنية بـ G التي تشكل هياكل فرشاة سلك DNA. 27 نظرًا لأن بوليمرات poly (dG) • poly (dC) وفرشاة سلك DNA تحتوي غالبًا على نسبة عالية من poly (dG) tetraplex بترتيب موازٍ للخيوط ، فإننا نفترض أن تشوم 12 يشكل أيضًا تيترابلكس متوازيًا بين الجزيئات. على الرغم من أن الهياكل التي اعتمدتها تشوم 12 و تشوم 22 مختلفان ، فكلاهما متوافق مع إمكانية تكوين الهيكل على أساس الاقتران بقاعدة G-quartet.

لاختبار المزيد من تنبؤاتنا بأن سلوك الحل المرصود تشوم 22 يسيطر عليها تكوين G-tetraplex المضاد للتوازي بدلاً من دبوس الشعر ذو الحلقة الجذعية ، قمنا بتحويل تشوم 22 التسلسل إما لتعزيز أو تعطيل احتمال تكوين رباعي الأطراف. لتقليد مقاطع الحمض النووي المزدوجة الأطول ، والتي فيها تشوم 22 تم تضمين مواقع REP في الحمض النووي الطبيعي ، أضفنا متواليات قصيرة ذاتية التكميل من 6 نيوكليوتيدات إلى نهايتي 5′ و 3′ لتسلسل Chom22 الأصلي (المخطط 1 أ) لتشكيل Chom 38 (المخطط 1 ب). تسلسل النوكليوتيدات المختارة لقطاعات الذيل تعسفي لأنه لم يتم العثور على إجماع أثناء تحليل التسلسل خارج C. hominis المجال REP. رباعي النوكليوتيد T.4 تمت إضافته كمفصلة مرنة بين تشوم−22 التسلسل الأصلي ومجال الذيل على الجانب 3′ لحساب تسلسل التعرف GTAG على الجانب 5 (المخطط 1 أ ، ب). لتعزيز احتمالية تكوين رباعي الأطراف في تشوم 38، قمنا بإدخال 3 T بشكل استراتيجي بدلاً من C في النصف 3 'من المتناظرة لتقليل تكامل Watson-Crick ، ​​وبالتالي تشكيل تشوم -3 ت. كاختبار إضافي لفرضيتنا ، لتعطيل احتمالية تكوين رباعي الانحناء ، استبدلنا 3 G في المسالك G للنصف الغني بالبيورين 5 'من نصف تشوم 38 متناظرة بنسبة 3 ألف لتشكيل تشوم -3 أ، قمنا أيضًا بتحويل G إلى A بالإضافة إلى تكميلية C إلى T في نفس الوقت لتشكيل Chom-3AT.

كما هو مبين في الشكل 2 ، فإن أطياف القرص المضغوط تشوم 38 تتفق مع الجزيء الذي يتبنى رباعي متوازٍ مشابه مثل الوالد تشوم 22 الجزيء ، على الرغم من أن خصائصه الطيفية يتم تغييرها بمهارة ، إلا أنها تعكس على الأرجح المساهمات من القواعد الإضافية والقيود الهيكلية التي تُدخلها. الأهم من ذلك ، المتحولة Chom-3T ، مصمم لتعزيز احتمال تكوين رباعي الانحناء ، عرض أطياف CD مماثلة لطيف تشوم 22 الوالد ، بما في ذلك نطاق موجب بالقرب من 290 نانومتر. تشوم 3 ت لا يظهر انتقال درجة حرارة تعاوني عند درجة حرارة انصهار أقل بكثير (51 درجة مئوية) من تشوم 22 و تشوم 38، مما يشير إلى أنه بالإضافة إلى G-tracts ، فإن C4- يتجاذب في تشوم 22 و تشوم 38 المساهمة في استقرار الشكل المطوي في الحل. في المقابل ، وبالتوافق مع مبادئ التصميم الخاصة بنا ، فإن أطياف القرص المضغوط ومنحنيات الذوبان السيني لـ تشوم -3 أ و Chom-3AT تفتقر المسوخات إلى السمات النموذجية لعكسات G-tetraplexes المضادة للتوازي. في الواقع ، فإن أطياف الأقراص المضغوطة الخاصة بهم تشبه إلى حد بعيد أطياف B-DNA التقليدية ، مع انتشار الاقتران القاعدي W-C ، على الرغم من أن الأطياف مشوهة قليلاً بالنسبة إلى أطياف B-DNA العامة ، وربما تعكس تأثيرات التركيب الأساسي.

مجتمعة ، تشير هذه الملاحظات إلى أن التشكل السائد الذي اعتمده تشوم 22 قليل النوكليوتيد في المحلول ليس دبوس شعر ذو حلقة جذعية ولكنه ترتيب يشبه العقدة الكاذبة يتكون حول نواة G-tetraplex ثنائية الجزيئات المركزية ، كما هو موضح في المخطط 1c. Such a bimolecular pseudoknot-like arrangement leaves the pyrimidine-rich segment nominally unpaired. However, cytosine tracks can also adopt secondary two- and four-stranded structures in solution, especially at low pH. 28-30 Formation of an ordered cytosine-based structure might further contribute stabilizing interactions to the central tetraplex structure. Importantly, the significant differences observed between the CD spectra of the Chom mutants (Figure 2) at low temperatures are largely absent in spectra of the denatured species measured at 95°C. The low temperature spectral differences therefore predominantly reveal differences in conformation of the native state rather than differences in the base composition.


النتائج

Length-dependent RNA oligonucleotide-induced ribosomal frameshifting

Although antisense oligonucleotides were found to induce ribosomal frameshifting ( 27, 28), the optimal number of base pairs has not been addressed yet. To investigate this we designed antisense RNA oligonucleotides that are 6, 9, 12, 15 and 18 bases complementary to the region downstream of an UUUAAAC slippery sequence in our reporter plasmid SF468 ( Figure 1). First, titration with RNA6 and RNA9 oligonucleotides revealed that a 625-fold molar excess of oligonucleotides over mRNA resulted in the highest level of frameshifting ( Figure 2a) this ratio was used in the following experiments. The shortest oligonucleotide, RNA6, was not capable of inducing significant levels of frameshifting ( Figure 2b), whereas RNA9 induced ∼3.5% of frameshifting. Maximum levels were obtained with RNA12, RNA15 and RNA18 all three induced ∼12% of frameshifting. In the following experiments oligonucleotides between 12 and 18 nt in length were used.

Schematic representation of frameshift reporter constructs. ORF1 (19 kD) is in the 0 frame and ORF2 (46 kD) is in the −1 translational frame with respect to ORF1. The appearance of the 65 kD fusion protein represents the occurrence of −1 frameshifting. The UUUAAAC slippery sequence is indicated in italics. The 0-reading frame and −1 reading frames codons are indicated above and below the sequences, respectively. RNA18, 12, 15, 9 and 6 are antisense RNA oligonucleotides complementary to the indicated region downstream of the slippery sequence in SF468 mRNA.

Schematic representation of frameshift reporter constructs. ORF1 (19 kD) is in the 0 frame and ORF2 (46 kD) is in the −1 translational frame with respect to ORF1. The appearance of the 65 kD fusion protein represents the occurrence of −1 frameshifting. The UUUAAAC slippery sequence is indicated in italics. The 0-reading frame and −1 reading frames codons are indicated above and below the sequences, respectively. RNA18, 12, 15, 9 and 6 are antisense RNA oligonucleotides complementary to the indicated region downstream of the slippery sequence in SF468 mRNA.

Optimizing the ratio and lengths of frameshift-inducing RNA oligonucleotides. (أ) An amount of 0.05 pmol of SF468 mRNA were mixed with 0.05, 0.25, 1.25, 6.25 and 31.25 pmol of RNA6 and RNA9 oligonucleotides, respectively. Mixtures were subsequently translated in the presence of 35 S-methionine and the labeled proteins were examined by 13% SDS–PAGE. Frameshift efficiencies [FS (%)] were calculated after quantification and correction of in-frame and frameshifted product. (ب) A total of 625 M excess of different lengths of RNA oligos (RNA6, 9, 12, 15, 18, respectively) and control without added oligonucleotide were mixed with 0.05 pmol of SF468 mRNA. Mixtures were translated and examined by 13% SDS–PAGE. In-frame and frameshifted protein products are indicated by NFS and FS, respectively. Frameshifting efficiency [FS (%)] and standard deviation (SD) of three independent duplicate assays are indicated below each lane.

Optimizing the ratio and lengths of frameshift-inducing RNA oligonucleotides. (أ) An amount of 0.05 pmol of SF468 mRNA were mixed with 0.05, 0.25, 1.25, 6.25 and 31.25 pmol of RNA6 and RNA9 oligonucleotides, respectively. Mixtures were subsequently translated in the presence of 35 S-methionine and the labeled proteins were examined by 13% SDS–PAGE. Frameshift efficiencies [FS (%)] were calculated after quantification and correction of in-frame and frameshifted product. (ب) A total of 625 M excess of different lengths of RNA oligos (RNA6, 9, 12, 15, 18, respectively) and control without added oligonucleotide were mixed with 0.05 pmol of SF468 mRNA. Mixtures were translated and examined by 13% SDS–PAGE. In-frame and frameshifted protein products are indicated by NFS and FS, respectively. Frameshifting efficiency [FS (%)] and standard deviation (SD) of three independent duplicate assays are indicated below each lane.

LNA/DNA mix-mers induced-ribosomal frameshifting

Since we have absent knowledge about the efficacy of LNA-induced ribosomal frameshifting, LNA/DNA mix-mers of 18 nt in length were designed to investigate this ( Figure 3). A DNA oligonucleotide, as expected, was less capable (3.5%) of inducing frameshift due to the lower thermodynamic stability of RNA–DNA duplexes, see also below. Surprisingly, substituting the 3′-cytosine and guanosine in this DNA oligonucleotide by their LNA analogs enhanced its frameshift inducing capacity to 8.7%, i.e. as high as an RNA oligonucleotide (8.8%). Increasing the LNA content of this oligonucleotide further did not lead to higher frameshifting. On the contrary, the efficiency of LNA4 was with 7.7% lower than that of LNA2 and that of LNA6 was a mere 1.1%. Since the overall translation efficiency seemed not affected by LNA6 we suspected an effect of the oligonucleotide itself (see below).

Effect of LNA substitutions on oligonucleotide-induced frameshifting. SF468 mRNA was translated in the presence of a 625-fold molar excess of DNA, RNA or LNA substituted DNA oligonucleotides in rabbit reticulocyte lysate. DNA and RNA oligonucleotides are indicated in capital and LNA substitutions are denoted by lowercase characters. See legend to Figure 2 for more details.

Effect of LNA substitutions on oligonucleotide-induced frameshifting. SF468 mRNA was translated in the presence of a 625-fold molar excess of DNA, RNA or LNA substituted DNA oligonucleotides in rabbit reticulocyte lysate. DNA and RNA oligonucleotides are indicated in capital and LNA substitutions are denoted by lowercase characters. See legend to Figure 2 for more details.

The effectiveness of LNA/DNA mix-mers is universal

To demonstrate that the enhanced effect of LNA oligonucleotides is a general feature we designed another construct (SF462) in which the target sequence was replaced by an unrelated sequence ( Figure 4). LNA/DNA mix-mers were designed in which nucleotides starting from the 3′-end were gradually replaced by LNA ( Figure 4). Increasing the number of LNAs from one to two and four in these DNA oligonucleotides improved their frameshift inducing ability, reaching an apparent optimum of 7.0% with four LNA substitutions. Further increase of the LNA content to 6 nt (LD6) did not improve frameshift efficiency, but, on the other hand, LD6 also did not lead to the dramatic decrease as observed above for the LNA6 oligonucleotide applied in the SF468 construct. We suspected that (partial) self-complementarity may be limiting the effective concentration of free LNA/DNA oligonucleotides. To check this possibility, we ran all the oligonucleotides on a non-denaturing polyacrylamide gel. Figure 5 showes that the LNA6 oligonucleotide indeed migrated more slowly indicative of partial dimer formation, presumably by intermolecular base pairing of the palindromic GCGCGC sequences in each oligonucleotide (compare the migration to that of the full dimer formed by annealing of oligonucleotides DNA18 and 18DNA). The LD series, as predicted, migrated as monomers. We noted that LD2, though loaded in equal amount, based on its UV absorbance, showed a higher affinity to ethidium bromide than its counterparts. At present we have no explanation for this unexpected behavior of LD2, since its migration and therefore its conformation was identical to the other LNA/DNA mix-mers.

Frameshift enhancing activity of LNA-substituted deoxy-oligonucleotides. mRNA SF462 was translated in the absence or presence of 625-fold molar excess of DNA, RNA or LNA substituted DNA oligonucleotides, in rabbit reticulocyte lysate. LNA modifications are indicated by lowercase characters. See legend to Figure 2 for more details.

Frameshift enhancing activity of LNA-substituted deoxy-oligonucleotides. mRNA SF462 was translated in the absence or presence of 625-fold molar excess of DNA, RNA or LNA substituted DNA oligonucleotides, in rabbit reticulocyte lysate. LNA modifications are indicated by lowercase characters. See legend to Figure 2 for more details.

Self-dimerization of frameshift-inducing oligonucleotides. An amount of 31.25 pmol of the indicated oligonucleotides were left at room temperature for 10 min. and then loaded on a 15% non-denaturing polyacrylamide gel. After electrophoresis, the gel was stained by EtBr and photographed under UV-light.

Self-dimerization of frameshift-inducing oligonucleotides. An amount of 31.25 pmol of the indicated oligonucleotides were left at room temperature for 10 min. and then loaded on a 15% non-denaturing polyacrylamide gel. After electrophoresis, the gel was stained by EtBr and photographed under UV-light.

These results demonstrate that LNA modifications indeed enhance the antisense-induced frameshifting efficiency probably due to higher thermodynamic stability and RNA-like structural properties. This phenomenon appears to be general, at least in our experiments.

Position effect of LNA substitutions

To investigate which positions in a DNA oligonucleotide would exert the largest effect when substituted by an LNA analog, we designed LNA/DNA mix-mer mutants based on LNA2, which is the most efficient LNA/DNA mix-mer in our experiments and would give a good read-out. When the two LNA substitutions were moved two positions more inward (L2-1), compared to LNA2, frameshift efficiency decreased to 6.7% ( Figure 6). However, when the LNA modifications were moved another two positions more inward (L2-2), activity dropped to 2.7% ( Figure 6) which is comparable to an unmodified DNA oligonucleotide. Similarly, when the LNA groups were introduced at the other end of the oligonucleotide, activity was as low as DNA18 ( Figure 6). Finally, L2-4, in which the first and fourth position were LNA, was only half as efficient as LNA2. These results indicate that the choice of the location of the LNA modifications is crucial for the frameshift-inducing efficiency of an oligonucleotide.

Position effect of LNA substitutions on their frameshift-inducing activity. LNA substitutions are indicated by lowercase characters. See legend to Figure 2 for more details.

Position effect of LNA substitutions on their frameshift-inducing activity. LNA substitutions are indicated by lowercase characters. See legend to Figure 2 for more details.

Thermodynamic stability of frameshift-inducing oligonucleotides

Theoretically the position effect of the LNA substitutions could simply be explained by differences in thermodynamic stability of the resulting mRNA/oligonucleotide duplexes. To investigate this possibility we carried out UV-melting studies of the 18-nt LNA oligonucleotides in a 1:1 complex with an 18-nt RNA (18RNA) representing the mRNA. The melting temperatures (تيم) are shown in Table 1. The تيم of the 18RNA/RNA18 duplex was the highest with 82°C in agreement with its high frameshifting efficiency. The 18RNA/DNA18 duplex had a much lower تيم of 72°C, which is expected for an RNA/DNA hybrid, and also agreed with the lower frameshifting efficiency. The LNA substituted oligonucleotides, all had higher تيمs (+4 to +9°C) than DNA18. ال تيم of L2-2 was with 81°C almost as high as that of RNA18. Remarkably there was no correlation between the تيم of the LNA oligonucleotides and their frameshifting inducing capacity. على سبيل المثال ، ملف تيم of LNA2 was rather low with 76°C but it had the highest frameshifting activity, and L2-2, which had the highest تيم, actually had the lowest frameshifting activity. تيمs of L2-3 and L2-4 were identical but their frameshifting activities were 2.3 and 4.6%, respectively. We also noted that both L2-2 and L2-3 were comparable to DNA18 in frameshifting activity but formed far more stable duplexes. These data suggest that the position effect of the LNA substitutions is related to the mechanism of frameshifting and not في حد ذاته to their thermodynamic stability.

تيم measurements of frameshift-inducing oligos hybridized to complementary RNA

تيم measurements of frameshift-inducing oligos hybridized to complementary RNA


Which DNA sequence will have higher melting temperature: CCCCCC… or GCGCGC… ? - مادة الاحياء

Genomic human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) RNA consists of two identical RNA molecules joined noncovalently near their 5′ ends in a region called the dimer linkage structure (DLS). Previous work has shown that the putative DLS is localized in a 113-nucleotide domain encompassing the 5′ end of the أسكت الجين. This region contains conserved purine tracks that are thought to mediate dimerization through purine quartets. However, recently, an HIV-1Ma1 RNA dimerization model was proposed as the HIV-1Ma1 RNA dimerization initiation site, involving another region upstream from the splice donor site and possibly confined within a stem-loop. In the present study, we have investigated the dimerization of HIV-1Lai RNA, using في المختبر dimerization assays under conditions of low ionic strength, predictive RNA secondary structures determined by computer folding, and antisense DNA oligonucleotides in order to discriminate between these two models. Our results suggest that purine quartets are not involved in the dimer structure of HIV-1Lai RNA and have led to the identification of a region upstream from the splice donor site. This region, comprising an autocomplementary sequence in a possible stem-loop structure, is responsible for the formation of dimeric HIV-1Lai RNA.

This work is dedicated to the memory of Claude Paoletti.

∗ This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche sur le SIDA (ANRS). The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore by hereby marked “الإعلانات"وفقًا لـ 18 U.S.C. القسم 1734 فقط للإشارة إلى هذه الحقيقة.

Student of the Institut de Formation Supérieure Biomédicale (IFSBM) and supported by a Synthelabo fellowship.


DNA intercalation and inhibition of topoisomerase II : Structure-activity relationships for a series of amiloride analogs

Among its many properties, amiloride is a DNA intercalator and topoisomerase II inhibitor. Previous work has indicated that the most stable conformation for amiloride is a planar, hydrogen-bonded, tricyclic structure. To determine whether the ability of amiloride to intercalate into DNA and to inhibit DNA topoisomerase II was dependent on the ability to assume a cyclized conformation, we studied the structure-activity relationship for 12 amiloride analogs. These analogs contained structural modifications which could be expected to allow or impede formation of a cyclized conformation. Empirical assays consisting of biophysical, biochemical, and cell biological approaches, as well as computational molecular modeling approaches, were used to determine conformational properties for these molecules, and to determine whether they intercalated into DNA and inhibited topoisomerase II. Specifically, we measured the ability of these compounds to 1) alter the thermal denaturation profile of DNA, 2) modify the hydrodynamic behavior of DNA, 3) inhibit the catalytic activity of purified DNA topoisomerase II في المختبر, 4) promote the topoisomerase II-dependent cleavage of DNA, and 5) inhibit functions associated with DNA topoisomerase II in intact cells. Results indicated that only those analogs capable of cyclization could intercalate into DNA and inhibit topoisomerase II. Thus, the ability of amiloride and the 12 analogs studied to intercalate into DNA and to inhibit topoisomerase II appears dependent on the ability to exist in a planar, hydrogen-bonded, tricyclic conformation.


شاهد الفيديو: DNA results are out,, shocked!!!! نتائج الحمض النووي طلعت وانصدمت بيها (شهر فبراير 2023).