معلومة

لماذا يمكنك أن تصفيح الخلايا بكثافات مختلفة في مقايسة كولورميتريك؟

لماذا يمكنك أن تصفيح الخلايا بكثافات مختلفة في مقايسة كولورميتريك؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

الهدف من تجربتي هو معرفة ما إذا كان مثبط الكيناز يقلل من قابلية الخلايا السرطانية للحياة. أنا أستخدم كثافتين مختلفتين من الخلايا 50000 خلية / بئر و 100000 خلية / بئر وجرعات مختلفة من مثبط كيناز.


التعليقات التي قدمتها هي بعض الأسباب ، على الرغم من أنها تعتمد أيضًا على تجمع الخلايا. يتأكد معلمك / أستاذك / مرشدك أيضًا من أنه يمكنك رؤية تأثير عند المستويات المنخفضة من الدواء ، بالإضافة إلى التأكد من أن التغييرات في الإشارة مرئية - على سبيل المثال ، يؤدي إلى انخفاض بنسبة 50٪ في الجدوى بسبب النشاط الدوائي. نفس الانخفاض في الإشارة عند تقليل عدد الخلايا بنسبة 50٪؟ لا يمكنك تحديد نوع الفحص الذي تقوم بتشغيله ، ولكن هناك نوع شائع إلى حد ما وغير مكلف هو اختبار MTT ، مع تحول بعض المجموعات في الوقت الحاضر إلى XTT للحصول على حساسية أكبر وتقليل عدد الخطوات في الفحص (مجموعة أدوات المثال من تشوير الخلية مقارنة بمجموعة اختبار MTT من ThermoFisher) ، حيث لا يتطلب المنتج اللوني النهائي الذوبان قبل القراءة. أخيرًا ، اعتمادًا على المختبر الذي تعمل فيه ، ربما لم يتم تحسين ظروف الفحص حتى الآن ، لذلك يريد منك مدرسك اختبار كثافتين مختلفتين لمعرفة ما هو الأفضل.


أرقام مفيدة لثقافة الخلية

توجد أحجام مختلفة من الأطباق والقوارير المستخدمة في زراعة الخلايا. بعض الأرقام المفيدة مثل مساحة السطح وأحجام حلول التفكك مذكورة أدناه لأوعية الاستزراع ذات الأحجام المختلفة.

رقم الكتالوجمساحة السطح (سم 2)كثافة البذر *الخلايا عند التقاء *فيرسين
(مل 0.05٪ يدتا). تقريبا. الصوت
التربسين
(مل 0.05٪ التربسين ، 0.53 ملي EDTA). تقريبا. الصوت
متوسطة النمو
(مل). تقريبا. الصوت
أطباق
35 ملم1504601503188.80.3 × 10 6 1.2 × 10 6 112
60 ملم15046215028821.50.8 × 10 6 3.2 × 10 6 335
100 ملم15046415035056.72.2 × 10 6 8.8 × 10 6 5512
150 ملم1504681683811455.0 × 10 6 20.0 × 10 6 101030
لوحات الثقافة
6 جيدا1406759.60.3 × 10 6 1.2 × 10 6 11من 1 إلى 3
12 جيدا1506283.50.1 × 10 6 0.5 × 10 6 0.4 إلى 10.4 إلى 1من 1 إلى 2
24 جيدا1424751.90.05 × 10 6 0.24 × 10 6 0.2 إلى 0.30.2 إلى 0.30.5 إلى 1.0
48 جيدا1506871.10.03 × 10 6 0.12 × 10 6 0.1 إلى 0.20.1 إلى 0.20.2 إلى 0.4
96 جيد1670080.320.01 10 6 0.04 × 10 6 0.05 إلى 0.10.05 إلى 0.10.1 إلى 0.2
قوارير
تي -25156367156340250.7 × 10 6 2.8 × 10 6 333–5
تي -75156499156472752.1 × 10 6 8.4 × 10 6 558–15
تي - 1751599101599201754.9 × 10 6 23.3 × 10 6 171735–53
تي 2251599341599332256.3 × 10 6 30 × 10 6 222245–68
* تعطى كثافة البذر لكل نوع من أوعية الاستزراع كما يلي: الأطباق والقوارير: الخلايا في كل وعاء. لوحات الاستزراع: الخلايا في كل بئر.

† سوف يختلف عدد الخلايا الموجودة على طبق أو طبق أو دورق متكدس باختلاف نوع الخلية. في هذا الجدول ، تم استخدام خلايا هيلا.


بروتوكول الفحص لقياس السمية الخلوية

الكواشف الإضافية المطلوبة:

  • وسط الثقافة ، على سبيل المثال ، RPMI 1640 (R0883) يحتوي على 10 ٪ FCS معطل بالحرارة (مصل العجل الجنيني ، 12106C) ، 2 ملي مولار من الجلوتامين (G6392) و 1 ميكروغرام / مل أكتينوميسين C1 (أكتينوميسين D ، A9415).
  • في حالة استخدام مضاد حيوي ، أضف البنسلين / الستربتومايسين أو الجنتاميسين للوسائط الإضافية.
  • عامل نخر الورم α ، الإنسان (hTNF-α) (10 ميكروغرام / مل) ، معقم (T6674).

بروتوكول:

لتحديد التأثير السام للخلايا لعامل نخر الورم البشري α (hTNF-α ، T6674) على خلايا WEHI-164 (الساركوما الليفية الفأرية ، 87022501) (الشكل 2).

  1. احتضان خلايا WEHI-164 مسبقًا بتركيز 1 × 10 6 خلايا / مل في وسط المزرعة مع 1 ميكروغرام / مل أكتينوميسين C1 لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5-6.5٪ من ثاني أكسيد الكربون2.
  2. خلايا البذور بتركيز 5 × 10 4 خلايا / بئر في وسط زراعة 100 ميكرولتر يحتوي على 1 ميكروغرام / مل أكتينوميسين C1 وكميات مختلفة من hTNF-α (التركيز النهائي على سبيل المثال ، 0.001-0.5 نانوغرام / مل) في صفيحة ميكروية (درجة زراعة الأنسجة ، 96 بئرا ، قاع مسطح).
  3. احتضان مزارع الخلايا لمدة 24 ساعة عند +37 درجة مئوية و 5-6.5٪ CO2.
  4. بعد فترة الحضانة ، أضف 10 ميكرولتر من كاشف وضع العلامات MTT (التركيز النهائي 0.5 مجم / مل) لكل بئر.
  5. احتضان الصفيحة المصغرة لمدة 4 ساعات في جو مرطب (على سبيل المثال ، +37 درجة مئوية ، 5-6.5٪ CO2).
  6. أضف 100 ميكرولتر من محلول الذوبان في كل بئر.
  7. اسمح للوحة بالوقوف طوال الليل في الحاضنة في جو مرطب (على سبيل المثال ، +37 درجة مئوية ، 5-6.5٪ من ثاني أكسيد الكربون2).
  8. تحقق من الذوبان الكامل لبلورات فورمازان الأرجواني وقياس امتصاص العينات باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية (إليسا). يتراوح الطول الموجي لقياس امتصاص منتج فورمازان بين 550 و 600 نانومتر وفقًا للفلاتر المتاحة لقارئ ELISA المستخدم. يجب أن يكون الطول الموجي المرجعي أكثر من 650 نانومتر.

الشكل 2. تحديد النشاط السام للخلايا لـ TNF-α البشري المؤتلف (hTNF-α) على خلايا WEHI-164 (الساركوما الليفية للفأر) باستخدام مقايسة MTT.


ملخص

اسم المنتج

طريقة الكشف

نوع العينة

نوع الفحص

وقت الفحص

نظرة عامة على المنتج

مجموعة فحص استهلاك الأكسجين خارج الخلية ab197243 عبارة عن اختبار قارئ لوحة مضان 96 بئر ومزيج وقراءة للتحليل الحركي في الوقت الفعلي لمعدلات استهلاك الأكسجين خارج الخلية (OCR). معدل استهلاك الأكسجين هو مقياس لمعدل التنفس الخلوي ووظيفة الميتوكوندريا.

تم تحسين الاختبار للميتوكوندريا المعزولة ومزارع الخلايا ، ويمكن استخدامه مع الأنسجة ، ومستحضرات الإنزيم ، والكائنات الحية الصغيرة.

يتم إخماد الصبغة الفلورية المستخدمة في مجموعة الفحص هذه بواسطة الأكسجين. تثير الصبغة عند 360-380 نانومتر (بحد أقصى 380 نانومتر) وتنبعث عند 630-680 نانومتر (بحد أقصى 650). كما أنه متوفر بشكل منفصل كـ ab197242.

في الاختبار ، تتم إضافة طبقة زيت فوق وسيط الفحص للحد من انتشار الأكسجين في وسيط الفحص. نظرًا لأن تنفس الميتوكوندريا يستنفد الأكسجين داخل وسيط الفحص ، يتم تقليل إخماد الصبغة الفلورية ، وتزداد إشارة التألق بشكل متناسب.

التفاعل غير مدمر وقابل للعكس تمامًا (لا يتم استهلاك الصبغة الحساسة للأكسجين) مما يتيح دورات زمنية للمقايسة والعلاجات الدوائية.

ملحوظات

أو قم بمراجعة دليل فحص التمثيل الغذائي الكامل للمقايسات الأخرى الخاصة بالمستقلبات ، والإنزيمات الأيضية ، ووظيفة الميتوكوندريا ، والإجهاد التأكسدي.


الطرد المركزي Isopycnic في الوسائط غير الأيونية

العوامل المؤثرة في تحليل التدرجات

كما ذكرنا سابقًا ، تمنع المواد السكرية من نشاط الإنزيمات ، وبعض الإنزيمات أكثر حساسية من غيرها. لذلك ، عند دراسة توزيع إنزيمات الواسمات عبر التدرج ، يجب تعديل تركيزات السكروز في كل مقايسة بحيث تكون متشابهة. يتداخل السكروز أيضًا مع تقدير الجليكوجين ، وتقدير الأورسينول للحمض النووي الريبي ، وتقدير ثنائي فينيل أمين للحمض النووي ، وتقدير البروتين الحيوي الدقيق للبروتين ويقلل من حساسية إجراء فحص البروتين لوري (هينتون ، بيرج وهارتمان ، 1969 وآخرون. ، 1974). ومع ذلك ، يمكن بسهولة إزالة السكريات الأحادية والسكريات الثنائية ، على سبيل المثال ، عن طريق الترسيب الحمضي للعينة ، أو تكوير المادة بعد التخفيف ، أو غسيل الكلى.

عند قياس النشاط الإشعاعي للكسور المتدرجة ، يمكن أن تؤدي إضافة المادة الوامضة القابلة للذوبان في الماء إلى ترسيب محلول السكر. ومع ذلك ، يمكن تجنب مثل هذه المشاكل عن طريق تخفيف العينات أو عن طريق الاختيار الدقيق للمادة الوامضة (انظر ص 54). حتى في حالة عدم وجود الترسيب ، يمكن للسكروز في العينات إخماد بواعث بيتا ، ولا سيما الانبعاث الضعيف لـ 3 مركبات تحمل علامة H (Dobrota and Hinton ، 1973).


مقايسة استنساخ الخلايا في المختبر

المقايسة المستنسخة أو مقايسة تكوين المستعمرة هي في المختبر مقايسة بقاء الخلية على أساس قدرة الخلية الواحدة على النمو لتصبح مستعمرة. تم تعريف المستعمرة على أنها تتكون من 50 خلية على الأقل. يختبر الاختبار بشكل أساسي كل خلية في المجتمع لقدرتها على الخضوع لانقسام "غير محدود". المقايسة المستنسخة هي الطريقة المفضلة لتحديد موت الخلايا التناسلية بعد العلاج بالإشعاع المؤين ، ولكن يمكن استخدامها أيضًا لتحديد فعالية العوامل الأخرى السامة للخلايا. يحتفظ جزء صغير فقط من الخلايا المصنفة بالقدرة على إنتاج المستعمرات. قبل أو بعد العلاج ، يتم زرع الخلايا في التخفيفات المناسبة لتشكيل مستعمرات في 1-3 أسابيع. تم إصلاح المستعمرات باستخدام الجلوتارالدهيد (6.0٪ حجم / حجم) ، ملطخة باللون البنفسجي الكريستالي (0.5٪ وزن / حجم) ويتم عدها باستخدام مجهر ستيريوميكروسكوبي. تم تضمين طريقة لتحليل منحنيات البقاء على قيد الحياة جرعة الإشعاع.


النتائج والمناقشة

يوضح الشكل 2 النسبة المئوية لتخفيض alamarBlue ® بعد حساب المتوسط ​​وتضمين الانحرافات المعيارية. لوحظ انخفاض أكبر في alamarBlue ® (أي مستويات أعلى من نمو الخلايا) للركيزة A خلال فترة الثقافة بأكملها. في كلا الركيزتين ، زاد تكاثر الخلايا مع وقت الثقافة خلال الأيام الخمسة عشر الأولى. يبدو أن النشاط الأيضي للخلايا التي تنمو على كلا الركيزتين يتباطأ بحلول اليوم الخامس عشر ، مما يشير إلى أن الأسطح كانت تتقدم نحو التقاء.

الشكل 2: النسبة المئوية لتخفيض alamarBlue كدالة لوقت الثقافة ، للركائز A و B.

الطرق السريعة لفحص صحة الأغذية

ماتياس أبمان ، كريستين بونابرت ، في موسوعة علم الأحياء الدقيقة للأغذية ، 1999

الطرق البصرية

قياس الألوان وقياس التألق: يمكن الإشارة إلى التغيرات الفيزيائية أو الكيميائية المحددة (درجة الحموضة ، احتمال الأكسدة / الاختزال ، التحولات الأنزيمية) المرتبطة بالنشاط الأيضي الميكروبي من خلال التغيرات في اللون أو التألق أو شدة اللون لصبغة الكاشف المضافة أثناء حضانة العينة. يتم استخدام العديد من الأصباغ الكروموجينية والفلورية اعتمادًا على التغيير الأيضي الذي سيتم عرضه. يعتمد عدد كبير من أنظمة تحديد الهوية المصغرة والمدعومة بالكمبيوتر أو حتى المؤتمتة بالكامل للثقافات النقية على هذا المبدأ.

يمكن أيضًا استخدام قياس الألوان وقياس التألق للأغراض الكمية عن طريق قياس وقت الحضانة المطلوب لإنتاج تفاعل لوني أو تكوين الفلوروكروم. المؤشرات المعروفة على نطاق واسع هي عباد الشمس والأرجواني البروموكريسول للكشف عن تحولات الأس الهيدروجيني أو ريسازورين ، والأزرق الميثيلين ، وكلوريد ثلاثي فينيل تيترازوليوم كمؤشرات أكسدة / اختزال.

تتوفر الآن إجراءات مؤتمتة بالكامل تستخدم مقاييس ألوان الانعكاس أو مقاييس الفلور. هذه التقنيات قابلة للتطبيق للتقدير السريع للأعداد الميكروبية الكلية أو الكائنات الدقيقة المحددة ، من أجل استقرار عمر المنتج ، ونشاط الاستزراع البادئ ، واختبار المضادات الحيوية. مزيد من التفاصيل الفراء انظر الجدول 2.

قياس التعكر: تؤدي زيادة عدد الخلايا إلى زيادة الكثافة الضوئية لوسائط النمو السائلة. لذلك ، سوف نضعف بشكل متزايد شعاع الضوء عند الضوء عندما يتم تحضين عينة سائلة. من خلال تغيير تخفيف العينة ، ووسط النمو ودرجة حرارة الحضانة ، يمكن تضييق النتيجة إلى أنواع أو أعداد بكتيرية محددة. يتم إعطاء بعض الخصائص المنهجية في الجدول 2.

يتم تطبيق مقياس التعكر على نطاق واسع في اختبارات الفيتامينات الحيوية واختبار المطهرات. تم استخدامه لاختبار العقم في مراقبة جودة الأغذية. قد يكون تطبيقه محدودًا بسبب تعكر الخلفية للأطعمة (كريات الدهون وخلايا الدم وجزيئات الطعام).

تحديد البيروفات: البيروفات هو مركب رئيسي في استقلاب اللاكتوز البكتيري ويمكن أن يكون بمثابة مؤشر لمراقبة جودة الحليب. يتم قياس البيروفات بشكل غير مباشر عن طريق الكشف الطيفي للنيكوتيناميد والأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) وهو عامل مساعد في الانهيار الأنزيمي للبيروفات. نظرًا لأن الخلايا الجسدية تساهم في محتوى البيروفات في الحليب وليس كل البكتيريا تنتج البيروفات ، فإن العلاقة بين هذا المستقلب والعدد الميكروبي الكلي محدودة (انظر الجدول 2).


أوجه التشابه بين فحص MTT و MTS

  • فحص MTT و MTS نوعان من المقايسات التي تحدد صلاحية الخلية في المختبر.
  • يساعد كلا الاختبارين في تقييم تأثير جزيئات الاختبار على تكاثر الخلايا والسمية الخلوية.
  • أيضا ، كلاهما فحوصات لونية.
  • علاوة على ذلك ، يقومون بتقييم النشاط الأيضي للخلايا بناءً على قدرة الخلايا على تقليل صبغة التترازوليوم إلى فورمازان.
  • بالإضافة إلى ذلك ، فإن الإنزيم المسؤول عن التخفيض أعلاه هو الأكسيدوروكتاز الخلوي المعتمد على NAD (P) H ، الموجود في الخلايا القابلة للحياة.
  • علاوة على ذلك ، يحدث تفاعل الاختزال خارج الخلية عن طريق نقل الإلكترون بغشاء البلازما.
  • يعتبر كاشف MTT حساسًا للضوء ، وبالتالي ، يجب إجراء هذه الاختبارات في الظلام.
  • إلى جانب ذلك ، فإن وقت الحضانة لكلا الاختبارين هو نفسه بعد إضافة صبغة التترازوليوم وهو من 1 إلى 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

طريقة بسيطة وقابلة للتكرار قائمة على 96-بئر لتشكيل الأغشية الحيوية الفطرية وتطبيقها في اختبار الحساسية لمضادات الفطريات

زاد معدل الإصابة بالعدوى الفطرية بشكل ملحوظ خلال العقود الماضية. غالبًا ما ترتبط هذه العدوى بتكوين الأغشية الحيوية على المواد الحيوية المزروعة و / أو الأسطح المضيفة. هذا له آثار سريرية مهمة ، حيث تعرض الأغشية الحيوية الفطرية خصائص تختلف اختلافًا كبيرًا عن مجموعات العوالق (التي تعيش بحرية) ، بما في ذلك زيادة المقاومة للعوامل المضادة للفطريات. نحن هنا نصف طريقة تعتمد على 96 ميكروتيتر سريعة وقابلة للتكرار بدرجة عالية لتشكيل الأغشية الحيوية الفطرية ، والتي يمكن تكييفها بسهولة لاختبار الحساسية المضادة للفطريات. يعتمد هذا النموذج على قدرة الخلايا اللاطئة النشطة الأيضية على تقليل ملح التيترازوليوم (2،3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide) إلى الماء- مركبات فورمازان البرتقالية القابلة للذوبان ، والتي يمكن بعد ذلك تحديد شدتها باستخدام قارئ لوحة ميكروتيتر. يستغرق الإجراء بأكمله حوالي يومين لإكماله. تعمل هذه التقنية على تبسيط تكوين الأغشية الحيوية وتقديرها ، مما يجعلها أكثر موثوقية وقابلية للمقارنة بين المختبرات المختلفة ، وهي خطوة ضرورية نحو توحيد اختبار الحساسية للأغشية الحيوية المضادة للفطريات.


شاهد الفيديو: موضوع خطير للغاية سحر التصفيح, لنشاهد كيف الكهنة يأدون الناس مع الدكتورة حنان (أغسطس 2022).