معلومة

3.3: الإشريكية القولونية هي خلية بدائية النواة صغيرة - علم الأحياء

3.3: الإشريكية القولونية هي خلية بدائية النواة صغيرة - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في هذه الدورة ، سوف نستخدم البروتيوباكتيريوم ، بكتريا قولونية، لنشر نسخ من التقىالجينات على البلازميدات ، وهي عبارة عن دوائر صغيرة من الحمض النووي تتكاثر في بكتريا قولونية السيتوبلازم. على عكس بكتريا قولونية السلالات التي تسمع عنها في حالات تفشي الأمراض التي تنقلها الأغذية ، فقد تم تصميم سلالاتنا المعملية لاستخدامها في مختبرات البيولوجيا الجزيئية وهي غير قادرة على استعمار الأمعاء البشرية. بكتريا قولونية
مفيدة بشكل خاص لعلماء الأحياء الجزيئية لأنها تنمو بسرعة إلى كثافات عالية جدًا
في وسط المزرعة المخبرية ، تصل إلى كثافة 1-10 مليار خلية لكل مليلتر. بالرغم ان بكتريا قولونية هي أصغر بـ10-100 مرة من خلايا الخميرة ، وأعدادها الهائلة وحركتها المميزة تجعلها مرئية بالمجهر الضوئي.

مجهر ضوئي لايكا DM500

لمراقبة بكتريا قولونية مع أي تفاصيل ، ستحتاج إلى استخدام عدسة 100X ، والتي تُعرف أيضًا باسم عدسة الغمر بالزيت. هذه هي العدسة الأطول والأقوى والأغلى في المجهر ، وتتطلب عناية إضافية عند استخدامها. كما يوحي الاسم ، فإن العدسة 100X مغمورة في قطرة زيت على الشريحة. يحتوي زيت الغمر على نفس معامل الانكسار مثل الزجاج ، لذلك فهو يمنع الضوء من الانحناء عند دخوله إلى العدسة. يجب إزالة الزيت فورًا من العدسة 100X بعد الاستخدام. يجب ألا يلمس الزيت أبدًا العدسات 4X أو 10X أو 40X ، التي دمرها الزيت.


قم بتنزيل وطباعة هذه المقالة لاستخداماتك العلمية والبحثية والتعليمية الشخصية.

شراء عدد واحد من علم مقابل 15 دولارًا أمريكيًا فقط.

علم

المجلد 313 ، العدد 5788
11 أغسطس 2006

أدوات المادة

الرجاء تسجيل الدخول لإضافة تنبيه لهذه المقالة.

بقلم جان فيليب نوجيرد ، ستيفان هومبورغ ، فريديريك طيب ، ميشيل بوري ، إلزبيتا برزوسزكيويتش ، غيرهارد جوتشالك ، كارمن بوخريزير ، يورغ هاكر ، أولريتش دوبريندت ، إريك أوزوالد

علم 11 أغسطس 2006: 848-851

تنتج الميكروبات التي تعيش عادة في الأمعاء جزيءًا صغيرًا يبطئ من دوران بطانة القناة الهضمية عن طريق إتلاف الحمض النووي للمضيف ، وربما تعزيز استعمارها.


الملخص

غالبًا ما تكون المضادات الحيوية التي تتحمل المضادات الحيوية متورطة في فشل علاج الالتهابات البكتيرية المزمنة والعاكسة ، لكن الآليات الجزيئية الأساسية ظلت بعيدة المنال. تدور الخلافات حول المساهمة النسبية لمفاتيح جينية محددة تسمى وحدات مضاد السموم (TA) والتعديل الشامل للوظائف الأساسية الخلوية مثل النمو البطيء. دراسات سابقة عن أمراض المسالك البولية الإشريكية القولونية لوحظ ضعف تشكيل مثابر للطفرات التي تفتقر إلى باسي locus التي تم اقتراحها لتشفير وحدة TA. هنا ، نظهر ذلك باسي ليس وحدة TA وأن المادة السامة المفترضة هي بدلاً من ذلك المتماثل البكتيري لبروتين الميتوكوندريا Coq10 الذي يمكّن وظيفة الناقل الإلكترون التنفسي يوبيكوينون كـ "مرافق دهني". باتساق، باسي تظهر الطفرات أنماطًا ظاهرية متعددة الاتجاهات مرتبطة بنقل الإلكترون المعيب مثل انخفاض إمكانات الغشاء وزيادة الحساسية للإجهاد التأكسدي. نحن نربط ضعف تشكيل المثابرة باسي المسوخ إلى تشويه عالمي لاستجابات الإجهاد الخلوي بسبب خلل في التنفس. اللافت للنظر ، التعبير خارج الرحم للإنسان coq10 يكمل إلى حد كبير عيوب الجهاز التنفسي ويقلل من مستويات المثابرة باسي المسوخ. يشير عملنا إلى أن PasT / Coq10 له دور مركزي في نقل الإلكترون في الجهاز التنفسي والذي يتم حفظه من البكتيريا إلى البشر ويحافظ على تحمل البكتيريا للمضادات الحيوية.


المواد والأساليب

تثبيت ودمج الخلايا.

الإشريكية القولونية تم استخدام سلالة RP437 كعنصر تحكم في التجارب البرية. البلازميدات pHSe5.tsrQQQQ و pHSe5.tsrQEQE تم استخدامها لإنتاج Tsr في خلايا HCB721 ، والتي لا تعبر عن البروتينات المرتبطة بالتركيز الكيميائي Tar و Tsr و Trg و Tap و CheA و CheW و CheR و CheB ، كما هو موضح سابقًا (32). تم تثبيت الخلايا المحصودة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 2.5 ساعة في خليط من 2٪ بارافورمالدهيد و 0.2٪ جلوتارالدهيد في وجود 60 ملي بيبرازين-ن,ن& # x02032-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES) ، 50 ملي مولار HEPES (الرقم الهيدروجيني 6.9) ، 4 ملي MgCl2، و 20 ملم EGTA. تم جمع الخلايا الثابتة بالطرد المركزي وتعليقها في محلول فوسفات 0.1 ميكرومتر مُدفأ مسبقًا يحتوي على 12 ٪ جيلاتين. بعد تصلب كريات الجيلاتين المحتوية على الخلايا على الجليد ، تم تقطيعها إلى مكعبات 1 مم واحتضانها بمحلول يحتوي على 2.3 مولار سكروز و 0.1 مولار محلول فوسفات الصوديوم (درجة الحموضة 7.4). تم تجميد مكعبات الجيلاتين على أسطح دبابيس الألمنيوم عن طريق غمرها في النيتروجين السائل وتم تقسيمها باستخدام كريولتراميكروتوم عند & # x02212120 & # x000b0C. تم وضع العلامات على الجسم المضاد لـ Tsr (الذي يتفاعل بشكل خاص مع مجال الإشارة المحفوظ) والبروتين A-gold والدمج اللاحق في ميثيل السليلوز مع أسيتات اليورانيل مع الكواشف كما هو موضح سابقًا (22).

المجهر الإلكتروني.

تم تسجيل صور الإسقاط الموضحة في الشكل. & # x200B الشكل 1 1 بكاميرا جهاز Gatan 2K مقترنة بالشحن مثبتة على مجهر إلكتروني Tecnai 12 (FEI Corporation ، Hillsboro ، Oreg.) مجهز بـ LaB6 فتيل يعمل عند 120 كيلو فولت. بالنسبة للتصوير المقطعي ، تم تسجيل سلسلة من الصور في درجة حرارة الغرفة بمساعدة جهاز Gatan 2K المقترن بالشحن (التكبير ، & # x0223c & # x000d747500) عن طريق إمالة العينة من & # x0221270 & # x000b0 إلى 70 & # x000b0 بزيادات 0.5 & # x000b0 في مجهر Tecnai F30 مزود برأس مسدس انبعاث ميداني يعمل عند 300 كيلو فولت. تم تسجيل الصور بقيم تركيز أقل من 2 و 3 & # x003bcm على طول محور الإمالة. تم استخدام خوارزمية الإسقاط الخلفي ، كما تم تنفيذها في حزمة إعادة بناء IMOD (15) ، لتحويل المعلومات الموجودة في سلسلة صور الإسقاط المائلة إلى خرائط كثافة ثلاثية الأبعاد.

تحضير أغشية توين 80 المستخرجة.

تم تحضين المستحضرات الغشائية (16) المعزولة على تدرجات السكروز بشكل نموذجي مع توين 80 عند نسبة بروتين / توين 80 مولار تبلغ 0.004 لحوالي 4 ساعات كما هو موضح سابقًا (32).

تجزئة والتقديم.

تم تقسيم الرسم المقطعي في بيئة برنامج أميرة (TGS Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا) عن طريق تحديد جميع المناطق في الحجم حيث يمكن تصور الطبقة الثنائية (الخطوط البيضاء في الشريحة) بوضوح في ثلاثة أبعاد. تم إنشاء سطح متساوي عن طريق تتبع مسار الطبقة الثنائية في كل شريحة من الرسم المقطعي. تم إرساء النماذج الهيكلية لنوعين من مجموعات المستقبلات الموضحة في الشكل 3d و e على السطح المتساوي باستخدام برنامج 3dsmax (DISCREET ، مونتريال ، كيبيك ، كندا). كانت إحداثيات ديمر المستقبل هي الإحداثيات في النموذج الذي وصفه Kim et al. (14) وتفضلًا بتقديمها Sung-Hou Kim. بدءًا من نموذج dimer ، تم إنشاء مجموعة متنوعة من الترتيبات المعقولة للترتيبات ذات الترتيب الأعلى ، مثل أداة تقليم الثنائيات الموضحة في الشكل ثلاثي الأبعاد و e ، باستخدام الصور المجهرية الإلكترونية كدليل. مجموعة واحدة من الترتيبات المعقولة مبينة في الشكل & # x200B الشكل 3 3.

(أ إلى ج) صورة مجهرية إلكترونية ملطخة سلبًا تم الحصول عليها من مستخلص توين 80 من الخلايا التي تعبر عن Tsr. حافظ المستخلص على المظهر العام لأشكال الغشاء في الرسم المقطعي ، وتظهر الصور بمزيد من التفصيل تنظيم الهياكل المنسدلة في المقطع العرضي (أ) والمنظر العلوي (ب) ، وكذلك الهياكل الحويصلية المستديرة (ج). أشرطة المقياس & # x0003d 50 نانومتر. (د) نموذج جزيئي للتعبئة في المناطق المضغوطة بناءً على النموذج الذري لهيكل Tsr الموضح في الشكل & # x200B الشكل 1 أ 1 أ والتحليل البلوري الإلكتروني للمناطق البلورية (32). تتوافق التعبئة في المناطق البلورية للغشاء (ب) تقريبًا مع شبكة مع الثوابت التالية: a ، & # x0223c75 & # x000c5 b ، & # x0223c75 & # x000c5 و & # x003b3 ، & # x0223c60 & # x000b0. مساحة المقطع العرضي لكل وحدة في البلورة هي & # x0223c5000 & # x000c5 2 ، والتي يمكن أن تستوعب على الأكثر ثلاثة ثنائيات Tsr ، بناءً على وجود أربعة حلزونات لكل مونومر Tsr في الطرف الأوسع المحيطي للمستقبل (20) والقيم المعروفة لحوالي 180 & # x000c5 2 التي تميز مناطق المقطع العرضي للحلزونات في المصفوفات البلورية ثنائية الأبعاد المعبأة جيدًا (12). المصفوفة الموضحة هي واحدة من العديد من الترتيبات الممكنة للثنائيات الثلاثة ويتم تقديمها بشكل أساسي لتوفير مؤشر على كثافة تعبئة المستقبلات في الغشاء. يتم تفسير المناطق البيضاء في مركز الهيكل المنغلق في اللوحة أ على أنها مناطق عالية الكثافة حيث يُفترض أن النهايات السيتوبلازمية لقصبة Tsr متداخلة. يتوافق عمق التداخل مع العرض النسبي لهذه المنطقة في الصورة المجهرية في اللوحة أ. متوسط ​​التباعد الداخلي للهياكل المضغوطة في شرائح التصوير المقطعي مثل الشريحة الموضحة في الشكل & # x200B الشكل 2c 2c هو 31.5 & # x0002b 2.5 نانومتر (بمتوسط ​​26 قياسًا منفصلاً). يقارن هذا بشكل جيد مع قيمة نفس التباعد الداخلي في هذه العينات الملطخة سلبًا (31.3 & # x000b1 0.6 نانومتر [متوسط ​​أكثر من 10 قياسات] ، كما ورد في Weis et al. [32]). (هـ) النموذج الجزيئي للتعبئة في المناطق الحويصلية (عرض مقطعي). يتم تفسير الحلقة البيضاء الخارجية للبنية الدائرية في اللوحة c على أنها سطح منطقة الغشاء التي تحيط بالحجم ، ويتم تفسير الحلقة الداخلية الأقل وضوحًا على أنها منطقة عالية الكثافة حيث تلتقي الأطراف السيتوبلازمية لـ Tsr معًا.


3. مسار التخليق الحيوي للفوسفوليبيد في بكتريا قولونية

3.1. تخليق حمض الفوسفاتيدك

كما هو الحال في الخلايا حقيقية النواة ، فإن PA هي مقدمة لجميع الفوسفوليبيدات القائمة على الجلسرين (كما تتميز عن Lipid A لب من عديدات السكاريد الدهنية (LPS)) بكتريا قولونية. يتم تصنيع PA في خطوتين متتاليتين باستخدام سلسلة طويلة من acyl-CoA أو acyl-ACP (بروتين حامل الأسيل) من أجل الأسيل أولاً في sn-1 ثم ملف sn-2 موقف محفز بواسطة الثابتة والمتنقلة [24] و الثابتة والمتنقلة [25] منتجات الجينات على التوالي. تمت تغطية تخليق PA [26] في البكتيريا بالتفصيل في مكان آخر من هذه القضية. اتبع كينيدي العديد من المتدربين الذين كانوا الشخصيات المركزية في تحديد المسار (انظر الشكل 3) ، والتمثيل الغذائي ووظيفة الدهون الفوسفورية في بكتريا قولونية. كان هذا الإطار الأساسي جنبًا إلى جنب مع الدراسات المبكرة لتخليق الفسفوليبيد في الثدييات بمثابة نقطة انطلاق لتوسيع فهم استقلاب الفوسفوليبيد في العتيقة [1 ، 27] ، الخميرة [28] ، النباتات [29] والخلايا الجسدية [30 ، 31] ، والتي يمكن الوصول إليها في العديد من المراجعات التي تم ذكر بعضها أعلاه.

مسارات لتخليق الدهون الفوسفورية في بكتريا قولونية. الإنزيمات التالية مع الجينات الخاصة بها المسماة: 1. سينثاز CDP-diacylglycerol (CdsA) 2. سينثيز فسفاتيديل سيرين (PssA) 3. فوسفاتيديل سيرين ديكاربوكسيلاز (Psd) 4. فسفاتيديل جليسيروفوسفات سينثيز (PgsA) 5. فوسفاتيد جليسيريز). ثلاثة جينات. و [ClsC] يشار إليها بين قوسين. لم يتم تحديد التحديد النهائي للركيزة الثانية لـ ClsB 7. فوسفاتيديل جلسرين: قليل السكاريد المشتق مسبقًا من الغشاء (MDO) sn-جلسرين-1-ص ترانسفيراز (MDO synthase) 8. diacylglycerol kinase (DgkA).

3.2 تشكيل فوسفاتيد إيثانول أمين وفوسفاتيديل جلسرين

في عام 1963 ، لاحظ كانفر وكينيدي [32] أن التوصيف الصارم للفوسفوليبيدات البكتيرية والمسارات المؤدية إلى تكوينها الحيوي لم يتم دراستها مقارنة بما كان معروفًا عن أنظمة الثدييات. قاموا أولاً بتسمية الخلايا المتنامية لـ بكتريا قولونية مع 32 صأنا لزيادة الأوقات من 30 ثانية إلى 30 دقيقة ، والتي أعقبتها مطاردة للتسمية. تم عزل الجزء الدهني ، وتم تحديد كمية دمج الملصق في منتجات نزع السيلان القلوية الخفيفة من الفوسفوليبيدات بعد الفصل الكروماتوجرافي. تم اكتشاف كل من PE و phosphatidylserine (PS) و PA و phosphatidylglycerol (PG) في نقاط زمنية مبكرة. انخفض الملصق في PA و PS بشكل مطرد مع أوقات وضع العلامات الأطول بما يتفق مع كونها وسيطة إلى فوسفوليبيدات أخرى. ظل الملصق في PE ثابتًا لعدة أجيال أثناء المطاردة ، مما يشير إلى أن جزء الفوسفات لا يتحول إلى منتجات أخرى. في وقت لاحق ، سيظهر أن الأحماض الدهنية في sn-1 يتم استخدام موضع PE [33 ، 34] لأسيلات الحمض الأميني N- طرفي للبروتينات الدهنية في الغشاء الخارجي متبوعًا بإعادة تكوين PE بواسطة ناقل أسيل محدد [35]. كانت الملاحظة المهمة هي أن الملصق الموجود في PG لم يكن مستقرًا أثناء المطاردة ، مما يشير إلى دوران المنتجات القابلة للذوبان في الماء بسبب التحلل أو بعض المركبات الأخرى التي تحمل علامة الفوسفات. لم يتم تحديد Cardiolipin (CL) بعد في بكتريا قولونية. كان الأمر الأكثر إثارة للاهتمام هو مصير الكثير من هذه التسمية لتخليق أوليغوساكاريد المشتق من الغشاء (MDO) في الفضاء المحيط بالبلازما ، وهي دراسة عاد إليها كينيدي في السبعينيات وعام 2010.

جاء بعد ذلك إنشاء مسار التخليق الحيوي PE و PG [36]. تم استبعاد مشاركة CDP-ethanolamine ، ولكن تم تأكيد تحويل PS إلى PE عن طريق نزع الكربوكسيل [37] ليكون هو نفسه كما لوحظ بالفعل في الخلايا الحيوانية [38] بينما كان تكوين PS مختلفًا تمامًا في بكتريا قولونية. بناءً على دور مشاركة CDP-DAG في تخليق PI ، جرب Kanfer و Kennedy الليبونوكليوتيد كركيزة مع L-serine لتخليق PS متبوعًا بنزع الكربوكسيل. في خلايا الثدييات ، يتكون PS عن طريق تبادل L-serine مع مجموعة الرأس المحبة للماء من PE أو PC بواسطة إنزيمين منفصلين [39]. حتى الآن ، يعتبر تخليق PS المعتمد على CDP-DAG فريدًا للبكتيريا والخميرة ويبدو أنه غائب في حقيقيات النوى الأعلى باستثناء وجوده في القمح [40]. استخدام sn- الجلسرين - 3 - الفوسفات بدلاً من السيرين أدى إلى تكوين PG ولكن ليس PG-phosphate (PGP) ، والذي افترضوا أنه قد تم تفعيله بواسطة الفوسفاتيز كما هو موضح لنفس التفاعل في كبد الدجاج [41]. أظهر تعطيل فوسفاتيز PGP في المستخلصات الخام بواسطة كواشف السلفهيدريل التكوين الوسيط لـ PGP [42]. سوف يمر ما يقرب من 50 عامًا قبل تحديد فوسفاتيز PGP الأولي [43]. في عام 1968 ، أظهر كارتر تخليق CDPDAG من CTP و PA بواسطة جزء جسيمي من بكتريا قولونية [44].

3.3 يختلف تخليق الكارديوليبين في بكتريا قولونية من الخلايا حقيقية النواة

من الفسفوليبيدات الرئيسية بكتريا قولونية بقي تركيب CL فقط ليتم إنشاؤه. تم عزل CL لأول مرة وتم تمييزه من قلب لحم البقر سعياً وراء المادة في مستخلصات الكحول التي تفاعلت مع الأمصال من مرضى الزهري [45]. بدأ Pangborn بـ 15 قلبًا من لحم البقر للحصول على خلاصة الكحول الأولية متبوعة بـ CdCl2 ترسب. بعد إذابة الراسب بإيثر البترول وحوالي 12 خطوة استخلاص / ترسيب أخرى ، تم عزل 5 جم من CL النقي. على الرغم من أن Pangborn اقترح بنية CL ، إلا أن Macfarlane لم يؤسس الهيكل الصحيح حتى عام 1958 [46]. أظهرت مجموعة Kennedy & # x02019s [47] دمج sn- [2- 3 H] الجلسرين -3 فوسفات إلى PG و PGP و CL بواسطة جزء جزيئي من بكتريا قولونية يعتمد على وجود CDP-DAG. لقد أثبتوا أن تحويل PGP إلى PG كان شرطًا أساسيًا لتوليف CL منذ استخدام sn- [2- 3 H] glycerol-3- [32 P] كركيزة فشلت في دمج الملصق في CL. ومع ذلك ، فإن التحفيز القوي بواسطة CDP-DAG لدمج PG المشع في CL يقود المحققين إلى التوصل إلى استنتاج خاطئ حول الآلية التي من خلالها بكتريا قولونية يجعل CL.

في جميع حقيقيات النوى البسيطة والمعقدة تقريبًا ، يتم تصنيع CL عن طريق إزاحة CMP من CDP-DAG بواسطة الهيدروكسيل الحر لـ PG في sn-3 موضع الجلسرين كما هو موضح في البداية بواسطة مجموعة van Deenen & # x02019s [48]. ومع ذلك ، كما أوضح لاحقًا هيرشبرغ وكينيدي [49] ، بكتريا قولونية يكثف جزيئين PG لصنع CL مع إطلاق الجلسرين. قد تراكمت أدلة كبيرة من بكتريا قولونية والبكتيريا الأخرى لدعم مسار غير معتمد على CDP-DAG لتخليق CL (انظر [49]). كان من بين الأدلة الملحوظة استمرار تكوين CL في غياب طاقة أيضية كبيرة ، وإطلاق الجلسرين أثناء تخليق CL ودمج PG المسمى في CL في غياب CDP-DAG. في سلسلة من التجارب الأنيقة المفردة والمزدوجة التسمية ، أسس هيرشبيرج وكينيدي [49] أن CDP-DAG حفز تكوين CL ولكنه لم يشارك بشكل مباشر في التفاعل. كما استبعدوا أي تفاعلات متبادلة بين PG والدهون الموجودة في مستحضرات الغشاء الخام. مع إنشاء الطريق الأكثر شيوعًا لتشكيل CL في حقيقيات النوى من خلال CDP-DAG ، بدا أن هناك تقسيمًا واضحًا بين بدائيات النوى وحقيقيات النوى. ومع ذلك ، كما سيتم مناقشته لاحقًا ، فقد أصبح هذا الخط غير واضح فيما يتعلق بالقيود الكاملة على بدائيات النوى أو حقيقيات النوى والمسار الثالث لتخليق CL الموجود مؤخرًا في بكتريا قولونية [50]. مرة أخرى ، لم يكن حتى عام 2012 أن جميع الجينات الثلاثة التي تشفر تركيبات CL في بكتريا قولونية كانت مسؤولة عن [50].

بحلول أواخر 1960 & # x02019s وأوائل 1970 & # x02019s ، تم إنشاء المخطط التفصيلي الأساسي لتخليق الدهون الفوسفورية الرئيسية في البكتيريا والخلايا الجسدية. ما تلا ذلك كان عصر تنقية الإنزيمات ، وتأسيس الخصائص الإنزيمية ، وتحديد الجينات المشفرة للإنزيمات. حوالي عام 1969 إلى 1974 ، كان مختبر كينيدي مأهولًا بمجموعة من طلاب الطب وزملاء ما بعد الدكتوراه الذين بدأوا العديد من الدراسات المذكورة أعلاه وأصبحوا قادة في مجالاتهم بعد مغادرتهم. بدأ بيل ويكنر في تنقية أول إنزيم مرتبط بالغشاء نفذ خطوة في التمثيل الغذائي للفوسفوليبيد. ذهب لتنقية المجمع بنجاح بكتريا قولونية آلات النسخ المتماثل في مختبر Arthur Kornberg & # x02019s متبوعًا بعمله الخاص الذي حدد كيفية إدخال البروتينات ونقلها عبر بكتريا قولونية غشاء. بدأ كريس رايتز في تنقية العديد من إنزيمات التمثيل الغذائي للفوسفوليبيد ، ثم طور خلال فترة ما بعد الدكتوراه مع هيرب تابور طرقًا جديدة لعزل الطفرات في التمثيل الغذائي للفوسفوليبيد. خلال سنواته المستقلة ، قام بتعريف & # x0201cRaetz Pathway & # x0201d لتخليق قلب الغشاء المضمن لـ LPS.حدد Carlos Hirschberg طريقة تصنيع CL بكتريا قولونية ثم في حياته المهنية المستقلة ، حدد العديد من الخطوات المهمة في تخليق شقوق الكربوهيدرات من البروتينات السكرية. درس إد دينيس عدة جوانب من التمثيل الغذائي للفوسفوليبيد في رباعية الغشاء ثم أصبح رائدًا في دراسة دور phospholipases في إشارات الخلية. كنت محظوظًا لوجودي في المختبر في الوقت الذي بدأت فيه اهتماماتي في تحليل إنزيمات التخليق الحيوي للفوسفوليبيد وتبع ذلك متابعة الجينات الأساسية لهذه الإنزيمات ودراسة دور الفوسفوليبيد في وظيفة الخلية.


محتويات

قدم عمل Kiwako Sakabe و Reiji Okazaki و Tsuneko Okazaki دليلًا تجريبيًا يدعم الفرضية القائلة بأن تكرار الحمض النووي هو عملية متقطعة. في السابق ، كان من المقبول عمومًا أن النسخ المتماثل كان مستمرًا في كلا الاتجاهين من 3 إلى 5 و 5 إلى 3. 3 'و 5' هي ذرات كربون مرقمة على وجه التحديد على حلقة deoxyribose في الأحماض النووية ، وتشير إلى اتجاه أو اتجاه حبلا. في عام 1967 ، اقترح كل من Tsuneko Okazaki و Toru Ogawa أنه لا توجد آلية تظهر تكرارًا مستمرًا في الاتجاه من 3 إلى 5 ، فقط 5 إلى 3 باستخدام DNA polymerase ، إنزيم النسخ المتماثل. افترض الفريق أنه في حالة استخدام النسخ المتقطع ، يمكن ربط خيوط قصيرة من الحمض النووي ، يتم توليفها عند نقطة التكرار ، في اتجاه 5 إلى 3 إلى الخيط الأقدم. [5]

لتمييز طريقة النسخ التي يستخدمها الحمض النووي بشكل تجريبي ، قام الفريق بتسمية المناطق المكررة حديثًا بالنبض الإشريكية القولونية الكروموسومات ، والتشويه ، واستخراج الحمض النووي. يعني عدد كبير من الوحدات القصيرة المشعة أن طريقة النسخ المتماثل كانت على الأرجح غير مستمرة. تم دعم الفرضية أيضًا من خلال اكتشاف بولينوكليوتيد ليجاس ، وهو إنزيم يربط خيوط الحمض النووي القصيرة معًا. [6]

في عام 1968 ، جمع Reiji و Tsuneko Okazaki أدلة إضافية على خيوط الحمض النووي الوليدة. لقد افترضوا أنه إذا كان التكرار المتقطع ، الذي يتضمن سلاسل DNA قصيرة مرتبطة ببعضها البعض بواسطة ليجاز متعدد النوكليوتيد ، هو الآلية المستخدمة في تخليق الحمض النووي ، فإن "سلاسل الحمض النووي القصيرة المُصنَّعة حديثًا ستتراكم في الخلية في ظل ظروف تكون فيها وظيفة الليغاز معطلة مؤقتًا." بكتريا قولونية مصابة بالعاثية T4 التي تنتج ليجاز بولينوكليوتيد حساس لدرجة الحرارة. تراكمت الخلايا المصابة بالعاقمات T4 عددًا كبيرًا من سلاسل الحمض النووي القصيرة المُصنَّعة حديثًا ، كما هو متوقع في الفرضية ، عند تعرضها لدرجات حرارة عالية. دعمت هذه التجربة أيضًا فرضية Okazakis المتمثلة في التكاثر المتقطع والارتباط بواسطة polynucleotide ligase. لقد دحض فكرة أن سلاسل قصيرة تم إنتاجها أثناء عملية الاستخراج أيضًا. [7]

قدمت تجارب Okazakis معلومات مستفيضة عن عملية تكرار الحمض النووي ووجود سلاسل DNA قصيرة مركبة حديثًا أصبحت تُعرف فيما بعد باسم أجزاء Okazaki.

تم اقتراح مسارين لمعالجة شظايا أوكازاكي: مسار رفرف قصير ومسار رفرف طويل.

تحرير مسار رفرف قصير

في مسار رفرف قصير في حقيقيات النوى ، يتم تحضير خيط الحمض النووي المتأخر في فترات زمنية قصيرة. في المسار القصير فقط ، يشارك نوكلياز FEN1. يصادف Pol بشكل متكرر جزء Okazaki المصب في اتجاه مجرى النهر ويؤدي إلى إزاحة البادئ البادئ RNA / DNA إلى رفرف 5. يدرك نوكلياز FEN1 5’-3 أن رفرف 5 'قد تم إزاحته ، وأنه ينشق ، مكونًا ركيزة للربط. في هذه الطريقة تتم إزالة التمهيدي المركب Pol a. دراسات [ أي؟ ] أظهر أنه في FEN1 اقترح "نموذج تتبع حيث ينتقل نوكلياز من السديلة 5" إلى قاعدته لتشكيل الانقسام. لا يعالج Pol نشاط نوكلياز لشق السديلة النازحة. يشق FEN1 السديلة القصيرة فور تشكلها. يتم منع الانقسام عندما يتم حظر الطرف الخامس من رفرف الحمض النووي إما باستخدام مادة أولية تكميلية أو جزء ستربتافيدين مترافق مع البيوتين. يقوم DNA ligase بإغلاق النك المصنوع بواسطة FEN1 ويخلق خيطًا وظيفيًا مزدوجًا مستمرًا من الحمض النووي. يحاكي PCNA الوظائف الأنزيمية للبروتينات لكل من FEN1 و DNA ligase. يعد التفاعل أمرًا حاسمًا في إنشاء ربط مناسب لشريط الحمض النووي المتأخر. يساعد الإزاحة والانقسام المتسلسل للخيط بواسطة Pol و FEN1 ، على التوالي ، على إزالة RNA البادئ بالكامل قبل الربط. يجب إجراء العديد من عمليات الإزاحة وتطلب تفاعلات الانقسام لإزالة البادئ التمهيدي. السديلة التي يتم إنشاؤها ومعالجتها وتنضج بمسار رفرف قصير.

تحرير مسار رفرف طويل

في بعض الحالات ، يستمر FEN1 لفترة قصيرة فقط وينفصل عن مجمع النسخ المتماثل. يؤدي هذا إلى تأخير في الانقسام بحيث تصبح اللوحات التي أزاحها Pol طويلة. عندما يصل RPA إلى طول طويل بما يكفي ، يمكن أن يرتبط بثبات. عندما يتم إعادة هيكلة اللوحات المرتبطة بـ RPA إلى انشقاق FEN1 ، يتطلب الأمر نوكليازًا آخر للمعالجة ، وقد تم تحديد هذا على أنه نوكلياز بديل ، DNA2. يحتوي DNA2 على عيوب في التعبير المفرط لـ DEN1. أظهر DNA2 أنه يعمل مع FEN1 لمعالجة اللوحات الطويلة. يستطيع DNA2 فصل RPA عن سديلة طويلة ، ويقوم بذلك باستخدام آلية مثل FEN1. يربط السديلة ويخيط الطرف 5 من السديلة. يشق نوكلياز اللوح مما يجعله قصيرًا جدًا بحيث لا يمكن ربطه بـ RPA ، ويعني كون السديلة قصيرة جدًا أنها متاحة لـ FEN1 والربط. يُعرف هذا باسم طريقة الرفرفة الطويلة. يمكن أن يعمل DNA2 بمثابة FEN1 كنسخة احتياطية لنشاط نوكلياز ولكنها ليست عملية فعالة.

تحرير المسار البديل

حتى وقت قريب ، كان هناك مساران معروفان فقط لمعالجة شظايا أوكازاكي. ومع ذلك ، فقد خلصت التحقيقات الحالية إلى وجود مسار جديد لتفتيت أوكازاكي وتكاثر الحمض النووي. يتضمن هذا المسار البديل إنزيمات Pol مع Pif1 التي تؤدي نفس عملية إزالة السديلة مثل Pol و FEN1. [8]

تحرير Primase

يضيف Primase مواد أولية من RNA إلى الشريط المتأخر ، مما يسمح بتركيب شظايا Okazaki من 5 'إلى 3'. ومع ذلك ، فإن Primase ينتج مواد أولية من الحمض النووي الريبي بمعدل أقل بكثير من تلك التي يقوم فيها بوليميريز الحمض النووي بتخليق الحمض النووي على الشريط الرئيسي. يجب أيضًا إعادة تدوير بوليميراز الحمض النووي الموجود على الشريط المتأخر بشكل مستمر لبناء شظايا Okazaki بعد بادئات RNA. هذا يجعل سرعة تخليق الخيوط المتأخرة أقل بكثير من سرعة الخيط الرئيسي. لحل هذه المشكلة ، يعمل primase كإشارة توقف مؤقتة ، ويوقف لفترة وجيزة تقدم شوكة النسخ المتماثل أثناء تكرار الحمض النووي. تمنع هذه العملية الجزيئية الخيط الرئيسي من تجاوز الخيط المتأخر. [9]

بوليميريز الحمض النووي δ تحرير

يتكون الحمض النووي الجديد خلال هذه المرحلة بواسطة الإنزيمات التي تصنع الحمض النووي في اتجاه 5 "إلى 3". إن بوليميراز الحمض النووي ضروري لكل من الخيط الرئيسي المصنوع كخيط مستمر وخيط متخلف مصنوع في قطع صغيرة في تخليق الحمض النووي. تحدث هذه العملية لتمديد الجزء المركب حديثًا وطرد جزء RNA و DNA. يحدث التوليف في 3 مراحل مع نوعين مختلفين من البوليميراز ، DNA polymerase α-primase و DNA polymerase. تبدأ هذه العملية بإزاحة البوليميراز α-primase من RNA و DNA التمهيدي بواسطة تأثير تكرار محمل المشبك ، وهذا التأثير يقود المشبك المنزلق على الحمض النووي. بعد ذلك ، يبدأ DNA polymerase في الانتقال إلى شكله الإنزيم الذي يبدأ بعد ذلك التوليف. ستستمر عملية التوليف حتى تصل النهاية الخامسة لجزء أوكازاكي السابق. بمجرد وصوله ، تستمر معالجة أجزاء Okazaki للانضمام إلى الجزء المركب حديثًا إلى الشريط المتأخر. الوظيفة الأخيرة لبوليميراز DNA δ هي أن تكون بمثابة مكمل لنشاط نوكلياز داخلي للرفرف FEN1 / RAD27 5 '. أليل rad27-p مميت في معظم التوليفات ولكنه كان قابلاً للتطبيق مع بوليميراز rad27-p و exo1. يصور كل من بوليميريز rad27-p و exo1 زيادات تآزرية قوية في طفرات تكرار CAN 1. السبب الوحيد لكون هذه الطفرة قابلة للحياة يرجع إلى جينات إصلاح كسر الشرائط المزدوجة RAD50 و RAD51 و RAD52. يُنشئ RAD27 / FEN1 شقوقًا بين شظايا أوكازاكي المجاورة عن طريق تقليل كمية طرد الخيوط في الخيط المتأخر.

DNA ligase أنا أحرر

أثناء تخليق الخيوط المتأخرة ، يربط DNA ligase I شظايا Okazaki ، بعد استبدال بادئات RNA مع نيوكليوتيدات DNA بواسطة DNA polymerase δ. يمكن أن تتسبب شظايا أوكازاكي التي لم يتم ربطها في حدوث فواصل مزدوجة ، مما يؤدي إلى شق الحمض النووي. [10] نظرًا لأنه لا يتم التسامح إلا مع عدد قليل من الفواصل المزدوجة ، ويمكن إصلاح عدد صغير فقط ، يمكن أن تكون حالات فشل الربط الكافية قاتلة للخلية.

تشير الأبحاث الإضافية إلى الدور التكميلي لتكاثر مستضد نواة الخلية (PCNA) لوظيفة DNA ligase I للانضمام إلى شظايا Okazaki. عندما يكون موقع ربط PCNA على DNA ligase I غير نشط ، فإن قدرة DNA ligase I على توصيل أجزاء Okazaki تكون ضعيفة بشدة. وهكذا ، تتبع الآلية المقترحة: بعد أن يقوم مركب بوليميراز PCNA-DNA δ بتركيب شظايا Okazaki ، يتم تحرير بوليميريز DNA δ. بعد ذلك ، يرتبط DNA ligase I بـ PCNA ، والذي يتم تثبيته على شقوق الخيط المتأخر ، ويحفز تكوين روابط phosphodiester. [11] [12] [13]

نوكلياز رفرف 1 تحرير

نوكلياز رفرف 1 (FEN1) مسؤول عن معالجة شظايا أوكازاكي. إنه يعمل مع بوليميريز DNA لإزالة التمهيدي RNA لجزء Okazaki ويمكنه إزالة 5 'ribonucleotide و 5' عندما يقوم بوليميريز DNA بإزاحة الخيوط أثناء تخليق الخيوط المتأخرة. تتضمن إزالة هذه اللوحات عملية تسمى ترجمة النيك وتخلق شقًا للربط. وبالتالي ، فإن وظيفة FEN1 ضرورية لنضج شظايا Okazaki في تكوين خيط DNA طويل مستمر. وبالمثل ، أثناء إصلاح قاعدة الحمض النووي ، يتم إزاحة النيوكليوتيدات التالفة إلى سديلة وإزالتها لاحقًا بواسطة FEN1. [14] [15]

تحرير نوكلياز الحمض النووي الداخلي

لا يحتوي نوكلياز الحمض النووي 2 على بنية محددة وخصائصها ليست مميزة بشكل جيد ، ولكن يمكن الإشارة إليها على أنها DNA أحادي الجديلة بنهايات حرة (ssDNA). نوكلياز الحمض النووي Dna2 ضروري لشق صفائح الحمض النووي الطويلة التي تترك FEN1 أثناء عملية Okazaki. نوكلياز الحمض النووي Dna2 مسؤول عن إزالة مقطع الحمض النووي الريبي البادئ على شظايا أوكازاكي. أيضًا ، يلعب نوكلياز الحمض النووي Dna2 دورًا محوريًا في المركبات الوسيطة التي تم إنشاؤها أثناء استقلاب الحمض النووي المتنوع وهو فعال في صيانة التيلومير. [16] [17] [18] [19] [20]

يصبح نوكلياز Dna2 نشطًا عندما يتصل جزء RNA طرفي في نهاية 5 ، لأنه ينتقل في اتجاه 5 "إلى 3". في وجود بروتين RPA واحد ملتصق بالحمض النووي الذي تقطعت به السبل ، تصبح لوحات DNA 5 طويلة جدًا ، ولم تعد النكات مناسبة كركيزة لـ FEN1. هذا يمنع FEN1 من إزالة اللوحات ذات 5′. وبالتالي ، فإن دور Dna2 هو تقليل 3 نهاية هذه الأجزاء ، مما يجعل من الممكن لـ FEN1 قطع اللوحات ، ونضج جزء Okazaki أكثر كفاءة. أثناء عملية Okazaki ، يكون Dna2 هيليكاز و نوكلياز داخليًا لا ينفصلان. نوكلياز الحمض النووي لا يعتمد على بنية شوكة الذيل 5 لنشاطه. يُعرف الارتباط غير المنتج بإنشاء كتل لانقسام FEN1 وتتبعه. من المعروف أن ATP يقلل من النشاط ، ولكنه يروج لإصدار ملصق نهاية 3’ال. أشارت الدراسات إلى أن نموذجًا جديدًا من نوكلياز Dna2 و FEN1 مسؤولان جزئيًا عن نضج شظايا أوكازاكي. [19] [17] [16] [21]

الحمض النووي المركب حديثًا ، والمعروف باسم شظايا أوكازاكي ، مرتبط بـ DNA ligase ، الذي يشكل خيطًا جديدًا من الحمض النووي. هناك نوعان من الخيوط التي يتم إنشاؤها عندما يتم تصنيع الحمض النووي. يتم تصنيع الخيط الرئيسي باستمرار ويتم تمديده خلال هذه العملية لفضح القالب المستخدم للحبلة المتأخرة (شظايا أوكازاكي). أثناء عملية تكرار الحمض النووي ، تتم إزالة بادئات الحمض النووي والحمض النووي الريبي من الشريط المتأخر للحمض النووي للسماح لشظايا أوكازاكي بالالتصاق بها. نظرًا لأن هذه العملية شائعة جدًا ، فإن نضج Okazaki سيحدث حوالي مليون مرة خلال إتمام واحد لتكرار الحمض النووي. لكي يحدث نضج أوكازاكي ، يجب أن تخلق بادئات الحمض النووي الريبي قطعًا على الأجزاء المراد ربطها. يستخدم هذا ككتلة بناء لتخليق الحمض النووي في الخيط المتأخر. على حبلا القالب ، سيتم تصنيع البوليميراز في الاتجاه المعاكس من شوكة النسخ المتماثل. بمجرد أن يصبح القالب غير مستمر ، فإنه سينشئ جزء Okazaki. يمكن أن تؤدي العيوب في نضج شظايا أوكازاكي إلى كسر خيوط في الحمض النووي وتسبب أشكالًا مختلفة من شذوذ الكروموسومات. يمكن أن تؤثر هذه الطفرات في الكروموسومات على المظهر أو عدد المجموعات أو عدد الكروموسومات الفردية. نظرًا لأن الكروموسومات ثابتة لكل نوع معين ، فيمكنها أيضًا تغيير الحمض النووي وتسبب عيوبًا في مجموعة الجينات لهذا النوع.

توجد شظايا أوكازاكي في كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى. [22] تختلف جزيئات الدنا في حقيقيات النوى عن الجزيئات الدائرية بدائيات النوى من حيث أنها أكبر وعادة ما يكون لها أصول متعددة للتكاثر. هذا يعني أن كل كروموسوم حقيقي النواة يتكون من العديد من وحدات تكرار الحمض النووي مع أصول متعددة من النسخ المتماثل. بالمقارنة ، فإن الحمض النووي بدائية النواة له أصل واحد فقط من النسخ المتماثل. في حقيقيات النوى ، تشكل هذه الشوكات المتضاعفة ، والمتعددة على طول الحمض النووي ، "فقاعات" في الحمض النووي أثناء التكاثر. تتشكل شوكة النسخ عند نقطة محددة تسمى تسلسلات النسخ الذاتي (ARS). تحتوي حقيقيات النوى على مجمع محمل مشابك ومشبك من ست وحدات يسمى مولد الضد النووي للخلية المتكاثرة. [23] تعتمد الحركة الفعالة لشوكة النسخ أيضًا بشكل حاسم على الوضع السريع للمشابك المنزلقة في مواقع معدة حديثًا على خيط الحمض النووي المتأخر بواسطة مجمعات محمل المشابك المعتمدة على ATP. هذا يعني أن الجيل متعدد الأجزاء لشظايا أوكازاكي يمكنه مواكبة التوليف المستمر للحمض النووي على الشريط الرئيسي. تعتبر مجمعات محمل المشبك هذه مميزة لجميع حقيقيات النوى وتفصل بعض الاختلافات الطفيفة في تركيب شظايا أوكازاكي في بدائيات النوى وحقيقيات النوى. [24] أطوال شظايا أوكازاكي في بدائيات النوى وحقيقيات النوى مختلفة أيضًا. بدائيات النوى لها شظايا أوكازاكي أطول من تلك الموجودة في حقيقيات النوى. تحتوي حقيقيات النوى عادةً على شظايا أوكازاكي يبلغ طولها من 100 إلى 200 نيوكليوتيد ، في حين أن الأجزاء الموجودة في بدائيات النوى بكتريا قولونية يمكن أن يكون طوله 2000 نيوكليوتيد. والسبب في هذا التناقض غير معروف.

يتكون كل كروموسوم حقيقي النواة من العديد من وحدات تكرار الحمض النووي مع أصول متعددة من النسخ المتماثل. بالمقارنة ، فإن كروموسوم الإشريكية القولونية بدائية النواة له أصل واحد فقط من النسخ المتماثل. يحدث التكاثر في بدائيات النوى داخل السيتوبلازم ، ويبدأ كل هذا في التكاثر الذي يتكون من حوالي 100 إلى 200 أو أكثر من النيوكليوتيدات. تحتوي جزيئات الحمض النووي حقيقية النواة على عدد أكبر بكثير من النسخ المتماثلة ، حوالي 50000 أو أكثر ، ومع ذلك ، لا يحدث النسخ المتماثل في نفس الوقت على جميع النسخ المتماثلة. في حقيقيات النوى ، يحدث تكرار الحمض النووي في النواة. شكل تكاثر كبير في جزيء DNA مكرر واحد فقط ، يتم نقل بداية تكرار الحمض النووي بعيدًا عن طريق البروتين متعدد الوحدات الفرعية. هذا النسخ المتماثل بطيء ، وفي بعض الأحيان يتم إضافة حوالي 100 نيوكليوتيد في الثانية.

نستنتج من هذا أن الخلايا بدائية النواة أبسط في التركيب ، فهي لا تحتوي على نواة ، وعضيات ، وقليل جدًا من الحمض النووي ، على شكل كروموسوم واحد. تحتوي الخلايا حقيقية النواة على نواة ذات عضيات متعددة والمزيد من الحمض النووي مرتبة في الكروموسومات الخطية. نرى أيضًا أن الحجم هو اختلاف آخر بين هذه الخلايا بدائية النواة وخلايا حقيقية النواة. تحتوي الخلية حقيقية النواة المتوسطة على حوالي 25 مرة من الحمض النووي أكثر من الخلية بدائية النواة. يحدث التكاثر بشكل أسرع في الخلايا بدائية النواة مقارنة بالخلايا حقيقية النواة ، وأحيانًا تستغرق البكتيريا 40 دقيقة فقط ، بينما يمكن أن تستغرق الخلايا الحيوانية ما يصل إلى 400 ساعة. تمتلك حقيقيات النوى أيضًا عملية مميزة لتكرار التيلوميرات في نهاية كروموسوماتها الأخيرة. بدائيات النوى لها صبغيات دائرية ، لا تسبب أي نهايات في التوليف. تمتلك بدائيات النوى عملية تكاثر قصيرة تحدث باستمرار الخلايا حقيقية النواة ، من ناحية أخرى ، تقوم فقط بتكرار الحمض النووي خلال المرحلة S من دورة الخلية.

أوجه التشابه هي خطوات تكرار الحمض النووي. في كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى ، يتم تحقيق التكاثر عن طريق فك الحمض النووي بواسطة إنزيم يسمى DNA hellase. يتم إنشاء خيوط جديدة بواسطة إنزيمات تسمى بوليميراز الحمض النووي. يتبع كلاهما نمطًا مشابهًا ، يسمى النسخ شبه المحافظ ، حيث يتم إنتاج خيوط فردية من الحمض النووي في اتجاهات مختلفة ، مما يؤدي إلى ظهور خيط متقدم ومتأخر. يتم تصنيع هذه الخيوط المتأخرة عن طريق إنتاج شظايا أوكازاكي التي سرعان ما يتم ضمها معًا. كل من هذه الكائنات الحية تبدأ سلاسل DNA جديدة والتي تشمل أيضًا خيوطًا صغيرة من الحمض النووي الريبي.

تحرير المفاهيم الطبية المرتبطة بشظايا أوكازاكي

على الرغم من أن الخلايا تخضع لخطوات متعددة لضمان عدم وجود طفرات في التسلسل الجيني ، إلا أن عمليات الحذف المحددة والتغيرات الجينية الأخرى أثناء نضوج جزء أوكازاكي تمر دون أن يلاحظها أحد. نظرًا لأن شظايا Okazaki هي مجموعة النيوكليوتيدات للخيط المتأخر ، فإن أي تغيير بما في ذلك الحذف أو الإدراج أو الازدواج من الخيط الأصلي يمكن أن يتسبب في حدوث طفرة إذا لم يتم اكتشافها وإصلاحها. تشمل الأسباب الأخرى للطفرات مشاكل في البروتينات التي تساعد في تكرار الحمض النووي. على سبيل المثال ، تؤثر طفرة مرتبطة بـ primase على إزالة RNA التمهيدي ويمكن أن تجعل خيط DNA أكثر هشاشة وعرضة للكسر. طفرة أخرى تتعلق بالبوليميراز ألفا ، الذي يضعف تعديل تسلسل جزء أوكازاكي ودمج البروتين في المادة الجينية. يمكن أن يؤدي كلا التعديلين إلى انحرافات صبغية ، وإعادة ترتيب جيني غير مقصود ، ومجموعة متنوعة من السرطانات في وقت لاحق من الحياة. [25]

من أجل اختبار آثار طفرات البروتين على الكائنات الحية ، قام الباحثون بتغيير فئران المختبر وراثيًا لتكون متماثلة اللواقح لطفرة أخرى في البروتين تتعلق بتكاثر الحمض النووي ، أو نوكلياز رفرف 1 ، أو FEN1. اختلفت النتائج بناءً على التعديلات الجينية المحددة. عانت الفئران الطافرة المتماثلة اللواقح ذات الضربة القاضية من "فشل تكاثر الخلايا" و "فتك الجنين المبكر" (27). ماتت الفئران المصابة بالطفرة F343A و F344A (المعروفة أيضًا باسم FFAA) بعد الولادة مباشرة بسبب مضاعفات الولادة بما في ذلك قلة الكريات الشاملة ونقص تنسج الرئة. هذا لأن طفرة FFAA تمنع FEN1 من التفاعل مع PCNA (مستضد الخلية النووي المتكاثر) ، وبالتالي لا تسمح لها بإكمال الغرض منها أثناء نضوج جزء Okazaki. يعتبر التفاعل مع هذا البروتين هو الوظيفة الجزيئية الرئيسية في الوظيفة البيولوجية لـ FEN1. تسبب طفرة FFAA عيوبًا في إزالة RNA التمهيدي وإصلاح زوج طويل القاعدة ، مما يتسبب في حدوث العديد من الانقطاعات في الحمض النووي.تحت الملاحظة الدقيقة ، يبدو أن الخلايا المتجانسة لطفرات FFAA FEN1 تظهر عيوبًا جزئية فقط في النضج ، مما يعني أن الفئران غير المتجانسة للطفرة ستكون قادرة على البقاء على قيد الحياة حتى مرحلة البلوغ ، على الرغم من الحفاظ على النكات الصغيرة المتعددة في جينوماتها. ومع ذلك ، فإن هذه النكات تمنع بشكل حتمي تكرار الحمض النووي في المستقبل لأن الكسر يتسبب في انهيار شوكة النسخ المتماثل ويسبب انكسارات الشريط المزدوج في تسلسل الحمض النووي الفعلي. بمرور الوقت ، تتسبب هذه النكات أيضًا في حدوث كسر كامل للكروموسوم ، مما قد يؤدي إلى حدوث طفرات شديدة وأمراض سرطانية. تم تنفيذ طفرات أخرى بإصدارات معدلة من Polymerase α ، مما أدى إلى نتائج مماثلة. [25]


مقدمة

في العديد من البكتيريا ، يكون الكروموسوم جزيء DNA مزدوج الشريطة مغلق تساهميًا (دائريًا) يشفر المعلومات الجينية في شكل أحادي العدد. يختلف حجم الحمض النووي من 500000 إلى عدة ملايين من أزواج القواعد (bp) التي تشفر من 500 إلى عدة آلاف من الجينات اعتمادًا على الكائن الحي. يوجد الحمض النووي الصبغي في الخلايا في شكل منظم للغاية مكثف يسمى nucleoid (يشبه النواة) ، وهو غير مغلف بغشاء نووي كما هو الحال في الخلايا حقيقية النواة. يحتوي النوكليويد المعزول على 80٪ DNA و 10٪ بروتين و 10٪ RNA بالوزن [1 ، 2]. في هذا العرض ، نراجع معرفتنا الحالية حول (1) كيف يصبح الحمض النووي الكروموسومي نواة ، (2) العوامل المتضمنة فيه ، (3) ما هو معروف عن هيكله ، و (4) كيف تؤثر بعض الجوانب الهيكلية للحمض النووي التعبير الجيني ، باستخدام البكتيريا سالبة الجرام الإشريكية القولونية كنظام نموذجي. نسلط الضوء أيضًا على بعض المشكلات ذات الصلة التي تحتاج إلى حل. هذا المعرض هو امتداد للمراجعات السابقة حول الموضوع [3 ، 4].

هناك جانبان أساسيان لتكثيف التكوين النووي لدنا كبير في مساحة خلوية صغيرة والتنظيم الوظيفي للحمض النووي في شكل ثلاثي الأبعاد [5 ، 6]. الكروموسوم الدائري أحادي الصيغة الصبغية ه. القولونية يتكون من

4.6 × 10 6 بي بي. إذا تم تخفيف الحمض النووي في الشكل B ، فسيكون له محيط

1.5 ملم (0.332 نانومتر × 4.6 × 10 6) (الشكل 1 أ). ومع ذلك ، فإن جزيء DNA كبير مثل ه. القولونية لا يبقى الحمض النووي الكروموسومي جزيءًا صلبًا مستقيمًا في معلق. ستولد الحركة البراونية انحناءًا وانحناءات في الحمض النووي. الحد الأقصى للطول الذي يظل فيه الحمض النووي ثنائي الحلزون مستقيمًا بمقاومة الانحناء الذي تفرضه الحركة البراونية هو

50 نانومتر أو 150 نقطة أساس ، وهو ما يسمى طول الثبات. وبالتالي ، يصبح الحمض النووي النقي مكثفًا إلى حد كبير دون أي عوامل إضافية عند التوازن الحراري ، ويفترض شكل ملف عشوائي. الملف العشوائي لـ ه. القولونية سيشغل الحمض النووي الكروموسومي (الشكل 1 ب) حجمًا (4/3 π r 3) من

523 ميكرومتر 3 ، محسوبة من نصف قطر الدوران (Rg = (N a) / √6) حيث a هو طول Kuhn (2 × طول الثبات) ، و N هو عدد مقاطع طول Kuhn في DNA (الطول الإجمالي من الحمض النووي مقسومًا على أ). على الرغم من أن الحمض النووي مكثف بالفعل في شكل ملف عشوائي ، إلا أنه لا يزال غير قادر على تحمل حجم النواة التي تقل عن ميكرون (الشكل 1C). وبالتالي ، فإن الخاصية المتأصلة في الحمض النووي ليست كافية: يجب أن تساعد العوامل الإضافية في تكثيف الحمض النووي بشكل أكبر بترتيب

10 3 (حجم الملف العشوائي مقسومًا على الحجم النووي). الجانب الأساسي الثاني للتكوين النووي هو الترتيب الوظيفي للحمض النووي. لا يتم تكثيف الحمض النووي للكروموسومات فحسب ، بل يتم تنظيمه وظيفيًا أيضًا بطريقة تتوافق مع عمليات معاملات الحمض النووي مثل التكرار وإعادة التركيب والفصل والنسخ (الشكل 1 ج). ما يقرب من خمسة عقود من الأبحاث التي بدأت في عام 1971 [1] ، أظهرت أن الشكل النهائي للنيوكليويد ينشأ من تنظيم هرمي للحمض النووي. على أصغر مقياس (1 كيلوبايت أو أقل) ، تتكثف البروتينات المعمارية للحمض النووي المرتبطة بالنيوكليويد وتنظم الحمض النووي عن طريق ثني الحمض النووي أو لفه أو تجسيره أو لفه. على نطاق أكبر (10 كيلوبايت أو أكبر) ، يشكل الحمض النووي حلقات بكتونية ، وهي شكل مضفر من الحمض النووي الناجم عن الالتفاف الفائق. على مقياس قاعدة الميجا ، تتحد الحلقات الوبائية في ستة مجالات منظمة مكانيًا (نطاقات كبيرة) ، والتي يتم تحديدها من خلال تفاعلات فيزيائية أكثر تكرارًا بين مواقع الحمض النووي داخل نفس النطاق الكبير مقارنة بالنطاقات الكبيرة المختلفة [7]. تساهم اتصالات الحمض النووي DNA-DNA طويلة وقصيرة المدى التي تتكون داخل وبين المجالات الكبيرة في التكثيف والتنظيم الوظيفي. أخيرًا ، النواة عبارة عن شكل إهليلجي حلزوني به مناطق من الحمض النووي عالي التكثيف عند المحور الطولي [8-10]. نناقش هذه السمات التنظيمية للنيوكليويد وأساسها الجزيئي أدناه.

أ. رسم توضيحي للتشكيل المفتوح للجينوم الدائري لـ ه. القولونية. تمثل الأسهم تكرار الحمض النووي ثنائي الاتجاه. الموضع الجيني لأصل تكرار الحمض النووي ثنائي الاتجاه (oriC) وموقع فك الكروموسوم (ديف) في منطقة إنهاء النسخ المتماثل (ثالثا). تمثل الألوان شرائح محددة من الحمض النووي كما تمت مناقشته في C. ب. رسم توضيحي لشكل ملف عشوائي اعتمده DNA دائري نقي لـ ه. القولونية عند التوازن الحراري بدون لفائف فائقة وعوامل استقرار إضافية [5 ، 6]. ج. رسم كاريكاتوري لكروموسوم المولود الجديد ه. القولونية زنزانة. لا يتم تكثيف الحمض النووي الجينومي فقط بمقدار 1000 ضعف مقارنة بشكل الملف العشوائي النقي ، بل يتم تنظيمه مكانيًا أيضًا. oriC و ديف يتم توطينها في الخلية الوسطى ، وتنظم مناطق معينة من الحمض النووي المشار إليها بواسطة الألوان في A في مجالات متميزة مكانيًا. تم تحديد ستة مجالات مكانية في ه. القولونية. تم تنظيم أربعة مجالات (Ori و Ter و Left و Right) واثنان (NS-right و NS-left) غير منظمين (انظر القسم 4 من النص الرئيسي للحصول على التفاصيل). يسمى الشكل المكثف والمنظم للحمض النووي مع البروتينات المرتبطة به والحمض النووي الريبي nucleoid. الرسومات ليست في نطاق مع بعضها البعض.

تكثيف الحمض النووي وتنظيمه بواسطة البروتينات المرتبطة بالنوكليويد (NAPs)

في حقيقيات النوى ، يتكثف الحمض النووي الجيني في شكل مجموعة متكررة من جزيئات بروتين الدنا تسمى الجسيمات الجينية [11-13].

146 نقطة أساس من الحمض النووي ملفوفة حول مركب ثماني من بروتينات هيستون. على الرغم من أن البكتيريا لا تحتوي على هيستونات ، إلا أنها تمتلك مجموعة من بروتينات ربط الحمض النووي يشار إليها بالبروتينات المرتبطة بالنيوكليويد (NAPs) والتي تشبه وظيفيًا الهستونات بمعنى واسع. إن برامج العمل الوطنية متوفرة بكثرة وتشكل نسبة كبيرة من مكون البروتين في النواة [14].

السمة المميزة لبرامج العمل الوطنية هي قدرتها على ربط الحمض النووي بطريقة محددة (إما متسلسلة أو هيكلية محددة) وغير متسلسلة. نتيجة لذلك ، فإن NAPs عبارة عن بروتينات ثنائية الوظيفة. غالبًا ما يشارك الارتباط المحدد لـ NAPs في النسخ الخاص بالجينات وتكرار الحمض النووي وإعادة التركيب والإصلاح. في ذروة وفرتها ، يكون عدد جزيئات العديد من برامج العمل الوطنية أعلى بعدة مرات من عدد مواقع الربط المحددة في الجينوم. لذلك ، من المنطقي أن ترتبط NAPs بالحمض النووي الكروموسومي في الغالب في الوضع المحدد غير المتسلسل وهذا الوضع هو أمر حاسم لضغط الكروموسوم. من الجدير بالذكر أن ما يسمى الربط النوعي غير المتسلسل لبرنامج العمل الوطني قد لا يكون عشوائيًا تمامًا. يمكن أن تكون هناك خصوصية منخفضة التسلسل و / أو خصوصية هيكلية بسبب تشكل الحمض النووي المعتمد على التسلسل أو تشكل الحمض النووي الناتج عن برامج العمل الوطنية الأخرى.

على الرغم من أن الآليات الجزيئية لكيفية تكثيف NAPs للحمض النووي في الجسم الحي ليست مفهومة جيدًا ، بناءً على الدراسات المخبرية المكثفة ، يبدو أن NAPs تشارك في ضغط الكروموسوم عبر الآليات التالية: تحفز برامج العمل الوطنية الانحناءات في الحمض النووي وتثبتها ، وبالتالي تساعد في تكثيف الحمض النووي عن طريق الحد طول الثبات (الشكل 2 أ). تقوم NAPs بتكثيف الحمض النووي عن طريق الجسر واللف والتجميع الذي يمكن أن يحدث بين مقاطع الحمض النووي القريبة أو أجزاء الحمض النووي البعيدة من الكروموسوم (الشكل 2C و 2 D و 2E). هناك آلية أخرى تشارك بها NAPs في ضغط الكروموسوم عن طريق تقييد الملفات الفائقة السالبة في الحمض النووي وبالتالي المساهمة في التنظيم الطوبولوجي للكروموسوم (انظر القسم 3).

تنظيم الحمض النووي بواسطة البروتينات المرتبطة بالنوكليويد (NAPs). يمثل الخط الرمادي المستقيم أو المنحني الحمض النووي ، بينما تصور الكرة الزرقاء خطة العمل الوطنية. أ. تنظم NAPs الحمض النووي عن طريق ثنيه. على سبيل المثال ، يتسبب IHF في حدوث انحناء حاد للحمض النووي (زاوية الانحناء & gt 160 درجة) عند الارتباط بموقع معين ، بينما تقدم HU انحناءات مرنة (تختلف زوايا الانحناء بين 10-180 درجة). يتسبب IHF أيضًا في حدوث انحناءات مرنة في مواقع غير محددة التسلسل مماثلة لتلك التي يسببها HU. Fis ينحني الحمض النووي بين زاوية 60-75 درجة. ب. على عكس الانحناء ، يمكن أن تسبب NAPs أيضًا استقامة أو تقوية الحمض النووي. على سبيل المثال ، ينتشر H-NS على طول الحمض النووي ، ونتيجة لذلك ، يصبح الحمض النووي صلبًا. يسبب HU أيضًا تصلب الحمض النووي بتركيزات عالية (نطاق ميكرومتر). ج. يؤدي الارتباط المتزامن لمسار متجاور من جزيئات NAP (يسار) أو جزيء NAP واحد (يمين) إلى زوج من مواقع الحمض النووي المجاورة أو البعيدة إلى تجسير الحمض النووي. في مثال على تجسير الحمض النووي ، يربط جزء من جزيئات H-NS المرتبطة جانبياً موقعين متجاورين من الحمض النووي. د. يشير تجميع أو تجميع الحمض النووي إلى تنظيم الحمض النووي حيث يؤدي التعدد الجانبي لـ HU الناجم عن الارتباط غير المتسلسل المحدد إلى تجميع عدة مقاطع DNA متوازية معًا ، كما هو الحال في مجموعة من الزهور. E. يمكن لجزيئات NAP المرتبطة ببعضها البعض التفاف الحمض النووي عن طريق الانحناء المتماسك. قد تنظم جزيئات Fis المرتبطة في مواقع ترادفية الحمض النووي بهذه الطريقة.

هناك ما لا يقل عن 12 برنامج عمل وطني تم تحديدها في ه. القولونية [15]. هنا ، نركز على أكثر برامج العمل الوطنية التي تمت دراستها على نطاق واسع ، HU ، IHF ، H-NS ، و Fis. تم تلخيص وفرة وخصائص ربط الحمض النووي في الجدولين 1 و 2. تتم مناقشة النماذج الحالية لكيفية تكثيف كل برنامج NAP وتنظيمه للحمض النووي بالتفصيل أدناه.

بروتين شبيه بالهيستون من ه. القولونية سلالة U93 (HU) هو بروتين محفوظ تطوريًا في البكتيريا [28 ، 29]. HU موجود في ه. القولونية كوحدات متجانسة وغير متجانسة من وحدتين فرعيتين HUα و HUβ تشتركان في هوية الأحماض الأمينية بنسبة 69٪ [30]. على الرغم من أنه يشار إليه على أنه بروتين شبيه بالهيستون ، فإن الأقارب الوظيفية القريبة لـ HU في حقيقيات النوى هي بروتينات مجموعة عالية الحركة (HMG) ، وليس هيستونات [31 ، 32]. HU هو بروتين ربط DNA محدد غير متسلسل. يرتبط بانجذاب منخفض لأي حمض نووي خطي. ومع ذلك ، فإنه يرتبط بشكل تفضيلي بدرجة عالية من الارتباط بالحمض النووي المشوه هيكليًا (الجدول 2) [19 ، 33-37]. تتضمن أمثلة ركائز الحمض النووي المشوهة الحمض النووي الصليبي ، أو الحمض النووي المنتفخ ، أو dsDNA الذي يحتوي على كسر أحادي الجديلة مثل النكات ، أو الفجوات ، أو الشوك. علاوة على ذلك ، يربط HU على وجه التحديد حلقة DNA بوساطة البروتين وتثبيتها [38]. في وضع ربط الحمض النووي المحدد هيكليًا ، يتعرف HU على شكل هيكلي شائع محدد بواسطة الانحناءات أو الالتواءات الناتجة عن التشويه [17 ، 18 ، 39] ، بينما يرتبط بالحمض النووي الخطي عن طريق قفل العمود الفقري للفوسفات [40]. في حين أن الارتباط عالي التقارب النوعي من الناحية الهيكلية مطلوب للوظائف المتخصصة لـ HU مثل إعادة التركيب الخاص بالموقع وإصلاح الحمض النووي وبدء تكرار الحمض النووي وتنظيم الجينات [41-43] ، يبدو أن الارتباط العام منخفض التقارب متضمن في تكثيف الحمض النووي [40]. في الترسيب المناعي الكروماتين المقترن بتسلسل الحمض النووي (ChIP-Seq) ، لا تكشف HU عن أي أحداث ارتباط محددة. بدلاً من ذلك ، فإنه يعرض ارتباطًا موحدًا عبر الجينوم من المفترض أنه يعكس ارتباطه الضعيف في الغالب وغير المتسلسل ، وبالتالي يخفي الارتباط عالي التقارب في الجسم الحي (الشكل 3).

أ. التخطيط الدائري لملف ه. القولونية الجينوم (كما هو موضح في الشكل 1 أ) يصور بالإضافة إلى ذلك شغل الجينوم لبرامج العمل الوطنية المشار إليها في مرحلة النمو. ب. شغل الجينوم لبرامج العمل الوطنية المشار إليها في المرحلة الثابتة. تخطيط الجينوم هو نفسه كما في A. يتم رسم شغل الجينوم لكل NAP ، الذي تم تحديده بواسطة ChIP-Seq ، كرسم بياني (حجم الحاوية 300 نقطة أساس) حيث يشير ارتفاع الشريط إلى إثراء الربط النسبي. تم إعداد الأرقام في Circos / 0.69–6 باستخدام البيانات من [46 ، 47].

في السلالات التي تفتقر إلى HU ، يكون النيوكليدي "منزوع التكثيف" ، بما يتوافق مع دور HU في انضغاط الحمض النووي [44]. تشير الدراسات التالية في المختبر إلى آليات محتملة لكيفية تكثيف HU وتنظيم الحمض النووي في الجسم الحي. لا يرتبط HU فقط بشكل ثابت بالحمض النووي المشوه مع الانحناءات ، ولكنه أيضًا يحث على الانحناءات المرنة حتى في الحمض النووي الخطي بتركيز أقل من 100 نانومتر (الشكل 2 أ) [45]. في المقابل ، يظهر HU التأثير المعماري المعاكس على الحمض النووي بتركيزات ذات صلة من الناحية الفسيولوجية أعلى [40 ، 45]. إنه يشكل خيوط بروتين نووي صلبة تسبب تضييق الحمض النووي وليس الانحناء (الشكل 2 ب). يمكن أن تشكل الخيوط شبكة DNA (تجميع الحمض النووي) قابلة للتوسيع جانبيًا ووسطيًا بسبب التعددية HU-HU الناتجة عن ارتباط الحمض النووي غير المتسلسل المحدد (الشكل 2 د) [40].

كيف ترتبط سلوكيات هليوبوليس هذه داخل الخلية؟ يتطلب تكوين الشعيرات ارتباطًا عالي الكثافة لـ HU على DNA ، وهو ثنائي HU لكل 9-20 زوجًا أساسًا من الحمض النووي [40 ، 45]. ولكن لا يوجد سوى ثنائي كل منها HU

150 زوج قاعدي من الحمض النووي الصبغي بناءً على الوفرة المقدرة بـ 30000 من ثنائيات HU لكل خلية (4600000 زوج قاعدي / 30000) [16]. يشير هذا إلى أنه من المرجح أن تحدث الانحناءات المرنة في الجسم الحي. قد يتسبب الانحناء المرن في حدوث تكاثف بسبب انخفاض طول ثبات الحمض النووي كما هو موضح في تجارب الملاقط المغناطيسية [45] ، والتي تسمح بدراسة تكثيف جزيء DNA واحد بواسطة بروتين رابط لـ DNA [48]. ومع ذلك ، بسبب التعاون ، يمكن أن تتشكل الخيوط والشبكات الصلبة في بعض المناطق في الكروموسوم. لا يؤدي تكوين الخيوط بمفرده إلى التكثيف [45] ، لكن شبكات الحمض النووي أو التجميع يمكن أن يساهم بشكل كبير في التكثيف عن طريق تجميع مقاطع الكروموسوم البعيدة أو القريبة معًا [40].

عامل مضيف التكامل (IHF) مطابق تقريبًا من الناحية الهيكلية لـ HU [49] ولكنه يتصرف بشكل مختلف عن HU في العديد من الجوانب. على عكس HU ، الذي يرتبط بشكل تفضيلي بعنصر هيكلي بغض النظر عن التسلسل ، يرتبط IHF بشكل تفضيلي بتسلسل DNA محدد على الرغم من أن الخصوصية تنشأ من خلال بنية الحمض النووي المعتمد على التسلسل والتشوه. الارتباط المحدد لـ IHF في المواقع المماثلة ينحني بحدة الحمض النووي بزاوية الانحناء & gt160 ° [49]. يبلغ حدوث عزر التسلسل المماثل حوالي 3000 في ه. القولونية الجينوم [47]. تبلغ الوفرة المقدرة لـ IHF في مرحلة النمو حوالي 6000 ديمر لكل خلية (الجدول 1). بافتراض أن ثنائى IHF يرتبط بعزر واحد وأن النواة تحتوي على أكثر من مكافئ جينوم واحد خلال مرحلة النمو الأسي ، فإن معظم جزيئات IHF ستشغل مواقع محددة في الجينوم ومن المحتمل أن تكثف الحمض النووي فقط عن طريق إحداث انحناء حاد (الشكل 2 أ).

إلى جانب الارتباط التفضيلي لتسلسل DNA معين ، يرتبط IHF أيضًا بالحمض النووي بطريقة محددة غير متسلسلة مع الصلات المشابهة لـ HU (الجدول 2). يبدو أن دور الارتباط غير المحدد لـ IHF في تكثيف الحمض النووي مهمًا في المرحلة الثابتة لأن وفرة IHF تزداد بمقدار خمسة أضعاف في المرحلة الثابتة (الجدول 1) ومن المرجح أن تربط ثنائيات IHF الإضافية الحمض النووي غير الكروموسومي. - على وجه التحديد [16 ، 50 ، 51]. على عكس HU ، لا يشكل IHF خيوطًا صلبة سميكة بتركيزات أعلى. بدلاً من ذلك ، يؤدي ارتباطه غير النوعي أيضًا إلى انحناء الحمض النووي وإن كانت درجة الانحناء أصغر بكثير من تلك الموجودة في مواقع محددة وتشبه الانحناء المرن الذي تحدثه HU في DNA خطي بتركيزات منخفضة [52]. في المختبر ، الانحناء الناجم عن الارتباط غير النوعي لـ IHF يمكن أن يسبب تكاثف الحمض النووي ويعزز تكوين معقدات بروتين نووي أعلى مرتبة اعتمادًا على تركيزات كلوريد البوتاسيوم وكلوريد المغنيسيوم [52]. ما إذا كانت منظمة الحمض النووي عالية المستوى من قبل IHF تحدث في الجسم الحي تحتاج إلى مزيد من التحقيق.

السمة المميزة لبروتين هيكلي نووي شبيه بالهيستون أو مستقر الحرارة (H-NS) [53-56] من NAPs الأخرى هي القدرة على التحول من الشكل المتجانس بتركيزات منخفضة نسبيًا (& lt1 x 10 5 M) إلى حالة قليلة القسيمات في المستويات الأعلى [57 ، 58]. بسبب خصائص قلة القلة ، ينتشر H-NS بشكل جانبي على طول الحمض النووي الغني بـ AT في تفاعل التنوي ، حيث تعمل المواقع عالية التقارب كمراكز تنوي [21 ، 59 ، 60]. ينتج عن انتشار H-NS على الحمض النووي نتيجتين متعاكستين اعتمادًا على تركيز المغنيسيوم في التفاعل (الشكل 2C). بتركيز منخفض من المغنيسيوم (& lt 2 مم) ، تشكل H-NS خيوط بروتين نووي صلبة بينما تشكل جسورًا بين الجزيئات وداخلها بتركيزات أعلى من المغنيسيوم (& gt 5 مم) [61-65]. ينتج عن تكوين خيوط صلبة استقامة الحمض النووي (الشكل 2 ب) بدون تكاثف بينما يتسبب التجسير في طي كبير للحمض النووي [64]. قدم تحليل ارتباط H-NS في الجينوم بواسطة فحوصات ChIP-Seq دليلًا غير مباشر على انتشار H-NS على الحمض النووي في الجسم الحي. يرتبط H-NS بشكل انتقائي بـ 458 منطقة في الجينوم [46]. على الرغم من إثبات أن H-NS تفضل الحمض النووي المنحني المتكون من مسارات A المتكررة في تسلسل الحمض النووي [59 ، 66] فإن أساس الارتباط الانتقائي هو وجود شكل تسلسل محفوظ موجود في المناطق الغنية بـ AT (الجدول 2) [ 20]. والأهم من ذلك ، أن التكرار المتكرر لعنصر التسلسل داخل منطقة ربط H-NS يمكن أن يعيد فرض تفاعلات البروتين والبروتين التعاوني ، والطول الطويل غير المعتاد لمنطقة الربط يتوافق مع انتشار البروتين. أي من النتيجتين ، تشكيل الخيوط أم تجسير الحمض النووي ، سائد في الجسم الحي؟ إذا كان التركيز الفسيولوجي للمغنيسيوم داخل الخلايا منخفضًا بشكل موحد (& lt 5 ملي مول) [67] ، فإن H-NS سيشكل خيوط بروتين نووي صلبة في الجسم الحي. بدلاً من ذلك ، إذا كان هناك توزيع غير متساوٍ للمغنيسيوم في الخلية ، فيمكن أن يعزز جسر الحمض النووي وتقويته ولكن في مناطق مختلفة من النواة.

علاوة على ذلك ، يُعرف H-NS على أنه كاتم صوت جيني عالمي يمنع بشكل تفضيلي نسخ الجينات المنقولة أفقيًا وهو الخيط الصلب الذي يؤدي إلى إسكات الجينات [68 ، 69]. مجتمعة ، يبدو أن تكوين خيوط صلبة هو النتيجة الأكثر احتمالا لتفاعلات H-NS-DNA في الجسم الحي التي تؤدي إلى إسكات الجينات ولكنها لا تحفز تكاثف الحمض النووي. باستمرار ، فإن غياب H-NS لا يغير الحجم النووي [70]. لكن، ه. القولونية قد يتعرض لتركيز عالي من المغنيسيوم في ظل بعض الظروف البيئية. في مثل هذه الظروف ، يمكن لـ H-NS التحول من شكل تحريض الشعيرة إلى شكل تحريض الجسر الذي يساهم في تكثيف وتنظيم الحمض النووي.

عامل التحفيز الانعكاسي (Fis) هو بروتين ربط DNA خاص بالتسلسل الذي يرتبط بتسلسلات DNA محددة تحتوي على نموذج متماثل 15-bp (الجدول 2) [24 ، 25 ، 71]. مثل IHF ، يستحث Fis ثني الحمض النووي في المواقع المماثلة. القدرة على ثني الحمض النووي واضحة في بنية homodimer Fis. يمتلك جهاز التماثل اللولبي Fis شكلين حلزوني الدوران (HTH) ، واحد من كل مونومر. يتعرف نموذج HTH عادةً على الأخدود الرئيسي للحمض النووي. ومع ذلك ، فإن المسافة بين حلزونات التعرف على الحمض النووي لزخارف HTH في homodimer Fis هي 25 درجة ، وهي

8 A ° أقصر من نغمة B-DNA الكنسي ، مما يشير إلى أن البروتين يجب أن ينثني أو يلف الحمض النووي ليرتبط بثبات [72 ، 73]. بشكل ثابت ، يُظهر التركيب البلوري لمجمعات Fis-DNA أن المسافة بين حلزونات التعرف لا تزال دون تغيير بينما منحنيات الحمض النووي في نطاق 60-75 درجة زوايا الانحناء [25]. هناك 1464 منطقة ربط Fis موزعة عبر ه. القولونية يتطابق الجينوم ومخطط الربط ، المحدد حسابيًا ، مع عزر 15-bp المعروف [46 ، 74]. قد يؤدي الارتباط المحدد لـ Fis في مثل هذه المواقع إلى حدوث انحناءات في DNA ، وبالتالي يساهم في تكثيف الحمض النووي عن طريق تقليل طول ثبات الحمض النووي. علاوة على ذلك ، تحدث العديد من مواقع الربط Fis جنبًا إلى جنب مثل تلك الموجودة في معززات RNA المستقرة ، على سبيل المثال ، P1 مروج أوبرا الرنا الريباسي rrnB. من المرجح أن يؤدي الانحناء المتماسك بواسطة Fis في المواقع الترادفية إلى إنشاء حلقة دقيقة للحمض النووي (الشكل 2E) يمكن أن تساهم بشكل أكبر في تكثيف الحمض النووي [75].

إلى جانب الارتباط النوعي عالي التقارب بالمواقع المشابهة ، يمكن لـ Fis الارتباط بتسلسل DNA عشوائي (الجدول 2). يعتبر ارتباط الحمض النووي غير النوعي مهمًا لأن Fis وفير مثل HU في مرحلة النمو (الجدول 1). لذلك ، من المتوقع أن تربط معظم جزيئات Fis الحمض النووي بطريقة غير متسلسلة محددة. تُظهر تجارب الملاقط المغناطيسية أن هذا الارتباط غير النوعي لـ Fis يمكن أن يساهم في تكثيف وتنظيم الحمض النووي [76 ، 77]. يسبب Fis تكاثفًا خفيفًا لجزيء DNA واحد عند & lt1 mM ولكنه يحرض على طي كبير من خلال تكوين حلقات DNA بحجم متوسط

800-نقطة أساس في & GT1 ملم. تختلف الحلقات في تجارب الملاقط المغناطيسية عن الحلقات الدقيقة التي تم إنشاؤها عن طريق الانحناء المتماسك للحمض النووي في المواقع المماثلة ، لأنها تتطلب تكوين مجمعات بروتين DNA عالية الكثافة يتم تحقيقها عن طريق الارتباط المستقل عن التسلسل. على الرغم من أن حدوث مثل هذه الحلقات في الجسم الحي لا يزال يتعين إثباته ، فقد يحدث الارتباط عالي الكثافة لـ Fis في الجسم الحي من خلال العمل المتضافر لكل من الربط المحدد وغير المحدد. قد يؤدي التواجد المترادف لمواقع معينة إلى بدء تفاعل تنوي مشابه لتفاعل H-NS ، ومن ثم يؤدي الارتباط غير المحدد إلى تكوين مصفوفات Fis الموضعية عالية الكثافة. يمكن أن يؤدي الجسر بين هذه المناطق المحلية (الشكل 2 ج) إلى إنشاء حلقات DNA كبيرة [77]. Fis موجود حصريًا في مرحلة النمو وليس في المرحلة الثابتة [78 ، 79]. وبالتالي ، فإن أي دور في تكثيف الكروموسومات بواسطة Fis يجب أن يكون خاصًا بالخلايا النامية.

تكثيف الحمض النووي وتنظيمه بواسطة الحمض النووي الريبي المرتبط بالنيوكليويد (NaRNAs)

أشارت الدراسات المبكرة التي فحصت تأثير علاج RNase A على النيوكلييدات المعزولة إلى أن RNA شارك في تثبيت النواة في الحالة المكثفة [80]. علاوة على ذلك ، عطل العلاج بـ RNase A ألياف الحمض النووي إلى ألياف أرق ، كما لوحظ بواسطة الفحص المجهري للقوة الذرية للنيوكليويد باستخدام "إجراء تحلل الركيزة" [81]. أظهرت هذه النتائج مشاركة الحمض النووي الريبي في البنية النووية ، لكن هوية جزيء (جزيئات) الحمض النووي الريبي ظلت مجهولة حتى وقت قريب [44]. ركزت معظم الدراسات التي أجريت على جامعة هليوبوليس على ارتباطها بالحمض النووي. ومع ذلك ، يرتبط HU أيضًا بـ dsRNA و RNA-DNA الهجينة مع ألفة أقل مماثلة لتلك مع dsDNA الخطي [82]. علاوة على ذلك ، يرتبط HU بشكل تفضيلي بـ RNA الذي يحتوي على بنى ثانوية وهجين RNA-DNA حيث يحتوي RNA على نك أو نتوء [82 ، 83]. تقاربات ربط HU مع ركائز الحمض النووي الريبي هذه مشابهة لتلك التي يرتبط بها الحمض النووي المشوه. تم تحديد ترسيب مناعي من الحمض النووي الريبي المرتبط بـ HU مقترنًا بالنسخ العكسي ودراسة المصفوفة الدقيقة (RIP-Chip) بالإضافة إلى تحليل الحمض النووي الريبي من النوكلييدات السليمة المنقاة التي حددت جزيئات الحمض النووي الريبي المرتبطة بالنيوكليويد والتي تتفاعل مع HU [44]. العديد منها عبارة عن RNAs غير مشفرة ، وواحد من هذه RNA يسمى naRNA4 (RNA 4 المرتبط بالنيوكليويد) ، تم ترميزه في متناظرة متكررة خارج الجين (REP325). في سلالة تفتقر إلى REP325 ، يتم فك تكثيف النواة النووية كما هي في سلالة تفتقر إلى HU [44]. من المرجح أن تشارك naRNA4 في تكثيف الحمض النووي عن طريق ربط مقاطع DNA في وجود HU [84]. تقدم الدراسات الحديثة نظرة ثاقبة حول الآلية الجزيئية لكيفية إنشاء naRNA4 لاتصالات DNA-DNA. يستهدف RNA مناطق الحمض النووي التي تحتوي على بنى صليبية وتشكل مركب RNA-DNA الذي يعتبر بالغ الأهمية لتأسيس وصلات DNA-DNA [85]. من المثير للدهشة ، على الرغم من أن HU يساعد في تكوين المجمع ، إلا أنه غير موجود في المجمع النهائي ، مما يشير إلى دوره المحتمل كمحفز (مساعد). تظل طبيعة مركب RNA-DNA محيرة لأن تكوين المركب لا يتضمن اقترانًا واسعًا لقاعدة Watson / Crick ولكنه حساس لـ RNase H ، الذي يشق الحمض النووي الريبي في هجين RNA-DNA. علاوة على ذلك ، يرتبط المركب بجسم مضاد خاص بهجائن RNA-DNA.

تكثيف الحمض النووي وتنظيمه عن طريق الالتفاف الفائق

الالتواء الفائق.

بسبب تركيبته الحلزونية ، يصبح جزيء DNA مزدوج الشريطة مقيدًا طوبولوجيًا في شكل دائري مغلق تساهميًا مما يلغي دوران الأطراف الحرة [86]. يُطلق على عدد المرات التي يتقاطع فيها الخيطان مع بعضهما البعض في DNA مقيد طوبولوجيًا رقم الارتباط (Lk) ، وهو ما يعادل عدد المنعطفات أو الالتواءات الحلزونية في جزيء دائري (الشكل 4). يظل Lk الخاص بالحمض النووي الطوبولوجي ثابتًا ، بغض النظر عن كيفية تشوه جزيء الحمض النووي ، طالما لم يتم كسر أي من الخيطين.

أ. يصبح الحمض النووي الخطي مزدوج الشريطة جزيءًا طوبولوجيًا مقيدًا إذا تم ربط الطرفين تساهميًا ، مكونين دائرة. يتم شرح قواعد طوبولوجيا الحمض النووي باستخدام مثل هذا الجزيء (ccc-DNA) حيث تحدد المعلمة العددية التي تسمى رقم الربط (Lk) الهيكل. Lk هو مجموع رياضي من معلمتين هندسيتين ، تويست (Tw) والتلوي (Wr). الالتواء هو تقاطع خيطين ، والتلوي هو لف الحلزون المزدوج للحمض النووي على محوره الذي يتطلب الانحناء. Lk هو دائمًا عدد صحيح ويظل ثابتًا بغض النظر عن مدى تشوه الخيوط. لا يمكن تغييره إلا عن طريق إدخال كسر في أحد خيوط الحمض النووي أو كليهما بواسطة إنزيمات أيضية للحمض النووي تسمى توبويزوميراز. ب. تتجلى السلالة الالتوائية الناتجة عن تغيير Lk في الحمض النووي المريح والمقيد طوبولوجيًا في شكل الالتواء الفائق للحمض النووي. انخفاض في Lk (Lk & ltLk0) يؤدي إلى الالتفاف الفائق السلبي في حين أن الزيادة في Lk (Lk & gtLk0) يحث على الالتفاف الفائق الإيجابي. يتم هنا تصوير الالتفاف الفائق السلبي فقط. على سبيل المثال ، إذا تم إدخال قطع في ccc-DNA وتمت إزالة أربع لفات قبل إعادة الانضمام إلى الخيطين ، يصبح الحمض النووي ملفوفًا بشكل سلبي مع انخفاض في عدد التقلبات أو الالتواء أو كليهما. يمكن أن تتبنى Writhe نوعين من الهياكل الهندسية تسمى plectoneme و toroid. تتميز Plectonemes بتشابك اللولب المزدوج للحمض النووي والحلقة القمية ، في حين أن تصاعد اللولب المزدوج للحمض النووي حول المحور يشكل التوريدات.

يتم تعريف Lk للحمض النووي في الشكل المسترخى على أنه Lk0. لأي DNA ، Lk0 يمكن حسابها بقسمة الطول (في bp) للحمض النووي على عدد bp لكل منعطف حلزوني. هذا يساوي 10.4 نقطة أساس للحمض النووي المريح من النوع ب. أي انحراف عن Lk0 يسبب الالتفاف الفائق في الحمض النووي. انخفاض في رقم الربط (Lk & ltLk0) يخلق supercoiling سلبيًا (الشكل 4) بينما زيادة في رقم الربط (Lk & gtLk0) يخلق فائقًا إيجابيًا (انظر [87 ، 88] لمزيد من التفاصيل عن الالتفاف الفائق).

الحالة فائقة الالتواء (عندما لا تساوي Lk Lk0) ينتج عنه انتقال في بنية الحمض النووي يمكن أن يظهر كتغيير في عدد التقلبات (سالب & lt10.4 bp / turn ، موجب & gt10.4 bp لكل دورة) و / أو في تكوين التواءات ، تسمى supercoils (الشكل 4) ). وبالتالي ، يتم تعريف Lk رياضيًا على أنه مجموع يعتمد على علامة من المعلمتين الهندسيتين ، الالتواء والتلوي. المقياس الكمي للفائق الفائق المستقل عن حجم جزيئات الحمض النووي هو كثافة الالتفاف الفائقة () حيث σ = ΔLk / Lk0.

يمكن أن تتبنى التجاعيد هيكلين plectoneme و solenoid أو حلقي (الشكل 4). تنشأ بنية plectonemic من تشابك المحور الحلزوني (الشكل 4). تنشأ الملفات الفائقة الحلقية عندما يشكل الحمض النووي عدة حلزونات ، حول محور ولا يتقاطع مع بعضها البعض ، مثل تلك الموجودة في سلك الهاتف. تكون التواءات في شكل plectonemes هي اليمنى واليسرى في DNA فائق الالتفاف سلبًا أو إيجابيًا ، على التوالي. إن استخدام يد الفائق الحلقي هو عكس تلك الموجودة في plectonemes. يمكن أن يكون كل من plectonemes والفائق الحلقي الفائق إما في شكل حر أو مقيدة في شكل مرتبط بالبروتينات. أفضل مثال على الالتفاف الفائق الحلقي المربوط في علم الأحياء هو النواة حقيقية النواة التي يلتف فيها الحمض النووي حول الهستونات (الشكل 5) [12].

أ. ينظم الجينوم البكتيري على هيئة لفائف فائضة للبكتيريا. نصف الملفات الفائقة موجودة في شكل حر ، والبروتينات المرتبطة بالنوكليويد (NAPs) ، التي تظهر على شكل كرات ملونة ، تقيد النصف المتبقي. ب. على النقيض من ذلك ، فإن جينوم حقيقيات النوى ينظم على شكل لفائف فائقة حلقية ، يتم تحفيزها عن طريق التفاف الحمض النووي حول بروتينات هيستون (اللون البرتقالي). يُشار إلى ثماني من الهيستونات مع 146 من الحمض النووي الملفوف على أنه نيوكليوسوم ، وينتظم الجينوم في مجموعة متكررة من النيوكليوسومات.

ال ه. القولونية يتم تنظيم الجينوم على شكل لفائف فائضة للدم.

في معظم البكتيريا ، يوجد الحمض النووي في شكل ملفوف للغاية. الطبيعة الدائرية لـ ه. القولونية يجعله الكروموسوم جزيءًا طوبولوجيًا مقيَّدًا في الغالب سالبًا للغاية مع متوسط ​​كثافة الالتفاف الفائق المقدرة (σ) من -0.05 [89]. في الكروماتين حقيقيات النواة ، يوجد الحمض النووي بشكل أساسي في الشكل الحلقي الذي يتم تقييده وتحديده بواسطة الهستونات من خلال تكوين الجسيمات النووية. في المقابل ، في بكتريا قولونية نووي ، يتم تنظيم حوالي نصف الدنا الكروموسومي على شكل لفائف فائقة السرعة (الشكل 5) [90-92]. يتم تقييد الحمض النووي المتبقي إما في الشكل البكتوني أو الأشكال البديلة (انظر القسم 5.3.3) ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الشكل الحلقي ، عن طريق التفاعل مع البروتينات مثل NAPs. وبالتالي ، تمثل الملفات الفائقة للبكتونيّة التفافًا فائقًا فعّالًا لـ ه. القولونية الجينوم المسؤول عن تكثيفه وتنظيمه. يساعد كل من plectonemic and toroidal supercoiling في تكثيف الحمض النووي. من الجدير بالذكر أنه بسبب تفرع الهياكل البكتونية ، فإنه يوفر تكاثفًا أقل للحمض النووي مقارنة بالبنية الحلقية. جزيء الحمض النووي بنفس الحجم مع كثافات الالتفاف الفائقة المتساوية يكون أكثر إحكاما في شكل حلقي منه في شكل بلكتونيمي. بالإضافة إلى تكثيف الحمض النووي ، فإن الالتفاف الفائق يساعد في تنظيم الحمض النووي. إنه يشجع على فك تشابك الحمض النووي عن طريق تقليل احتمالية الإنجاب [93]. يساعد الالتواء الفائق أيضًا على تقريب موقعين بعيدين من الحمض النووي ، وبالتالي تعزيز التفاعل الوظيفي المحتمل بين أجزاء مختلفة من الحمض النووي.

مصادر supercoiling في ه. القولونية.

تساهم ثلاثة عوامل في توليد اللفائف الفائقة للحمض النووي الصبغي والحفاظ عليها بكتريا قولونية: (1) أنشطة topoisomerases ، (2) فعل النسخ ، و (3) NAPs.

توبويزوميراز.

تعتبر Topoisomerases فئة معينة من الإنزيمات الأيضية للحمض النووي التي تخلق أو تزيل الالتفاف الفائق عن طريق تكسير ثم إعادة ربط خيوط الحمض النووي [94]. ه. القولونية يمتلك أربعة إيزوميراز (الجدول 3). يقدم DNA gyrase الالتفاف الفائق السلبي في وجود ATP ويزيل الالتفاف الإيجابي في غياب ATP [95]. في جميع أشكال الحياة ، يعتبر DNA gyrase هو التوبويزوميراز الوحيد الذي يمكن أن يخلق التفافًا فائقًا سلبيًا ، وبسبب هذه القدرة الفريدة ، تمتلك الجينومات البكتيرية لفائف فائقة سالبة حرة ، يوجد DNA gyrase موجود في جميع البكتيريا ولكنه غائب من حقيقيات النوى الأعلى. في المقابل ، يعارض Topo I جريز الحمض النووي عن طريق إرخاء الحمض النووي فائق الالتفاف سلبيًا [96 ، 97]. هناك أدلة جينية تشير إلى أن التوازن بين الأنشطة المتعارضة لـ DNA gyrase و Topo I هي المسؤولة عن الحفاظ على مستوى الحالة المستقرة لمتوسط ​​superhelicity السلبي في ه. القولونية [98]. كلا الإنزيمين ضروريان ل ه. القولونية نجاة. سلالة فارغة من أعلى، الجين المشفر Topo I ، لا يعيش إلا بسبب وجود طفرات مثبطة في الجينات التي تشفر DNA gyrase. تؤدي هذه الطفرات إلى انخفاض نشاط الجيراز ، مما يشير إلى أن الالتفاف الفائق السلبي الزائد بسبب عدم وجود Topo I يتم تعويضه عن طريق تقليل نشاط الالتفاف الفائق السلبي لجريز الحمض النووي. يمكن الاستغناء عن Topo III في ه. القولونية وليس من المعروف أن له أي دور في الالتفاف الفائق في ه. القولونية [99]. تتمثل الوظيفة الأساسية لـ Topo IV في حل الكروموسومات الشقيقة. ومع ذلك ، فقد ثبت أنه يساهم أيضًا في مستوى الحالة المستقرة لللف الفائق السلبي عن طريق تخفيف الالتواء الفائق السلبي مع Topo I [100 ، 101].

النسخ.

جادل نموذج مجال الالتفاف المزدوج الذي اقترحه ليو ووانغ بأن فك اللولب المزدوج للحمض النووي أثناء النسخ يؤدي إلى الالتفاف الفائق في الحمض النووي كما هو موضح في الشكل 6 [102]. وفقًا لنموذجهم ، فإن نسخ بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNAP) المنزلق على طول الحمض النووي يجبر الحمض النووي على الدوران على محوره الحلزوني. قد ينشأ عائق في الدوران الحر للحمض النووي بسبب قيود طوبولوجية ، مما يتسبب في أن يصبح الحمض النووي الموجود أمام RNAP ملتويًا بشكل مفرط (ملفوف بشكل إيجابي) وسيصبح الحمض النووي الموجود خلف RNAP غير ملتوي (سلبًا فائق الالتواء) (الشكل 6) . لقد وجد أن القيد الطوبولوجي ليس ضروريًا لأن RNAP يولد عزمًا كافيًا يسبب الالتفاف الفائق حتى في قالب DNA الخطي [103]. إذا كان الحمض النووي ملفوفًا بشكل سلبي بالفعل ، فإن هذا الإجراء يؤدي إلى إرخاء اللفائف الفائقة السلبية الموجودة قبل التسبب في تراكم supercoils الإيجابية قبل RNAP ويقدم المزيد من الملفات الفائقة السلبية خلف RNAP. من حيث المبدأ ، يجب على DNA gyrase و Topo I إزالة الملفات الفائقة الإيجابية والسلبية الزائدة على التوالي ، ولكن إذا تجاوز معدل استطالة RNAP معدل دوران الإنزيمين ، فإن النسخ يساهم في مستوى الحالة المستقرة للفائق الفائق.

أ. مثال على الحمض النووي المقيّد طوبولوجيًا. يمثل الشريط الرمادي قيدًا طوبولوجيًا ، على سبيل المثال بروتين أو غشاء مرساة. ب. ينتج عن ملاءمة بوليميراز الحمض النووي الريبي لبدء النسخ فتح الحلزون المزدوج للحمض النووي. ج. لا يمكن لمركب بوليميريز الحمض النووي الريبي المطول أن يدور حول المحور الحلزوني للحمض النووي. لذلك ، فإن إزالة المنعطفات الحلزونية بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي تتسبب في إفراط في الحمض النووي المقيد طوبولوجيًا في الأمام وتلف الحمض النووي خلفه ، مما يؤدي إلى توليد الحمض النووي فائق الالتفاف إيجابيًا وسلبيًا ، على التوالي. يمكن أن يظهر الالتواء الفائق على أنه إما تغيير في عدد التقلبات كما هو موضح في C أو تلوي plectonemic كما هو موضح في د.

التحكم في الالتفاف الفائق بواسطة برامج العمل الوطنية.

في الكروماتين حقيقي النواة ، نادرًا ما يوجد الحمض النووي في شكل ملفوف حر لأن النيوكليوزومات تكبح كل الالتفاف السلبي تقريبًا من خلال الارتباط المحكم للحمض النووي بالهيستونات. وبالمثل ، في ه. القولونية، تعمل مجمعات البروتينات النووية التي تكونت بواسطة NAPs على تقييد نصف كثافة الالتواء الفائق للنيوكليويد [89 ، 92]. بعبارة أخرى ، إذا انفصل NAP عن مركب البروتين النووي ، فإن الحمض النووي سيتبنى الشكل الحر والبكتوني. ثبت بشكل تجريبي أن ارتباط الحمض النووي لكل من HU و Fis و H-NS يحد من الالتواء الفائق السلبي في DNA مرتخي ولكنه مقيد طوبولوجيًا [104-108]. يمكنهم القيام بذلك إما عن طريق تغيير الملعب الحلزوني للحمض النووي أو توليد التواءات حلقية عن طريق الانحناء والتفاف الحمض النووي (الشكل 2). بدلاً من ذلك ، يمكن أن ترتبط برامج العمل الوطنية بشكل تفضيلي بأشكال أخرى من الحمض النووي تحت الجرح وتثبيته مثل الهياكل الصليبية والضفائر المتفرعة. تم الإبلاغ عن Fis لتنظيم plectonemes المتفرعة من خلال ارتباطها بالمناطق المتقاطعة (الشكل 5) ويرتبط HU بشكل تفضيلي بالبنى الصليبية [108].

تنظم NAPs أيضًا الالتفاف الفائق للحمض النووي بشكل غير مباشر. يمكن لـ Fis تعديل الالتفاف الفائق عن طريق قمع نسخ الجينات المشفرة لـ DNA gyrase [109]. هناك أدلة جينية تشير إلى أن HU يتحكم في مستويات الالتواء الفائق عن طريق تحفيز DNA gyrase وتقليل نشاط Topo I [110 ، 111]. دعماً للدراسات الجينية ، ثبت أن جامعة هليوبوليس تحفز فصل الحمض النووي عن طريق تحفيز الجيروسكوب. في المختبر [112]. من غير الواضح ميكانيكيًا كيف تعدل HU أنشطة gyrase و Topo I. HU قد تتفاعل جسديًا مع DNA gyrase و Topo I أو أنشطة تنظيم DNA لـ HU مثل انحناء DNA قد تسهل أو تمنع عمل DNA gyrase و Topo I على التوالي.

يتم تنظيم الملفات الفائقة Plectonemic في مجالات طوبولوجية متعددة.

إحدى السمات اللافتة للنظر للنيوكليويد هي أن الملفات الفائقة البكتونية منظمة في مجالات طوبولوجية متعددة (الشكل 7) [113]. بعبارة أخرى ، سيؤدي القطع الفردي في مجال واحد فقط إلى استرخاء هذا المجال وليس المجالات الأخرى. يتكون المجال الطوبولوجي بسبب حاجز الانتشار الفائق. أفادت الدراسات المستقلة التي تستخدم طرقًا مختلفة أن المجالات الطوبولوجية متغيرة الحجم تتراوح من 10-400 كيلو بايت [91 ، 113 ، 114]. يبدو أن التنسيب العشوائي للحواجز التي لوحظت بشكل شائع في هذه الدراسات يفسر التباين الواسع في حجم المجالات.

أ. رسم توضيحي لمجال طوبولوجي واحد لحمض نووي فائق الالتفاف. سيكون القطع الفردي المزدوج الذي تقطعت به السبل في أي مكان كافيًا لتخفيف توتر الالتفاف الفائق للمجال بأكمله. ب. توضيح لمجالات طوبولوجية متعددة في جزيء DNA فائق الالتفاف. يفصل وجود حواجز فائقة الالتواء-الانتشار جزيء DNA فائق الالتفاف إلى مجالات طوبولوجية متعددة. يتم تمثيل حواجز الانتشار الفائقة الافتراضية على شكل كرات خضراء. نتيجة لذلك ، سيؤدي القطع الفردي المزدوج الذي تقطعت به السبل إلى إرخاء مجال طوبولوجي واحد فقط وليس المجالات الأخرى. اللفائف الفائقة Plectonemic من الحمض النووي داخل ه. القولونية يتم تنظيم النيوكليويد في عدة مجالات طوبولوجية ، ولكن يتم عرض أربعة مجالات فقط مع عدد مختلف من الملفات الفائقة من أجل البساطة.

على الرغم من أن هويات حواجز المجال لا تزال قيد الإنشاء ، فإن الآليات المحتملة المسؤولة عن تشكيل الحواجز تشمل: (1) يمكن أن يتشكل حاجز المجال عندما يرتبط البروتين الذي لديه القدرة على كبح اللفائف الفائقة في وقت واحد بموقعين متميزين على الكروموسوم يشكلان موقعًا طوبولوجيًا. حلقة أو مجال DNA معزول. لقد تم إثبات أن الحلقات التي يتوسطها البروتين في الحمض النووي فائق الالتفاف يمكن أن تخلق مجالًا طوبولوجيًا [115 ، 116]. تعد برامج العمل الوطنية مثل H-NS و Fis مرشحين محتملين ، بناءً على قدرات حلقات الحمض النووي الخاصة بهم وتوزيع مواقع الربط الخاصة بهم. (2) تظهر عناصر الفسيفساء البكتيرية المتناثرة (BIMEs) أيضًا كمرشحين محتملين لحواجز المجال. BIMEs هي متواليات متكررة متجانسة توجد عادة بين الجينات. لقد ثبت أن BIME يعيق انتشار الالتفاف الفائق في شريط طوبولوجي مصمم صناعيًا يتم إدخاله في ه. القولونية كروموسوم [117]. يوجد

600 BIMEs موزعة عبر الجينوم ، وربما تقسم الكروموسوم إلى 600 مجال طوبولوجي [118]. (3) يمكن أن تنجم الحواجز أيضًا عن ارتباط الحمض النووي بغشاء الخلية من خلال بروتين يرتبط بكل من الحمض النووي والغشاء أو من خلال النسخ الناشئ وترجمة البروتينات المثبتة بالغشاء (انظر القسم 5.2). (4) يمكن أن يولد نشاط النسخ حواجز فائقة الالتفاف.لقد ثبت أن النسخ الفعال لـ RNAP يمنع تبديد اللفائف الفائقة للدم ، وبالتالي تشكيل حاجز انتشار فائق الالتفاف [119-121].

التنظيم المكاني للنيوكليويد

مجالات التفاعل الكروموسومات.

في السنوات الأخيرة ، سمح ظهور طريقة جزيئية تسمى التقاط تشكل الكروموسوم (3C) بدراسة تنظيم مكاني عالي الدقة للكروموسومات في كل من البكتيريا وحقيقيات النوى [122]. تحدد 3C ونسختها المقترنة بالتسلسل العميق (Hi-C) [123] القرب المادي ، إن وجد ، بين أي موقعين جينومين في الفضاء ثلاثي الأبعاد (الشكل 8 أ و 8 ب). خريطة اتصال عالية الدقة للكروموسومات البكتيرية بما في ذلك ه. القولونية كشف الكروموسوم أن الكروموسوم البكتيري مجزأ إلى العديد من المناطق شديدة التفاعل الذاتي تسمى مجالات التفاعل الكروموسومي (CIDs) (الشكل 8 ب) [124–126]. تعادل CIDs المجالات المرتبطة طوبولوجيًا (TADs) التي لوحظت في العديد من الكروموسومات حقيقية النواة [127] ، مما يشير إلى أن تكوين CIDs هو ظاهرة عامة لتنظيم الجينوم. هناك سمتان تحددان CIDs أو TADs. أولاً ، تتفاعل المناطق الجينومية في CID جسديًا مع بعضها البعض بشكل متكرر أكثر من المناطق الجينومية خارج CID أو مع تلك الموجودة في CID المجاور. ثانيًا ، وجود حد بين CIDs يمنع التفاعلات الفيزيائية بين المناطق الجينومية لاثنين من CIDs المتجاورتين.

أ. تستكشف طرق التقاط التشكل الكروموسومي (3C) تنظيم الجينوم ثلاثي الأبعاد عن طريق تحديد التفاعلات الفيزيائية بين المواقع الجينومية القريبة في الفضاء ثلاثي الأبعاد ولكنها قد تكون بعيدة في الجينوم الخطي. يرتبط الجينوم مع الفورمالديهايد للحفاظ على الاتصالات المادية بين المواقع الجينومية. بعد ذلك ، يتم هضم الجينوم باستخدام إنزيم تقييد. في الخطوة التالية ، يتم إجراء ربط الحمض النووي تحت تركيزات الحمض النووي المخففة لتفضيل الارتباط الجزيئي (بين الأجزاء المتشابكة التي يتم إحضارها إلى القرب المادي من خلال تنظيم الجينوم ثلاثي الأبعاد). يعكس تكرار أحداث الربط بين مواقع الحمض النووي البعيدة تفاعلًا ماديًا. في طريقة 3C ، يتم الكشف عن تقاطعات الربط عن طريق تضخيم PCR شبه الكمي حيث تكون كفاءة التضخيم تقديرًا تقريبيًا للتلامس المادي الزوجي بين المناطق الجينومية ذات الاهتمام وترددها. تقوم طريقة 3C بالتحقيق في تفاعل مادي بين منطقتين محددتين تم تحديدهما مسبقًا ، بينما تكتشف نسخة Hi-C التفاعلات الفيزيائية بين جميع الأزواج الممكنة من المناطق الجينومية في وقت واحد. في طريقة Hi-C ، تمتلئ النهايات المهضومة بمحول حيوي قبل الربط. يتم تقطيع الشظايا المترابطة ثم إثرائها عن طريق سحب البيوتين. ثم يتم الكشف عن تقاطعات الربط وتحديد كميتها بواسطة طرق تسلسل الجيل التالي من الطرف المزدوج. ب. عادةً ما يتم تمثيل بيانات Hi-C في شكل مصفوفة ثنائية الأبعاد يمثل فيها المحور x والمحور y إحداثيات الجينوم. ينقسم الجينوم عادة إلى صناديق ذات حجم ثابت ، على سبيل المثال ، 5 كيلو بايت. يحدد حجم الصناديق بشكل أساسي دقة الاتصال. كل إدخال في المصفوفة ، ماي جاي، يمثل عدد قراءات التسلسل الوهمي المعينة للمواقع الجينية في الصناديق i و j. يشير التقدير الكمي للقراءات (ممثلة بخريطة حرارية) إلى التردد النسبي للاتصالات بين المواقع الجينية للصناديق i و j. السمة البارزة لخريطة الحرارة هي خط قطري يظهر بسبب تفاعل مادي متكرر بين المواقع القريبة جدًا من بعضها البعض في الجينوم الخطي. تمثل الشدة عندما نبتعد عن هذا الخط القطري التردد النسبي للتفاعل المادي بين المواقع البعيدة عن بعضها البعض في الجينوم الخطي. تمثل المثلثات عالية الكثافة على طول الخط القطري مجالات تفاعل كروموسومية شديدة التفاعل الذاتي (CIDs) مفصولة بمنطقة حدية تتكون من عدد أقل من التفاعلات. ج. في العديد من الأنواع البكتيرية بما في ذلك ه. القولونية، يبدو أن المجالات الطوبولوجية فائقة الالتفاف تُنظم على أنها CIDs. يعزز اللفائف الفائقة Plectonemic مستوى عالٍ من التفاعل بين المواقع الجينومية داخل CID ، والمنطقة الخالية من plectoneme (PFR) ، التي تم إنشاؤها بسبب نشاط النسخ العالي ، تعمل كحدود CID. تعمل البروتينات المرتبطة بالنيوكليويد ، التي تم تصويرها على أنها دوائر مغلقة ، على استقرار التفاعلات فائقة الالتواء. إن بوليميراز الحمض النووي الريبي الناسخ (الذي تم تصويره على أنه كرة خضراء) في PFR يمنع تبديد الالتفاف الفائق بين المجالين وبالتالي يعمل كحاجز انتشار فائق الالتفاف. يتراوح حجم CIDs بين 30-400 كيلو بايت. تندمج عدة مثلثات (CIDs) لتشكل مثلثًا أكبر يمثل نطاقًا كبيرًا. بعبارة أخرى ، تتفاعل CIDs لنطاق كبير ماديًا مع بعضها البعض بشكل متكرر أكثر من مع CIDs لنطاق كبير مجاور أو مع مواضع جينومية خارج ذلك النطاق الكبير. قد يشتمل النطاق الكبير على العديد من CIDs. للتبسيط ، يتم عرض نطاق كبير يتألف من اثنين فقط من CIDs.

ال ه. القولونية تم العثور على أن الكروموسوم يتكون من 31 CIDs في مرحلة النمو [124]. تراوح حجم CIDs من 40 إلى

300 كيلو بايت. يبدو أن حاجز الانتشار الفائق المسؤول عن فصل حلقات الحمض النووي الوبائي في المجالات الطوبولوجية يعمل كحدود CID في ه. القولونية والعديد من البكتيريا الأخرى. بعبارة أخرى ، فإن وجود حاجز فائق الانتشار يحدد تكوين CIDs. النتائج من فحص Hi-C للكروموسومات في ه. القولونية [124], Caulobacter الهلال [125] و العصوية الرقيقة [126] تتقارب في نموذج تتشكله CIDs لأن حلقات البكتونيميك جنبًا إلى جنب مع أنشطة تنظيم الحمض النووي لبرامج العمل الوطنية تعزز التفاعلات الفيزيائية بين المواقع الجينومية ، وتتكون حدود CID من منطقة خالية من plectoneme (PFR) تمنع هذه التفاعلات (الشكل 8C). يتم إنشاء PFR بسبب نشاط النسخ العالي لأن الفك الحلزوني للحمض النووي عن طريق النسخ الفعال لـ RNAP يقيد اللفائف الفائقة للدم. نتيجة لذلك ، يتم أيضًا حظر تبديد الملف الفائق ، مما يؤدي إلى إنشاء حاجز فائق الانتشار. يأتي الدليل غير المباشر لهذا النموذج من ملاحظة أن CIDs من الكروموسومات البكتيرية بما في ذلك ه. القولونية يعرض الكروموسوم جينات مكتوبة بشكل كبير عند حدودها ، مما يشير إلى دور النسخ في تشكيل حدود CID [124 ، 125]. جاء المزيد من الأدلة المباشرة من اكتشاف أن وضع الجين المنسوخ بدرجة عالية في موضع لا توجد فيه حدود قد خلق حدود CID جديدة في ج. الهلال كروموسوم [125]. ومع ذلك ، لا ترتبط جميع حدود CID بالجينات المنسوخة بدرجة عالية في ه. القولونية يشير الكروموسوم إلى أن العوامل الأخرى غير المعروفة مسؤولة أيضًا عن تكوين حدود CID وحواجز الانتشار فائقة الالتواء.

Macrodomains.

حلقات DNA Plectonemic المنظمة على شكل مجالات طوبولوجية أو CIDs يبدو أنها تتحد بشكل أكبر لتشكل نطاقات كبيرة مميزة مكانيًا تسمى macrodomains [128 ، 129]. في ه. القولونية، تم تحديد النطاقات الكبيرة في البداية على أنها أجزاء كبيرة من الجينوم التي توضع فيها علامات الحمض النووي معًا (موضعية مشتركة) في دراسات التهجين في الموقع (FISH). منطقة جينومية كبيرة (

1-ميجا بايت) تغطية oriC (أصل النسخ المتماثل للكروموسوم) تم ترجمة الموقع بشكل مشترك وكان يسمى Ori macrodomain. وبالمثل ، فإن منطقة جينومية كبيرة (

1-ميغا بايت) تغطي منطقة نهاية النسخ المتماثل (ثالثا) شارك في الترجمة وكان يسمى Ter macrodomain. تم تحديد النطاقات الكبيرة في وقت لاحق بناءً على معدل تكرار أزواج لامدا Att المواقع التي تم إدخالها في مواقع بعيدة مختلفة في الكروموسوم المعاد تجميعها مع بعضها البعض. في هذه الطريقة القائمة على إعادة التركيب ، تم تعريف النطاق الكبير على أنه منطقة جينومية كبيرة يمكن أن تتحد مواقع الحمض النووي الخاصة بها بشكل أساسي مع بعضها البعض ، ولكن ليس مع خارج ذلك النطاق الكبير. أكدت الطريقة القائمة على إعادة التركيب المجالات الكبرى Ori و Ter التي تم تحديدها في دراسات FISH وحددت اثنين من المجالات الكبيرة الإضافية [7 ، 130].

تم تشكيل النطاقين الماكروين الإضافيين بواسطة النطاق الإضافي

مناطق 1-ميغابايت المحيطة بـ Ter ويشار إليها باسم اليسار واليمين. تضمنت هذه المجالات الأربعة الكبرى (أوري ، تير ، يسار ، ويمين) معظم الجينوم ، باستثناء منطقتين جينوميتين تحيطان بالأوري (الشكل 1). كانت هاتان المنطقتان (NS-L و NS-R) أكثر مرونة وغير منظمة مقارنة بالنطاق الكبير حيث تم إعادة تجميع مواقع الحمض النووي فيهما مع مواقع الحمض النووي الموجودة في المجالات الكبيرة على كلا الجانبين. الموقف الجيني oriC يبدو أنه يملي تشكيل النطاقات الكبيرة ، لأن تغيير موضع oriC عن طريق التلاعب الجيني يؤدي إلى إعادة تنظيم المجالات الكبيرة. على سبيل المثال ، المناطق الجينومية الأقرب إلى oriC دائمًا ما تتصرف مثل NS بغض النظر عن تسلسل الحمض النووي والمناطق البعيدة تتصرف مثل النطاقات الكبيرة [131].

أكدت تقنية Hi-C كذلك على التنظيم المكاني الهرمي لـ CIDs في شكل نطاقات كبيرة [124]. بعبارة أخرى ، تفاعلت CIDs لنطاق كبير جسديًا مع بعضها البعض بشكل متكرر أكثر من تفاعلها مع CIDs لنطاق كبير مجاور أو مع مواضع جينومية خارج ذلك النطاق الكبير (الشكل 8 ب و 8 ج). أظهرت بيانات Hi-C أن ملف ه. القولونية كان الكروموسوم ينقسم إلى مجالين مختلفين. المنطقة المحيطة ثالثا شكلت مجالًا معزولًا يتداخل مع نطاق Ter macrodomain المحدد مسبقًا. حدثت اتصالات DNA-DNA في هذا المجال فقط في نطاق يصل إلى

280 كيلو بايت. شكلت بقية الكروموسوم مجالًا واحدًا أظهر مواضعه الجينومية جهات اتصال في نطاق & gt280-kb. بينما تم تقييد معظم جهات الاتصال في هذا المجال بمسافة قصوى تبلغ

500 كيلو بايت ، كانت هناك منطقتان مفكوكتان شكلت مواضعهما الجينية جهات اتصال على مسافات أكبر (حتى

1 ميغا بايت). تتوافق هذه المناطق الفضفاضة مع المناطق المرنة والأقل تنظيماً المحددة سابقاً (NS). تشمل حدود المجال المعزول ثالثا وقسمت المنطقتان الفضفاضتان اللتان تم تحديدهما بواسطة طريقة Hi-C الكروموسوم بأكمله إلى ست مناطق تتوافق مع المجالات الأربعة الكبيرة ومنطقتين NS المحددتين بواسطة المقايسات القائمة على إعادة التركيب. وبالتالي ، كان النهجان متفقين جيدًا مع بعضهما البعض.

البروتينات التي تحرك تكوين المجال الكلي

أدى البحث عن البروتين (البروتينات) المسؤولة عن تكوين المجال الكبير إلى تحديد بروتين Macrodomain Ter (MatP) [27]. يرتبط MatP بشكل حصري تقريبًا في Ter macrodomain من خلال التعرف على شكل 13 bp يسمى macrodomain ثالثا تسلسل (ماتس) (الجدول 2). يوجد 23 ماتس المواقع الموجودة في Ter macrodomain ، يوجد في المتوسط ​​موقع واحد كل 35 كيلوبايت. مزيد من الأدلة على ارتباط MatP في Ter macrodomain يأتي من التصوير الفلوري لـ MatP. لوحظت بؤر منفصلة MatP متوضعة بشكل مشترك مع علامات الحمض النووي Ter macrodomain [27]. كما أن الإثراء القوي لإشارة ChIP-Seq في Ter macrodomain يؤكد أيضًا الارتباط التفضيلي لـ MatP بهذا المجال الكبير (الشكل 9).

تخطيط دائري لملف ه. القولونية الجينوم الذي يصور الإشغال على مستوى الجينوم لـ MatP و MukB في ه. القولونية. الدائرة الأعمق تصور ه. القولونية الجينوم. يشار إلى مناطق الجينوم التي تنظم كمجالات مكانية (نطاقات كبيرة) في النواة على أنها نطاقات ملونة. يتم رسم شغل الجينوم لكل بروتين ، الذي تم تحديده بواسطة ChIP-Seq ، كرسم بياني في الدوائر الخارجية (حجم الحاوية 300 نقطة أساس) حيث يشير ارتفاع الشريط إلى إثراء الارتباط النسبي. تم تحضير الرقم في السيرك / 0.69-6 باستخدام بيانات ChIP-Seq المعالجة من [132].

يكثف MatP الحمض النووي في Ter macrodomain لأن عدم وجود MatP زاد من المسافة بين اثنين من علامات DNA الفلورية الموجودة على مسافة 100 كيلو بايت في Ter macrodomain. علاوة على ذلك ، يعد MatP لاعبًا مهمًا في عزل Ter macrodomain عن باقي الكروموسوم [124]. إنه يعزز اتصالات الحمض النووي والحمض النووي داخل نطاق Ter macrodomain ولكنه يمنع الاتصالات بين مواقع DNA لمجال Ter وتلك الخاصة بالمناطق المحيطة. كيف يقوم MatP بتكثيف الحمض النووي وتعزيز اتصالات الحمض النووي والحمض النووي؟ النتائج التجريبية متضاربة. يمكن أن تشكل MatP حلقة DNA بين اثنين ماتس المواقع في المختبر ونشاط حلقات الحمض النووي الخاص بها يعتمد على tetramerization MatP. تحدث عملية Tetramerization من خلال تفاعلات الملف اللولبي بين جزيئي MatP المرتبطين بالحمض النووي [133]. أحد النماذج الواضحة التي تستند إلى النتائج المختبرية هو أن MatP يعزز اتصالات الحمض النووي والحمض النووي في الجسم الحي عن طريق التجسير ماتس المواقع (الشكل 10 أ). ومع ذلك ، على الرغم من أن MatP متصلة بالمواقع البعيدة في دراسات Hi-C ، إلا أنها لم تربط على وجه التحديد ماتس المواقع [124]. علاوة على ذلك ، فإن متحولة MatP التي لم تكن قادرة على تكوين tetramers تتصرف مثل النوع البري. هذه النتائج تجادل ضد ماتس نموذج تجسير لمنظمة Ter ، مما يترك آلية عمل MatP بعيدة المنال. أحد الاحتمالات هو أن MatP ينتشر إلى أجزاء الحمض النووي القريبة من أوله ماتس موقع الربط والجسر بين المواقع البعيدة عبر آلية لا تعتمد على tetramerization.

أ. أ ماتس- نموذج تهجين لتنظيم DNA في Ter macrodomain بواسطة MatP. يتعرف MatP على تسلسل DNA بتوقيع 13 نقطة أساس يسمى ماتس الموجودة حصريًا في Ter macrodomain. يوجد 23 ماتس مواقع مفصولة ببعضها البعض بمتوسط ​​35 كيلو بايت. MatP يربط إلى ملف ماتس الموقع باعتباره ديمر ، و tetramerization للجسور الثنائيات المرتبطة بالحمض النووي ماتس المواقع التي تشكل حلقات DNA كبيرة. ب. الهندسة المعمارية ه. القولونية مجمع MukBEF. يتكون المركب من تفاعلات البروتين البروتين بين MukB (أزرق) و MukF (برتقالي غامق) و MukE (برتقالي فاتح). MukB ، الذي ينتمي إلى عائلة الصيانة الهيكلية لبروتينات الكروموسومات (SMCs) ، يشكل ثنائيات (تظهر المونومرات بألوان زرقاء داكنة وفاتحة) يتكون من مجال رأس ATPase و 100 نانومتر ملف ملف داخل جزيئي طويل مع منطقة مفصلية في المنتصف. نظرًا لمرونة منطقة المفصلة ، تتبنى MukB شكل V مميزًا لعائلة SMC. يميل MukF أيضًا إلى الوجود كثنائي بسبب التقارب القوي بين المونومرات [134 ، 135]. يمكن أن يتفاعل المجال الطرفي C لـ MukF مع المجال الرئيسي لـ MukB بينما يمكن أن يتفاعل مجالها المركزي مع MukE. يرتبط جزيئين من MukE وجزيء واحد من MukF ببعضهما البعض بشكل مستقل عن MukB لتشكيل مركب ثلاثي (MukE)2F). نظرًا لأن MukF يميل إلى الوجود في شكل خافت ، ينتج عن تناقص MukF مجمع سداسي أمريكي ممدود (MukE2F)2 [134]. في غياب ATP ، فإن (MukE2F)2 يرتبط المركب بمجالات MukB الرئيسية من خلال المجال C-terminal الخاص بـ MukF لتشكيل مجمع MukBEF متماثل (كما هو موضح على اليسار). قياس العناصر المتكافئة للمجمع المتماثل هو ب2(هـ2F)2. يفرض ارتباط ATP بين مجالات رأس MukB فصل جزيء MukF واحد وجزيئين MukE [134 ، 136]. نتيجة لذلك ، فإن مجمع MukBEF غير المتماثل للقياس المتكافئ ب2(هـ2F)1 لقد تكون. نظرًا لأن MukF يتضاءل بسهولة ، يمكن أن ينضم ثنائي MukF المحتمل إلى جزيئين غير متماثلين مرتبطين بـ ATP مما يؤدي إلى تكوين ثنائيات ثنائية مع قياس العناصر المتكافئة لـ B4(هـ2F)2 (يظهر على اليمين). يُقدر قياس العناصر المتكافئة لمركب MukBEF في الجسم الحي بـ B.4(هـ2F)2 مما يشير إلى أن ثنائيات الثنائيات هي الوحدة الوظيفية في الجسم الحي [137]. ج. نموذج لحلقة البثق بواسطة ثنائيات MukBEF من الثنائيات. ثنائى أحمال ديمر على الحمض النووي (يُصوَّر على أنه خط رمادي) من خلال مجالات ربط الحمض النووي في MukB. لقد ثبت أن MukB يربط الحمض النووي عبر منطقة المفصل والمنطقة العليا من مجال رأسه [134 ، 138]. يؤدي نقل المجمع بعيدًا عن موقع التحميل الخاص به إلى بثق حلقات DNA. يتم بثق الحلقات بطريقة تسلق الصخور عن طريق الفتح والإغلاق المنسقين لحلقة MukBEF من خلال فك ارتباط رأس MukB الذي يحدث بسبب التحلل المائي المنسق لـ ATP في الثنائيين [137]. تمثل الدوائر الزرقاء الداكنة والأزرق الفاتح أحداث ارتباط ATP والتحلل المائي على التوالي. لا يظهر MukE في المجمع من أجل البساطة.

MukBEF.

ينتمي MukB إلى عائلة ATPases تسمى الصيانة الهيكلية لبروتينات الكروموسوم (SMCs) ، والتي تشارك في تنظيم كروموسوم عالي الترتيب في حقيقيات النوى [139]. يرتبط اثنان من مونومرات MukB عبر تفاعل ملفي ملفوف مضاد للتوازي المستمر مكونًا قضيبًا صلبًا بطول 100 نانومتر. توجد منطقة مفصلة مرنة في منتصف القضيب [140 ، 141]. نظرًا لمرونة منطقة المفصلة ، تتبنى MukB شكل V مميزًا لعائلة SMC (الشكل 10 ب). الوحدات الفرعية غير SMC المرتبطة بـ MukB هي MukE و MukF. تغلق الرابطة تشكيل V ، مما ينتج عنه هياكل كبيرة تشبه الحلقة (الشكل 10 ب). يتم ترميز MukE و MukF مع MukB في نفس المشغل في ه. القولونية [142]. ينتج عن حذف أي من الوحدتين الفرعيتين نفس النمط الظاهري مما يوحي بأن مركب MukBEF هو الوحدة الوظيفية في الجسم الحي [١٣٧]. توجد أنشطة ربط الحمض النووي للمجمع في الوحدة الفرعية MukB ، بينما يعدل MukE و MukF نشاط MukB.

مجمع MukBEF ، جنبًا إلى جنب مع Topo IV ، مطلوب لفك التشابك وإعادة وضع النسخ المتماثل حديثًا oriCs [132، 143–146] لم يتم تقييد دور MukBEF أثناء تكرار الحمض النووي [147]. ينظم ويكثف الحمض النووي حتى في الخلايا غير المتكاثرة. خريطة تشكّل الكروموسوم عالية الدقة الحديثة لخريطة MukB المستنفدة ه. القولونية يكشف السلالة أن MukB يشارك في تكوين تفاعلات DNA-DNA على الكروموسوم بأكمله ، باستثناء النطاق Ter macrodomain [124]. كيف يتم منع MukB من التصرف في Ter macrodomain؟ يتفاعل MatP جسديًا مع MukB ، وبالتالي منع MukB من التوطين في Ter macrodomain [132]. يتضح هذا في ارتباط الحمض النووي لـ MatP و MukB في Ter macrodomain. يتم إثراء ارتباط MatP DNA في Ter macrodomain ، في حين يتم تقليل ارتباط MukB DNA مقارنة ببقية الجينوم (الشكل 9). علاوة على ذلك ، في سلالة تفتقر بالفعل إلى MatP ، يؤدي عدم وجود MukB إلى انخفاض اتصالات الحمض النووي في جميع أنحاء الكروموسوم ، بما في ذلك Ter macrodomain [124]. تتفق هذه النتيجة مع الرأي القائل بأن MatP يزيح MukB من مجال Ter.

كيف تعمل الدالة المعقدة MukBEF على تنظيم ه. القولونية كروموسوم؟ وفقًا لوجهة النظر الحالية ، تنظم مجمعات SMC الكروموسومات عن طريق بثق حلقات DNA [148]. تنتقل مجمعات SMC على طول الحمض النووي لبثق الحلقات بطريقة رابطة الدول المستقلة (على نفس جزيء الحمض النووي) ، حيث يعتمد حجم الحلقات على عملية المجمع. تختلف مجمعات SMC من الكائنات الحية المختلفة في آلية بثق الحلقة [148]. الفحص المجهري لجزيء واحد من MukBEF في ه. القولونية يشير إلى أن الحد الأدنى للوحدة الوظيفية في الجسم الحي هو ثنائى الثنائيات (الشكل 10 ب) [137]. تتكون هذه الوحدة من خلال الانضمام إلى مجمعين MukBEF مرتبطين بـ ATP من خلال dimerization بوساطة MukF. يتم ترجمة MukBEF في الخلية ككتل من 1 إلى 3 ممدودة بالتوازي مع المحور الطويل للخلية. كل مجموعة تحتوي على متوسط

8-10 ديمر ديمر. وفقًا للنموذج الحالي ، يبث MukBEF حلقات DNA بطريقة "تسلق الصخور" (الشكل 10 ج) [137 ، 149]. يطلق ثنائيات الثنائيات جزءًا واحدًا من الحمض النووي ويلتقط جزءًا جديدًا من الحمض النووي دون الانفصال عن الكروموسوم.إلى جانب حلقات الحمض النووي ، فإن الارتباط بين الالتفاف الفائق السلبي ووظيفة MukBEF في الجسم الحي جنبًا إلى جنب مع قدرة الوحدة الفرعية MukB لتقييد الفائق السالبة في المختبر يشير إلى أن MukBEF ينظم الحمض النووي عن طريق توليد لفائف فائقة [150-152]. يتطلب الفهم الكامل للآلية الجزيئية لعمل MukBEF في الجسم الحي مزيدًا من التحقيقات.

التنظيم المكاني للنيوكليويد بواسطة NAPs و naRNAs.

بالإضافة إلى المساهمة في انضغاط الكروموسوم عن طريق الانحناء والجسور وحلقات الحمض النووي على نطاق أصغر (

1-kb) ، تشارك NAPs في تكثيف الحمض النووي وتنظيمه من خلال تعزيز اتصالات الحمض النووي DNA طويلة المدى. برز اثنان من NAPs ، Fis و HU ، كلاعبين رئيسيين في تعزيز اتصالات الحمض النووي طويلة المدى التي تحدث في جميع أنحاء الكروموسوم [124]. يبقى أن ندرس كيف أن أنشطة تنظيم الحمض النووي في Fis و HU مفهومة جيدًا على نطاق أصغر (

1-kb) ينتج عنه تكوين تفاعلات طويلة المدى بين الحمض النووي والحمض النووي. ومع ذلك ، تتطلب بعض تفاعلات الحمض النووي بوساطة HU وجود naRNA4 [84]. يشارك naRNA4 أيضًا في إجراء اتصالات DNA طويلة المدى. يحفز HU بعض جهات الاتصال ، وليس كلها ، مما يشير إلى أن RNA يشارك مع NAPs الأخرى في تكوين اتصالات DNA. يبدو أيضًا أن HU يعمل جنبًا إلى جنب مع MukB لتعزيز تفاعلات الحمض النووي والحمض النووي بعيدة المدى. يعتمد هذا الرأي على الملاحظات التي تفيد بأن غياب HU أو MukB تسبب في انخفاض اتصالات الحمض النووي والحمض النووي [124]. من غير الواضح كيف يعمل MukB و HU معًا في تعزيز تفاعلات الحمض النووي والحمض النووي. قد يتفاعل البروتينان جسديًا. بدلاً من ذلك ، بينما يقوم MukBEF ببثق حلقات DNA كبيرة ، يقوم HU بتكثيف تلك الحلقات وتنظيمها بواسطة الآليات الموضحة في القسم 2.1.1.

التنظيم المكاني للنيوكليويد من خلال الارتباط الوظيفي للجينات.

هناك تقارير تفيد بأن الجينات ذات الصلة وظيفيًا لـ ه. القولونية معًا جسديًا في مساحة ثلاثية الأبعاد داخل الكروموسوم على الرغم من أنهما بعيدان عن بعضهما البعض بالمسافة الجينية. لا يؤدي القرب المكاني للجينات المرتبطة وظيفيًا إلى جعل الوظائف البيولوجية أكثر تجزئة وكفاءة فحسب ، بل يساهم أيضًا في التنظيم القابل للطي والمكاني للنيوكليويد. فحصت دراسة حديثة باستخدام علامات الفلورسنت للكشف عن مواقع الحمض النووي المحددة المسافات المادية الزوجية بين عوامل الرنا الريباسي السبعة المنفصلة وراثيًا عن بعضها البعض (بما يصل إلى مليوني نقطة أساس). ذكرت أن جميع الأوبرا ، باستثناء rrnC ، كانت على مقربة جسدية [153 ، 154]. والمثير للدهشة أن دراسات 3C-seq لم تكشف عن التجمعات المادية لـ rrn Operons [124] ، يتعارض مع نتائج الدراسة المستندة إلى التألق. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق لحل هذه الملاحظات المتناقضة. في مثال آخر ، يشكل GalR شبكة تفاعل لمواقع ربط GalR المنتشرة عبر الكروموسوم [155]. GalR هو منظم نسخي لتنظيم الجالاكتوز يتكون من جينات ترميز الإنزيمات للنقل والتمثيل الغذائي للسكر D-galactose [156]. يوجد معدل النمو في البؤرة (GalR) في بؤرتين فقط في الخلايا [155] ويمكن أن يتجمع ذاتيًا في هياكل مرتبة كبيرة [157]. لذلك ، يبدو أن GalR المرتبط بالحمض النووي يتكاثر لتشكيل تفاعلات بعيدة المدى.

الشكل العام والهيكل النووى

النواة عبارة عن شكل بيضاوي حلزوني ، محصور شعاعيًا في الخلية.

المجهر الإلكتروني التقليدي للإرسال (TEM) للثابت كيميائياً ه. القولونية صورت الخلايا النواة على أنها عضية غير منتظمة الشكل. ومع ذلك ، كشف التصوير الفلوري واسع المجال للنيوكلييدات الحية ثلاثية الأبعاد عن شكل إهليلجي منفصل (الشكل 11) [4 ، 8-10]. أظهر تراكب صورة تباين الطور للخلية والصورة الفلورية للنيوكليويد تجاورًا قريبًا فقط في البعد الشعاعي بطولها الكامل من النواة إلى محيط الخلية. يشير هذا الاكتشاف إلى الحبس الشعاعي للنيوكليويد [8]. كشف الفحص التفصيلي للصورة الفلورية ثلاثية الأبعاد بعد المقطع العرضي المتعامد على محورها الطويل عن سمتين عالميتين للنواة: الانحناء والمناطق الطولية عالية الكثافة. أظهر فحص تماثل الخط المركزي للنيوكليويد عن طريق توصيل مركز كثافة كل مقطع عرضي أن الشكل النووي الكلي منحني (الشكل 11 أ) [158]. كشف توزيع شدة التألق في المقاطع العرضية عن بنية أساسية كثيفة ، تتكون من مناطق أو حزم منحنية عالية الكثافة في القلب المركزي ، ومناطق منخفضة الكثافة في الأطراف (الشكل 11 ب) [8 ، 9]. أحد الآثار المترتبة على الحبس الشعاعي هو أنه يحدد الشكل المنحني للنيوكليويد. وفقًا لأحد النماذج ، يُجبر النواة على الانحناء لأنها محصورة في أسطواني ه. القولونية خلية نصف قطرها أصغر من طولها القابل للانحناء (طول الثبات) [8]. تم دعم هذا النموذج من خلال الملاحظات التي تفيد بأن إزالة جدار الخلية أو تثبيط تخليق جدار الخلية أدى إلى زيادة نصف قطر الخلية مما أدى إلى زيادة مصاحبة في نصف القطر الحلزوني وانخفاض في الملعب الحلزوني في النواة [8].

أ. رسم كاريكاتوري لـ ه. القولونية خلية ذات نواة منحنية (رمادي غامق). يؤكد مسار النقط الوسطى المنحني ، الذي يُشار إليه بخط أسود ، على الشكل المنحني للنيوكليويد. الرسوم الكاريكاتورية مبنية على شكل في [8]. ب. المقطع العرضي لل ه. القولونية nucleoid تصورها HU-mCherry. تؤخذ شدة التألق كبديل لكثافة الحمض النووي ويتم تمثيلها باللون الأزرق إلى الأحمر بترتيب متزايد. البيانات مأخوذة من [9].

اتصالات بين النوكليويد وغشاء الخلية.

يبدو أن قوة التمدد الناتجة عن الروابط بين الحمض النووي داخل الغشاء النووي والخلوي (وصلات غشاء الحمض النووي) تعمل في مواجهة قوى التكثيف للحفاظ على مستوى التكثيف الأمثل للنواة. أشارت دراسات تجزئة الخلايا والمجهر الإلكتروني أولاً إلى إمكانية وصلات غشاء الحمض النووي [159 ، 160]. يوجد الآن العديد من الأمثلة المعروفة لوصلات غشاء الحمض النووي. التحويل عبارة عن آلية للنسخ المتزامن والترجمة وإدخال بروتينات الغشاء الوليدة التي تشكل اتصالات غشاء DNA عابرة [161]. تم إثبات أن انتقال اثنين من بروتينات الغشاء ، LacY و TetA ، يتسببان في تغيير موضع موضع الكروموسومات نحو الغشاء [162]. آلية أخرى لتوصيلات الغشاء النووي هي من خلال الاتصال المباشر بين منظمات النسخ المثبتة بالغشاء والمواقع المستهدفة في الكروموسوم. مثال واحد على مثل منظم النسخ في ه. القولونية هو CadC. يحتوي CadC على مجال حسي محيطي ومجال ربط الحمض النووي السيتوبلازمي. إن استشعار البيئة الحمضية من خلال المجال الحسي المحيط بها يحفز نشاط ربط الحمض النووي لـ CadC ، والذي ينشط بعد ذلك نسخ الجينات المستهدفة [163]. لم يتم بعد إثبات توطين الغشاء للجينات التي ينظمها منظم النسخ الغشائي. ومع ذلك ، من المتوقع أن يؤدي تنشيط الجينات المستهدفة في الكروموسوم بواسطة هذه المنظمات إلى اتصال غشاء نووي وإن كان سيكون اتصالًا ديناميكيًا. إلى جانب هذه الأمثلة ، يرتبط الكروموسوم أيضًا بشكل خاص بغشاء الخلية من خلال تفاعل البروتين البروتين بين البروتينات المرتبطة بالحمض النووي ، على سبيل المثال ، SlmA و MatP ، والقسمة [164 ، 165].

نظرًا لتوزيع جينات ترميز البروتين الغشائي في جميع أنحاء الجينوم ، يمكن أن تعمل اتصالات غشاء الحمض النووي الديناميكي من خلال التحويل كقوة توسع نوكليويد. ستعمل قوة التمدد هذه في مواجهة قوى التكثيف للحفاظ على مستوى التكثيف الأمثل. تكوين النيوكلييدات عالية التكثيف عند التعرض لـ ه. القولونية توفر الخلايا إلى الكلورامفينيكول ، الذي يمنع الترجمة ، دعمًا لقوة التمدد لاتصالات غشاء الحمض النووي العابرة المتكونة من خلال التحويل. يشير الشكل المستدير للنيوكلييدات شديدة التكثيف بعد معالجة الكلورامفينيكول أيضًا إلى دور ملامسات غشاء الحمض النووي بوساطة التحويل في تحديد الشكل الإهليلجي للنواة.

ديناميات نوكليويد تعتمد على مرحلة النمو

يعيد النوكليود تنظيمه في خلايا الطور الثابت مما يشير إلى أن البنية النووية ديناميكية للغاية ، والتي تحددها الحالة الفسيولوجية للخلايا. كشفت مقارنة خرائط الاتصال عالية الدقة للنيوكليويد أن الاتصالات بعيدة المدى في Ter macrodomain زادت في المرحلة الثابتة ، مقارنة بمرحلة النمو [124]. علاوة على ذلك ، كانت حدود CID في المرحلة الثابتة مختلفة عن تلك الموجودة في مرحلة النمو. أخيرًا ، يخضع مورفولوجيا النيوكليويد لتحول هائل أثناء الطور الثابت المطول [166] في المعروضات النووية ، الهياكل الحلقية المرتبة [167].

يمكن إحداث تغييرات محددة في مرحلة النمو في البنية النووية من خلال تغيير في مستويات البروتينات المعمارية للحمض النووي المرتبطة بالنيوكليويد (NAPs ووحدات Muk الفرعية) ، ونشاط الالتفاف الفائق ، والنسخ. تتغير وفرة برامج العمل الوطنية والوحدات الفرعية Muk وفقًا لدورة نمو البكتيريا. Fis والبروتين المرتبط بالحمض النووي الناجم عن الجوع Dps ، وهو NAP آخر ، موجودان بشكل حصري تقريبًا في طور النمو والمرحلة الثابتة على التوالي. ترتفع مستويات Fis عند الدخول إلى المرحلة الأسية ثم تنخفض بسرعة بينما لا تزال الخلايا في المرحلة الأسية ، لتصل إلى مستويات لا يمكن اكتشافها في المرحلة الثابتة [168]. بينما تبدأ مستويات Fis في الانخفاض ، تبدأ مستويات Dps في الارتفاع وتصل إلى الحد الأقصى في المرحلة الثابتة [16]. يُعزى الانتقال الدرامي في البنية النووية التي لوحظت في المرحلة الثابتة المطولة بشكل أساسي إلى Dps. إنه يشكل تجميعات الحمض النووي / البلورية التي تعمل على حماية النواة من العوامل الضارة للحمض النووي الموجودة أثناء الجوع [167].

HU و IHF و H-NS موجودة في كل من طور النمو والمرحلة الثابتة [16]. ومع ذلك ، فإن وفرتها تتغير بشكل كبير بحيث أن HU و Fis هما أكثر برامج العمل الوطنية وفرة في مرحلة النمو ، في حين أن IHF و Dps أصبحا أكثر برامج العمل الوطنية وفرة في المرحلة الثابتة [16]. HUαα هو الشكل السائد في الطور الأسي المبكر ، بينما يسود الشكل غير المتجانس HUαß في الطور الثابت ، مع كميات صغيرة من أجهزة القياس المتجانسة [169]. هذا الانتقال له عواقب وظيفية فيما يتعلق بالبنية النووية لأن HUαα و HUαß يبدو أنهما ينظمان ويكثفان الحمض النووي بشكل مختلف عن كل من الشعيرات ، ولكن يمكن لـ HUαα فقط تجميع مقاطع DNA متعددة معًا (تجميع الحمض النووي) لتشكيل شبكة DNA [40]. يزيد عدد نسخ MukB ضعفين في المرحلة الثابتة [136 ، 147]. يمكن أن يكون للزيادة في عدد جزيئات MukB تأثير على معالجة مجمع MukBEF كعامل بثق في حلقة DNA مما يؤدي إلى عدد أكبر أو أكبر من الحلقات.

يمكن أن يعمل الالتواء الفائق بطريقة منسقة مع البروتينات المعمارية للحمض النووي لإعادة تنظيم النواة. ينخفض ​​مستوى الالتفاف الفائق الكلي في المرحلة الثابتة ، ويظهر الالتفاف الفائق نمطًا مختلفًا على المستوى الإقليمي [170]. يمكن للتغييرات في الالتفاف الفائق أن تغير التنظيم الطوبولوجي للنيوكليويد. علاوة على ذلك ، نظرًا لأن منطقة الكروموسومات ذات نشاط النسخ العالي تشكل حدود CID ، فإن التغييرات في نشاط النسخ خلال مراحل النمو المختلفة يمكن أن تغير تشكيل حدود CID ، وبالتالي التنظيم المكاني للنيوكليويد. من الممكن أن تكون التغييرات في حدود CID التي لوحظت في المرحلة الثابتة ناتجة عن التعبير العالي لمجموعة مختلفة من الجينات في المرحلة الثابتة مقارنة بمرحلة النمو [124].

التركيب النووي والتعبير الجيني

برامج العمل الوطنية والتعبير الجيني.

ال ه. القولونية يبدو أن بنية الكروموسوم والتعبير الجيني يؤثران على بعضهما البعض بشكل متبادل. من ناحية أخرى ، يشير ارتباط حدود CID مع نشاط النسخ العالي إلى أن تنظيم الكروموسوم مدفوع بالنسخ. من ناحية أخرى ، قد تكون البنية ثلاثية الأبعاد للحمض النووي داخل النواة على كل نطاق مرتبطة بالتعبير الجيني. أولاً ، لقد ثبت أن إعادة تنظيم البنية ثلاثية الأبعاد للنيوكليويد في ه. القولونية يمكن أن تعدل ديناميكيًا نمط النسخ الخلوي [171]. تسبب طفرة من HUα في تكثيف النيوكليدي إلى حد كبير عن طريق زيادة اللدونة الفائقة الإيجابية للحمض النووي الصبغي. ونتيجة لذلك ، تم قمع العديد من الجينات ، وتم التعبير عن العديد من الجينات الهادئة. إلى جانب ذلك ، هناك العديد من الحالات المحددة التي تغير فيها التغييرات المعمارية المحلية بوساطة البروتين (الشكل 2) نسخ الجينات. على سبيل المثال ، يؤدي تكوين خيوط بروتين نووي صلبة بواسطة H-NS إلى منع وصول RNAP إلى المحفز وبالتالي منع النسخ الجيني [172]. من خلال إسكات الجينات ، يعمل H-NS كمثبط عالمي بشكل تفضيلي يمنع نسخ الجينات المنقولة أفقياً [20 ، 46]. في مثال آخر ، الارتباط المحدد لـ HU في فتاه أوبرون يسهل تكوين حلقة DNA التي تحافظ على فتاه المكبوتة في حالة عدم وجود المحرض [173]. الحلقة الدقيقة للحمض النووي المتميزة طوبولوجيًا والتي تم إنشاؤها عن طريق الانحناء المتماسك للحمض النووي بواسطة Fis في محفزات الحمض النووي الريبي المستقر تنشط النسخ. يتحكم انحناء الحمض النووي بواسطة IHF بشكل تفاضلي في النسخ من مروجين ترادفيين لـ ilvGMEDA أوبرون في ه. القولونية [174 ، 175]. من الجدير بالذكر أن التغييرات الطوبولوجية المحددة بواسطة برامج العمل الوطنية لا تنظم نسخ الجينات فحسب ، بل تشارك أيضًا في عمليات أخرى مثل بدء تكرار الحمض النووي وإعادة التركيب والتبديل. على النقيض من تنظيم الجينات المحددة ، لا يزال يتعين تحديد كيفية تأثير بنية الكروموسوم عالية الرتبة ودينامياتها على التعبير الجيني على مستوى العالم على المستوى الجزيئي.

الالتفاف الفائق للحمض النووي والتعبير الجيني.

يوجد ترابط ثنائي الاتجاه بين الالتفاف الفائق للحمض النووي والنسخ الجيني [176]. يمكن أن يؤدي الالتفاف الفائق السلبي لمنطقة المروج إلى تحفيز النسخ عن طريق تسهيل ذوبان المحفز وعن طريق زيادة تقارب ارتباط الحمض النووي لمنظم البروتين. يبدو أن الدفقات العشوائية للنسخ هي خاصية عامة للجينات المعبر عنها بشكل كبير ، ومستويات الالتفاف الفائقة لقالب الحمض النووي تساهم في الانفجار النسخي [177]. وفقًا لنموذج مجال الالتفاف المزدوج ، يمكن أن يؤثر الالتفاف الفائق الناجم عن النسخ على نسخ الجينات الأخرى المجاورة من خلال مرحل الالتفاف الفائق. أحد الأمثلة على ذلك هو تنشيط ملف ليو -500 المروج [176]. لا يقتصر اللف الفائق على التوسط في التغييرات الخاصة بالجينات فحسب ، بل يتوسط أيضًا التغييرات واسعة النطاق في التعبير الجيني [178]. حدد تحليل التعبير الجيني العالمي استجابةً لفقدان الالتفاف الفائق 306 جينات حساسة للالتفاف الفائق (SSGs) في ه. القولونية [178]. توجد مجموعات SSG في جميع أنحاء الكروموسوم وتقوم بتشفير البروتينات بوظائف متنوعة. يمكن أن يسمح التنظيم الطوبولوجي للنيوكليويد بالتعبير المستقل عن مجموعات SSG في المجالات الطوبولوجية المختلفة. أظهرت خريطة مقياس الجينوم للفائق الفائق غير المقيد أن المناطق الجينومية لها كثافة مختلفة في حالة الثبات الفائق ، مما يشير إلى أن مستوى الالتفاف الفائق يختلف في المجالات الطوبولوجية الفردية [170]. نتيجة لذلك ، يمكن أن يؤدي التغيير في supercoiling إلى مستويات تعبير خاصة بالمجال لـ SSGs ، اعتمادًا على درجة supercoiling في كل مجال.

يمكن التوسط في تأثير الالتفاف الفائق على التعبير الجيني عن طريق برامج العمل الوطنية التي تؤثر بشكل مباشر أو غير مباشر على الالتفاف الفائق. يبدو أن تأثير HU على التعبير الجيني ينطوي على تغيير في الالتواء الفائق وربما تنظيم DNA عالي الترتيب [179]. يشير الارتباط الإيجابي بين ربط الحمض النووي بجريز الحمض النووي وتنظيم الجينات الناجم عن غياب HU إلى أن التغيرات في الالتفاف الفائق هي المسؤولة عن التعبير التفاضلي [47]. وجد أن HU أيضًا مسؤول عن التأثير الموضعي على التعبير الجيني عن طريق عزل وحدات النسخ عن طريق تقييد الالتفاف الفائق الناجم عن النسخ [180]. تغيرت الطفرات النقطية في HUα بشكل كبير ملف تعريف التعبير الجيني لـ ه. القولونية، وتغيير شكله ، وعلم وظائف الأعضاء ، والتمثيل الغذائي [171]. نتيجة لذلك ، كانت السلالة الطافرة أكثر تغلغلًا في خلايا الثدييات [181]. كان هذا التأثير الدراماتيكي مصاحبًا للضغط النووي وزيادة الالتفاف الإيجابية. على عكس الثنائيات من النوع البري ، فإن البروتين الطافر عبارة عن أوكتامر يلف الحمض النووي على سطحه بطريقة اليد اليمنى ، مما يحد من اللفائف الفائقة الإيجابية على عكس النوع البري من النوع HU [182]. تُظهر هذه الدراسات أن بدائل الأحماض الأمينية في HU يمكن أن يكون لها تأثير كبير على البنية النووية ، وبالتالي على التعبير الجيني ، مما يؤدي بدوره إلى تغييرات نمطية كبيرة.

على الرغم من أن HU يبدو أنه يتحكم في التعبير الجيني عن طريق تعديل كثافة الالتفاف الفائقة ، إلا أن الآلية الجزيئية الدقيقة لا تزال غير معروفة. منذ ظهور MukB و HU كلاعبين أساسيين في تفاعلات الحمض النووي بعيدة المدى ، سيكون من المفيد مقارنة تأثير كل من هذين البروتينين على التعبير الجيني العالمي. تأثير MukB على التعبير الجيني لم يتم تحليله بعد.

الوضع الحالي ومنظور المستقبل

على الرغم من أن الدراسات التي أجريت على النيوكلييدات المعزولة بدأت في السبعينيات ، إلا أن البنية الكاملة والكاملة للنيوكليويد البكتيري لا تزال غير متوفرة. لا يزال يمثل تحديًا كبيرًا حتى عند دقة 10 كيلو بايت ، لوصف التنظيم الهرمي للحمض النووي الصبغي بدقة مما يؤدي إلى تكوين نواة وظيفية. دقة النوكليوتيدات المفردة أكثر صعوبة. ومع ذلك ، فقد قمنا بتحسين فهمنا للخصائص الهيكلية للنيوكليود بشكل ملحوظ. باختصار ، الحمض النووي الكروموسومي عبارة عن جزيء فائق الالتفاف يتحول إلى حلقات بكتونية. يتم إنشاء كثافة الالتفاف الفائقة والحفاظ عليها بواسطة اثنين من الأيزوميراز العلوي (DNA gyrase و Topo I) مع وظائف متعارضة. تنظم NAPs الحمض النووي من خلال أنشطة الانحناء والجسور والحلقات. يؤدي هذا التنظيم جنبًا إلى جنب مع أنشطة النسخ إلى تنظيم أعلى رتبة للحمض النووي في مجالات تفاعل كروموسومية مميزة طوبولوجيًا ومكانيًا (النطاقات الدقيقة) التي يتم تنظيمها بشكل أكبر على أنها نطاقات كبيرة الحجم. يبدو أن NAPs والبروتينات الخاصة بنطاق macrodomain MukBEF و MatP تتعاون في التنظيم المكاني. يساهم تكوين المجال الفائق والطوبولوجي أيضًا في التنظيم المناسب للنسخ الجيني. يوفر الانحناء المتأصل للحمض النووي بسبب الحركة البراونية وأنشطة الالتفاف الفائق وأنشطة تنظيم الحمض النووي الخاصة بـ NAPs و MukBEF قوى تكثيف لتقليل حجم الحمض النووي الصبغي بشكل كافٍ ليتناسب مع حجم الخلية. تضفي هذه العملية تنظيمًا هرميًا ، وينتج عن الحمض النووي الصبغي المكثف نواة وظيفية ذات شكل إهليلجي حلزوني.

يمكن للتقدم في تقنيات التصوير أن يمهد الطريق للتصور المباشر للبنية النووية عالية الرتبة في الجسم الحي بدقة عالية. طرق المجهر الإلكتروني الحديثة التي تستخدم التجميد عالي الضغط والتقسيم بالتبريد للحفاظ على البنية التحتية الأصلية [183] ​​، واستخدام تقنيات محسنة للكشف عن الحمض النووي للحصول على تباين حاد [184] ، والسماح بالتصوير ثلاثي الأبعاد مع المقطع العرضي للخلايا باستخدام الحزم الأيونية المتبعة بواسطة إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد [185] يحمل وعودًا في دفع فهم جديد للترتيب ثلاثي الأبعاد للحمض النووي الصبغي بأكمله بدقة عالية.على الرغم من أن العديد من المشكلات المتعلقة بالهيكل والوظيفة الدقيقة للنيوكليويد لا تزال بحاجة إلى حل ، فإن بعضًا من أكثرها إثارة للاهتمام هي التالية:

  1. هل هناك بنية ثلاثية الأبعاد محددة تعتمد على النمو / البيئة للحمض النووي داخل النواة؟
  2. كيف يتم نقل الإشارات البيئية لتغيير البنية النووية؟
  3. ما هي طبيعة حواجز الانتشار فائقة الالتواء التي تفصل النواة في مجالات طوبولوجية مستقلة؟
  4. ما هي الآليات الجزيئية التي يتم بواسطتها إجراء الاتصالات البعيدة للحمض النووي والحمض النووي؟
  5. ما هي الآليات الجزيئية لربط الغشاء بالنيوكليويد؟

تشابك عامل الاستطالة EF-G مع الوحدة الفرعية الريبوزومية 50S للإشريكية القولونية

مشاهدات المقالات هي مجموع تنزيلات النصوص الكاملة للمقالات المتوافقة مع COUNTER منذ نوفمبر 2008 (بتنسيق PDF و HTML) عبر جميع المؤسسات والأفراد. يتم تحديث هذه المقاييس بانتظام لتعكس الاستخدام حتى الأيام القليلة الماضية.

الاقتباسات هي عدد المقالات الأخرى المقتبسة من هذه المقالة ، ويتم حسابها بواسطة Crossref ويتم تحديثها يوميًا. اعثر على مزيد من المعلومات حول عدد الاقتباسات من Crossref.

درجة الانتباه Altmetric هي مقياس كمي للاهتمام الذي تلقته مقالة بحثية عبر الإنترنت. سيؤدي النقر فوق أيقونة الكعك إلى تحميل صفحة على altmetric.com تحتوي على تفاصيل إضافية حول النتيجة ووجود وسائل التواصل الاجتماعي للمقالة المحددة. يمكنك العثور على مزيد من المعلومات حول "نقاط الانتباه البديلة" وكيفية احتساب النتيجة.

ملحوظة: بدلاً من الملخص ، هذه هي الصفحة الأولى للمقالة.


تجميد الإشريكية القولونية الخلايا عن طريق استخدام الببتيد المضاد للميكروبات Cecropin P1

تين. 1. تجميد بكتريا قولونية O157: H7 على صفيحة ميكروسكوبية مغلفة بـ cecropin P1. تم تجميد الخلايا في آبار تحتوي على 33 ± 1 pmol (○) و 26 ± 3 pmol (•) و 20 ± 1 pmol (▪) من cecropin P1. تين. 2. تجميد بكتريا قولونية K-12 على cecropin P1. تم تجميد الخلايا في آبار صفيحة ميكروسكوبية تحتوي على 40 ± 1 pmol (○) ، 31 ± 1 pmol (•) ، و 25 ± 1 pmol (▪) من cecropin P1. تين. 3. مقارنة منحنيات الربط لـ بكتريا قولونية O157: H7 (○) و K-12 (•) مع cecropin P1. تم رسم البيانات على أنها امتصاص عند 450 نانومتر لكل بيكومول من cecropin لكل منحدر مقابل سجل CFU. يعكس عدد البيكومولات من cecropin كمية الببتيد المقترنة بسطح البئر ، في حين أن المنحدر هو منحدر مركز منحنى الربط لكل سلالة مرتبطة بمضاد-بكتريا قولونية الأجسام المضادة - الفجل البيروكسيديز المتقارن. تين. 4. ملامح الأس الهيدروجيني ل بكتريا قولونية O157: H7 (A) و K-12 (B) مثبتان على cecropin P1. تين. 5. تأثير القوة الأيونية على ربط بكتريا قولونية O157: H7 (A) و K-12 (B) إلى cecropin P1.

4. مناقشة

في الوقت الحاضر ، تم تطوير العديد من لقاح SARS-CoV-2 ، باستخدام RBD لبروتين SARS-CoV-2 S كمستضد. تم التعبير عن مستضد RBD بشكل أساسي بواسطة أنظمة التعبير عن الخلايا حقيقية النواة ، مثل خلايا الثدييات وخلايا الحشرات وخلايا الخميرة. ومع ذلك ، عانى RBD-2 المشتق من الخلايا حقيقية النواة من التكلفة العالية ومستوى التعبير المنخفض. بالمقارنة مع RBD-2 ، تم التعبير عن RBD-1 بواسطة بكتريا قولونية كان قابلاً للتطوير إلى حد كبير بتكلفة منخفضة. في هذه الدراسة ، كان ناتج RBD-1 هو 13.3 مجم / لتر عن طريق زراعة القارورة. في المقابل ، كان ناتج RBD-2 في خلايا الثدييات (HEK-293T) 5 مجم / لتر بواسطة مزرعة الخلية [30]. ومع ذلك ، فإن فعالية RBD-1 مشتقة من بكتريا قولونية كان من الضروري أن يتم تقييمها.

في هذه الدراسة ، تم التعبير عن RBD-1 بواسطة بكتريا قولونية في شكل هيئات شمولية. تم إذابة أجسام التضمين في 6 مولار من هيدروكلوريد الغوانيدين وأعيد تشكيلها في وجود 0.5 م لتر-أرجينين. تمت تنقية RBD المعاد تشكيله بواسطة عمود Ni Sepharose Fast Flow. وهكذا تم الحصول على RBD من خلال عملية تنقية تقارب من خطوة واحدة بنقاوة عالية وعائد تنقية عالي. بالمقارنة مع RBD المعبر عنها بواسطة خلايا HEK293 (RBD-2) ، تم التعبير عن RBD بواسطة بكتريا قولونية (RBD-1) يفتقر إلى الارتباط بالجليكوزيل. يرتبط عدم وجود ارتباط بالجليكوزيل بانخفاض حجم RBD-1 ، مما قد يؤدي إلى تقصير مدة مصل RBD. إذا تمت صياغة RBD واستخدامه كلقاحات الجسيمات النانوية ، فيمكن إهمال تأثير حجم RBD.

تم فحص بنية RBD-1 بواسطة القرص المضغوط والفلورة و FT-IR. اقترح القرص المضغوط أن المحتوى الرئيسي للورقة RBD-1 لم يتغير تقريبًا. اقترح التحليل الطيفي الفلوري أن البنية الثلاثية لـ RBD-1 قد تغيرت قليلاً. كشف التحليل الطيفي FT-IR أن RBD-1 يفتقر إلى الارتباط بالجليكوزيل مع تغيير هيكلي طفيف. اقترح تحليل SPR أن RBD-1 يمكن أن يربط بقوة ACE2 مع K.د من 2.98 × 10 –8 M. وهكذا ، كانت دراستنا ذات أهمية عملية لضمان فعالية RBD للتطبيق السريري.

باختصار ، تم التعبير عن RBD-1 بنجاح في بكتريا قولونية وتنقيته بواسطة كروماتوغرافيا تقارب النيكل. تم تمييز RBD-1 هيكليًا ومقارنته مع RBD المعبر عنها بواسطة خلايا HEK293 (RBD-2). تم الحفاظ على الهيكل الثانوي والهيكل الثالث لـ RBD-1 إلى حد كبير. علاوة على ذلك ، يمكن لـ RBD-1 ربط ACE2 بقوة بـ K.د من 2.98 × 10 –8 M. وهكذا ، كان من المتوقع أن يطبق RBD-1 في تصميم اللقاح وعقاقير الفحص ومجموعة اختبار الفيروس.


شاهد الفيديو: البكتيريا. بدائيات النوى. مادة الأحياء (شهر نوفمبر 2022).