معلومة

طوبولوجيا الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل - علم الأحياء

طوبولوجيا الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل - علم الأحياء



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

يجب فك خيوط حلزون الحمض النووي الأبوي حتى يتمكن البوليميراز من قراءة كل قالب وتوليف الخيط التكميلي الجديد. تسمى الإنزيمات التي تحفز هذا الفصل هليكازات الحمض النووي. يمكن قياس نشاطهم كيميائيًا حيويًا عن طريق تحويل الحمض النووي المزدوج إلى DNA أحادي الشريطة.

هليكازات الحمض النووي لها نشاط ثانٍ أيضًا. يمكنهم التحرك على طول الحمض النووي المفرد الذي تقطعت بهم السبل بقطبية محددة. يمكن قياس قطبية الحركة بواسطة في المختبرالمقايسة باستخدام ركيزة يكون فيها خيطان مميزان قصيران ومسمىان على الوجهين مع طرفي حبلا أطول (الشكل 5.22). سوف ترتبط الهليكاز مبدئيًا بالجزء أحادي السلسلة من الحمض النووي للركيزة وتتبعها على طولها حتى تلتقي بمنطقة الطباعة المزدوجة ، وعند هذه النقطة ستحفز فك اللف المزدوج. سيتم إزاحة واحدة فقط أو أخرى من الخيوط القصيرة ذات العلامات بواسطة الهليكاز ، اعتمادًا على اتجاه التتبع على طول المنطقة الفردية التي تقطعت بهم السبل. يُظهر إزاحة الجزيء A في الشكل 5.22A أن هذه الهليكاز (DnaB) تحركت في اتجاه 5 'إلى 3' على طول الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل للوصول إلى الجزء المزدوج بما في ذلك A. ثم تم إزاحة الجزء A بواسطة نشاط الهليكاز.

أ. ب.

الشكل 5.22: مقايسة لاتجاه تتبع هليكاز على طول منطقة واحدة تقطعت بهم السبل.

يوضح الشكل 5.22B نتائج اختبار التتبع لطائرة هليكوبتر تسمى PriA. في أي اتجاه يتتبع على طول الحمض النووي أحادي السلسلة؟

تم عزل سبع طائرات حربية من بكتريا قولونية. لم يتم تحديد وظيفة مميزة لهم جميعًا ، كما أنه ليس من الواضح تمامًا ما الذي يعمل عند شوكة النسخ المتماثل. طائرات الهليكوبتر الرئيسية ل E. القولونيةيبدو أن النسخ الكروموسومي هو PriA و DnaB ، اللذان يستخدمان أيضًا في آلية صنع البادئات. هيليكاز إضافية سيتم النظر فيها في الفصل 7 هي هيليكس 2 ، أو UvrD ، المستخدمة في إصلاح الحمض النووي.

بمجرد فصل خيوط جزيء الحمض النووي الأبوي ، يجب منعهما من إعادة الالتحام. طلاء الحمض النووي أحادي السلسلة ببروتين ربط الحمض النووي أحادي السلسلة (SSB) هل هذا (الشكل 5.21). SSB من بكتريا قولونية هو مقياس متماثل ، وهو مركب من أربع وحدات فرعية أحادية متطابقة. الوحدات الفرعية للبروتين الأحادي هي 74 كيلو دالتون ؛ يتم ترميزها بواسطة ssbالجين. المسوخ في ssbأوقف تركيب الحمض النووي على الفور ، وبالتالي فهي ضرورية للاستطالة. إن طفرات فقدان الوظيفة هذه معيبة أيضًا في إصلاح وإعادة تركيب الحمض النووي. يرتبط SSB بشكل تعاوني بالحمض النووي أحادي الجديلة ، وفي هذا الشكل لا يمكن للحمض النووي أحادي الجديلة أن يصلب إلى خيطه التكميلي. بروتين مشابه موجود في حقيقيات النوى هو عامل النسخ A ، أو RFA. هذا هو متغاير ، أي يتكون من ثلاث وحدات فرعية مختلفة.

يؤثر تفكك خيوط الحمض النووي بواسطة الهليكازات على الهيكل العام للحمض النووي (الشكل 5.23). على سبيل المثال ، لكل 10 أزواج أساسية غير ملفوفة (DT = -1) ، ستكون هناك زيادة تعويضية في التلوي (DW = + 1) ما لم يتم تغيير رقم الارتباط. كما تمت مناقشته سابقًا في الفصل 2 ، فإن الإنزيمات التي يمكنها تغيير رقم الارتباط هي الإنزيمات العلوية. تعمل هذه الإنزيمات بمثابة دوارات أثناء النسخ المتماثل لتخفيف الضغط الطوبولوجي. في بكتريا قولونية، هذا الدوران هو إنزيم جيريز (الجدول 5.3 ، الشكل 5.23). يستخدم Topoisomerase II طاقة ATP لعمل كسر مزدوج في جزيء DNA ، ويمرر جزءًا مختلفًا من الحمض النووي من خلال الكسر ، ويعيد إغلاق الكسر. يكون اتجاه المرور من النوع الذي يتم فيه إدخال منعطف فوق حلزوني سلبي ، وبالتالي إبطال التغيير الإيجابي في W الذي يحدث عندما يتم فك الحمض النووي. المركبات التي تثبط الجيراز ، مثل حمض النالاديكسيك أو الكومارين ، تمنع أيضًا تخليق الحمض النووي ، مما يُظهر الدور الحاسم للجيريز في هذه العملية. في خلايا الثدييات ، يمكن استخدام topoisomerase I أو topoisomerase II كمحور. يصنع Topoisomerase I شقًا واحدًا تقطعت به السبل في الحمض النووي فائق الالتفاف ، مما يسمح للفائف الفائقة بالاسترخاء.

الشكل 5.23. التغييرات في طوبولوجيا الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل. يتسبب عدم الالتواء المعتمد على ATP (DT السلبي) المحفز بواسطة هليكازات الحمض النووي في حدوث تغيير تعويضي في الالتواء (موجب DW) ، والذي يتم تخفيفه من خلال عمل topoisomerase II ، مثل DNA gyrase. يعمل Gyrase على تحفيز تفاعل ثلاثي الخطوات معتمد على ATP ، حيث يشق خيطي DNA ، ويمرر جزءًا آخر من DNA المزدوج من خلال الكسر ويعيد إحكام الغلق. يولد عمل gyrase DW سلبيًا لموازنة DW الإيجابي من عمل الهليكاز. تشير X و Y إلى منطقتين مختلفتين من جزيء الحمض النووي. يشير السهم الرمادي إلى اتجاه حركة الازدواج خلال الفاصل. Gyrase هو رباعي الأسطوانات ، ويظهر في شكل أربع كرات وردية اللون.


AP Biology 6.2 - النسخ المتماثل

في هذا القسم ، سوف نركز على كيفية تكرار الحمض النووي & # 8211 وهي عملية أساسية للحياة على الأرض. سنبدأ من خلال النظر في النظريات المختلفة لتكرار الحمض النووي التي تم اقتراحها في الأصل بعد فهم بنية الحمض النووي: التكرار المحافظ ، والنسخ شبه المحافظ ، والنسخ التشتيت. اشتهرت تجربة ميسيلسون-ستال بأن التكرار شبه المحافظ كان النظرية الأكثر دقة. بعد ذلك ، سنتعمق في عملية تكرار الحمض النووي. سنبدأ بإنزيمات هيليكس والتوب إيزوميراز التي تفك جزيء الحمض النووي المزدوج الشريطة. بعد الاختبار الأول ، سنرى كيف يعمل DNA polymerase فعليًا لبناء خيط DNA جديد من خيط القالب. أخيرًا ، سنرى الخطوات النهائية في تكرار الحمض النووي التي تنهي العملية وكيف أن تكرار الحمض النووي مشابه جدًا لنسخ الحمض النووي الريبي.


مكبرات الصوت

  • آخر موعد للتسجيل
  • 30 أغسطس 2021
  • الموعد الاخير لتسليم الملخص
  • 20 يوليو 2021
  • سيتم إخطار المشاركين المختارين من قبل
  • 20 أغسطس 2021
  • الموعد الاخير للدفع
  • 10 سبتمبر 2021
  • الطالب / البريد 75 يورو
  • أكاديمي 100 يورو
  • صناعة 200 يورو

التسجيل يشمل:

قسط

سيتم ربط الدفع بنظام 3D Secure ويمكن إجراؤه عن طريق بطاقة الائتمان أو الفاتورة أو التحويل المصرفي.

معيار الاختيار

سيتم اختيار المشاركين على أسس علمية ، والتوازن بين الجنسين والتوزيع الجغرافي (توزيع واسع).

إرشادات مجردة

يجب ألا يزيد عدد الكلمات في الملخصات عن 250 كلمة ، باستثناء العنوان والمؤلفين والانتماءات.

مواصفات الملصق

يجب أن تكون الملصقات بحد أقصى 4 شرائح. سيقوم مقدمو الملصقات بإعداد محادثات فلاش مسجلة مسبقًا بحد أقصى 3 دقائق.

منح السفر

بدلاً من منح السفر ، سيتاح عدد من الإعفاءات من الرسوم للمشاركين. لا يحتاج مقدمو الطلبات إلى التقدم بشكل منفصل للحصول على إعفاءات من الرسوم لهذا الحدث ولكن يجب أن يشيروا في نموذج التسجيل إلى ما إذا كانوا يرغبون في النظر في الإعفاء من الرسوم. يتم التعامل مع اختيار الفائزين مباشرة من قبل المنظم الذي سيبلغ جميع المشاركين المؤهلين. يتوفر المزيد من المعلومات على صفحة EMBO Travel Grants.

إعفاءات الرسوم المحددة متاحة للمشاركين من أي جنسية يعملون في المختبرات في تشيلي والهند وسنغافورة وتايوان. للتقدم ، يرجى إرسال بريد إلكتروني مباشرة إلى منظمي الاجتماع لتبرير طلبك.

منحة رعاية الطفل

تقدم دورات وورش عمل EMBO منحًا لتعويض تكاليف رعاية الطفل الإضافية التي يتكبدها المشاركون أو المتحدثون عند المشاركة في أي دورات EMBO والاجتماعات الممولة من ورشة العمل. تشمل التكاليف المؤهلة رسوم مقدم الرعاية أو مرفق رعاية الأطفال ، وتكاليف السفر لمقدم الرعاية ، أو تكاليف السفر لأخذ الطفل إلى الاجتماع وما إلى ذلك. يرجى الإشارة في نموذج التسجيل إلى ما إذا كنت ترغب في الحصول على المنحة. يرجى أيضًا وصف كيف تنوي استخدام منحة رعاية الطفل وتحديد المبلغ الذي ستحتاجه.


طوبولوجيا الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل - علم الأحياء

جون إي هيرست (أ ، ب) ، لو كوفمان (ج) ، وم. مارتن ماكلين (د) ، ويومينغ شي (أ)

(أ) قسم الكيمياء ، جامعة كاليفورنيا ، بيركلي
(ب) قسم البيولوجيا الإنشائية ، مختبر لورنس بيركلي الوطني
(ج) قسم الرياضيات ، جامعة إلينوي ، شيكاغو
(د) قسم الكيمياء ، جامعة واين ستيت ، ديترويت

الملخص

I. مقدمة

من المتفق عليه عمومًا أنه بعد البدء في أصل معين للنسخ المتماثل ، يحدث تخليق الحمض النووي بشكل ثنائي الاتجاه عند "شوكتين متناميتين" يتباعدان عن بعضهما البعض على محيط DNA (1). إن تخليق الخيط الرئيسي مستمر ويتم إجراؤه بواسطة d DNA polymerase ، ويتم نسخ الحامل المتأخر بشكل متقطع في عملية تتضمن RNA primase ، على الأقل بوليميريز DNA إضافي (a) وربما أكثر ، RNase H الذي يحط من بادئات RNA ، و DNA ligase الذي يربط الأجزاء القصيرة (2000 سنة مضت) من الحمض النووي المركب بشكل متقطع معًا. يتم مساعدة معقدات البوليميراز في التكاثر على طول مزدوج الحمض النووي بمساعدة الهليكاز الذي يفك مزدوج الحمض النووي ، ومن خلال "المشابك المنزلقة" التي تعزز عملية كل عملية بلمرة الحمض النووي (2). نظرًا لأن الدنا المزدوج الأصلي يتم تغذيته في "الشوكة المتنامية" حيث يتم فك الحمض النووي ، يتم نسخ كل خيط مفرد بواسطة مجمع البوليميراز. في هذه المخطوطة ، يُشار إلى كل مركب من مركبات البوليميراز ، بما في ذلك الهليكاز ، والمشابك المنزلقة ، والحمض النووي الذي تم التقاطه باسم شوكة النسخ المتماثل ، وهذه الشوكات هي أساس أفكارنا الطوبولوجية حول تكرار الحمض النووي.

الحقيقة الثانية الراسخة هي وجود أصول تكرار متعددة داخل كروموسوم حقيقيات النوى (1). في كل أصل ، يتم إنشاء شوكتي نسخ متماثلتين (موجهتين بشكل معاكس ، كما هو موضح في الشكل 1 أ) في موقع محدد لبدء النسخ المتماثل الذي يُعتقد أنه تم تحديده من خلال ربط "مجمع ربط الأصل" ، ORC. أثناء النسخ المتماثل ، تنتشر الشوكتان بعيدًا عن بعضهما البعض على كفاف الحمض النووي ، مما يؤدي إلى إنشاء شقين مزدوجين من الحمض النووي الناشئين.

في هذا العمل ، لا نقدم أي افتراضات تتعلق بالهيكل التفصيلي أو الارتباط لمكونات البروتين التي تحدد شوكات النسخ المتماثل ولا يوجد أي هيكل معين ضمنيًا أو مطلوبًا لمناقشتنا بما يتجاوز افتراض السلامة الطوبولوجية لخيوط القالب للحمض النووي التي تشتمل على الأولي ازدواج الحمض النووي قبل النسخ المتماثل. كان هناك اعتبار قيم للغاية لقضايا طوبولوجيا الحمض النووي المتعلقة بالنسخ من قبل الآخرين. (3) غالبًا ما كانت المشكلات التي تم تناولها تتعلق بدرجة الترابط الفائق أو التوتر الالتوائي الناتج عن عملية النسخ المتماثل ، سواء في النموذج الأبوي المزدوج بين شوكات النسخ المتقاربة التي بدأت في الأصول المجاورة للنسخ المتماثل ، وفي مناطق الازدواج الابنة ، والتي تعتمد أيضًا على تفاصيل النموذج المحلي المنضم. نحن مهتمون هنا بمسألة تشابك الازدواج الناشئ الذي يمكن إنشاؤه إما عن طريق الدوران النشط للشوكة كل 10 أزواج أساسية ، المرتبط بالدوران النشط لكل من شوكات النسخ المتباينة أثناء الانتشار (3) ، أو بالدوران النسبي للتباعد أزواج من شوكات النسخ ، ببساطة من الانتشار. يقدم الشكل 1 مثالاً بيانيًا لكيفية أن يؤدي الدوران المستقل النسبي لشوكات النسخ المتماثل المتباينة إلى تشابك DNA مزدوج الاتجاه الناشئ. لاحظ أن قضية التشابك تختلف عن قضية اللدائن الفائقة للحمض النووي أو التوتر الالتوائي ، سواء في النموذج الأبوي المزدوج أو في الأبنة المزدوجة (التي تم تصنيعها حديثًا).

من أجل تجنب التشابك المحتمل للازدواج الناشئ بين شوكات النسخ المتماثل المتباعدة ، نفترض أن الشوكات متصلة فعليًا وبالتالي غير قادرة على الدوران فيما يتعلق ببعضها البعض. إذا كان التكرار ناتجًا عن شوكات ثنائيه مستقلة ، فسيكون هناك تشابك حتمي لنوعين من الدنا المزدوج الناشئين أثناء النسخ المتماثل ، وسيتطلب الفصل آلية خاصة مستقلة عن عملية النسخ نفسها للقضاء على التشابكات. تم رسم الرسوم الكاريكاتورية لأبسط تشابك ممكن في الشكل 1.

رسم بياني 1. أبسط حالة تشابك حبلا. (أ) شوكات النسخ المتجاورة مع عدم وجود تشابك. (ب) تنتشر شوكات النسخ المتباعدة بشكل دوراني بدورة كاملة واحدة فيما يتعلق ببعضها البعض ، مما يتسبب في تشابك بسيط. (C) في الانقسام الفتيلي ، لا يمكن فصل دنا مزدوجات DNA ابنة nacsent المتشابكة دون مرور.

الشكل عبارة عن رسم كاريكاتوري يشير فيه الهيكل البيضاوي الأزرق إلى ذلك الجزء من بروتينات الشوكة المتماثلة التي تتفاعل مع الشريط الرئيسي. في المقابل ، يُقصد من الهيكل الدائري الأحمر تمثيل ذلك الجزء من بروتينات شوكة النسخ المتفاعلة التي تتفاعل مع الشريط المتأخر للشوكة. قد يكون الارتباط المادي بين هاتين المجموعتين من بروتينات الشوكة بالكامل من خلال الحمض النووي أو قد يتضمن تفاعلات بروتينية بين فئتي البروتينات في شوكة النسخ المتماثل. مسألة "دوران الشوكة" وبالتالي "تشابك الازدواج الناشئ" مستقلة عن هيكل الشوكة المحلي ، ولكنها تعتمد كليًا على افتراض الاحتفاظ بالسلامة الطوبولوجية لسلاسل القالب الأبوي أثناء النسخ المتماثل. إن الطبقة الأولى من الإيزوميراز التي تعمل إما على الازدواج الأبوي في الأبنة المزدوجة الناشئة لا تغير من السلامة الطوبولوجية التي نتحدث عنها. من ناحية أخرى ، يمكن أن يكون هناك تمييز محلي للبنية (4) مرتبط بنشاط توبويزوميراز من الفئة الثانية والذي يمكن أن يخفف من التشابك المرتبط بالدوران النشط لشوكات النسخ المتماثل أثناء انتشار الشوكة. نقدم مثالنا في مصلحة البساطة وكمثال. يمكن تصور آلية أكثر تعقيدًا وقد تم اقتراحها بحيث تنتهك آلية فك التشابك افتراض التكامل الطوبولوجي للخيوط الأبوية.

فكرة التعلق المادي للأشواك المتنامية المتباعدة ليست أصلية لهؤلاء المؤلفين. في ورقة كلاسيكية ، أدلى Sundin و Varshavski (5) بالبيان التالي "إذا كان الشوكتان الناميتان تدوران فيما يتعلق ببعضهما البعض أثناء النسخ المتماثل ، فقد يحدث تشابك في خيوط الكروماتين الابنة. لتجنب هذه الصعوبة ، نقترح أن ترتبط كل من شوكات النسخ المتماثل معًا وتوجيهها بشكل فريد داخل مجمع ثنائي ". بالإضافة إلى ذلك ، أبلغ Wessel و Schweizer و Stahl (6) عن أدلة تجريبية لمثل هذا المرفق في النسخ المتماثل ثنائي الاتجاه SV40. لا يمكن لهذا العمل إثبات صحة مثل هذه الفرضية. ما نقوم به هنا هو معالجة العواقب الآلية لعمل مثل هذه الفرضية. هناك أنشطة إنزيمية راسخة في جميع الخلايا الحية والتي في ظل الظروف المناسبة يمكن أن تمرر DNA مزدوجًا واحدًا عبر آخر (أنشطة من الدرجة الثانية topoisomerase) (7). ولكن في العقدة المعقدة التي لا تكون مترجمة إلى حجم صغير هي مساحة بحيث يكون للإنزيم العامل أساس للتعرف على الهيكل ، فإن المرور العشوائي لخيط واحد من خلال الآخر من المرجح أن يزيد من العقد كما يقلل من ذلك (8) . يتطلب فك التشابك معرفة عالمية بطوبولوجيا العقدة ، ولكن يجب أن تستشعر أنظمة الإنزيم وتعمل ضمن حجم محلي للغاية ، مقيدًا بمدى قصير من القوى بين الجزيئات. تم اقتراح حل لمشكلة فك التشابك Gordian (4) ، حيث يمكن للإنزيم ، المرتبط بموقعين منفصلين للربط على الحمض النووي المزدوج ، تتبع (الهجرة على طول الكنتور) ، وجمع السلاسل في بنية محلية يمكن التعرف عليها. يتم تطبيق مثل هذه الآلية بسهولة أكبر على الدنا الدائرية. قد يتم تطبيقه بين شوكات النمو المتباعدة ، ولكن مرة أخرى ، بشكل أكثر شفافية إذا كانت مرتبطة فعليًا ببعضها البعض ، على الأقل في نهاية ترحيل الشوكة. مرة أخرى ، نؤكد أن عملنا لا يهدف إلى تحديد أي البدائل قد يكون صحيحًا. وهي تنوي إظهار العواقب الطوبولوجية لفرضية الشوكة المتنامية المتصلة.

يفسح نموذج الشوكة المتنامية المتصلة نفسه للتمثيل في نوع من الرمزية الجزيئية التي يمكن للمرء أن يطبق عليها حساب التفاضل والتكامل الرياضي ، ما يسمى بحساب التفاضل والتكامل "لامدا" (9). نعطي اسم تكافلي لهذه الطريقة الجديدة في التفكير. تم بالفعل تجسيد المفاهيم الأساسية لحساب لامدا في لغات الكمبيوتر المتقدمة ، وقد ألهم هذا خوارزمية ملموسة تولد سيناريو رمزيًا مفصلاً للتكرار الرباعي لأي كروموسوم رمزي معين. في الوقت الحاضر ، نستخدم السيناريو الرمزي كبيانات لفيلم بسيط عن استنساخ الكروموسوم. يُظهر الفيلم تأثيرًا جانبيًا محتملاً لنموذج شوكة النسخ المتصل المتصل ، وهو التكثيف الخطي للكروموسوم أثناء النسخ المتماثل. في المستقبل ، سيكون من الممكن تضمين خصائص الحمض النووي التفصيلية (التركيب والمرونة والهيستون والمرفقات الأخرى والطوبولوجيا) في مثل هذه الحسابات التكافلية وتمثيلاتها المرئية.

II. تكرار الكروموسوم بواسطة آلية شوكة متنامية متصلة

التين. 2. تضاعف شوكة متشابكة ثنائية الاتجاه متصلة. (أ) مزدوج من الحمض النووي مع مجمع النسخ المتماثل غير مكتمل. (ب) يؤدي الانتهاء من المجمع بما في ذلك وصول إشارة بدء إلى إنشاء شوكتين داخليتين متتاليتين ، غير قادرتين على الدوران فيما يتعلق ببعضهما البعض. (ج) مرحلة لاحقة من النسخ المتماثل ، مع حلقتين ناشئتين من الحمض النووي المزدوج المنبثق من الجانبين المعاكسين لمجمع شوكة النسخ المتماثل.

موقع المنشأ أو موضع ارتباط ORC هو الجزء الأول من الحمض النووي الذي يتم تكراره وبثقه. لقد تم اقتراح أن مناطق المنشأ المركبة حديثًا تُمنع من بدء آخر للنسخ المتماثل في نفس الموقع مرة ثانية في دورة الخلية لأنه لا تحدث إشارة أخرى للبدء. قد تصبح الحلقات الوليدة من نفس مجمع شوكة النسخ المتماثل أو من مجمعات الشوكة المجاورة طويلة بما يكفي للتشابك ربما حتى بعد إعادة الكروماتين ، ولكن لا يمكن أن يحدث التشابك طالما أن الشوكات الزوجية لا تواجه أي دوران داخلي نسبي. هذا يسمح الفصل طاهر.

يحتوي جينوم حقيقيات النوى على كروموسومات خطية بأصول النسخ المتماثل متباعدة بحوالي 100 كيلوباز أزواج (1) ، يشار إلى كل منطقة زوج من 100 كيلو بايت على أنها نسخة طبق الأصل. خلال المرحلة S ، تبدأ هذه الأصول المختلفة المرتبطة خطيًا للنسخ المتماثل في أوقات غير متزامنة مبرمجة وفي أوامر مبرمجة بحكم إشارات محددة.

الشكل 3 هو تمثيل لتكرار كروموسوم صغير جدًا. يبدأ في حالة ممتدة مع ثنائيات الأصل في مكانها (الشكل 3 أ). في الشكل 3 ب ، تتشكل مجمعات شوكة النسخ المتماثل ويتم إنشاء أزواج شوكة الحمض النووي ، متتالية حتمًا. مع استمرار النسخ المتماثل في الشكل 3 ج والشكل ثلاثي الأبعاد ، تنمو الحلقات الوليدة وتتقلص المقاطع الأبوية المزدوجة بين مجمعات شوكة النسخ المتقاربة حتى يصبح كل ما تبقى في النهاية صفًا ممتدًا من مجمعات شوكة النسخ المتماثل (الشكل 3E) ، كل منها به حلقتان طويلتان ولكن غير معقودتان من الحمض النووي الناشئ متصلان بجوانبهما. يعتبر تقلص الطول الظاهر في هذا الشكل واقعيًا ، وقد يساهم في تكاثف الكروموسوم قبل الانقسام الفتيلي. من المعروف أن هناك عاملًا آخر مهمًا لتكثيف الكروموسوم سواء من التجربة أو من حقيقة أن كروماتيدات الطور الطوري أصغر بكثير في القطر ثم الأطوال الخطية لحلقات الحمض النووي المنسوخة حديثًا ، مما يشير إلى أن آليات التكثيف الأخرى يجب أن تكون ضرورية في النهاية تشكيل كروموسوم الطور.

في الإطار النهائي ، تنقسم مجمعات النسخ المتماثل مرة أخرى في الاتجاه المعاكس تمامًا لخطوة تكوينها ، مع تخصيص نصف محتوى البروتين لكل حبلا مزدوج. عند هذه النقطة يمكن أن يبدأ الانقسام الخالي من أي تشابك بطبيعته.

تحتاج تفاصيل التكوين المتضارب بالكامل في الشكل 3E إلى المناقشة. لم يكتمل طول صغير من الحمض النووي المتصل مباشرة بمجمعات الشوكة المصادمة التكرار عند حدوث الاصطدام لأول مرة ، ويجب إكماله بواسطة آلية نسخ خاصة متأصلة في هذه الهياكل المصادمة. تمت دراسة "اللعبة النهائية" في استنساخ الحمض النووي ببعض التفاصيل باستخدام SV40 كنموذج ، وإذا تركت دون قلق فهي فعالة في تجنب التشابك (5). تم الإبلاغ عن أن هذه العملية تتطلب نشاط توبويزوميراز من الدرجة الثانية.

الشكل 3. ربط تكرار شوكة متزايد للكروموسوم ، مع انقسام طاهر. (أ) تجميع معقد ، (ب) تفرع ، (ج ، د) تكرار ، (هـ) تصادم ، (و) الانقسام.

يجب أن يتبع الانقسام المتساوي تمديد الكروموسوم بحيث يمكن الوصول إلى معلوماته خلال المرحلة G1. من الممكن أن تنفصل مجمعات شوكة النسخ المتماثل عن الحمض النووي ، مما يسمح لها بالتوسع في الحجم الذي تشغله في نواة الخلية عن طريق الانتشار. سيتم بعد ذلك استهداف المجمعات الجديدة لإعادة تصميمها من خلال مجمعات التعرف على الأصل ، ORC (10). كبديل ، نظهر في الفيلم أن امتداد الكروموسوم مرتبط بعودة بعض مكونات بروتينات النسخ المنفصلة حاليًا والتي لا تزال موجودة على الحمض النووي وتهاجر من خلال قيادتها على طول محيط الحمض النووي في عملية تعكس مساراتها أثناء النسخ المتماثل ، حتى يعثروا على أصول النسخ المتماثل أو أصول ORC التي تحددهم. تشير الأسئلة حول مرحلة التمديد إلى الحاجة إلى مزيد من العمل التجريبي الذي يحدد قواعد إقران الوحدة الفرعية لبوليميراز الحمض النووي والمواقع الفعلية لمواقع المنشأ ، ولكن لا يتضمن أي منها أي مشاكل جوردية من حيث المبدأ.


نتائج

كان هدفنا الأساسي هو منع Topo IV دون التأثير على DNA gyrase. لهذا السبب ، اخترنا أولاً بكتريا قولونية خلايا DH5 & # x003b1F & # x02032 لأنها تتحمل الطفرة جير التي تجعل هذه الخلايا مقاومة لمشتقات حمض الناليديكسيك (25 ، 44). في الواقع ، تم استخدام خلايا هذه السلالة المعرضة للنورفلوكساسين بنجاح سابقًا لتراكم الكاتينانات دون التأثير على DNA gyrase (17 ، 45). بالإضافة إلى ذلك ، فإن خلايا DH5 & # x003b1F & # x02032 هي RecA & # x02212 تتجنب تكوين multimers (46 ، 47). سهولة استخدام سلالة RecA & # x02212 موضحة بوضوح في الشكل 4 أ. pBR-تي إيتم استخدامAatII لتحويل خلايا W3110 التي هي RecA +. الاكتشاف المشترك للأشكال غير المكررة والمكررة جزئيًا من المونومرات والمتعددة ، بمعنى آخر. الثنائيات ، والقصاصات ، وما إلى ذلك ، تجعل من الصعب تحديد إشارات الاهتمام. ومع ذلك ، وجدنا أن الجزيئات التي تحتوي على شوكات متوقفة تميل إلى الانكسار في وجود النورفلوكساسين (الشكل 4). ب). تشير الإشارات المميزة بـ & # x0201cBroken RIs & # x0201d إلى تعطل RIs عند مفترق الطرق (48، 49). لهذا السبب ، لتثبيط Topo IV دون التأثير على DNA gyrase ، انتقلنا إلى خلايا parE10 التي تحمل طفرة Topo IV ts (25 ، 26 ، 44). للتحقق مما إذا كانت طوبولوجيا البلازميدات البكتيرية قد تأثرت بطريقة ما في خلايا DH5 & # x003b1F & # x02032 في غياب النورفلوكساسين مقارنة بسلالة من النوع البري ، حددنا كثافة الالتفاف الفائقة (& # x003c3) للأشكال غير المكررة من pBR-تي إيAatII معزول عن خلايا DH5 & # x003b1F & # x02032 التي هي RecA & # x02212 و Topo IV + و جير أو خلايا W3110 التي هي RecA + و Topo IV + و Gyr +. النتائج التي تم الحصول عليها موضحة في الشكل 5. في كلتا الحالتين & # x003c3 كانت & # x022120.065 (مشروط & # x00394لوك = & # x0221227). لذلك ، في التجارب التالية ، من أجل تحديد التوتر الالتوائي لـ RIs في وجود وغياب Topo IV ، قررنا استخدام خلايا DH5 & # x003b1F & # x02032 وخلايا parE10 المعرضة لدرجة الحرارة المقيدة للساعة الماضية.

مناعية الأشكال السليمة من pBR-تي إيAatII معزولة عن أي منهما بكتريا قولونية خلايا W3110 أو DH5 & # x003b1F & # x02032 (تتعرض للنورفلوكساسين) تم تحليلها بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ثنائي الأبعاد. أ، خلايا W3110 هي RecA + و Topo IV + و Gyr + (44). ب، خلايا DH5 & # x003b1F & # x02032 هي RecA & # x02212 و TopoIV + وتتحمل جير الطفرة التي تجعل هذه الخلايا مقاومة لمشتقات حمض الناليديكسيك. تمت زراعة DH5 & # x003b1F & # x02032 حتى حققت الثقافة نموًا لوغاريتميًا وتم تعريضها بعد ذلك لـ 15 & # x003bc m نورفلوكساسين خلال آخر 15 دقيقة. الى حق من كل مخطط مناعي هو رسم تخطيطي تفسيري لأكثر الميزات ذات الصلة حيث يتم تصوير CCCs و OCs غير المكررة في أسود. يتم تصوير CCRIs في أحمر. تشير الأرقام إلى المونومرات (1) والمتعددة: الثنائيات (2) ، المشذبات (3) ، إلخ. يشار إلى RI المكسور (48 ، 49).

أشكال غير متكررة من pBR-تي إيAatII معزول عن DH5 & # x003b1F & # x02032 أو W3110 بكتريا قولونية تحليل الخلايا بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ثنائي الأبعاد. تُظهر المخططات المناعية التمثيلية للمواد الهلامية ثنائية الأبعاد المكان الذي حدث فيه البعدين الأول والثاني في وجود تركيزات مختلفة من الكلوروكين لحل جميع تجمعات الأيزومرات العلوية. ظهر البعد الأول بوجود 1 & # x003bcg / ml ، أما البعد الثاني فكان بوجود 2 & # x003bcg / ml chloroquine. يشار إلى أكثر الأيزومرات وفرة بـ a السهم الأزرق. في كلتا الحالتين ، كانت كثافة الالتفاف الفائقة هي & # x022120.065 (مشروط & # x00394لوك = & # x0221227).

قمنا بتحويل كلا سلالتي الخلايا باستخدام البلازميدات البكتيرية pBR-تي إيStyI ، pBR-تي إيAatII و pBR-تي إيDraI ، زرع الخلايا حتى تحقق النمو اللوغاريتمي ، وعزل الحمض النووي من أي منهما بكتريا قولونية خلايا DH5 & # x003b1F & # x02032 (حيث يكون Topo IV نشطًا) أو خلايا parE10 نمت لآخر ساعة عند درجة الحرارة المقيدة (حيث يكون Topo IV غير نشط). تم استخدام التحليل الكهربائي لجيل الاغاروز ثنائي الأبعاد عالي الدقة وتهجين الحمض النووي مع مجسات مناسبة لفحص RIs السليمة للبلازميدات الثلاثة.

النتائج التي تم الحصول عليها موضحة في الشكل 6. تمت محاذاة جميع المناعية مع مراعاة تنقل موانع الحمل الفموية. لاحظ أن إقحام الكلوروكين ليس له أي تأثير على التنقل الكهربي للجزيئات غير المكررة (29 ، 37 ، 50).

تصوير مناعي للأشكال السليمة للبلازميدات الثلاثة المعزولة إما من DH5 & # x003b1F & # x02032 أو parE10 بكتريا قولونية تحليل الخلايا بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ثنائي الأبعاد. يشار إلى المواد الهلامية ثنائية الأبعاد حيث حدث البعد الثاني في وجود 5 & # x003bcg / مل كلوروكين على أعلى. الى حق من كل مخطط مناعي هو رسم تخطيطي تفسيري لأكثر الميزات ذات الصلة حيث يتم تصوير CCRIs أحمر. حيثما ينطبق ذلك ، فإن نظام CatAs (بتنسيق أزرق فاتح) ، CatBs (بتنسيق أزرق غامق) و CatCs (بتنسيق لون أخضر). تمت محاذاة جميع أجهزة المناعة وفقًا للتنقل الكهربي للمونومرات المكسورة (OCs) ووسطاء النسخ المتماثل (OCRIs) التي لا تتأثر بالكلوروكين. السهام الزرقاء يشير إلى أكثر الأيزومرات العلوية وفرة من الأشكال غير المكررة ، و السهام الحمراء تشير إلى CCRI الأكثر وفرة في جميع الحالات.

كانت الحركة الكهربية للأشكال غير المكررة لجميع البلازميدات الثلاثة المعزولة من خلايا DH5 & # x003b1F & # x02032 التي تم تحليلها بدون الكلوروكين هي نفسها كما هو متوقع للجزيئات المتشابهة تقريبًا في الكتلة والشكل على النحو التالي: 4385 نقطة أساس لـ pBR-تي إيStyI 4449 نقطة أساس لـ pBR-تي إيAatII و 4433 نقطة أساس لـ pBR-تي إيDraI (العمود الأيسر في الشكل 6). الاختلاف الوحيد المهم بين pBR-تي إيStyI ، pBR-تي إيAatII و pBR-تي إيDraI هو موقع تي إي ( تين. 3 ). لهذا السبب ، تباينت التنقل الكهربي للـ RI المكسور (OCRIs) للبلازميدات الثلاثة ، حيث كانت كتلتها 5525 نقطة أساس لـ pBR-تي إيStyI ، 7118 نقطة أساس لـ pBR-تي إيAatII ، و 7979 نقطة أساس لـ pBR-تي إيDraI ، على التوالي. لاحظ أن CCRIs ، الموضحة في أحمر في المخططات التفسيرية ، ظهرت على أنها مجرد عدد قليل من الأيزومرات العلوية ذات التنقل الكهربي خلال البعد الثاني بالقرب من تنقل CCCs غير المكررة لـ pBR-تي إيتضمين التغريدة لـ pBR-تي إيAatII ، ظهرت CCRIs كقوس يتكون من سلسلة من الأيزومرات العلوية التي تمتد من مكان به حركة كهربي خلال البعد الثاني ، أعلى قليلاً من OCs غير المكررة حتى OCRIs. أخيرًا ، لـ pBR-تي إيDraI ، ظهرت CCRIs أيضًا على شكل قوس يتكون من سلسلة من الأيزومرات العلوية التي تمتد من بقعة ذات قابلية للتنقل الكهربي خلال البعد الثاني ، أقل قليلاً من OCs غير المكررة حتى OCRIs أيضًا. ولكن في هذه الحالة ، أظهر قوس الإيزومرات العلوية RI انعطافًا لآخر جزيئات الالتواء الضعيفة.

لم تظهر الحركة الكهربية للأشكال غير المكررة لجميع البلازميدات الثلاثة المعزولة من خلايا parE10 التي تم تحليلها بدون الكلوروكين أي فرق عند مقارنتها بالحمض النووي المعزول من خلايا DH5 & # x003b1F & # x02032. في هذه المجسات المناعية ، على الرغم من ذلك ، كانت الكاتينانات المكررة بالكامل (CatAs ، CatBs ، و CatCs) مرئية بوضوح (بجوار العمود الأيمن في الشكل 6). كما ذكرنا سابقًا ، في حالة عدم وجود Topo IV ، & # x0223c ، فإن 20 ٪ من البلازميدات تفلت من تي إي- انسداد النسخ المتماثل للحنجرة والنسخ المتماثل الكامل ، لكن الدوبلكس الشقيقة تفشل في الفصل وتتراكم الكاتينانات (17 ، 29). لم يلاحظ أي فرق كبير بالنسبة لـ CCRIs المعزولة من خلايا parE10 مقارنة بالمناعة المناعية للحمض النووي المعزول من خلايا DH5 & # x003b1F & # x02032 في حالة pBR-تي إيStyI و pBR-تي إيتضمين التغريدة ومع ذلك ، فإن نمط القوس المقابل لـ CCRIs (كما هو موضح في أحمر في الرسم البياني التفسيري) لـ pBR-تي إيAatII كان مختلفًا بشكل كبير. على الرغم من أن غالبية الأيزومرات العلوية RI أظهرت في كلتا الحالتين أسرع تنقل كهربائي يمكن تمييزه ، إلا أنه يمكن اكتشاف عدد قليل فقط من الأيزومرات العلوية التي تظهر قدرة أقل على الحركة الكهربي أثناء البعد الثاني بالنسبة لـ RIs المعزولة من خلايا parE10. على العكس من ذلك ، في حالة الحمض النووي المعزول من خلايا DH5 & # x003b1F & # x02032 ، كان قوس CCRIs شبه مكتمل. تشير هذه الملاحظة بقوة إلى أنه على الأقل بالنسبة لـ pBR-تي إيAatII ، كانت CCRIs المعزولة من خلايا parE10 (حيث يكون Topo IV غير نشط) أكثر توترًا من تلك المعزولة من خلايا DH5 & # x003b1F & # x02032 (حيث يكون Topo IV نشطًا).

في محاولة لمقارنة التوتر الالتوائي لهذه RIs المعزولة من سلالات خلوية مختلفة بطريقة مختلفة ، تمت إضافة 5 & # x003bcg / ml chloroquine فقط خلال البعد الثاني لنظام الهلام ثنائي الأبعاد. الكلوروكين هو جزيء مستوٍ يقحم بين خيطي الحلزون المزدوج للحمض النووي. هذا الإقحام يغير تطور الحمض النووي. نظرًا لأن البلازميدات البكتيرية (& # x02212) - ملفوفة بشكل فائق ، يزيل الكلوروكين (& # x02212) - الالتفاف الفائق أولاً ويضيف الشبكة (+) - الالتفاف الفائق فقط بعد إزالة جميع الطبقات الأصلية (& # x02212) (37 ، 51). علاوة على ذلك ، فقد تبين مرارًا وتكرارًا أنه في الجزيئات المكررة جزئيًا التي تحتوي على شوكات ثلاثية الاتجاهات ، فإن التفاف المنطقة غير المكررة يحول ثلاثي الاتجاهات إلى تقاطعات رباعية الاتجاهات تسمى الشوكات المعكوسة أو أقدام الدجاج (37 ، 50 ، & # x0201353). الجزيئات مع هذه التقاطعات رباعية الاتجاهات حيث يختلف طول الذراع الرابع ليست (+) - فائق الالتفاف وتظهر نفس الحركة الكهربية مثل RI المكسورة.

كما ذكرنا سابقًا ، من المتوقع أن يؤثر إقحام الكلوروكين فقط في المنطقة غير المكررة من RIs على طوبولوجيا الحمض النووي. لهذا السبب ، سيكون له تأثير عميق على pBR-تي إيStyI لكن ليس على pBR-تي إي@ دراي (29 ، 37). اخترنا 5 & # x003bcg / ml chloroquine كما علمنا ذلك لـ pBR322 مع & # x00394لوك = 0 ، هذا التركيز يقدم & # x0223c23 (+) - supercils. 4 في الواقع ، أكدت النتائج التي تم الحصول عليها توقعاتنا. بالنسبة للبلازميدات الثلاثة المعزولة من خلايا DH5 & # x003b1F & # x02032 ، كان تأثير إقحام الكلوروكين على الجزيئات غير المكررة متشابهًا (بجانب العمود الأيسر في الشكل 6). The effect on the shape of the arc corresponding to partially replicated molecules, however, differed for the three plasmids. For pBR-terE@StyI, the electrophoretic mobility of CCRIs during the second dimension in the presence of 5 μg/ml chloroquine changed in a way similar to the change observed for unreplicated CCCs. Taking into account that CCRIs cannot re-gain mobility after the removal of all their native (−)-supercoiling (37, 50), we may conclude that in the presence of 5 μg/ml chloroquine the modal topoisomer for pBR-terE@StyI CCRIs was close to 0 (indicated by the corresponding red arrow in Fig. 6 ). For pBR-terE@AatII, the arc of CCRIs changed its shape dramatically. It described a smooth arc without chloroquine. This arc, though, turned into an acute angle in the presence of chloroquine during the second dimension. In this case the modal topoisomer was 𢄣 (indicated by the corresponding red arrow in Fig. 6 ). For pBR-terE@DraI, however, the change in the shape of the arc was subtle. If we compare these results with those obtained for the same three plasmids isolated from parE10 cells, the differences were obvious (see the right column on Fig. 6 ). pBR-terE@StyI CCRIs were not fully relaxed, and the majority of the molecules still showed an electrophoretic mobility higher than their corresponding OCRIs. The modal topoisomer in this case was 𢄤 (indicated by the corresponding red arrow in Fig. 6 ). This means that for pBR-terE@StyI CCRIs isolated from parE10 cells, exposure to 5 μg/ml chloroquine during the second dimension was not enough to remove all the torsional tension. For pBR-terE@AatII, the shape of the arc of CCRIs was not as abrupt as in the case of the molecules isolated from DH5㬟′ cells. Indeed, here most of the CCRIs were still torsionally tensioned and the modal topoisomer was � still showing an electrophoretic mobility significantly higher than their corresponding OCRIs (indicated by the corresponding red arrow in Fig. 6 ). For pBR-terE@DraI, however, the change in the shape of the arc was once again only subtle (the modal topoisomer was � for DH5㬟′ عكس � for parE10). Altogether, these observations indicated that 5 μg/ml chloroquine added during the second dimension affected the mobility of CCRIs differently. The results obtained confirmed that CCRIs isolated from parE10 cells were more torsionally tensioned than those isolated from DH5㬟′ cells. The effect of chloroquine was notable for pBR-terE@StyI, less apparent for pBR-terE@AatII, and almost negligible for pBR-terE@DraI. Unreplicated plasmids isolated from cells where Topo IV is inactive are slightly more (−)-supercoiled than those isolated from cells where Topo IV is active (44, 54). As mentioned previously, here we used the RecA − DH5㬟′ cells to avoid the formation of multimers due to recombination.

It was recently shown that torsional tension reduces the probability for Topo IV to create replication knots (29, 55,�). In contrast, it is well known that the level of DNA knotting is proportional to molecular mass (40, 59). To further confirm the results obtained so far, we decided to measure DNA knotting in the replicated region of the RIs isolated from DH5㬟′ and parE10 cells. We anticipated that the number and complexity of replication knots would be higher for pBR-terE@DraI and lower for pBR-terE@StyI. To facilitate the quantitation of replication knots, we digested the RIs of the three plasmids with AlwNI. This restriction enzyme cuts the plasmids only once at the unreplicated region (see Fig. 3 ). The resulting digested molecules consisted of linear DNAs containing an internal bubble. These molecules were analyzed in two-dimensional gels allowing the identification of unknotted and knotted forms after hybridization with proper probes. Finally, the signals corresponding to unknotted عكس knotted molecules were quantitated by densitometry (29, 43). The results obtained confirmed our expectations ( Fig. 7 ). For both cell strains (DH5㬟′ and parE10) the percentage of knotted bubbles increased with the size of the bubble (40). This observation suggests that torsional tension was higher for those CCRIs isolated from parE10 cells (29, 55,�).

Comparison of knotted and unknotted RIs of the three plasmids isolated from either DH5㬟′ or parE10 بكتريا قولونية cells analyzed by two-dimensional agarose gel electrophoresis. DNA was isolated, digested with AlwNI, and analyzed in two-dimensional gels. The area of the immunogram where unknotted and knotted RIs migrated was scanned and analyzed by densitometry. In each case, immunograms are shown to the اليسار, diagrammatic interpretations are in the middle, and densitometric profiles are to the حق. ال numbers في ال top right corner of each profile indicate the ratio of knotted/unknotted molecules. Note that for both cell types, this ratio was higher for pBR-terE@DraI. For each plasmid, however, the ratio was always higher for the RIs isolated from DH5㬟′ cells.


TOPOLOGICAL DYNAMICS IN THE UN-REPLICATED REGION OF REPLICATION INTERMEDIATES

The situation becomes even more complicated during replication. The cartoons in Figure 2 illustrate the changes in topological sign and chirality that occur as replication progresses in a circular covalently-closed (CCC) molecule in vivo. In bacteria, un-replicated circular molecules are maintained negatively supercoiled by the combined action of DNA gyrase introducing (-) RH supercoils and topoisomerase I keeping it under control (Figure 2A).

As replication starts, the advance of replication forks generates (+) supercoiling (over-winding of the DNA duplex) that transiently accumulates only immediately ahead of the forks (Figure 2B). RH (-) crossings and LH (+) ones cancel each other because they cannot co-exist in the same topological domain. Topo IV removes some of the LH (+) supercoils that form as a result of the advance of replication forks, and DNA gyrase introduces RH (-) supercoils to keep the un-replicated region negatively supercoiled. Note that in the cartoon represented in Figure 2B the upper part of the un-replicated region appears positively supercoiled while the lower part is negatively supercoiled. As mentioned above, this situation is inconsistent and it is presented here only for didactical reasons. The advancing rate of the DNA helicase far exceeds the capacity of Topo IV and DNA gyrase to completely eliminate all the overwound LH (+) supercoiling that transiently accumulates immediately ahead of the advancing forks. [ 12 ] To solve this conundrum, Champoux & Been proposed that fork swiveling allows some of these LH (+) supercoils to migrate from the un-replicated to the replicated region. [ 12 ] This causes intertwining of the newly made sister duplexes. The nodes between sister duplexes in the replicated region are called pre-catenanes. [ 13 ] Migration of each crossing from the un-replicated region to the replicated one generates two pre-catenane crossings (Figure 2C).

It is important to note that replication intermediates contain two regions that in vivo behave as independent topological domains: the un-replicated and the replicated regions. The combined action of Topo IV, DNA gyrase and swiveling of the forks guarantee that the un-replicated region is always kept negatively supercoiled (Figure 2C).


TOPOLOGICAL DYNAMICS IN THE REPLICATED REGION OF REPLICATION INTERMEDIATES

The sister duplexes in the replicated region cannot be supercoiled because rotation of the free ends of the nascent strands of the duplex dissipates all the torsional tension that might form in vivo as well as in vitro. In replication intermediates, it is energetically favorable for supercoils of the un-replicated region to diffuse to the replicated one, and vice-versa, with opposite handedness. [ 4 ] For this reason, the LH supercoil crossings that transiently accumulate immediately ahead of the forks (Figure 2B) migrate to the replicated region as RH pre-catenane crossings. As crossing DNA duplexes run in opposite directions in the un-replicated region, whilst they run in the same direction in the replicated one, the (+) sign of the crossings is maintained after their diffusion to the replicated region (Figure 2C). Hence, replication intermediates in vivo comprise RH (-) crossings in the un-replicated region and RH (+) pre-catenane crossings in the replicated one (Figure 2C). As replication forks keep advancing, the un-replicated region becomes progressively smaller, with fewer (-) supercoils, while the replicated region becomes larger, with more and more RH (+) pre-catenanes (Figure 2C). Finally, once replication is completed, the fully replicated sister duplexes end-up heavily catenated (Figure 2F). Topo IV is responsible for the elimination of all catenane crossings leading to the segregation of the newly made sister molecules. [ 14 ] At the same time, DNA gyrase progressively introduces (-) supercoiling in the daughter CCCs [ 15 ] to start the cycle again (Figure 2G).


DNA topoisomerase II

DNA topoisomerase II is ATP dependent enzyme which required 2 ATP molecule per reaction. It acts of entire double-stranded DNA, cut it and rejoin it. Topo II relaxes positive supercoiling in eukaryotic DNA.

One special type of DNA topoisomerase II found in prokaryote named “DNA gyrase” which introduces supercoiling in bacterial DNA. DNA gyrase performs both functions of releasing as well as introducing negative supercoiling in bacterial DNA.

Image credit: “Molecular biology of the gene”, 7th edition by Watson. The image represents how topoisomerase II cut dsDNA and relax it.

Another important function is performed by topoII, are catenation and de-catenation. Imagine two linked rings. DNA molecules are catenated in the same manner. Here, topoisomerase cut the dsDNA and decatenate it for relaxing. Further, it catenates the decatenated DNA for supercoiling.

Image credit: “Molecular biology of the gene”, 7th edition by Watson. the Image represents catenation and decatenation.

The process of decatenation is a very important process as it allows separation of the DNA molecule into two daughter cells, after replication.


الملخص

The replication of chromosomal DNA is a fundamental event in the life cycle of every cell. The first step of replication, initiation, is controlled by multiple factors to ensure only one round of replication per cell cycle. The process of initiation has been described most thoroughly for bacteria, especially الإشريكية القولونية, and involves many regulatory proteins that vary considerably between different species. These proteins control the activity of the two key players of initiation in bacteria: the initiator protein DnaA and the origin of chromosome replication (oriC). Factors involved in the control of the availability, activity, or oligomerization of DnaA during initiation are generally regarded as the most important and thus have been thoroughly characterized. Other aspects of the initiation process, such as origin accessibility and susceptibility to unwinding, have been less explored. However, recent findings indicate that these factors have a significant role. This review focuses on DNA topology, conformation, and methylation as important factors that regulate the initiation process in bacteria. We present a comprehensive summary of the factors involved in the modulation of DNA topology, both locally at oriC and more globally at the level of the entire chromosome. We show clearly that the conformation of oriC dynamically changes, and control of this conformation constitutes another, important factor in the regulation of bacterial replication initiation. Furthermore, the process of initiation appears to be associated with the dynamics of the entire chromosome and this association is an important but largely unexplored phenomenon.


2 إجابات 2

This article (DNA Topology: Fundamentals by Mirkin SM) probably defines and describes linking number better than I ever could:

The fundamental topological parameter of a covalently closed circular DNA is called the linking number (Lk). Assume that one DNA strand is the edge of an imaginary surface and count the number of times that the other DNA strand crosses this surface (Figure 3). The algebraic sum of all intersections (which accounts for a sign of every intersection) is the Lk. Two important features of the Lk are evident from Figure 3. First, Lk is always an integer. Second, Lk cannot be changed by any deformation of the DNA strands, i.e. it is topologically invariant. The only way to change Lk is to introduce a break in one or both DNA strands, rotate the two DNA strands relative to each other and seal the break. Another characteristic of a circular DNA is called twist, or Tw. Tw is the total number of helical turns in circular DNA under given conditions. Since DNA is a right handed helix with 10.5 base pairs (bp) per turn, Tw is a large positive number for any natural DNA. Take a planar, circular DNA and try to locally separate the two DNA strands, i.e. to decrease the Tw. Since Lk cannot change, a decrease in Tw will be compensated by several positive writhes of the double helix (Figure 4). Writhing (Wr) is the third important characteristic of circular DNA, describing the spatial pass of the double helix axis, i.e. the shape of the DNA molecule as a whole. Wr can be of any sign, and usually its absolute value is much smaller than that of Tw. The above consideration can be formalized by the following equation: Lk = Tw + Wr. Note, that while Lk is an integer, neither Tw nor Wr should be such. Also, neither Tw nor Wr are topological invariants and their values easily change.

Linking number is simply the number of times one strand of DNA passes over the other. Compare this to:

You can, perhaps, think of twist as the passing over of strands within the helix and writhe as the passing over of strands when the entire helix crosses itself. Both twist and writhe involve strands of DNA passing over the other and so both contribute to the linking number. In the absence of writhe, linking number and twist are equal and both describe the same thing: the number of helical turns. However, in the presence of writhe, twist alone is insufficient to describe the topology of DNA because it doesn't account for the passing of the entire helix over itself.

Since twist is the number of helical turns, actually counting it in your image is not necessarily difficult, just time consuming. The image already has the twists numbered, and I've put a red do at every turn of the double helix. I've also circled, in blue, every point where the double helix passes over itself (writhe):

In that image, in may be difficult to visualize (and even understand!) that the strands only cross over each other 36 times (Lk), even though there are 42 helical turns (Tw). While twist and writhe are different modes of strand crossing, it is important to realize that they are interchangeable without breaking the strands. Let's consider a simpler example, where Lk = -1 (Wikipedia: DNA Supercoil):

In the lower image, the strands do not form a helical structure (Tw = 0) but they do both pass over each other together (Wr = -1). Can you imagine that if you were to "unfold" the superhelix (Wr = 0), the two individual strands would still be مرتبط together in a helical structure (Tw = -1)? Neither could I, so I made a video with my shoelaces:

I hope that answers your question. Let me know if I misunderstood what you were asking or if anything needs clarification. You may also find my shoelace video on the topology of helicase-mediated DNA unwinding informative.


شاهد الفيديو: Nucleic acids and DNA - الاحماض النووية والدنا - MOLECULAR BIOLOGY - تعلم بالعربي (سبتمبر 2022).