معلومة

منحنى قياسي للوقت الحقيقي

منحنى قياسي للوقت الحقيقي



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

عند إجراء منحنى قياسي لبعض البادئات الجديدة لاختبار تغيير الطية ، هل من الضروري تشغيل المنحنى القياسي؟ أعني ، في حالة احتواء تجربتك على عدة أنماط وراثية لنفس خلفية النمط البيئي ، مع التحكم والمعالجات المتوافقة ، هل يجب علي تشغيل المنحنيات القياسية لكل هذه السيناريوهات ، أو بالأحرى هل يمكنني اختيار ، فقط لأقول نمطًا وراثيًا عشوائيًا للأنواع المعالجة ، انظر أنه R = 0.99 هو أو أعلى والكفاءة 2؟ من أجل عدم إهدار المواد.


قم بعمل المنحنى القياسي مرة واحدة لكل زوج تمهيدي لتحديد الكفاءات. يمكنك استخدام قيم الكفاءة لأي عدد من التكرارات مع أي قالب.

أعتقد أننا ناقشنا هذه المسألة إلى حد ما في رسالتك السابقة.


تأثير القالب على إنشاء منحنى قياسي للتقدير الكمي المطلق لفيروس RNA عن طريق تفاعل سلسلة النسخ العكسي للبوليميراز في الوقت الفعلي

تم تقييم تأثير القوالب المختلفة على إنشاء المنحنيات القياسية اللازمة للتقدير الكمي المطلق لفيروس الحمض النووي الريبي عن طريق النسخ العكسي في الوقت الحقيقي- PCR (RT-PCR). استخدمنا فيروس نخر البنكرياس المعدي (IPNV) ، أحد مسببات الأمراض الفيروسية الرئيسية للسلمون البري والمستزرع ، كمثال لفيروس RNA للدراسة. تم استخدام سلسلة تخفيف من أربعة قوالب مختلفة تمثل جين بروتياز IPNV (اثنان في المختبر من RNAs من 100 قاعدة و 500 قاعدة في الطول ، DNA البلازميد و DNA oligo) كقالب لإنتاج منحنيات معيارية لقياس حمل IPNV في تراوت قوس قزح . كان المنحدر وجودة الملاءمة (r (2)) وكفاءة (e) PCR مكافئة إحصائيًا بغض النظر عن طبيعة القالب المستخدم في PCR. باستخدام ANOVA عاملي ، لم يلاحظ أي فرق كبير في عدد نسخ IPNV باستخدام المنحنيات القياسية الأربعة المختلفة للتقدير الكمي المطلق لـ IPNV في تراوت قوس قزح الذي يواجه تحديات تجريبية. ومع ذلك ، عندما كانت وفرة نسخة IPNV أقل من 100 نسخة لكل تفاعل وعندما كان حجم القالب أكبر من تضخيم حجم amplicon كان أكثر تنوعًا. تشير البيانات إلى أن حجم القالب المستخدم لإنشاء منحنى قياسي يجب أن يكون مشابهًا جدًا لحجم amplicon. سيكون قالب أوليجو للحمض النووي الاصطناعي هو الأمثل لهذا الغرض حيث يمكن تصنيعه حسب الطلب ويتطلب فقط معلومات التسلسل لتركيبه. ومع ذلك ، إذا تم إنشاء المنحنى القياسي برقم نسخ القالب يزيد عن 100 نسخة لكل تفاعل ، فإن طبيعة القالب ليس لها أي تأثير على المنحنى القياسي ، وبالتالي ، سيكون القالب الأرخص هو الخيار المفضل للقالب على الآخر. خيارات باهظة الثمن.


طريقة تعتمد على المنحنى القياسي لمعالجة بيانات PCR النسبية في الوقت الحقيقي

خلفية: يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي الطريقة الأكثر دقة لقياس التعبير الجيني. تولد الطريقة كمية كبيرة من البيانات الرقمية الخام وقد تؤثر المعالجة بشكل ملحوظ على النتائج النهائية. تعتمد معالجة البيانات إما على المنحنيات القياسية أو على تقييم كفاءة PCR. في الوقت الحالي ، يُفضل نهج كفاءة PCR في PCR النسبي بينما يستخدم المنحنى القياسي غالبًا في PCR المطلق. ومع ذلك ، لا توجد حواجز أمام استخدام المنحنيات القياسية لـ PCR النسبي. توفر هذه المقالة تنفيذًا لطريقة المنحنى القياسي وتناقش مزاياها وقيودها في PCR في الوقت الفعلي النسبي.

نتائج: قمنا بتصميم إجراء لمعالجة البيانات في الوقت الحقيقي النسبي PCR. يتجنب الإجراء تمامًا تقييم كفاءة PCR ، ويقلل من مشاركة المشغل ويوفر تقييمًا إحصائيًا للتباين داخل الفحص. يتضمن الإجراء الخطوات التالية. (I) يتم تصفية الضوضاء من قراءات التألق الخام عن طريق التنعيم والطرح الأساسي وتطبيع السعة. (II) يتم تحديد الحد الأمثل تلقائيًا من معلمات الانحدار للمنحنى القياسي. (III) نقاط العبور (CPs) مشتقة مباشرة من إحداثيات النقاط حيث يتقاطع خط العتبة مع مخططات التألق التي تم الحصول عليها بعد تصفية الضوضاء. (4) يتم احتساب الوسائل واختلافاتها من أجل CPs في نسخ PCR المتماثلة. (5) النتائج النهائية مستمدة من وسائل CPs. يتم تتبع تباينات CPs إلى النتائج بواسطة قانون انتشار الخطأ. يتم توفير وصف تفصيلي وتحليل لمعالجة هذه البيانات. يتم تحليل القيود المرتبطة باستخدام الأساليب الإحصائية البارامترية وتطبيع السعة على وجه التحديد ووجد أنها مناسبة للممارسة المخبرية الروتينية. تمت مناقشة الخيارات المختلفة لتجميع البيانات التي تم الحصول عليها من جينات مرجعية متعددة.

استنتاج: تم تجميع إجراء معياري قائم على المنحنى لمعالجة بيانات PCR والتحقق من صحته. يوضح أن تصميم المنحنى القياسي يظل بديلاً موثوقًا وبسيطًا للحسابات القائمة على كفاءة PCR في الوقت الفعلي النسبي PCR.


9 أمثلة واقعية للتوزيع الطبيعي

يستخدم التوزيع الطبيعي على نطاق واسع في فهم توزيعات العوامل في السكان. نظرًا لأن التوزيع الطبيعي يقارب العديد من الظواهر الطبيعية جيدًا ، فقد تطور إلى معيار مرجعي للعديد من مشاكل الاحتمال.

التوزيع الطبيعي / الغاوسي هو رسم بياني على شكل جرس يشتمل على مصطلحين أساسيين - يعني والانحراف المعياري. إنه ترتيب متماثل لمجموعة بيانات تتجمع فيها معظم القيم في الوسط وتتناقص الباقي بشكل متماثل نحو أي من الطرفين. تؤثر العديد من العوامل الوراثية والبيئية على السمة.

نظرية الحد المركزي

يتبع التوزيع الطبيعي نظرية الحد المركزي التي تنص على أن العديد من العوامل المستقلة تؤثر على سمة معينة. عندما تساهم جميع هذه العوامل المستقلة في ظاهرة ، فإن مجموعها الطبيعي يميل إلى أن ينتج عنه توزيع غاوسي.

منحنى عادي

يحدد متوسط ​​التوزيع موقع مركز الرسم البياني ، ويحدد الانحراف المعياري ارتفاع وعرض الرسم البياني والمساحة الإجمالية تحت المنحنى الطبيعي تساوي 1.

دعونا نفهم أمثلة الحياة اليومية للتوزيع الطبيعي.

1. الارتفاع

ارتفاع السكان هو مثال على التوزيع الطبيعي. معظم الناس في مجموعة سكانية محددة متوسط ​​الطول. عدد الأشخاص الأطول والأقصر من متوسط ​​الطول متساوٍ تقريبًا ، وعدد قليل جدًا من الأشخاص إما طويل القامة أو قصير جدًا. ومع ذلك ، فإن الارتفاع ليس خاصية واحدة ، فالعديد من العوامل الوراثية والبيئية تؤثر على الارتفاع. لذلك ، يتبع التوزيع الطبيعي.

2. رمي النرد

يعتبر التدحرج العادل للنرد أيضًا مثالًا جيدًا على التوزيع الطبيعي. في إحدى التجارب ، وجد أنه عندما يتم رمي النرد 100 مرة ، فإن فرص الحصول على & # 82161 & # 8217 هي 15-18٪ وإذا رمي النرد 1000 مرة ، فإن فرص الحصول على & # 82161 & # 8217 هي ، مرة أخرى ، نفس الشيء ، والذي يبلغ متوسطه 16.7٪ (1/6). إذا دحرجنا نردتين في وقت واحد ، فهناك 36 مجموعة ممكنة. متوسط ​​احتمال التدحرج & # 82161 & # 8217 (مع ستة مجموعات محتملة) مرة أخرى إلى حوالي 16.7 ٪ ، أي (6/36). سيكون عدد النردات الأكثر تفصيلاً هو الرسم البياني للتوزيع العادي.

3. رمي قطعة نقود

يعد تقليب العملة أحد أقدم الطرق لتسوية النزاعات. لقد قلبنا جميعًا عملة معدنية قبل المباراة أو المباراة. إن الإنصاف المتصور في قلب العملة يكمن في حقيقة أن لها فرصًا متساوية للتوصل إلى أي من النتيجتين. فرص الحصول على الرأس هي 1/2 ، ونفس الشيء بالنسبة للذيول. عندما نجمع كلاهما ، فإنه يساوي واحدًا. إذا ألقينا العملات المعدنية عدة مرات ، فسيظل مجموع احتمالية الحصول على صورة وذيول 1 دائمًا.

4. معدل الذكاء

في هذا السيناريو الخاص بالمنافسة المتزايدة ، يرغب معظم الآباء ، وكذلك الأطفال ، في تحليل مستوى الحاصل الذكي. حسنًا ، معدل الذكاء لسكان معينين هو منحنى توزيع طبيعي حيث يقع معدل الذكاء لغالبية السكان في النطاق الطبيعي بينما يقع معدل الذكاء لبقية السكان في النطاق المنحرف.

5. سوق الأسهم الفنية

سمع معظمنا عن ارتفاع وانخفاض أسعار الأسهم في البورصة.

والدينا أو في الأخبار عن هبوط أسعار الأسهم ورفعها. غالبًا ما تشكل هذه التغييرات في قيم السجل لأسعار الفوركس ومؤشرات الأسعار وأسعار الأسهم منحنى على شكل جرس. بالنسبة لعوائد المخزون ، غالبًا ما يسمى الانحراف المعياري بالتقلب. إذا تم توزيع العوائد بشكل طبيعي ، فمن المتوقع أن يقع أكثر من 99 في المائة من العوائد ضمن انحرافات القيمة المتوسطة. تسمح هذه الخصائص للتوزيع العادي على شكل جرس للمحللين والمستثمرين بعمل استنتاجات إحصائية حول العائد المتوقع ومخاطر الأسهم.

6. توزيع الدخل في الاقتصاد

يكمن دخل أي بلد في أيدي السياسة والحكومة الدائمة. يعتمد عليهم في كيفية توزيع الدخل بين المجتمعات الغنية والفقيرة. نحن جميعًا ندرك جيدًا حقيقة أن الطبقة الوسطى أعلى قليلاً من السكان الأغنياء والفقراء. لذا ، فإن أجور الطبقة الوسطى تشكل المتوسط ​​في منحنى التوزيع الطبيعي.

7. حجم الحذاء

هل تساءلت عما كان سيحدث إذا كان النعال الزجاجي الذي تركته سندريلا في منزل الأمير & # 8217s يناسب قدم امرأة أخرى؟ كان سينتهي به الأمر بالزواج من امرأة أخرى. لقد كان أحد الافتراضات المسلية التي صادفناها جميعًا. وفقًا للبيانات التي تم جمعها في الولايات المتحدة ، يتم عادةً توزيع مبيعات الأحذية النسائية حسب الحجم لأن التركيب الجسدي لمعظم النساء متماثل تقريبًا.

8. الوزن عند الولادة

يتراوح الوزن الطبيعي عند الولادة من 2.5 إلى 3.5 كجم. يتمتع غالبية الأطفال حديثي الولادة بوزن طبيعي عند الولادة ، في حين أن نسبة قليلة فقط من الأطفال حديثي الولادة لديهم وزن أعلى أو أقل من الوزن الطبيعي. ومن ثم ، فإن الوزن عند الولادة يتبع أيضًا منحنى التوزيع الطبيعي.

9. تقرير متوسط ​​الطالب & # 8217s

في الوقت الحاضر ، تعلن المدارس عن أدائها على وسائل التواصل الاجتماعي والتلفزيون. يقدمون النتيجة المتوسطة لمدرستهم ويحثون الآباء على تسجيل أطفالهم في تلك المدرسة. تجد السلطات المدرسية متوسط ​​الأداء الأكاديمي لجميع الطلاب ، وفي معظم الحالات ، تتبع منحنى التوزيع الطبيعي. متوسط ​​عدد الطلاب الأذكياء أعلى من معظم الطلاب الآخرين.


SYBR Green qPCR مع بروتوكول المنحنى القياسي

يعتمد هذا البروتوكول على تجارب استخدام آلة StepOnePlus ويهدف إلى مساعدة المستخدمين في الحصول على نتائج qPCR ذات مغزى.

إجراء

الخطوة 1: تنقية الحمض النووي الريبي

استخدم المجموعة المناسبة المتوفرة تجاريًا اعتمادًا على الأنواع ونوع العينة (خلايا الثدييات / الأنسجة / الدم ، الخميرة ، النبات). اتبع البروتوكول بعناية ، مع توخي الحذر الشديد بشأن التلوث بـ RNAses. لا تلمس أي شيء بأيدٍ عارية ، وقم بتغيير القفازات كثيرًا ، وتنظيف سطح الطاولة والمعدات باستخدام رذاذ إزالة RNAse المتاح تجاريًا (على سبيل المثال RNAse Away # 038184 ، MBP). يجب شراء جميع الملابس البلاستيكية (أطراف الماصة ، وأنابيب البولي بروبلين 1.5 مل ، وما إلى ذلك) "خالية من RNAse". لا تقم بتعقيم الأنابيب البلاستيكية قبل استخدامها. من الجيد عمومًا أن يكون لديك مصدر جيد للمياه الخالية من RNAse قبل البدء.

الخطوة 2: تقييم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي المنقى

بعد الخطوة الأخيرة لتنقية الحمض النووي الريبي باستخدام إحدى المجموعات المذكورة أعلاه ، خذ قسمة صغيرة (5-10ul) من الحمض النووي الريبي لاختبار الجودة. انقل هذه القسمة إلى أنبوب خالٍ من الحمض النووي الريبي الجديد وقم بتخزين باقي العينة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. حدد تركيز (ng / ul) من الحمض النووي الريبي المنقى الخاص بك باستخدام آلة nanodrop أو ما يعادلها. سيتعين عليك تفريغ الجهاز بنفس المحلول (الماء الخالي من RNAse بشكل عام) الذي استخدمته لاستخراج RNA في الخطوة الأخيرة من إجراء تنقية RNA. بشكل عام ، ستكون مهتمًا في الغالب بالتركيز من آلة nanodrop ، لكن بعض القيم الأخرى يمكن أن تعطيك بعض المعلومات حول التلوث بالبروتين أو المذيبات التي قد تكون مفيدة. على سبيل المثال ، تعتبر نسبة 260 نانومتر إلى 280 نانومتر 2.0 على الأقل خالية نسبيًا من البروتين والمذيبات. وبالمثل ، تتراوح نسبة 260 نانومتر إلى 230 نانومتر بشكل عام من 2.0 إلى 2.2 ويمكن أن تشير القيم الأقل إلى وجود الكربوهيدرات أو المذيبات.

لاختبار الجودة ، يمكنك إما تشغيل RNA gel أو استخدام Agilent Bioanalyzer أو آلة مكافئة لحساب النسبة بين 28S و 18S RNA لتحديد ما إذا كان هناك تدهور (أو تلوث RNAse).

حتى إذا كان برنامج الحصول على الصور الخاص بك لا يسمح بحساب شدة النطاق ، يمكنك إنشاء قيم 28S: 18S جيدة إلى حد ما باستخدام برنامج ImageJ. للقيام بذلك ، افتح ملف صورتك باستخدام ImageJ ، ارسم مربعًا مستطيلًا في منطقة فارغة / سوداء وانقر فوق Analyze-Measure. هذه هي قيمة الخلفية التي ستطرحها من قيم 28S و 18S. ثم اسحب المربع إلى شريط 28S ، وانقر فوق Analyze-Measure ثم كرر مع الفرقة 18S (الشكل 2).

يمكنك أيضًا استخدام وظيفة ملف تعريف ImageJ Analyze-Plot لإنشاء رسم بياني يوضح الكميات النسبية 28S و 18 S والتدهور (الشكل 3).

إذا كنت تستخدم Agilent Bioanalyzer ، فستعتمد على كل من نسبة 28S: 18S ورقم تكامل RNA (RIN). يصفون كلا المقياسين في هذه الوثيقة:

يستخدم Agilent Bioanalyzer نهج ميكروفلويديكس لتقييم جودة الحمض النووي الريبي ، ولكن المبدأ معقول مشابه لما هو موصوف أعلاه. يوضح الشكل 4 بعض نتائج العينة.

بالنسبة للعديد من التطبيقات ، من الأفضل استخدام RNA فقط مع 28S: 18S & gt1.5 و RIN & gt8.0.

الخطوه 3: أول توليف حبلا (إنتاج cDNA)

بدءًا من RNA الذي قمت بتخزينه عند -80 درجة مئوية (الخطوة 2) ، اتبع البروتوكول من مجموعة توليف cDNA التي تختارها. تتطلب هذه المجموعات عمومًا أي مكان من 1ng إلى 5ug من RNA. ارجع إلى تركيزات nanodrop التي حصلت عليها في الخطوة 2 وقم بإجراء أول تخليق حبلا بكميات متساوية (نانوغرام) من الحمض النووي الريبي لجميع عيناتك. سوف تحتاج إلى معادلة الأحجام بمياه خالية من RNAse.

بعد الانتهاء من البروتوكول المرتبط بالمجموعة التي اخترتها ، يوصى بتنظيف cDNA باستخدام مجموعة متوفرة تجاريًا (على سبيل المثال تنظيف Qiagen's Qiaquick PCR أو MACHEREY-NAGEL's NucleoSpin Gel و PCR Clean-up) لإزالة أوليغومرات المتبقية ونسخة عكسية. قم بتخفيف عينات cDNA الخاصة بك على الأقل 1: 5 في الماء الخالي من RNAse ، خذ قسامة صغيرة (10ul-20ul) من كل واحدة ، وقم بتخزين عينات cDNA المتبقية عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية حتى تحتاج إليها.

الخطوة الرابعة: اختبار qPCR التمهيدي الخاص بك

سواء كنت قد اشتريت مواد أولية متوفرة تجاريًا أو أنشأت بنفسك باستخدام بروتوكولنا ، صمم qPCR Primers الخاصة بك ، فمن المهم اختبار البرايمر باستخدام العينات الخاصة بك ، و SYBR Green Master Mix ، وجهاز qPCR الخاص بك للتأكد من أنك تقوم بتضخيم واحد amplicon وأن هذا هو التسلسل الصحيح لـ mRNA الذي تحاول قياسه.

* لاحظ دائمًا تأكيد أن المزيج الرئيسي qPCR متوافق مع آلة qPCR التي ستستخدمها

إجراء لإعداد لوحة qPCR للاختبار الأولي للاشعال qPCR

1) بدءًا من القسمة الصغيرة 10-20ul التي أخذتها في نهاية الخطوة 3 أعلاه ، قم بإنشاء مجموعة واحدة من جميع عينات cDNA لغرض اختبار qPCR Primer هذا. قم بعمل سلسلة تخفيف (1: 5) من هذا التجمع حتى تتمكن من رؤية مكان قيم Ct الخاصة بك في النطاق القابل للقياس. يجب أن يكون كافياً للحصول على التركيزات التالية:

2) يجب أن يكون محلول مخزون التمهيدي (للأمام والعكس) بتركيز 10 ميكرومتر.

3) قم بإعداد مزيج رئيسي من SYBR Green Master Mix (2X) والبادئات (0.4uM).

4) مزيج لفترة وجيزة و 10ul ماصة في كل بئر من لوحة qPCR. لتجنب الفقاعات ، ادفع مكبس عامل الماصة إلى وضع الإخراج قبل تجميع الخليط. سيحتوي طرف الماصة الآن على أكثر من 10ul ، ولكنه سيخرج فقط 10ul (ولا توجد فقاعات) إذا توقفت عند نقطة المقاومة الأولى أثناء الإخراج مباشرة في قاع البئر. أضف 10ul إلى جميع الآبار التي ستستخدمها.

5) استخدم طرف ماصة منفصل لكل بئر ، وأضف 10ul من العينة (مخففة بشكل صحيح بالماء) مباشرة في SYBR Green Master Mix الذي يحتوي على مواد أولية. اخلط بالمص لأعلى ولأسفل مرة أو مرتين. لا تستخدم وظيفة الإخراج لعامل الماصة في هذه الخطوة. قم دائمًا أيضًا بتشغيل عنصر تحكم سلبي (مزيج رئيسي ، مواد أولية ، وماء) حتى تتمكن من اختبار وجود ثنائيات البرايمر ودرجة حرارة انصهارها وما إلى ذلك.

6) ختم الطبق الخاص بك مع الأختام البصرية qPCR وابدأ تشغيل qPCR على آلة qPCR الخاصة بك. إذا كان برنامج جهازك يجعلك تختار ، فستحتاج إلى الإشارة إلى أنك تستخدم كواشف SYBR Green (وليس Taqman) ، وأنك تريد البروتوكول الطويل (وليس البروتوكول السريع) ، وأنك تستخدم طريقة دلتا دلتا Ct ، و التي تريد تضمينها في تحديد منحنى الذوبان. إذا كنت مجبرًا على اختيار جين مرجعي وعينة مرجعية ، فاختر أيًا منها لأنك تختبر للتو بادئات qPCR الخاصة بك.

بعد تشغيل qPCR ، استخدم البرنامج لتقييم النتائج ، ولكن حفظ اللوحة في 4C للخطوة 5.

منحنيات الانصهار (اختبار خصوصية)

باستخدام برنامج آلة qPCR ، انظر إلى منحنيات الذوبان لكل زوج تمهيدي يتم اختباره لمعرفة ما إذا كانت هناك ذروة درجة حرارة واحدة. يوضح الشكل 5 بعض الأمثلة على منحنيات الانصهار الجيدة والسيئة.

مخططات التضخيم (إيجاد المدى الخطي)

بعد ذلك ، باستخدام برنامج آلة qPCR ، انظر إلى منحنيات التضخيم لكل من التخفيفات 1: 1 ، 1: 5 ، 1:25 ، 1: 125 المعدة أعلاه جنبًا إلى جنب مع عنصر التحكم السلبي. يجب أن يمثل كل تغيير وحدة واحدة في Ct فرقًا بمقدار ضعفين في مادة البداية ، لذلك يجب أن ترى تحولًا نحو قيم Ct الأعلى مع عينات أكثر تمييعًا. ما تحتاج إلى إلقاء نظرة عليه هنا هو شكل المنحنى. قد تحتوي العينات المركزة جدًا على منحنى تضخيم على شكل حرف S ، بينما قد لا تحتوي العينات المخففة جدًا على منحنى على الإطلاق أو تحتوي على قيم Ct عالية جدًا (الشكل 6).

بناءً على نتائج هذا التحليل ، ستعرف إلى أي درجة (1: 1 ، 1: 5 ، 1:25 ، أو 1: 125) ستحتاج إلى تخفيف (كدنا) الخاص بك قبل استخدام هذا الزوج التمهيدي لرؤية هذه C- منحنيات الشكل عند تنفيذ الخطوة 7.

الخطوة الخامسة: تسلسل سانجر للمنتج وتوليد المنحنى القياسي

الآن بدءًا من لوحة qPCR المكتملة / المختومة التي قمت بتخزينها في 4 درجة مئوية ، قم بتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة متوفرة تجاريًا (على سبيل المثال تنظيف Qiagen's Qiaquick PCR أو MACHEREY-NAGEL's NucleoSpin Gel و PCR Clean-up). حدد تركيز (ng / ul) من الحمض النووي المنقى الخاص بك باستخدام آلة nanodrop أو ما يعادلها. سيتعين عليك تفريغ الجهاز بنفس المحلول (الماء الخالي من الحمض النووي بشكل عام) الذي استخدمته لاستخراج الحمض النووي في الخطوة الأخيرة من إجراء تنقية الحمض النووي.سجل هذا التركيز ، والذي سيكون مهمًا جدًا بالنسبة لك لمعرفة الوفرة الحقيقية (ng) لمنتج PCR الذي تستخدمه عند إنشاء المنحنى القياسي الخاص بك. أرسل جزءًا صغيرًا من منتج PCR المنقى وإما التمهيدي الأمامي أو العكسي إلى شركة تقوم بتنفيذ تسلسل Sanger كخدمة باتباع تعليماتها بعناية فيما يتعلق بتركيز العينة والتمهيدي. التكاليف بشكل عام 5 يورو / تسلسل. عندما يرسلون إليك النتائج تؤكد أن المنتج المضخم هو بالفعل الجين محل الاهتمام. يمكنك أيضًا إلقاء نظرة على المنتج المنقى على هلام DNA agarose الملون EtBr للتأكد من وجود نطاق واحد في الوزن الجزيئي المتوقع ، ولكن التسلسل كافٍ بشكل عام.

لتوليد المنحنى القياسي ، قم بتخفيف منتج PCR المتسلسل من أعلى 1: 100 في محلول TE 1X ، ودرجة الحموضة 7.5 مع 10ug / ml DNA Salmon Sperm المنفصمة. على سبيل المثال ، أضف 10ul من منتج PCR المنقى إلى المخزن المؤقت 990ul. ثم قم بإجراء سلسلة تخفيف 1:10 في نفس المخزن المؤقت لإعداد المعايير: 1:10 3 و 1:10 4 و 1:10 5 و 1:10 6 و 1:10 7. يوصى بعمل 500 مايكرولتر على الأقل من كل معيار وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

* ملاحظة: عند التعامل مع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المضخمة ، من المحتمل جدًا أنك سوف تلوث ماصة ماصة. استخدم نصائح التصفية وفكر في استعارة عامل المرور الخاص بجارك لهذه الخطوة.

الخطوة السادسة: تقييم كفاءة qPCR الخاص بك

الآن بعد أن قمت بإنشاء المنحنى القياسي الخاص بك ، يمكنك اختبار هذه العينات باستخدام آلة qPCR الخاصة بك. باستخدام نفس الإجراء بالضبط كما في الخطوة 4 ، قم بتنفيذ qPCR وفقًا لمعاييرك ، كل واحد في ثلاث نسخ. قد يسمح لك جهازك بإدخال الكميات الحقيقية (ng) لكل معيار ، والتي يجب أن تعرفها بناءً على نتائج nanodrop في الخطوة 5.

يظهر منحنى قياسي جيد في الشكل 7.

أثناء تقييمك لمعاييرك (1:10 3 ، 1:10 4 ، 1:10 5 ، 1:10 6 ، 1:10 7) ، قد تجد أن بعضها لا يتماشى مع المعايير الأخرى لأنها مخففة جدًا أو شديد التركيز. يمكنك استبعاد هذه من التحليل للعثور على أفضل 3 أو 4 معايير للمقايسة الخاصة بك. بشكل عام ، لا تعاني المعايير من ظاهرة المنحنى على شكل حرف S الموصوفة في الشكل 6 ، ويمكن أن يمتد النطاق الخطي إلى قيم Ct حول 10 (الشكل 7). بعد التخلص من هذه القيم المتطرفة ، إذا كان المنحنى القياسي الخاص بك لا يزال يحتوي على قيمة R 2 غير مقبولة ، فستحتاج على الأرجح إلى إعادة عمل المنحنى القياسي ، مع الحرص على مزج كل تخفيف جيدًا قبل الانتقال إلى التخفيف التالي. قد تشير الكفاءة التي تزيد عن 100٪ إلى مشاكل أكثر أهمية ، ومع ذلك ، قد تتطلب منك تصميم زوج تمهيدي جديد.

الخطوة السابعة: أداء qPCR على العينات الخاصة بك

أنت الآن جاهز لإجراء qPCR على عينات cDNA التي قمت بتخزينها مجمدة منذ نهاية الخطوة 3.

إجراء لتحضير لوحة qPCR لـ qPCR على العينات الخاصة بك

1) بدءًا من 1: 5 cDNA المخفف الذي جمدته في نهاية الخطوة 3 أعلاه ، قم بتخفيف جميع العينات بشكل مناسب (1: 1 ، 1: 5 ، 1:25 ، أو 1: 125) وفقًا للنتائج التي حصلت عليها في الخطوة 4. يمكنك تخفيف كل الـ cDNA المتبقية لديك لهذا التخفيف ، ولكن يجب أن تدرك أن بعض أزواج التمهيدي ستعطي منحنيات تضخيم مختلفة بشكل كبير عن غيرها. إذا كنت تعمل بنسخة وفيرة جدًا (مثل جابده) ، على سبيل المثال ، قد تخفف cDNA الخاص بك كثيرًا بحيث لا تتمكن من اكتشاف النصوص الأقل وفرة.

2) يجب أن يكون محلول مخزون التمهيدي (للأمام والعكس) بتركيز 10 ميكرومتر.

3) قم بإعداد مزيج رئيسي من SYBR Green Master Mix (2X) والبادئات (0.4uM).

4) مزيج لفترة وجيزة و 10ul ماصة في كل بئر من لوحة qPCR. لتجنب الفقاعات ، ادفع مكبس عامل الماصة إلى وضع الإخراج قبل تجميع الخليط. سيحتوي طرف الماصة الآن على أكثر من 10ul ، ولكنه سيخرج فقط 10ul (ولا توجد فقاعات) إذا توقفت عند نقطة المقاومة الأولى أثناء الإخراج مباشرة في قاع البئر. أضف 10ul إلى جميع الآبار التي ستستخدمها.

5) استخدم طرف ماصة منفصل لكل بئر ، وأضف 10ul من العينة (مخففة بشكل صحيح بالماء) مباشرة في SYBR Green Master Mix الذي يحتوي على مواد أولية. اخلط بالمص لأعلى ولأسفل مرة أو مرتين. لا تستخدم وظيفة الإخراج لعامل الماصة في هذه الخطوة. يجب تحليل العينات في ثلاث نسخ على الأقل. قم دائمًا أيضًا بتشغيل عنصر تحكم سلبي (مزيج رئيسي ، مواد أولية ، وماء) حتى تتمكن من اختبار وجود ثنائيات البرايمر ودرجة حرارة انصهارها وما إلى ذلك. على نفس اللوحة ، قم أيضًا بتحميل المنحنى القياسي الخاص بك في نسختين أو ثلاث نسخ.

6) ختم الطبق الخاص بك مع الأختام البصرية qPCR وابدأ تشغيل qPCR على آلة qPCR الخاصة بك. إذا كان برنامج جهازك يجعلك تختار ، فستحتاج إلى الإشارة إلى أنك تستخدم كواشف SYBR Green (وليس Taqman) ، وأنك تريد البروتوكول الطويل (وليس البروتوكول السريع) ، وأنك تستخدم طريقة منحنى قياسية ، وأنك تريد تضمين تحديد منحنى الذوبان.

ستنتج آلة qPCR بعد ذلك نتائج PCR كمية ذات مغزى وتخبرك بالكميات الحقيقية (ng) لنسختك في كل عينة. سوف تكون على يقين من تسلسل وخصوصية وخطية الفحص.

ملاحظات قانونية:

StepOnePlus هي علامة تجارية مسجلة لشركة Applied Biosystems. NanoDrop هي علامة تجارية مسجلة لشركة تقنيات NanoDrop ، Inc. TaqMan هي علامة تجارية لشركة Roche Molecular Systems، Inc. RNase AWAY هي علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Bio-Products، Inc.. Qiaquick هي علامة تجارية مسجلة لمجموعة QIAGEN Group. NucleoSpin & reg هي علامة تجارية مسجلة لشركة MACHEREY-NAGEL. SYBR هي علامة تجارية مسجلة لشركة Molecular Probes، Inc. العلامات التجارية لأطراف أخرى هي ملك لأصحابها ويجب معاملتها على هذا الأساس.

هل أعجبك هذا البروتوكول؟ اشترك في شبكة علوم الحياة.
إذا كان لديك بالفعل حساب Life Science Network أو LinkedIn أو Google:


ميزات برنامج CFX Maestro

تشتمل جميع أنظمة اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي من Bio-Rad على برنامج CFX Maestro القوي وسهل الاستخدام. باستخدام برنامج واحد لجميع الأنظمة الأربعة ، يمكنك بسهولة فتح الملفات وقراءتها من أي من الأدوات ، والتعاون مع الباحثين الآخرين ، والانتقال إلى نظام آخر دون تعلم استخدام برامج جديدة.

على غرار برامج PCR الأخرى في الوقت الفعلي ، يقدم برنامج CFX Maestro العديد من وحدات التحليل ، بما في ذلك القياس الكمي ومنحنى الذوبان والتعبير الجيني والتمييز الأليلي وتحليلات نقطة النهاية. فيما يلي مثال على كيفية تحليل تجربة التعبير الجيني في برنامج CFX Maestro.

جهز اللوحة & [مدش] تشير إلى موضع مجهول ، لا توجد عناصر تحكم في القالب (NTCs) ، وعينات منحنى قياسي على اللوحة (الشكل 1). يمكن القيام بذلك قبل الجري أو أثناءه أو بعده.

الشكل 1. إعداد اللوحة في نافذة محرر اللوحة.

حلل البيانات & [مدش] يتم إنشاء ملف بيانات تلقائيًا بعد تشغيل وحدة التعبير الجيني. يمكنك بسهولة عرض ما يصل إلى ستة مخططات أو جداول مختلفة ، مثل مخطط التضخيم أو المنحنى القياسي أو مخطط التعبير الجيني أو تخطيط اللوحة أو الذروة الذائبة باستخدام علامة التبويب عرض البيانات المخصصة (الشكل 2). تحقق من الكفاءة و R 2 للمنحنى القياسي. يجب أن تكون الكفاءة في حدود 90 & ndash110٪ ويجب أن تكون R 2 & gt0.990. إذا كانت هذه القيم خارج النطاق ، فستحتاج إلى استكشاف أخطاء تجربتك وإصلاحها.

الشكل 2. نافذة عرض البيانات المخصصة.

نتائج التصدير للنشر & [مدش] قم بتصدير أي مخططات أو جداول بسرعة بالنقر بزر الماوس الأيمن في النافذة وتحديد حفظ الصورة باسم (الشكل 3) أو تصدير إلى Excel (الشكل 4). يمكنك أيضًا إنشاء تقارير أو ملفات لغة ترميز بيانات PCR في الوقت الفعلي (RDML) للاستيراد السريع إلى برنامج qbase +.

الشكل 3. حدد "حفظ الصورة باسم" في نافذة تحليل البيانات.

الشكل 4. حدد تصدير إلى Excel في نافذة تحليل البيانات.


Cy0 - طريقة جديدة لتقدير qPCR

خلفية: أصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي هو الأسلوب المفضل لتقدير الأحماض النووية المطلقة والنسبية. تفترض طريقة القياس الكمي المعياري الذهبي في PCR في الوقت الفعلي أن العينات المقارنة لها كفاءة PCR مماثلة. ومع ذلك ، فإن العديد من العوامل الموجودة في العينات البيولوجية تؤثر على حركية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والتحليل الكمي المربك. في هذا العمل نقترح استراتيجية جديدة لاكتشاف العينات الخارجية ، تسمى SOD.
نتائج: تم تركيب وظيفة ريتشاردز على قراءات التألق لتحديد منحنيات التضخيم. لم يكن هناك ارتباط كبير بين معلمات التضخيم المحسوبة (الهضبة والمنحدر والإحداثي y لنقطة الانعطاف) وسجل إدخال DNA مما يدل على أنه يمكن استخدام هذا النهج لتحقيق "بصمة" لكل منحنى تضخيم. لتحديد العمليات الخارجية ، تمت مقارنة المعلمات المحسوبة لكل عينة غير معروفة مع تلك الخاصة بالعينات القياسية. عندما تم العثور على تقدير أقل من بداية جزيئات الحمض النووي ، بسبب وجود مثبطات بيولوجية مثل حمض التانيك ، IgG أو كيرسيتين ، قام SOD بتمييز ملفات التضخيم هذه بشكل فعال على أنها قيم متطرفة. تمت مقارنة SOD لاحقًا مع KOD ، النهج الحالي الذي يعتمد على تقدير كفاءة PCR. أظهرت البيانات التي تم الحصول عليها أن SOD كان أكثر حساسية من KOD ، في حين أن SOD و KOD كانتا محددة بنفس القدر.

استنتاج: أظهرت نتائجنا ، لأول مرة، يمكن أن يعتمد الكشف الخارجى على شكل التضخيم بدلاً من كفاءة PCR. يمثل SOD تحسنًا في تحليل PCR في الوقت الفعلي لأنه يقلل من تباين البيانات وبالتالي يزيد من موثوقية القياس الكمي.

-->

مرحبًا ، أنت 102954 الزائر شكرا.

زيارتنا من.

أحدث النقرات.

في السنوات القليلة الماضية ، أصبح تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل (تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي) هو الأسلوب المفضل للتقدير الكمي المطلق أو النسبي للتعبير الجيني بسبب سرعته ودقته وحساسيته [1-3].
علاوة على ذلك ، فإن التطورات الحديثة في تسلسل الجينوم البشري ، و mRNA ، وخصائص تعبير ميرنا لأنواع عديدة من السرطان ، وتحديد تعدد الأشكال المرتبط بالأمراض ، والتوافر المتزايد لمعلومات التسلسل الجيني لمسببات الأمراض البشرية أدت إلى نمو ملحوظ في التشخيص الجزيئي [4-6 ].
تفترض طريقة القياس الكمي المعياري الذهبي (طريقة Ct) في PCR في الوقت الفعلي أن العينات المقارنة لها كفاءات PCR مماثلة. ومع ذلك ، فإن القياس الكمي بواسطة PCR في الوقت الحقيقي حساس للغاية للاختلافات الطفيفة في كفاءة PCR بين العينات. في الواقع ، سيؤدي اختلاف بسيط بنسبة 5٪ في كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى اختلاف ثلاثة أضعاف في كمية الحمض النووي بعد 25 دورة من التضخيم الأسي. العديد من العوامل الموجودة في العينات بالإضافة إلى الملوثات المستخرجة بشكل مشترك يمكن أن تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما يربك تضخيم القالب والتحليل [٧-١٠]. هذه مشكلة كبيرة عند العمل مع العينات البيولوجية. سيؤدي التثبيط الشديد إلى نتائج سلبية خاطئة ، في حين أن التثبيط الخفيف إلى المتوسط ​​يمكن أن يؤدي إلى التقليل من تركيز الحمض النووي للعينة المتأثرة [11]. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتقلب كفاءة التضخيم كدالة لتصميم المقايسة غير الأمثل ، أو عدم استقرار الإنزيم ، أو وجود مثبطات [12]. على الرغم من تطوير مجموعة متنوعة من الأساليب لقياس الحمض النووي للقالب [11 ، 13-17] ، إلا أن القليل جدًا منها يسمح بالتقييم المتزامن لكمية القالب وجودته دون إضافة عنصر تحكم إيجابي داخلي يتم تضخيمه بشكل مشترك مع الهدف محل الاهتمام. ومن ثم اقترح بار وزملاؤه طريقة (تسمى KOD) تعتمد على حساب كفاءة التضخيم للكشف المبكر عن ظروف المقايسة غير المثلى [18 ، 19]. هذا النهج واضح للغاية وفعال ، لكنه يعتمد على حساب كفاءة تضخيم PCR الذي لا يزال غير مقبول بشكل كامل من قبل المجتمع العلمي. حاول عدد كبير من الدراسات حساب كفاءة التضخيم على افتراض أن تفاعل البوليميراز المتسلسل بطبيعته أسي بطبيعته. بناءً على افتراض منطقة اللوغاريتم الخطي ، يتم حساب كفاءة التضخيم الثابت من منحدر الانحدار الخطي في تلك النافذة [20 ، 23]. يعتمد النهج البديل على الملاحظة التي تشير إلى إمكانية نمذجة مسار تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل فعال بواسطة الدالة السينية [14 ، 24] مما يسمح بتقدير كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام تركيب الانحدار غير الخطي [15 ، 25 ، 26]. في الآونة الأخيرة ، سمح لنا نهج مبسط يسمى "الانحدار الخطي للكفاءة" بتقدير كفاءة التضخيم من خلال تطبيق تحليل الانحدار الخطي على قراءات التألق داخل المنطقة المركزية لملف التضخيم [27]. والجدير بالذكر أنه تم إثبات أن تقديرات كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل تختلف اختلافًا كبيرًا وفقًا للنهج المتبع [28].
في الآونة الأخيرة ، Tichopad et al. [29] قدم اختبارًا جديدًا لمراقبة الجودة لـ PCR الكمي في هذا الإجراء ، تم تقدير المشتق الأول الأقصى والمشتق الأقصى الثاني باستخدام تركيب لوجستي على مسار PCR. سمح لهم هذا النهج بمراقبة النصف الأول من المنحنى باستخدام معلمتين. تهدف دراستنا إلى تطوير أداة اختبار الجودة ، والتي لا تعتمد على تقدير كفاءة التضخيم ، من أجل الكشف عن العينات التي لا تظهر حركية تضخيم مماثلة لتلك الخاصة بالعينات القياسية. في هذا العمل ، تم استخدام تركيب غير خطي لمعادلة ريتشاردز لتحديد معالم تضخيم PCR من مجموعة عينات كبيرة. سمح لنا الحساب اللاحق لتباين المعلمات المقدرة وتطوير مقياس إحصائي بناءً على مسافة Mahalanobis بتطوير طريقة SOD (سحركية أساسها القرد امنفعة دetection). تم فحص تحليل SOD للتضخيم المانع ومقارنة هذه الطريقة مع KOD بالتفصيل.

الوقت الحقيقي الكمي PCR

يتكون معيار الحمض النووي من بلازميد pGEM-T (Promega) يحتوي على جزء 104 نقطة أساس من جين الميتوكوندريا NADH dehydrogenase 1 (MT-ND1) كإدراج. تم إنتاج جزء الحمض النووي هذا بواسطة زوج التمهيدي ND1 / ND2 (الأمام ND1: 5'-ACGCCATAAAACTCTTCACCAAAG- 3 'وعكس ND2: 5'-TAGTAGAAGCGATGGTGAGCTA- 3'). تمت تنقية هذا البلازميد باستخدام Plasmid Midi Kit (Qiagen) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تقدير التركيز النهائي للبلازميد القياسي بطريقة القياس الطيفي عن طريق حساب متوسط ​​ثلاثة مكررات أ260 قرارات الامتصاص.
تم إجراء تضخمات PCR في الوقت الحقيقي باستخدام LightCycler & # 174480 SYBR Green I Master (Roche) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة ، مع 500 نانومتر من البادئات وكمية متغيرة من معيار DNA في حجم التفاعل النهائي 20 & # 181l. تم إجراء التدوير الحراري باستخدام أ LightCycler & # 174480 (Roche) بدأت بحضانة لمدة 10 دقائق عند 95 & # 176 درجة مئوية ، تليها 40 دورة (95 & # 176 درجة مئوية لمدة 5 ثوان 60 & # 176 درجة مئوية لمدة 5 ثوان 72 & # 176 درجة مئوية لمدة 20 ثانية) مع قراءة فلورسنت واحدة تؤخذ في نهاية كل دورة .
تم إجراء كل مجموعة تفاعل ، وتحديداً بدء الحمض النووي ونسبة مزيج التضخيم ، في ثلاث نسخ وتكرارها في أربع دورات تضخيم منفصلة. تم الانتهاء من جميع الأشواط بتحليل منحنى الذوبان لتأكيد خصوصية التضخيم وعدم وجود ثنائيات التمهيدي. ط (طريقة نقطة الملاءمة) و سي بي (طريقة المشتق الثاني) تم تحديد القيم بواسطة LightCycler & # 174480 إصدار البرنامج 1.2 وتصديره إلى ورقة بيانات MS Excel (Microsoft) للتحليل بعد طرح الخلفية (متاح كملف إضافي 1). ل ط م (طريقة نقطة الملاءمة) تم استخدام عتبة مضان تم ضبطها يدويًا على 0.4 لجميع الأشواط.

تقدير كفاءة PCR

تم استخدام بيانات PCR الخام لحساب كفاءة التضخيم. تم اشتقاق كفاءة PCR لكل عينة فردية من منحدر خط الانحدار في نافذة الخطية [20]. تم إجراء تصحيح خط الأساس ونافذة تحديد الخطية باستخدام الإصدار الأخير من LinRegPCR [23]. تم تقدير كفاءات PCR من أربع مجموعات عينات: منحنيات التضخيم القياسية ، ومنحنيات التضخيم القياسية المضافة لقراءات حمض التانيك ، ومنحنيات التضخيم القياسية المضافة لقراءات IgG ومنحنيات التضخيم القياسية المضافة لقراءات كيرسيتين. شملت نافذة الخطية المحسوبة من جميع مجموعات البيانات المتوسطة عتبة التألق البالغة 0.4 التي تم اختيارها للتحليل الكمي.

نموذج رياضي من KOD

تم اقتراح النموذج الرياضي لـ KOD ، بناءً على الكفاءة ، بواسطة Bar et al. [18]. باختصار ، تم إجراء ذلك بمقارنة كفاءة PCR لعينة (xإف) مع كفاءات عينات المنحنى القياسية. يتم تصنيف عينة الاختبار على أنها متقطعة إذا |ض| & GT 1.96 مع > - mu _ < emph>> < سيغما _ < emph> > > ، أين &مجهريإف هي الكفاءة يعني و σإف هو الانحراف المعياري لكفاءة عينات المنحنى القياسية. بدلاً من ذلك ، يجب اعتبار أن الإحصاء < left ( frac ight )^2 > is distributed as a c ² with one degree of freedom if c ² > 3.84, we can reject the null hypothesis at a = 0.05. c IE7 Mozilla c ²Chrome c -->

نموذج رياضي من SOD

استند الكشف الحركي القائم على الشكل (SOD) على أشكال منحنيات التضخيم. من أجل ملاءمة البيانات الخام الفلورية ، تم استخدام تركيب الانحدار غير الخطي لوظيفة ريتشاردز المكونة من 5 معلمات ، وهو امتداد لمنحنى النمو اللوجستي ، [11 ، 25]:

مكافئ. 1
أين x هو رقم الدورة ، Fx هو تألق التفاعل في الدورة x, Fالأعلى هو أقصى رد فعل مضان ، Fب هو تألق رد فعل الخلفية و ب, ج و د تمثل المعاملات المقدرة. تم إجراء الانحدارات غير الخطية لوظائف ريتشاردز ذات 5 معلمات لتحديد تقديرات المربعات الصغرى غير الموزونة للمعلمات باستخدام ليفنبرغ ماركوارت طريقة.
كانت معلمات الشكل المستخدمة هي قيمة هضبة منحنى التضخيم (Fالأعلى) ، منحدر خط مستقيم مماس في نقطة انعطاف (م) وتنسيق ص لنقطة انعطاف (صF) (ملف إضافي 2).
إحداثي ص لنقطة انعطاف (صF) حسبت على النحو التالي:
مكافئ. 2
ومنحدر الخط المستقيم المماس (م) تم تقديره على أنه:
مكافئ. 3
التوزيع الطبيعي لـ Fالأعلى، صF و م تم فحص المعلمات ، التي تم الحصول عليها من العينات القياسية ، باستخدام كولموغوروف سميرنوف اختبار للحالة الطبيعية أهمية العلاقة بين هذه المعلمات وتركيزات الحمض النووي المدخلات ، معبراً عنها بـ السجل (DNA) تم اختباره مع أ ر اختبار على النحو التالي:
مكافئ. 4
أين ص هو معامل بيرسون و ن حجم العينة (ن = 72). تم تقييم الحالة الطبيعية متعددة المتغيرات للمجموعة المرجعية المعتمدة وفقًا لـ Rencher AC [30] (ملف إضافي 3). بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم التماثل (اسيم) من منحنيات التضخيم على النحو التالي:
مكافئ. 5
استبدال صF و Fالأعلى، مكافئ. يمكن تبسيط 5 على النحو التالي:
مكافئ. 6
بالاتفاق مع هذه المعادلة ، يكون المنحنى متماثلًا (أي Asym = 0) عندما يكون d = 1 ، أو 2 * Yf = Fmax. على العكس من ذلك ، عندما يكون لدينا d & gt 1 2 * Yf & lt Fmax (المنحنى غير متماثل) وبالتالي Asym & gt 0.

بعد تطوير طريقة لتقدير ثلاث معلمات مختلفة للشكل (Fالأعلى, ذF و م) ، كانت الخطوة التالية هي تحديد معيار لتحديد عينات الاختبار التي انحرفت عن القيم المتوقعة. تم ذلك باستخدام ناقل العينة الذي يمكن حسابه لكل تضخيم تجريبي إذا ذ ينتمي إلى توزيع عادي متعدد المتغيرات ، بمتجه متوسط ​​& # 931 مصفوفة التباين-التغاير المقابلة ، (ذ - Σ)' Σ -1 (ذ - Σ) قيمة (مسافة Mahalanobis) لها توزيع مقارب c & # 178 ، مع 3 درجات من الحرية. تعتمد مسافة Mahalanobis على الارتباطات بين المتغيرات التي يمكن من خلالها تحديد وتحليل الأنماط المختلفة. إنها طريقة مفيدة لتحديد تشابه مجموعة عينة غير معروفة متعددة المتغيرات مع مجموعة معروفة. يأخذ في الاعتبار ارتباطات مجموعة البيانات ولا يعتمد على مقياس القياسات. تم حساب متوسط ​​مصفوفة المتجه والتباين - التباين من معلمات الشكل لعينات المنحنى القياسية. ثم إذا كان c & # 178 & gt 7.81 ، فيمكننا رفض الفرضية الصفرية (مع a = 0.05) وإثبات أن شكل منحنى التضخيم يختلف عن شكل عينات المنحنى القياسي ، مع الأخذ في الاعتبار جميع المعلمات الثلاثة [30]. تم الحصول على جميع التفاصيل والرسومات باستخدام Excel (Microsoft) و Statistica 6.0 (Statsoft) والحزمة الإحصائية للعلوم الاجتماعية (SPSS 13.0).

تحليل المنحنى القياسي SOD

يعتمد نموذج SOD على افتراض أنه من أجل تحقيق تقدير كمي موثوق ، يجب ألا تختلف منحنيات التضخيم لعينات غير معروفة اختلافًا كبيرًا عن منحنيات المنحنى القياسي. قدمنا ​​فكرة أن حركية التضخيم يمكن مراقبتها من خلال شكل منحنى التضخيم. تم تحديد شكل منحنيات التضخيم باستخدام تركيب الانحدار غير الخطي لوظيفة ريتشاردز على قراءات التألق [11].
سمح لنا هذا الإجراء الرياضي بالحصول على المعلمات الخمسة المميزة لمعادلة ريتشاردز. تم استخدام هذه القيم لاحقًا لحساب ميل الظل عند نقطة الانعطاف (م) ، الإحداثي y لنقطة الانقلاب (ذF) وأقصى قيمة مضان (Fالأعلى) من القراءة. أخيرًا ، سمحت لنا هذه المعلمات الثلاثة بإنشاء "بصمة" لكل منحنى تضخيم.
بناءً على هذا الافتراض ، فإن المعلمات م, ذF و Fالأعلى لا ينبغي أن تختلف التضخمات المستخدمة في بناء منحنى معياري اختلافًا كبيرًا عن بعضها البعض ويجب ألا تكون مرتبطة بمدخلات الحمض النووي. للتحقق من هذا الافتراض ، تم إنشاء منحنى قياسي على مدى واسع من مدخلات DNA (3.14x10 7 -3.14x10 2 الشكل 1 ملفات إضافية 1).
يوضح الجدول 1 متوسط ​​اختبار SD و Kolmogorov- Smirnov من إجمالي 72 جولة. أظهرت هذه النتائج ذلك م, ذF و Fالأعلى تم توزيعها بشكل طبيعي ، على الرغم من أنها أظهرت تشتتًا مختلفًا. بعد ذلك ، العلاقة بين م, ذF و Fالأعلى وتمت دراسة سجل بدء قالب DNA. كما هو مبين في الشكل 2 ، لم يكن هناك ارتباط كبير بين سجل إدخال DNA وهذه المعلمات (Fالأعلى: ص 2 = 0.017 ص = 0.28 ذF : ص 2 = 0.033 ص = 0.12 م: ص 2 = 0.030 ص = 0.14). في الواقع ، معاملات التحديد (ص 2) كمية قليلة جدًا فقط من تباينات المعلمات أقل من 3،3٪.
من أجل تحديد ملف تعريف التضخيم بشكل موضوعي باعتباره خارجيًا ، قدمنا ​​المتغير Log (نأوبإكسب) ، والتي تقدر الأخطاء من التحليل الكمي باستخدام طريقة Ct. يعتمد هذا المتغير على البقايا المقدرة على أنها الفرق بين الجزيئات المحسوبة ، باستخدام طريقة Ct (سجل عدد الجزيئات المرصودة ، والمشار إليها باسم LogNob) ، وجزيئات DNA المدخلات (سجل الجزيئات المتوقعة ، والمشار إليها باسم LogNexp في الواقع LogNob- LogNexp = تسجيل (نأوبإكسب)). سجل النسبة (نأوبإكسب) أظهر توزيعًا طبيعيًا يفي بافتراض المثلية (ملف إضافي 4). وبالتالي من الممكن تحديد فاصل ثقة 95٪ (CI) للسجل المتغير (نأوبإكسب). أظهرت هذه البقايا توزيعًا طبيعيًا بغض النظر عن قالب DNA البداية ، بمتوسط ​​يساوي صفر وثابت الانحراف المعياري (& # 963 = 0.041). في قاعدة البيانات الخاصة بنا ، من بين إجمالي 72 تشغيلًا تم استخدامها لإنشاء المنحنى القياسي ، أظهرت 6 عمليات تشغيل سجل النسبة (نأوبإكسب) من CI (ملف إضافي 5). بعد ذلك ، تم تقدير كفاءة PCR (Eff) أيضًا لكل منحنى تضخيم ، تم استخدام برنامج Lin-RegPCR [20 ، 23] لملاءمة نقاط البيانات في النطاق الأمثل لمرحلة PCR الأسية للحصول على تقييم آلي لـ Eff (الجدول 1) ).
لتحديد مدى جودة تحديد العينات الخارجية بواسطة KOD و SOD ، قمنا بتطبيق هذه التحليلات الإحصائية على عمليات تشغيل المنحنى القياسي على وجه الخصوص وجدنا أن KOD حددت عمليتين على قيمة c & # 178 العتبة 3.84 بينما كشفت SOD عن 3 عمليات تشغيل من CI (ملف إضافي 5). من المحتمل أن تكون هذه القيم المتطرفة إيجابية كاذبة بسبب التعريف والخصائص الجوهرية لـ 95٪ CI.

الجدول 1: عينة واحدة من اختبار Kolmogorov-Smirnov لمنحنى المعايرة.

يعني (الانحراف المعياري) وقيمة اختبار Kolmogorov-Smirnov (K-S) (الاحتمال) للمعلمات التالية: كفاءة LineReg (إف) ، تنسيق قيمة نقطة الانعطاف (ذF) ، انحدار الخط المستقيم المماس في نقطة الانعطاف (م) وقيمة الهضبة (Fالأعلى).

تأثيرات المانع على التضخيم في الوقت الحقيقي

يتأكسد حمض التانيك لتكوين الكينونات التي ترتبط تساهميًا طق بوليميراز الدنا يثبط نشاطه [31].
تم الحصول على مخططات تضخيم في الوقت الحقيقي من 3.5 × 10 4 جزيئات DNA في وجود تركيزات متزايدة (0-0.1 مجم لكل مل) من أحماض التانيك. تم الحصول على جميع قيم القياس الكمي باستخدام ط م طريقة. توضح منحنيات التضخيم الناتجة والقياسات المقابلة آثار التثبيط على التحليل في الوقت الفعلي (الشكل 3 أ و 3 ب). مع زيادة تركيز حمض التانيك ، فإن ط م ارتفعت القيم بشكل مطرد مما أدى إلى التقليل من قيمة جزيئات البداية. تم تمييز خطأ القياس الكمي هذا عند تسجيل (نأوبإكسب) خرجت من CI المقابلة (الشكل 3 ب). تم توضيح التضخيم المكبوت من خلال حسابات الكفاءة باستخدام إجراء LinRegPCR (ملف إضافي 5). كانت الأخطاء المرصودة نتيجة التخفيض التدريجي للهضبة وطول الطور الخطي وانحدار المنحنيات المثبطة معًا ، أدت هذه التأثيرات إلى زيادة ط م القيم (الشكل 3 أ) [19 ، 32].

تم استخدام تحليلات SOD و KOD لتحديد العينات ذات الخواص الحركية الشاذة لـ PCR ، بسبب وجود المانع ، مما قد يؤدي إلى كميات خاطئة. Fالأعلى, م، و ذF تم استخدام القيم المحسوبة من كل منحنى تضخيم ، والتي تم الحصول عليها في وجود زيادة تركيز حمض التانيك ، أو IgG أو كيرسيتين ، لتقدير 2 تم تحديد الأشواط على c & # 178SOD القيمة. ومن ثم ، إذا كان c & # 178SOD كانت القيمة من منحنى التضخيم أعلى من القيمة الحدية 7.81 ، وتم تعريف التقدير الكمي على أنه قيمة خارجية. كما تم تقدير كفاءات PCR و c & # 178كود القيم المحددة من نفس التضخمات. منحنيات القياس مع c & # 178كود تم رفض القيم التي تزيد عن 3.84.
ومن ثم تم تقييم أداء SOD و KOD وفقًا لقدرتهم على تحديد التضخيم باعتباره خارجًا عند السجل (نأوبإكسب) النسبة ليست ضمن 95٪ CI.
النتائج التي تم الحصول عليها بواسطة تحليلات SOD و KOD في وجود تركيزات متزايدة من حمض التانيك موضحة في الشكل 6 أ و 6 ب. عندما تمت إضافة تركيزات حمض التانيك تتراوح من 0.1 - 0.0125 مجم / مل ، فإن جميع المنحنيات التي تم الحصول عليها بها أخطاء كبيرة في القياس الكمي (الشكل 6 أ و 6 ب تشير الرموز الكاملة إلى العينات التي أظهرت نسبة السجل (نأوبإكسب) أقل من الحد الأدنى 95٪ CI).

الجدول 2: حساسية وخصوصية تحليل KOD و SOD.

من الموضوعات التي تحظى باهتمام كبير تطوير أدوات بدون استخدام اليد للكشف عن ملفات تعريف التضخيم الشاذة في تحليل PCR في الوقت الفعلي. أصبح تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي أكثر التقنيات استخدامًا على نطاق واسع في تقدير كمية الحمض النووي. على الرغم من أن تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي قد حظي باهتمام كبير في العديد من مجالات البيولوجيا الجزيئية ، إلا أنه لا يزال يعاني من مشاكل فنية كبيرة [34]. ومن ثم فقد ركزت الدراسة الحالية على التحقيق في نهج الكشف الخارجى الجديد الذي لا يعتمد على تقدير كفاءة PCR بل على شكل ملف تعريف التضخيم.
طبيعة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل تجعله عرضة للاختلافات الصغيرة في كفاءة العينات المقارنة [20]. في الواقع ، "المعيار الذهبي" الحالي في تحليل PCR في الوقت الفعلي ، طريقة دورة العتبة (تسمى ط م طريقة) ، تتطلب كفاءات PCR مماثلة بين العينات المقارنة.
ومع ذلك ، فإن الاختلاف في كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل ينتج عن مصادر مختلفة لمواد البداية ، على سبيل المثال ، أنواع مختلفة من الأنسجة [9]. يمكن أيضًا العثور على هذه الاختلافات عند مثبطات طق توجد بوليميريز الحمض النووي في عينات (كدنا) [35] أو في وجود SYBR الأخضر و / أو dNTPs منخفضة الجودة [36 ، 37]. علاوة على ذلك ، فإن تكرار تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل [38] والتأثيرات المثبطة المختلفة حتى بين التكرارات [39] تبرز الحاجة إلى تقييم الجودة الحركية لكل عينة. ومن هنا بار وآخرون. [18] اقترح طريقة إحصائية ، تسمى KOD ، لاكتشاف العينات ذات الكفاءات المتباينة.
يبحث KOD عن القيم المتطرفة بناءً على الافتراض الرئيسي بأنه للحصول على تقدير كمي موثوق ، يجب أن تظهر عمليات PCR كفاءات لا تختلف اختلافًا كبيرًا عن بعضها البعض. يتم التحقق من هذا الشرط بمقارنة منحدرات انحدار الخط المستقيم المحسوبة في نافذة الخطية بعد تحويل السجل لكل مضان للقراءة. بعبارة أخرى ، إذا عدنا إلى البيانات الأولية ، يجب ألا يكون ملف تعريف المنحنيات الأسية في نافذة الخطية مختلفًا بشكل كبير بين عمليات التشغيل المقارنة. في تطوير طريقة SOD قمنا بتوسيع هذا المفهوم ليشمل المنحنى بأكمله ، ويجب أن تُظهر جميع عمليات التشغيل المضمنة في التحليل ملفات تعريف تضخيم قابلة للمقارنة.
ال ط م تعتمد الطريقة على تحليل هدف مخفف تسلسليًا. يتم تقديم مثال على هذا النهج في الشكل 1 أ. يوضح الفحص الدقيق لمحات التضخيم التي تم الحصول عليها المبدأ المركزي لطريقة SOD: جميع منحنيات التضخيم متشابهة في الشكل ويرتبط موضع المظهر الجانبي فقط بالكمية المستهدفة. توجد ملفات تعريف التضخيم الأولى ، المقابلة للعينات الأكثر تركيزًا ، على اليسار ، بينما تتحول العينات ذات عامل التخفيف المتزايد بانتظام نحو اليمين. قادتنا هذه الملاحظة إلى فكرة مفادها أن معيار الاستبعاد يمكن أن يعتمد على الاختلاف في الشكل بدلاً من الكفاءة. هذا يتفق مع عمل روتليدج وستيوارت [40] الذي وصف فيه هؤلاء المؤلفون منحنى التضخيم كدالة للكفاءة. ومن ثم ، إذا كانت الكفاءة تحدد شكل المنحنى ، فمن خلال مراقبة شكل ملف تعريف التضخيم ، يمكن الحصول على معلومات تتعلق بكفاءة التضخيم.
اولا "بصمة اصبع" لكل منحنى تضخيم باستخدام م, ذF و Fالأعلى الناتجة عن ملاءمة معادلة ريتشاردز على البيانات الخام تم الحصول عليها. بعد ذلك ، تم استخدام هذه المعلمات للحصول على مصفوفة التباين-التباين من أجل حساب مسافة ماهالانوبيس [30].
يعتمد هذا المقياس الإحصائي على الارتباطات بين المتغيرات التي يمكن من خلالها تحديد وتحليل الأنماط المختلفة. على وجه الخصوص ، استخدم تحليل SOD مسافة Mahalanobis لتحديد تشابه عينة غير معروفة مقارنة بالمجموعة القياسية. كان هذا النهج مفيدًا للغاية لأنه سمح لنا بتقييم ليس فقط تباين المعلمات الفردية (م, ذF و Fالأعلى) ، ولكن أيضًا لتحديد الاختلافات المشتركة المتبادلة بين م, ذF و Fالأعلى.
Fالأعلى تم اعتباره في تطوير SOD لأن هذه المعلمة توضح تضخيمًا ناجحًا وعادةً ، في ظروف التضخيم دون الأمثل ، لا تصل القراءات إلى الخاصية المميزة Fالأعلى القيم [9]. فحص قاعدة البيانات الخاصة بنا ، لوحظ أن Fالأعلى أظهر تباينًا كبيرًا ، وبالتالي فإنه يؤثر بشكل طفيف على c & # 178SOD وحده ، ولكن Fالأعلى كان لها تأثير كبير على مصفوفة التباين - التغاير. المعلمة م يصف ميل المنحنى في نقطة الانعطاف [11]. في نموذجنا ، ارتفعت قيمة م، كلما زاد معدل التضخيم. ومع ذلك ، لا يشير هذا المقدّر بشكل مباشر إلى كفاءة التضخيم التي تُفهم على أنها النسبة بين كميات المنتج الحالية والسابقة [38].
أخيرًا ، تمت مراقبة عدم تناسق ملفات تعريف التضخيم من خلال العلاقة بين Fالأعلى و ذF. لقد ثبت أن منحنيات PCR المتناظرة تمامًا نادرًا ما تحدث ، مما يبرر إدخال ملاءمة من خمسة متغيرات [25]. علاوة على ذلك ، في عملنا السابق [11] ، تم توضيح أن تفاعل التضخيم قد ينحرف عن منحنى السيني المتماثل إلى السيني غير المتماثل (الموصوف جيدًا بواسطة معادلة ريتشاردز) في وجود كفاءة دون المستوى الأمثل. في الواقع ، تناقص جودة ملاءمة النموذج اللوجستي تدريجيًا مع انخفاض الكفاءة مما يشير إلى تغيير شكل تضخيم منحنى PCR [32].
تحليل الارتباط بين م, ذF و Fالأعلى تم الحصول عليها من المنحنى القياسي ومدخلات الحمض النووي أظهرت أن معلمات الشكل هذه تعتمد على التركيز. يدعم هذا فرضيتنا التجريبية بأن جميع منحنيات التضخيم للمنحنى القياسي متشابهة في الشكل وأن موضع الملف الشخصي فقط هو الذي يحدد الكمية المستهدفة. في ظل وجود مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وجد أن زيادة تركيزات حمض التانيك و IgG أدى إلى انخفاض Fالأعلى و م القيم ، بينما يزداد عدم التناسق مع زيادة تركيزات المثبط (عندما يزداد عدم التناسق ، ذF ينخفض ​​أكثر من المقابل Fالأعلى الشكل 3 و 4). قد يكون تثبيط حمض التانيك ناتجًا ببساطة عن التبريد بالفلورة حيث وجدنا انخفاضًا كبيرًا في Fالأعلى وانحدار منحنى الشريحة ينخفض. ومع ذلك ، أظهرنا أيضًا أن عدم تناسق التألق زاد مما يدل على أن حمض التانيك أنتج تشويهًا حركيًا للتضخيم. أدت إضافة الكيرسيتين إلى تضخمات تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى إنتاج بيانات مثيرة للاهتمام للغاية. في الواقع ، وجدنا انخفاض Fالأعلى و م القيم في وجود تركيزات عالية من المثبط ، ولكن هذا الفلافونيد لم يحث على تعديل غير متماثل للمنحنيات (الشكل 5 د). توضح البيانات المبلغ عنها بوضوح أن طريقة SOD يمكنها تحديد حركيات PCR غير المثلى الناتجة عن نماذج تثبيط مختلفة. علاوة على ذلك ، فإن النتائج التي تم الحصول عليها في وجود كيرسيتين تسلط الضوء على أهمية استخدام نهج متعدد المتغيرات.
عند مقارنة SOD بأداء KOD ، وجد أن SOD كان أكثر حساسية من KOD في جميع الإعدادات المختبرة. كان SOD و KOD محددًا بشكل متساوٍ في وجود IgG و quercitin ، بينما كان SOD أكثر تحديدًا من KOD في وجود حمض التانيك.
علاوة على ذلك ، تقدم طريقة SOD العديد من المزايا على KOD SOD وهي خالية تمامًا من اليد. في الواقع ، ليس من الضروري للمستخدم تحديد نافذة التحليل كما في طريقة KOD ، والأهم من ذلك ، لا تعتمد SOD على قيمة كفاءة ثابتة لتجنب جميع المشكلات المرتبطة بتحديدها [28 ، 40 ، 41]. كما ذكرنا سابقًا ، يمكن أن يؤدي تحديد كفاءة PCR المتغير إلى نتائج مختلفة تساهم في تحديد الكميات الخاطئة والمنتشرة [19].
علاوة على ذلك ، يتم تجنب تحويل بيانات التألق التي يمكن أن تكون مسؤولة عن التحيز في التحليل.
تم تطوير طريقة SOD للكيمياء Sybr Green ، ويجب تقييم تطبيق هذا الإجراء على كيميائية أخرى مثل TaqMan على نطاق واسع.
في الآونة الأخيرة ، Tichopad et al. [29] اقترح إجراء KOD جديدًا بناءً على إحصائية Malahanobis [30]. في هذه الدراسة تم تقدير الحد الأقصى للمشتق الأول والحد الأقصى للمشتق الثاني باستخدام تركيب لوجستي على الجزء المركزي من مسار PCR. باستخدام هاتين المعلمتين ، اقترح هؤلاء المؤلفون مراقبة النصف الأول فقط من المنحنى. على العكس من ذلك ، تعتمد طريقة SOD على إمكانية وصف مسار PCR بالكامل باستخدام معادلة Richards. يمثل SOD استمرارًا وامتدادًا لتطبيق معادلة ريتشاردز لقراءات PCR في الوقت الفعلي [11]. نعتقد أن طريقة SOD تقدم مفاهيم أصلية غير موجودة في الطريقة التي تم تطويرها مؤخرًا والتي وصفها Tichopad et al. [29]. يستفيد SOD من إمكانية وصف شكل مسار PCR بالكامل من خلال مجموعة المعلمات م, ذF و Fالأعلى بينما كانت طريقة Tichopad et al. [29] يركز على نقطتين رئيسيتين في المسار: الحد الأقصى للمشتق الأول والثاني.
علاوة على ذلك ، في طريقة SOD استخدمنا نهجًا متريًا مختلفًا تمامًا. على الرغم من توفر طرق أخرى متعددة المتغيرات لمهام مماثلة (آلات المتجهات الداعمة ، K- يعني الكتلة) ، فقد استخدمنا التوزيع المقارب لمسافة Mahalanobis لأنها امتداد منطقي لطريقة KOD ، والتي تعتمد على التوزيع الطبيعي أحادي المتغير.

أظهرنا ، لأول مرة، أنه يمكن استخدام مقارنة تباين شكل ملف تعريف التضخيم مع شكل ملفات التعريف القياسية لاستبعاد العينات الشاذة من ط م التحليلات. هذا يسمح لنا بتجنب انتشار النتائج وبالتالي يزيد من إمكانات التحليل الكمي.
ومن ثم فإننا نقترح SOD كطريقة لمراقبة الجودة بدون استخدام اليد في تحليل PCR في الوقت الفعلي مع تطبيقات في أي مجال من مجالات التشخيص الجزيئي.

ملف إضافي 1 -
بيانات الإسفار والتوضيح المناسب لتضخيم العينة القياسي (المنحنى القياسي) والتضخمات التي تم الحصول عليها في وجود: حمض التانيك ، IgG والكيرسيتين. ملف إضافي 2 -
الحلول التحليلية لقيمة y لنقطة الانعطاف (صF.) وميل الخط المستقيم المماس (م) عبور نقطة الانعطاف.
  • أ) توزيع مربع كاي للمسافات التربيعية حول متجه الوسط السكاني (D2 = ذ - Σ)'Σ -1 (ذ - Σ)) مع 3 درجات من الحرية.
  • ب) مخططات مبعثرة لجميع أزواج المتغيرات Fالأعلى, صF و م.
ملف إضافي 2 -
التضخيم (المنحنى القياسي) والتضخيم الذي تم الحصول عليه في وجود: حمض التانيك ، IgG وكيرسيتين.

ط م: دورة العتبة مفتش: الغلوبولين المناعي G SOD: الكشف عن الناشز الحركي القائم على الشكل كود: كشف الناشز الحركية اسيم: عدم التماثل.

نفذ MG و DS تصميم الدراسة ، وشاركا في تحليل البيانات ، وطورا طريقة SOD وصاغا المخطوطة. شاركت MBLR في جمع البيانات وتحليلها ونقحت المخطوطة بشكل نقدي. نفذت PT اختبار PCR في الوقت الحقيقي. شاركت بلدية دبي في جمع البيانات. شارك VS في تصميم الدراسة وقام بمراجعة نقدية للمخطوطة. كل الكتاب قراءة وافقت على المخطوط النهائي.

1 Dipartimento DiSUAN، Sezione di Biomatematica، Universit degli Studi di Urbino "Carlo Bo"، Campus Scientifico Sogesta Localit Crocicchia - 61029 Urbino، Italy و 2 Dipartimento di Scienze Biomolecolari، Sezione di Ricerca sull'Attivitute Motoria degli Studi di Urbino "Carlo Bo"، Via I Maggetti، 26/2 - 61029 Urbino، Italy.

استشهد بهذا المقال على النحو التالي: سيستي وآخرون., الكشف الحركي القائم على الشكل في الوقت الحقيقي PCR المعلوماتية الحيوية BMC 2010, 11:186

1. Gingeras TR ، Higuchi R ، Kricka LJ ، Lo YM ، Wittwer CT: خمسون عامًا من التشخيص الجزيئي (DNA / RNA).

بروتوكولات الطبيعة 2006 , 1(3):1559-1582. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل BioMed

تقنيات الحيوية 2008 , 44(5):619-626. بيوميد

Gunson RN و Bennett S و Maclean A و Carman WF: استخدام تعدد الإرسال PCR في الوقت الفعلي من أجل تبسيط خدمة التشخيص الروتينية.

ياء نوتر فيرول 2008 , 43(4):372-375.

Watzinger F و Ebner K و Lion T: الكشف عن الإصابات بالفيروسات ومراقبتها عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الوقت الفعلي.

الجوانب الجزيئية للطب 2006 , 27(2-3):254-298. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

كالتينبوك ب ، وانغ سي: التطورات في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي: التطبيق على التشخيص المختبري السريري.

التطورات في الكيمياء السريرية 2005 , 40:219-259. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

Akane A و Matsubara K و Nakamura H و Takahashi S و Kimura K: التعرف على مركب الهيم المُشترك مع الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) من بقع الدم ، وهو مثبط رئيسي لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

مجلة علوم الطب الشرعي 1994 , 39(2):362 - 372. ملخص PubMed | بيوميد

ويلسون IG: تثبيط وتسهيل تضخيم الحمض النووي.

علم الأحياء الدقيقة التطبيقي والبيئي 1997 , 63(10):3741-3751. ملخص PubMed | PubMed Central النص الكامل | بيوميد

تيتشوباد أ ، ديدييه أ ، بفافل ميغاواط: تثبيط القياس الكمي لـ RT-PCR في الوقت الحقيقي بسبب الملوثات الخاصة بالأنسجة.

مجسات خلية مول 2004 , 18(1):45-50. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

روسين إل ، نورسكوف ف ، هولمستروم ك ، راسموسن من: تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة مكونات عينات الطعام ، والفحوصات التشخيصية الجرثومية وحلول استخراج الحمض النووي.

المجلة الدولية لعلم الأحياء الدقيقة الغذائي 1992 , 17(1):37-45. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

Guescini M و Sisti D و Rocchi MB و Stocchi L و Stocchi V: طريقة PCR جديدة في الوقت الحقيقي للتغلب على عدم الدقة الكمية الكبيرة بسبب تثبيط التضخيم الطفيف.

كينز ف: مرحلة هضبة PCR - نحو فهم حدودها.

Biochimica et biophysica acta 2000 , 1494(1-2):23-27. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

ليفاك كج ، شميتجن TD: تحليل بيانات التعبير الجيني النسبي باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي وطريقة 2 (-Delta Delta C (T)).

الطرق (سان دييغو ، كاليفورنيا) 2001 , 25(4):402-408. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

ليو دبليو ، سانت دا: التحقق من صحة الطريقة الكمية لحركية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي.

Biochem Biophys Res Commun 2002 , 294(2):347-353. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

روتليدج RG: يعيد تركيب المنحنى السيني تعريف PCR الكمي في الوقت الحقيقي مع إمكانية تطوير تطبيقات آلية عالية الإنتاجية.

بفافل MW: نموذج رياضي جديد للتقدير النسبي في الوقت الحقيقي RT-PCR.

Goll R و Olsen T و Cui G و Florholmen J: تقييم الكميات المطلقة عن طريق الانحدار غير الخطي في PCR في الوقت الحقيقي القائم على المسبار.

بار T و Stahlberg A و Muszta A و Kubista M: الكشف عن الحركة النائية (KOD) في الوقت الحقيقي PCR.

Kontanis EJ و Reed FA: تقييم كفاءات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي للكشف عن مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل.

مجلة علوم الطب الشرعي 2006 , 51(4):795-804. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

Ramakers C و Ruijter JM و Deprez RH و Moorman AF: تحليل خالٍ من الافتراضات لبيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (PCR).

ليت نيوروسسي 2003 , 339(1):62-66. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

Wilhelm J، Pingoud A، Hahn M: التحقق من صحة خوارزمية للتقدير التلقائي لأرقام نسخ الحمض النووي عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الحقيقي.

الشرج Biochem 2003 , 317(2):218-225. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

Wilhelm J، Pingoud A، Hahn M: SoFAR: برنامج للتقييم التلقائي الكامل لبيانات PCR في الوقت الفعلي.

تقنيات الحيوية 2003 , 34(2):324-332. بيوميد

Ruijter JM و Ramakers C و Hoogaars WM و Karlen Y و Bakker O و Hoff MJ و Moorman AF: كفاءة التضخيم: ربط خط الأساس والتحيز في تحليل بيانات PCR الكمية.

ليو دبليو ، سانت دا: طريقة كمية جديدة لمقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي في الوقت الحقيقي بناءً على محاكاة حركية تفاعل البوليميراز المتسلسل.

الشرج Biochem 2002 , 302(1):52-59. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

Spiess AN، Feig C، Ritz C: تركيب سيني عالي الدقة لبيانات PCR في الوقت الفعلي عن طريق إدخال معلمة لعدم التماثل.

Qiu H، Durand K، Rabinovitch-Chable H، Rigaud M، Gazaille V، Clavere P، Sturtz FG: تم قياس التعبير الجيني لـ HIF-1alpha و XRCC4 في عينات بشرية بواسطة RT-PCR في الوقت الفعلي باستخدام طريقة تركيب المنحنى السيني.

تقنيات الحيوية 2007 , 42(3):355-362. بيوميد

روتليدج آر جي ، ستيوارت د: نموذج سيني قائم على الحركية لتفاعل البلمرة المتسلسل وتطبيقه على تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المطلق عالي السعة في الوقت الحقيقي.

Cikos S و Bukovska A و Koppel J: القياس الكمي النسبي للـ mRNA: مقارنة الطرق المستخدمة حاليًا لتحليل بيانات PCR في الوقت الفعلي.

Tichopad A و Bar T و Pecen L و Kitchen RR و Kubista M و Pfaffl MW: مراقبة جودة PCR الكمي بناءً على اختبار توافق التضخيم.

رينشر أس: طرق التحليل متعدد المتغيرات. الطبعة الثانية. وايلي ، طبع في الولايات المتحدة 2002.

Young CC و Burghoff RL و Keim LG و Minak-Bernero V و Lute JR و Hinton SM: Polyvinylpyrrolidone-Agarose Gel Electrophoresis تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل - الحمض النووي القابل للتضخيم من التربة.

علم الأحياء الدقيقة التطبيقي والبيئي 1993 , 59(6):1972-1974. ملخص PubMed | PubMed Central النص الكامل | بيوميد

Tichopad A ، Polster J ، Pecen L ، Pfaffl MW: نموذج لتثبيط Thermus aquaticus polymerase و Moloney Murine leukemia virus العكسي المنتسخة بواسطة بوليفينول الشاي (+) - كاتشين و (-) - epigallocatechin-3-gallate.

ي إثنوفارماكول 2005 , 99(2):221-227. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

Nolan T، Hands RE، Ogunkolade W، Bustin SA: SPUD: فحص كمي PCR للكشف عن المثبطات في مستحضرات الحمض النووي.

الشرج Biochem 2006 , 351(2):308-310. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

مورفي جيه ، بوستين سا: موثوقية PCR النسخ العكسي في الوقت الحقيقي في التشخيص السريري: المعيار الذهبي أم دون المستوى؟

مراجعة الخبراء للتشخيص الجزيئي 2009 , 9(2):187-197. ملخص PubMed | الناشر النص الكامل | بيوميد

تشاندلر دي بي ، واجنون كاليفورنيا ، بولتون إتش جونيور: تثبيط النسخ العكسي (RT) لـ PCR بتركيزات منخفضة من القالب وآثاره على RT-PCR الكمي.

علم الأحياء الدقيقة التطبيقي والبيئي 1998 , 64(2):669-677. ملخص PubMed | PubMed Central النص الكامل | بيوميد

Kubista M، Stahlberg A، Bar T: Q-PCR في الوقت الحقيقي قائم على مسبار الضوء.

في وقائع تقنيات الجينوم والبروتيوميات من SPIE حرره: TW Raghavachari R. 2001، 53-58. بيوميد

Karsai A و Muller S و Platz S و Hauser MT: تقييم خليط تفاعل SYBR green I محلي الصنع لتقدير PCR في الوقت الحقيقي للتعبير الجيني.

تقنيات الحيوية 2002 , 32(4):790-792. بيوميد

Tichopad A و Dzidic A و Pfaffl MW: تحسين استنساخ RT-PCR الكمي في الوقت الحقيقي من خلال تعزيز كفاءة التضخيم المرتبط بالتمهيدي.

رسائل التكنولوجيا الحيوية 2002 , 24:2053-2056. الناشر النص الكامل | بيوميد

Rosenstraus M، Wang Z، Chang SY، DeBonville D، Spadoro JP: ضوابط داخلية للتشخيص الروتيني PCR: التصميم والخصائص والتأثير على الأداء السريري.

مجلة علم الأحياء الدقيقة السريرية 1998 , 36(1):191-197. ملخص PubMed | PubMed Central النص الكامل | بيوميد

روتليدج آر جي ، ستيوارت د: التقييم النقدي للطرق المستخدمة لتحديد كفاءة التضخيم يدحض الطابع الأسي لـ PCR في الوقت الحقيقي.

Skern R ، Frost P ، Nilsen F: القياس الكمي النسبي للنسخة عن طريق PCR الكمي: هل هو صحيح تقريبًا أم خاطئ تمامًا؟


نتائج

القياس الكمي باستخدام AccuCal

لمعالجة المشاكل طويلة الأمد للطرق التقليدية لتقدير تفاعل البوليميراز المتسلسل [8] ، يجب أن يتكامل الحل المنهجي بسهولة في كل دورة qPCR ، ويوفر نتائج دقيقة ويكون قابلاً للتطبيق عالميًا.

تعتمد الطريقة على AccuCal-D ، وهو معاير DNA مزدوج الجديلة لاستخدامه مع الأصباغ المقحمة ، أو AccuCal-P ، وهو معاير مفرد مجدول ومُسمَّى بالفلوريسنت لمقايسات qPCR القائمة على المسبار. التحسين الأولي مطلوب ، ولكن بعد ذلك ، تتضمن طريقة AccuCal ثلاث خطوات بسيطة (الشكل 1 أ ومفصلة في الطرق). تم تطوير برنامج RealCount ™ لأتمتة الخطوات الحسابية.

القياس الكمي للحمض النووي المضخم لـ PCR باستخدام جهاز معايرة AccuCal. أ سير العمل المرتبط باستخدام AccuCal لتقدير كمية الحمض النووي المدخلة في كل PCR ، ب تم تخفيف معايرة AccuCal بحيث تمت إضافة 0 و 40 و 60 و 80 و 120 و 140 و 200 نانوغرام في Sso Fast EvaGreen Supermix إلى الآبار الخاصة بلوحة PCR وتعريضها لـ 40 دورة تضخيم. ج تم رسم شدة التألق لكل جهاز معايرة AccuCal (بعد طرح متوسط ​​0 نانوغرام مضان AccuCal) مقابل الكمية (pmols) وخط الانحدار الخطي المجهز لإنشاء منحنى المعايرة. د تم تضخيم التخفيفات عشرة أضعاف من DNA lambda ، والتي تتراوح من 4.5 × 10 6 - 4.5 × 10 1 نسخة / PCR ، في أربع نسخ في Sso Fast EvaGreen Supermix على نفس اللوحة مثل أجهزة معايرة AccuCal. ه تم استخدام منحنى المعايرة ، جنبًا إلى جنب مع الكفاءة المحسوبة لكل تفاعل تضخيم وأرقام الدورة بين نقطة الإقلاع (Cq) والحد الأقصى المشتق الثاني لكل تفاعل تضخيم ، لتحديد متوسط ​​كمية البداية من الحمض النووي في كل PCR. كما يتم عرض الخطأ المعياري للمتوسط. F تم رسم العدد النظري والمحدّد للنسخ / PCR ، بالإضافة إلى SEM ، مقابل بعضها البعض ورسم خط الانحدار لإثبات الاتفاق بين القيمتين

لتحديد نطاق AccuCal-D المراد استخدامه ، تم إجراء التحسين الأولي في ظل نفس ظروف التفاعل الخاصة بتضخيم الحمض النووي. في المثال الموضح ، كان النطاق من 0-140 نانوغرام ، هو الأمثل ، حيث امتد هذا الجزء الأسي لمنحنيات التضخيم ، حيث يتناسب مقدار الهدف المكبر طرديًا مع كمية الإدخال [9 ، 10] ، ويعطي قيمة خطية منحنى المعايرة بقيمة R 2 تبلغ 0.9987 (الشكل 1 ب ، ج وملف إضافي 1). يجب إجراء هذا التحديد مرة واحدة فقط ، بشرط أن تظل ظروف التفاعل لجميع تقارير PCR اللاحقة ثابتة.

لإظهار دقة القياس الكمي لـ AccuCal-D ، قمنا بتضخيم التخفيفات التسلسلية بعشرة أضعاف للكميات المعروفة من أمبليكون 92 bp من lambda DNA ، من 4.5 × 10 6 - 4.5 × 10 1 نسخ ، بشكل رباعي إلى جانب AccuCal-D ، في كميات محددة مسبقًا ، ورسم منحنى المعايرة (الشكل 1 ب-د). ثم تم تحديد كفاءة كل تفاعل تضخيم بواسطة RealCount باستخدام خوارزميات معروفة [10]. أخيرًا ، باستخدام قيم الكفاءة ومنحنى المعايرة ، تم حساب متوسط ​​كمية إدخال DNA ، والخطأ القياسي للمتوسط ​​، لجميع الدورات خلال المرحلة الأسية لكل منحنى تضخيم باستخدام RealCount (الشكل 1 هـ). أسفر تحليل الانحدار بين القيم المحددة والكمية النظرية المصنفة في PCR عن R 2 من 0.9977 (الشكل 1f) مما يدل على فائدة طريقة AccuCal-D ودقتها في التقدير الكمي المطلق لـ qPCR في الوقت الحقيقي.

يعتمد AccuCal-D على صبغة مقحمة لتوليد التألق ، لكن الصبغة: نسبة التألق AccuCal-D غير معروفة. لفهم هذه العلاقة ، قمنا بتطوير إصدار قائم على التحقيق من AccuCal ، AccuCal-P. تم تضخيم أمبليكون 92 نقطة أساس من مجموعة من تركيزات الحمض النووي لامدا واكتشافه باستخدام إما مسبار التحلل المائي المسمى FAM أو صبغة EvaGreen المقسمة. تم تضمين كل من AccuCal-D و AccuCal-P المسمى FAM على لوحة PCR وتم استخدامهما بشكل مستقل لتحديد الحمض النووي لـ lambda الذي تم اكتشافه بواسطة كلتا العلامات. أسفر التقدير الكمي باستخدام إما AccuCal-D أو AccuCal-P ، لكلا مجموعتي تضخيم PCR ، عن نتائج لا يمكن تمييزها لكل تخفيف مع عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المنحدرات عند رسم العدد النظري للنسخ مقابل عدد محدد من النسخ (المنحدرات = 0.9601 ، 0.9653 ، 0.9623 و 0.9701 ، R 2 = 1 لكل شكل 2 أ وملف إضافي 1). يتم تسمية AccuCal-P ومسبار التحلل المائي بشق FAM واحد لكل جزيء DNA ، ويبلغان عن نفس التألق لكل جزيء DNA كما تفعل صبغة EvaGreen في ظل ظروف qPCR هذه.

القياس الكمي باستخدام كل من AccuCal-D و AccuCal-P. أ تم تضخيم خمسة ، عشرة أضعاف كمية معروفة من DNA lambda ، تتراوح من 4.5 × 10 5 إلى 4.5 × 10 1 ، مرتين في أربع مرات واكتشافها باستخدام إما EvaGreen ، صبغة الإقحام في Sso Fast mastermix ، أو مسمى FAM مسبار التحلل المائي الخاص بالأمبليكون المستهدف. في كلتا الحالتين ، تم تضمين أجهزة معايرة AccuCal-D و AccuCal-P على نفس اللوحة واستخدمت بشكل مستقل لتحديد كمية البداية من DNA المدخلات في كل PCR. تم رسم المقدار النظري مقابل المبلغ المحسوب ، والذي تم تحديده بواسطة AccuCal-D أو AccuCal-P ، باستخدام صبغة EvaGreen (EG) أو مسبار التحلل المائي (P) ، ويظهر الانحدار الخطي لكل منهما في الرسم البياني على اليمين . ب تم تضخيم خمسة أو عشرة أضعاف التخفيفات من كمية معروفة من DNA lambda في رباعي المضاعفات في Sso Fast mastermix باستخدام بادئات لإعطاء أمبليكون 501 نقطة أساس. تم تضمين أجهزة معايرة AccuCal-D و AccuCal-P على نفس اللوحة واستخدمت بشكل مستقل لتحديد كمية البداية من DNA lambda في كل PCR. تم رسم المقدار النظري مقابل المبلغ المحسوب ، الذي تم تحديده بواسطة AccuCal-D أو AccuCal-P ، لـ 501 bp amplicon ، ويظهر الانحدار الخطي لكل منهما في الرسم البياني الموجود على اليمين. ج تم تضخيم خمسة ، عشرة تخفيفات (ثلاث مائة ضعف على Eco) لكمية معروفة من DNA lambda في العديد من الخلطات الرئيسية (انظر الطرق) على منصات qPCR المختلفة المشار إليها على مدى 2-10 دورات PCR. تم رسم المقدار النظري مقابل متوسط ​​المبلغ المحسوب ، الذي تم تحديده بواسطة AccuCal-D ، عبر جميع الأنظمة الأساسية ويظهر الانحدار الخطي في الرسم البياني الموجود على اليمين. يتم عرض متوسط ​​عدد النسخ المحسوبة / PCR و SEM في كل حالة

لتحديد نطاق أحجام amplicon التي يمكن استخدام تقدير AccuCal-D الكمي لها ، قمنا أيضًا بتضخيم أمبليكون لامدا بمقدار 501 نقطة أساس. تغطي الأمبليكونات من 92 نقطة أساس إلى 501 نقطة أساس طيف أحجام الأمبليكون التي يتم تضخيمها عادةً بواسطة qPCR. مرة أخرى ، تم استخدام AccuCal-P ومسبار التحلل المائي الخاص بالقالب المسمى FAM كمقارن لـ AccuCal-D وصبغة الإقحام. تظهر النتائج أن القياس الكمي مشابه لكل من أحجام amplicon سواء تم حساب ذلك باستخدام AccuCal-D أو AccuCal-P ، مع عدم اختلاف المنحدرين بشكل كبير عن 1 (الشكل 2 ب). يشير هذا إلى أن صبغة ومسبار الفلورة يظلان ثابتًا على هذا النطاق من أحجام الأمبليكون ، وبالتالي يمكن استخدام AccuCal بشكل موثوق لتحديد أي أمبليكون ضمن هذا النطاق.

لتقييم أداء AccuCal-D في مجموعة متنوعة من الخلطات الرئيسية القائمة على الصبغة على عدد من منصات qPCR في الوقت الفعلي ، تم تزويد ثماني مجموعات بحثية مستقلة بـ AccuCal-D وكواشف لتضخيم lambda (92 نقطة أساس أمبليكون). قام كل مختبر بتضخيم أهداف الحكومة ومقادير المدخلات المعروفة من لامدا في ظل مجموعة من الظروف النموذجية لتلك المختبرات. تظهر النتائج أن AccuCal-D يوفر تقديرًا كميًا دقيقًا ومطلقًا للتركيزات المعروفة من DNA lambda في هذه الاختبارات المتنوعة والمستقلة (الشكل 2 ج). عند المقارنة بشكل جماعي عبر جميع المنصات ، فإن متوسط ​​التقدير الكمي المحدد يرتبط تمامًا بالعدد النظري للنسخ في كل PCR (الشكل 2 ج ، المنحدر = 1).

عند دمجها في كل qPCR تعمل في ظل نفس الظروف مثل GOI (s) ، يوفر AccuCal تقديرًا كميًا قويًا مطلقًا عبر مجموعة من كميات الإدخال وأحجام amplicon ، في فحوصات تعتمد على الصبغة أو المسبار.

يوفر AccuCal الثقة في التحليل الكمي النسبي

القياس النسبي على سبيل المثال تعد تحليلات ΔΔCq [11] و Pfaffl [12] تقليديًا الطريقة الأبسط والأكثر استخدامًا لتقدير تفاعل البوليميراز المتسلسل. على الرغم من أن AccuCal يوفر تقديرًا كميًا مطلقًا ، إلا أنه يمكن تطبيقه نسبيًا.

لمقارنة AccuCal-D مع تحليلات Cq و Pfaffl ، قمنا بتقييم مستويات متغيرات سلسلة ألفا لمستقبلات CD40 و Interleukin 7 (IL7R). يكشف تنشيط الخلايا أحادية النواة في الدم البشري المحيطي (PBMCs) عن ذخيرة من متغيرات لصق هذه الجينات التي تعكس استعدادًا لمرض التصلب المتعدد [13 ، 14]. أجرينا تجارب لقياس مستويات CD40 و IL7R في PBMCs البشرية عبر qPCR بعد تنشيط لمدة 24 ساعة بكميات متفاوتة من phorbol myristate acetate (PMA) و ionomycin (PMA / I). تم إجراء التقدير الكمي المطلق لـ qPCR باستخدام AccuCal-D و RealCount (الشكل 3 أ وملف إضافي 1). تم تقييم الكميات النسبية من خلال التعبير عن قيم AccuCal-D المطلقة بالنسبة إلى عدم وجود تحكم PMA / أيونوميسين ، أو عن طريق تحليلات Cq أو Pfaffl التقليدية باستخدام نازعة هيدروجين الغليسرالديهيد 3-فوسفات (جابده) كجينة مرجعية والخلايا غير المحفزة كعنصر تحكم (الشكل 3 ب). لتحليل Pfaffl ، تم استخدام الكفاءات المحسوبة بواسطة RealCount.

التحديد الكمي لـ CD40, IL7R و جابده في PBMCs مع 0-1x PMA / أيونوميسين. أ التقدير المطلق لـ CD40, IL7R و جابده في PBMCs محفز بـ 0 و 0.25x و 0.5x و 1x PMA / ionomycin (20 نانوغرام مل -1 PMA ، 500 نانوغرام مل -1 أيونوميسين PMA / I) بواسطة برنامج RealCount الذي يتبع qPCR باستخدام معايرات AccuCal-D. ب مستويات التعبير النسبي CD40 و IL7R في PBMCs محفز بـ 0 ، 0.25x ، 0.5x و 1x PMA / ionomycin (20 نانوغرام مل −1 PMA ، 500 نانوغرام مل أيونوميسين). الأشرطة المظلمة هي مستويات تعبير نسبي يتم تحديدها باستخدام ΔΔCq جابده باعتبارها الجين المرجعي وليس PMA / أيونوميسين كعينة تحكم ، فإن القضبان الصلبة هي مستويات تعبير نسبي يحددها تحليل Pfaffl ، باستخدام GAPDH كجينة مرجعية ، والخلايا غير المحفزة كعناصر تحكم وقيم الكفاءة الفردية المحسوبة بواسطة برنامج RealCount ، ويتم تحديد الأشرطة ذات المربعات بواسطة برنامج RealCount بعد إدراج AccuCal-D في نفس تشغيل PCR ، ويتم التعبير عنه بالنسبة إلى عدم وجود عنصر تحكم PMA / ionomycin. ج رسوم بيانية تراكب تمثيلية من قياس التدفق الخلوي تُظهر القياس النسبي لـ CD40 و IL7R في نفس السكان من PBMCs المحفزة بـ 0 (أحمر) ، 0.25 ضعفًا (أزرق) ، 0.5x (لون أخضر) و 1 x PMA / ionomycin (20 نانوغرام مل −1 PMA ، 500 نانوغرام مل -1 أيونوميسين البرتقالي) مثل كلمة (أ). **** ص & lt 0.0001 نسبة إلى عدم وجود تحكم في PMA / أيونوميسين ، ن = 4

أظهر كل من التحليلات المطلقة والنسبية التعبير عن IL7R كان أقل بمقدار 3-10 أضعاف في الخلايا المنشطة (ص ≤ 0.0001 بكل الطرق) مقارنة بالخلايا غير المحفزة بينما توجد اختلافات في مستويات CD40 لم تكن ذات أهمية كبيرة. في هذه التجربة ، كان تفسير بيانات qPCR من تحليلات ΔΔCq و Pfaffl هو نفسه الذي قدمه AccuCal-D (الشكل 3 ب). افتراض تحليلات ΔΔCq و Pfaffl هو أن مستوى جابده يبقى الجين المرجعي ثابتًا بين العلاجات. الأهم من ذلك ، أشار التقدير الكمي المطلق باستخدام AccuCal-D إلى أن هذا هو الحال بالفعل (الشكل 3 أ). تم دعم نتائج تحليلات qPCR بواسطة قياس التدفق الخلوي ، ولم يظهر أي اختلاف في مستوى تعبير CD40 وانخفاض بمقدار 3-5.5 أضعاف في التعبير عن IL7R في مجموعة العلاج مقارنة بالخلايا غير المعالجة (الشكل 3 ج).

الأهم من ذلك ، يوفر تحليل AccuCal-D و RealCount بيانات تتعلق بمستويات التعبير لجميع الجينات ، بما في ذلك الجين المرجعي ، بين العلاجات / المجموعات (الشكل 3 أ) ، والكفاءات الفردية لكل تفاعل تضخيم ، والتي لا تتوفر باستخدام ΔΔCq و Pfaffl التحليلات.

يحل AccuCal محل تحليلات القياس الكمي التقليدية

يستحث الفوسفاتاز الخاص بظهارة البروستات والضربة القاضية المتجانسة التنسينية (pePTENKO) علم أمراض البروستات [15] ويعدل التعبير عن مستقبلات الأندروجين (AR) للبروستات في الفئران على النحو الذي تحدده الكيمياء المناعية (الشكل 4 أ وملف إضافي 1) أو اللطخة الغربية (الشكل 4 ب) ). أظهر التحليل الغربي أن مستويات بروتين بيتا-أكتين (ACTB) كانت ثابتة وتم استخدامها لتحديد مستويات التعبير البروتين النسبية. كان محتوى بروتين AR أكبر بشكل ملحوظ (ص = 0.008) في أنسجة البروستات من فئران pePTENKO مقارنة بالنوع البري (WT الشكل 4 ب).

التحديد الكمي لمستويات البروتين و mRNA لمستقبلات الأندروجين (AR ، أر) في البروستاتا الأمامية للفأر. أ الكيمياء المناعية التمثيلية تظهر تعبير البروتين AR (تلطيخ بني) وعلم الأمراض التفاضلي في البروستاتا لفئران WT و pePTENKO. ب القياس الكمي لبروتين AR بواسطة لطخة غربية في البروستاتا الأمامية لـ WT (ن = 2) و pePTENKO (ن = 4) الفئران ، باستخدام β-actin (ACTB) كعنصر تحكم في التحميل لتحديد مستويات البروتين النسبية. ج القياس الكمي النسبي أر بواسطة تحليلات ΔΔCq و Pfaffl باستخدام فعل باعتباره الجين المرجعي و WT كعنصر تحكم. د qPCR من أر و فعل في WT (منحنيات زرقاء, ن = 7 في نسختين) و pePTENKO (منحنيات حمراء, ن = 5 في مكررة) الفئران. ه مقارنة بين القياس الكمي النظري مقابل التحديد الكمي للتخفيفات التسلسلية المحتوية على البلازميدات أر أو فعل amplicons ، إما عن طريق المنحنيات القياسية التقليدية (الماس الأزرق والخط) أو استخدام AccuCal و RealCount (المربعات الحمراء والخط). F عدد نسخ مرنا المطلق الكمي أر و فعل الجين المرجعي في البروستاتا الأمامية لـ WT (ن = 7) و pePTENKO (ن = 5) الفئران كما هو محدد بواسطة RT-qPCR مع أجهزة معايرة AccuCal وبرنامج RealCount (AC) أو المنحنيات القياسية (Std). ز التقدير الكمي المطلق لعدد من الجينات المرجعية باستخدام AccuCal و RealCount لكل من WT (ن = 7) و pePTENKO (ن = 5) الفئران. ح مقارنة منهجيات القياس الكمي النسبي ل أر. تم استخدام تحليلات ΔΔCq و Pfaffl أيضًا فعل أو همبس كجين مرجعي و WT كعنصر تحكم ، وتم التعبير عن القيم المطلقة AccuCal (AC) والمنحنى القياسي (Std) بطريقة نسبية إلى WT كعنصر تحكم. يتم عرض جميع البيانات الرسومية على أنها تعني ± SEM. **** p & lt0.0001 ، ** ص = 0.001–0.01, * ص = 0.01-0.05 بواسطة عينتين مستقلتين ر-اختبار بين التعبير عن مستقبلات الأندروجين أو β-actin mRNA أو البروتين في فئران pePTENKO مقارنةً بفئران WT ، أو بين طرق التعبير النسبي مقارنةً بـ Cq و Pfaffl التي أجريت باستخدام فعل كجينات مرجعية

لتحديد ما إذا كان يمكن استبدال هذه المقايسات المعقدة بتحليل mRNA باستخدام qPCR ، قمنا بتضخيم PCR أر و فعل من RNA البروستاتا المستخرج من الفئران WT و pePTENKO. في البداية ، تم إجراء القياس الكمي النسبي بواسطة تحليلات ΔΔCq و Pfaffl التقليدية باستخدام فعل باعتباره الجين المرجعي و WT كعنصر تحكم. فعل تم اختياره حيث تم التعبير عن البروتين بثبات بين المجموعات (الشكل 4 ب). أشارت تحليلات ΔΔCq و Pfaffl إلى عدم وجود تغيير كبير في أر مستويات التعبير في الفئران pePTENKO مقارنة مع WT (1.250 و 1.286 أضعاف زيادة ، على التوالي الشكل 4 ج). من المعروف أن مستويات البروتين و mRNA لا ترتبط بالضرورة [16 ، 17] ، مما قد يفسر هذه النتيجة. بدلاً من ذلك ، قد يكون تحليل qPCR النسبي غير صحيح. اقترح فحص مخططات التضخيم تعبيرا أكبر عن أر، إلى جانب Actb ، في البروستاتا من الفئران pePTENKO (الشكل 4 د).

لحل هذه المشكلة ، استخدمنا القياس الكمي المطلق عبر AccuCal-D ، أو المنحنيات القياسية ، لتحديد مستويات أر و فعل في الفئران pePTENKO و WT. أظهرت النتائج أن مستويات التعبير لكل جين لها تقديرات كمية مطلقة مماثلة بكلتا الطريقتين (الشكل 4 هـ) وكانت أعلى بشكل ملحوظ في البروستات من الفئران pePTENKO من الفئران WT لكل من المنحنى القياسي و AccuCal-D (ع ، ص & lt 0.0001 و ص & lt 0.0001 فعل, ص = 0.0049 و ص = 0.0043 ، على التوالي الشكل 4f). عندما يتم التعبير عنها بطريقة نسبية ، أر كان التعبير في الفئران pePTENKO أعلى بمقدار 3.806 ضعفًا من الفئران WT عن طريق القياس الكمي للمنحنى القياسي و 3.697 ضعفًا أعلى من خلال القياس الكمي AccuCal-D. كان كلاهما مختلفًا بشكل كبير عن تحليلي ΔΔCq و Pfaffl باستخدام فعل كجينة مرجعية (ص & lt 0.0001 Fig. 4h) ، لكنها كانت متوافقة مع نتائج اللطخة الغربية. في هذا المثال ، لم تكن تحليلات ΔΔCq و Pfaffl دقيقة لأن الجين المرجعي المستخدم تغير بشكل مشابه لـ GOI بين الأنماط الظاهرية (الشكل 4f).

بالإضافة إلى ذلك ، قمنا باستخدام AccuCal-D بتحديد عدد من الجينات المرجعية المحتملة الأخرى لاستخدامها في التطبيع. لم يكن هناك فرق كبير بين التعبير عن بروتين الريبوسوم L19 (Rpl19) و hydroxymethylbilane synthase (همبس) بين WT و pePTENKO ، ولكن تم التعبير عن جميع الجينات المرجعية المتبقية بكثرة في بروستات فئران pePTENKO أكثر من الفئران WT ، مما يبرز صعوبة العثور على جين مرجعي مناسب في بعض التجارب (الشكل 4g). ثم كررنا تحليلات ΔΔCq و Pfaffl باستخدام أقل جين مرجعي متغير ، همبس، وكانت النتائج (4.294 و 3.603 أضعاف الزيادات ، على التوالي) متشابهة جدًا مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام AccuCal-D أو تقدير المنحنى القياسي ، ومختلفة بشكل كبير عن تحليلات ΔΔCq و Pfaffl التي تم إجراؤها باستخدام فعل كجينة مرجعية (ص & lt 0.0001 في كلتا الحالتين الشكل 4 ح).

في النموذج الموصوف ، قدم AccuCal-D طريقة بديلة للتقدير الكمي ، مستقلة عن الجينات المرجعية ، حيث يصعب العثور عليها (الشكل 4 ح). الأهم من ذلك ، لقد أظهرنا أيضًا أن القياس الكمي المطلق بواسطة المنحنى القياسي يتوافق تمامًا مع تحليل AccuCal-D (الشكل 4 هـ ، و). أظهر هذا أن مستويات التعبير البروتيني والجيني لـ AR /أر مترابط ، مما يسمح باستخدام تحليل mRNA بواسطة qPCR كمقايسة مراسل مخلص. والجدير بالذكر أن AccuCal قدم هذه المعلومات بشكل أكثر بساطة من طريقة المنحنى القياسية ، ويمكن استخدام منحنى معايرة واحد لتحديد جميع الجينات التي تم فحصها بشكل متزامن.


المنشور 3 - حساب التراكيز "غير المعروفة" باستخدام منحنى قياسي

المنحنى القياسي عبارة عن رسم بياني يتعلق بكمية مُقاسة (نشاط إشعاعي ، أو فلورة ، أو كثافة بصرية ، على سبيل المثال) بتركيز المادة محل الاهتمام في & quotknown & quot؛ العينات. تقوم بإعداد ومعايرة & quotknown & quot؛ عينات تحتوي على المادة بكميات مختارة لتغطي نطاق التركيزات التي تتوقع العثور عليها في & quotunknown & quot؛ العينات. يمكنك بعد ذلك رسم المنحنى القياسي عن طريق رسم الكمية المقاسة (على المحور Y) مقابل التركيز (على المحور X). يمكن استخدام مثل هذا المنحنى لتحديد تركيزات المادة في عينات & quotunknown & quot. المنشور بأتمتة هذه العملية.

يمكن أن يتلاءم المنشور مع المنحنيات القياسية باستخدام الانحدار غير الخطي (تركيب المنحنى) ، أو الانحدار الخطي ، أو منحنى شريحة مكعبة (أو LOWESS). للعثور على & اقتباس & quot التركيزات باستخدام منحنى قياسي ، اتبع الخطوات التالية:

في ال مرحبًا بك في Prism مربع الحوار ، حدد أنشئ مشروعًا جديدًا و العمل باستقلالية. اختر تنسيق العمود X بتنسيق أعداد ولتنسيق العمود Y لعدد التكرارات في بياناتك. على سبيل المثال لدينا ، اختر عمود واحد من القيم.

أدخل البيانات للمنحنى القياسي. في مثالنا ، الموضح أدناه ، أدخلنا تركيزات لعينات & quotknown & quot في العمود X والصفوف 1-5 ونتائج الفحص المقابلة في العمود Y. لا تقلق إذا عرض Prism أصفارًا زائدة لم تدخلها - سنقوم بتغيير ذلك لاحقًا. أسفل قيم المنحنى القياسية مباشرةً ، بدءًا من الصف 6 ، أدخل نتائج الفحص لعينات & quotunknown & quot في العمود Y ، تاركًا خلايا X المقابلة فارغة. لاحقًا ، سوف يتلاءم المنشور مع المنحنى القياسي ثم يُبلغ عن تركيزات المادة غير المعروفة باستخدام هذا المنحنى.

اضغط على حلل زر. يختار تحليل مدمج. من المنحنيات والانحدار أمبير فئة ، حدد الانحدارالخطي إذا كنت تستخدم بيانات المثال الخاصة بنا (أو إذا كنت تقوم بتحليل البيانات التي تشك في أنها منحنية الخطوط ، فاختر الانحدار غير الخطي [ملاءمة المنحنى]). للحصول على مثال حول كيفية المتابعة مع البيانات غير الخطية ، راجع المثال على تحليل بيانات RIA أو ELISA.

في مربع الحوار المعلمات: الانحدار الخطي ، حدد المربع المسمى المنحنى القياسي X من Y، لأننا نريد توفير تركيزاتنا غير المعروفة. في ال انتاج | فئة الخيارات ، حدد آلي خيارات لتحديد المكان الذي سيبدأ فيه Prism خط الانحدار وينتهي به. اضبط عدد الأرقام المعنوية على 3.

عند النقر فوق نعم لترك مربع حوار معلمات الانحدار الخطي ، يقوم Prism بتنفيذ الملاءمة وإنشاء ورقة نتائج.

يعرض المنشور النتائج على صفحات تسمى طرق العرض. يُظهر العرض الافتراضي المعلمات المحددة لمنحنى أفضل ملاءمة.

حدد المربع المنسدل المسمى & quotView & quot في الصف الثالث من شريط الأدوات (وليس قائمة & quotView & quot في أعلى الشاشة). يختار محرف X القيم (في الإصدارات المبكرة من Prism ، كان هذا & quot المنحنى القياسي X من Y & quot).

يُبلغ المنشور عن قيمة X المقابلة لكل قيمة Y غير مقترنة في ورقة البيانات الخاصة بك.

أضف المجهول إلى الرسم البياني الخاص بك

يتضمن الرسم البياني التلقائي Prism & # 39 s البيانات من ورقة البيانات والمنحنى. لإضافة & quotunknowns & quot إلى الرسم البياني:

قم بالتبديل إلى ملف الرسوم البيانية قسم من مشروعك.

اضغط على يتغيرون زر ثم حدد البيانات على الرسم البياني.

يعرض مربع الحوار جميع البيانات وجداول النتائج الممثلة في الرسم البياني. اضغط على يضيف زر.

من القائمة المنسدلة أعلى ملف أضف مجموعات البيانات إلى الرسم البياني مربع الحوار ، حدد . الانحدار الخطي: محرف X القيم. انقر فوق يضيف، من ثم قريب. يجب أن تبدو قائمة مجموعات البيانات المضمنة في الرسم البياني الآن مثل النافذة أدناه.

صحافة نعم للعودة إلى الرسم البياني.

إذا كنت ترغب في تمثيل & quotunknowns & quot على شكل ارتفاعات متوقعة على المحور X (بدلاً من نقاط البيانات) ، فانقر فوق الزر "تغيير" وحدد الرموز والخطوط. من القائمة المنسدلة & quot؛ مجموعة البيانات & quot ، حدد. الانحدار الخطي: محرف X القيم. قم بتغيير شكل الرمز إلى أحد الخيارات الأربعة الأخيرة (المسامير) ، واضبط الحجم على 0.

نتائج المنحنى القياسي - يتم تمثيل المجهول على شكل ارتفاعات في الرسم البياني يتم الإبلاغ عن النتائج الرقمية كجدول مضمن. يتضمن الرسم التوضيحي بعض تغييرات التنسيق التي لم تتم مناقشتها هنا.


مناقشة

  • اعتقدت أنها طريقة رائعة للمساعدة في فهم ما كنت أفعله بدلاً من مجرد إخباري بما يجب القيام به.
  • في الواقع ، كان اختيار طفرة قمنا بها شخصيًا هو الشيء الأكثر إثارة للاهتمام حتى الآن طوال مسيرتي المهنية هنا في IUP.
  • كان من المثير للاهتمام اختيار الطفرة الخاصة بك مقابل فهم الطفرة التي اختارها شخص آخر.
  • اعتقدت انه كان رائعا حقا. جعلني هذا أشعر أنني باحث ومستكشف حقيقي.

من خلال اختيار الطفرة الخاصة بهم ، يدخل هؤلاء الطلاب في وضع الباحثين وقد رحبوا بهذا بوضوح. يتمثل الخطر في محاكاة موقف بحثي في ​​دورة معملية للطلاب في الإمكانات العالية للحصول على نتائج أقل من الأمثل مقارنة بالإجراءات "التي تم اختبارها بواسطة الطالب". في الواقع ، نجحت مجموعة واحدة فقط من المجموعات الثلاث في BIOC 312 في إنتاج بروتين متحور للتحليل وتم تنقية هذا البروتين جزئيًا فقط بالطريقة المستخدمة في الدورة. في حين أن الفشل في إنتاج بروتين متحور سيكون مخيبا للآمال ، فإن كل مجموعة ستنتج وتنقي بنجاح البروتين من النوع البري. يمكن بسهولة استخدام فترات الدورة التدريبية التي كان من الممكن أن يتم إنفاقها في تحليل البروتين المتحول لتحليل إضافي للشكل من النوع البري.

بالإضافة إلى الجمع بين ميزات مشروعين تم وصفهما مسبقًا ، يتضمن هذا المشروع عنصرًا جديدًا ، وهو استخدام طريقة تحليل عالية الإنتاجية في شكل دراسات استقرار البروتين باستخدام أداة PCR في الوقت الفعلي. نظرًا للتركيز المتزايد على الأساليب عالية الإنتاجية في البحث ، فإن تعريض الطلاب لمثل هذه الأساليب أمر مرغوب فيه. هناك العديد من الفوائد الإضافية في هذه الحالة. أدى استخدام أداة PCR في الوقت الحقيقي إلى زيادة كبيرة في عدد العينات التي تم تحليلها وعدد جلسات الأداة لكل مجموعة مقارنة بالتحليل بواسطة مقياس الطيف الضوئي لعينة واحدة. تم قياس المجموعات التي تستخدم أداة PCR في الوقت الفعلي من 36 إلى 76 منحنيات انصهار لبروتينها من النوع البري في خمس جلسات منفصلة للأجهزة. في العام السابق ، قامت ثلاث مجموعات طلابية باستخدام مقياس الطيف الضوئي بقياس من 3 إلى 5 منحنيات ذوبان. لذلك كان لدى الطلاب فرصة أكبر لصقل أسلوبهم ، واختبار المتغيرات التجريبية ، وتصميم تجارب المتابعة. بالإضافة إلى ذلك ، اكتسبوا خبرة في إدارة وتحليل مجموعات بيانات أكبر مما يواجهونه عادةً في الدورات المختبرية الأخرى.

من عيوب التمسخ الحراري كما ترصده صبغة المراسل مثل برتقالي SYPRO أن التحليل الديناميكي الحراري الممكن باستخدام بيانات التألق الجوهرية لتقدير Δح س و Δس o للتكشف 11 غير صالح. يفترض هذا التحليل وجود توازن بسيط وقابل للعكس بين البروتين المطوي وغير المطوي. في حين أن هذا ربما لا يكون صحيحًا تمامًا بالنسبة لمعظم البروتينات في ظل ظروف التمسخ الحراري ، فمن المؤكد أنه ليس صحيحًا في وجود صبغة مراسلة ترتبط بالبروتين بشكل مختلف عندما تتكشف. ستعكس القيم الديناميكية الحرارية التي تم الحصول عليها في هذه الحالة كلاً من تكشف البروتين وربط صبغة المراسل.

هناك عدة خيارات ممكنة إذا كان من المطلوب تضمين تحليل يتجاوز الحساب البسيط تيم من منحنيات الذوبان. يمكن استخدام قياس التألق بالمسح التفاضلي (قياس منحنيات الانصهار في غياب ووجود الترابط) لحساب ثوابت تفكك الترابط 7 ، 8. لهذا التحليل ، يجب ألا يحتوي البروتين في البداية على يجند مرتبط. بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام منحنيات الذوبان المقاسة بواسطة أداة PCR في الوقت الفعلي في وجود برتقال SYPRO لحساب المعلمات الحركية لتكشف البروتين في وجود مواد كيميائية مغيرة للتشبع 9. لم تتم محاولة أي من هذين التحليلين في التجربة الأولية لمشروع عامل الترجمة الموسع. تم استكشاف بديل ثالث في إعداد دورة منفصلة. يعتمد هذا على التخلص من صبغة المراسل باستخدام GFP المحسن (EGFP) ، وهو بروتين يتألق بشكل طبيعي بطول موجة يمكن اكتشافه بواسطة أداة PCR في الوقت الفعلي.

يتم استخدام EGFP والبروتينات الفلورية ذات الصلة كمستشعرات حيوية في مجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك دراسات تفاعلات البروتين والبروتين والتغيرات التوافقية. تمت دراسة عملية الطي / التفتح لهذه البروتينات المهمة من خلال مجموعة من الطرق 15-17. تتمتع هذه البروتينات باستقرار حراري عالٍ في ظل الظروف الفسيولوجية العادية ، ويتم إجراء العديد من الدراسات حول طيها / تفتحها عند درجة حموضة منخفضة أو في وجود عوامل تغيير طبيعة. تشير مراجعة الأدبيات إلى أنه كانت هناك دراسات قليلة حول التمسخ الحراري لـ EGFP. في حين أنه من المعروف أن هذه البروتينات لا تتبع نموذجًا بسيطًا ثنائي الحالة للتكشف ، فإن منحنيات التمسخ في ظل بعض الظروف لها شكل يتوافق مع هذا النموذج ، وبالتالي يمكن استخدامها لاشتقاق القيم الديناميكية الحرارية لعملية التفتح الشاملة. يوضح الشكل 7 منحنيات الانصهار لـ EGFP التي تم الحصول عليها بواسطة أداة PCR في الوقت الحقيقي. تم إنشاء نتائج EGFP من قبل الطلاب الجامعيين في دورة الكيمياء الحيوية لمدة فصل دراسي واحد والتي لا تتضمن عادةً مكونًا معملًا. تم تضمين تجربة معملية تنطوي على التعبير والتنقية وتوصيف EGFP للدورة المقدمة مع تسجيل صغير خلال جلسة صيفية. تشير هذه النتائج الأولية للتمسخ الحراري لـ EGFP باستخدام أداة PCR في الوقت الفعلي إلى أن هذا النظام قد يكون نظامًا واعدًا لإدراجه في تجربة معملية جامعية.


شاهد الفيديو: MARINKO ROKVIĆ U TEŠKOM STANJU! Evo sta se desilo pevaču! (سبتمبر 2022).