معلومة

Polymerases - علم الأحياء

Polymerases - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

من بين جميع الوظائف الأنزيمية اللازمة لتكرار الحمض النووي ، فإن القدرة على تحفيز دمج الديوكسينوكليوتيدات في الحمض النووي هي الأكثر أهمية. تم عزل الإنزيمات التي تحفز هذا التفاعل ، وهي بوليميرات الحمض النووي ، من العديد من الأنواع ، والعديد من الأنواع لديها بوليميرات متعددة من الحمض النووي. يأتي فهمنا الأول والأكثر اكتمالاً لآلية هذه الإنزيمات من دراسات أول بوليميريز DNA معزول ، يسمى DNA polymerase I.

آلية إضافة النيوكليوتيدات بواسطة بوليميراز الحمض النووي

في عام 1956 ، عزل آرثر كورنبرج وزملاؤه بروتينًا من E. القولونيةالتي لديها العديد من الخصائص المتوقعة لبوليميراز الدنا المستخدم في النسخ المتماثل. على وجه الخصوص ، يحفز تخليق الحمض النووي من الديوكسينوكليوتيدات ، ويتطلب قالبًا ويقوم بتجميع تكملة القالب. إنها سلسلة أحادية الببتيد من 928 من الأحماض الأمينية ، وهي نتاج بولاالجين. نحن نفهم الآن أن هذا البوليميراز وفير ، ولكن بدلاً من تخليق DNA جديد في مفترق النسخ ، يتم استخدامه أثناء عملية الانضمام إلى شظايا Okazaki بعد التوليف وإصلاح الحمض النووي. كانت الدراسات التفصيلية لبوليميراز الحمض النووي I لا تقدر بثمن لفهمنا لآليات البلمرة. على الرغم من أن بوليميريز الحمض النووي I ليس بوليميراز مكرر في بكتريا قولونية، تُستخدم الإنزيمات المتماثلة في التكرار في الأنواع الأخرى. أيضًا ، قصة كيفية اكتشاف بوليمرات الحمض النووي التكراري في E. القولونيةهو توضيح كلاسيكي لقوة الجمع بين الكيمياء الحيوية وعلم الوراثة لتحقيق فهم أكثر اكتمالاً لعملية خلوية مهمة.

إن بوليميراز الحمض النووي I يحفز بلمرة dNTPs في DNA. يحدث هذا عن طريق إضافة dNTP (مثل dNMP) إلى 3 'نهاية سلسلة DNA ، وبالتالي يحدث نمو السلسلة في اتجاه 5' إلى 3 '(الشكل 5.11). في هذا التفاعل ، يكون الهيدروكسيل 3 بوصات في نهاية سلسلة النمو عبارة عن محب للنواة ، يهاجم ذرة الفوسفور في الفوسفات من dNTP الوارد. يستمر التفاعل عن طريق تكوين فوسفويستر بين الطرف 3 'من سلسلة النمو و 5' فوسفات من النوكليوتيدات الواردة ، مكونًا رابطة فسفودايستر مع النيوكليوتيد الجديد وتحرير البيروفوسفات (اختصار PPi). وهكذا في هذا التفاعل ، تتكسر رابطة فسفوهيدريد في dNTP ، ويتكون فوسفوديستر. تغيير الطاقة الحرة لكسر وتشكيل هذه الروابط التساهمية غير موات إلى حد ما للتفاعل كما هو موضح. ومع ذلك ، فإن التفاعلات غير التساهمية الإضافية ، مثل الترابط الهيدروجيني للنيوكليوتيدات الجديدة بالنيوكليوتيدات التكميلية وتفاعلات التراص القاعدية مع النيوكليوتيدات المجاورة ، تساهم في إحداث تغيير كلي في الطاقة الحرة يكون مواتياً للتفاعل في الاتجاه التركيبي. ومع ذلك ، عند التركيزات العالية من البيروفوسفات ، يمكن عكس التفاعل. في التفاعل في الاتجاه العكسي ، تتم إزالة النيوكليوتيدات تدريجياً وإطلاقها على شكل dNTP في a التحلل الفسفوريتفاعل. من غير المحتمل أن يكون لهذا أهمية فسيولوجية كبيرة ، لأن بيروفوسفاتاز في كل مكان يحفز التحلل المائي للبيروفوسفات إلى جزيئات الفوسفات. يفضل هذا التفاعل الأخير بشدة ديناميكيًا حراريًا في اتجاه التحلل المائي. وهكذا فإن التفاعلات المجمعة لإضافة نيوكليوتيد جديد إلى سلسلة DNA المتنامية والتحلل المائي للبيروفوسفات تضمن أن التفاعلات الكلية تفضل تخليق الحمض النووي. تعد الكيمياء الأساسية لإضافة النيوكليوتيدات إلى سلسلة عديد النوكليوتيد المتنامية الموضحة في الشكل 5.11 أمرًا شائعًا لجميع بوليمرات الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي تقريبًا.

الشكل 5.11.التفاعل المحفز بواسطة بوليميرات الدنا.

يتطلب تفاعل تخليق الحمض النووي المحفز بواسطة بوليميراز الحمض النووي I Mg2 + ، وهو عامل مساعد للحفز ، وثلاثي فوسفات ديوكسينوكليوزيد الأربعة (dNTPs) ، وهي كتل بناء أحادية للبوليمر المتنامي. يتطلب التفاعل أيضًا خيطًا نموذجيًا من الحمض النووي لتوجيه توليف الخيط الجديد ، كما تنبأ به النموذج الحلزوني المزدوج للحمض النووي وأكدته تجربة ميسيلسون وستال.

يتطلب رد الفعل هذا أيضًا التمهيدي، وهو جزيء (عادة ما يكون سلسلة من DNA أو RNA) يوفر هيدروكسيل 3 الذي يضاف إليه النوكليوتيدات الواردة. لا يمكن لبوليميرات الدنا أن تبدأ في التوليف على قالب بمجرد ضم اثنين من النيوكليوتيدات. بدلاً من ذلك ، فإنها تحفز إضافة dNTP إلى سلسلة موجودة مسبقًا من النيوكليوتيدات ؛ هذه السلسلة المركبة مسبقًا هي التمهيدي. يعتبر التمهيدي مكملًا للقالب ، ويرتبط الطرف الثالث من التمهيدي بالإنزيم في الموقع النشط للبلمرة (الشكل 5.12). عندما يتم صنع سلسلة DNA جديدة ، بمجرد إضافة نيوكليوتيد جديد إلى سلسلة النمو ، فإن 3 'هيدروكسيل هو الآن نهاية التمهيدي. يتحرك البوليميراز إلى الأمام نيوكليوتيد واحد بحيث يكون هذا التمهيدي الجديد في الموقع النشط للبلمرة. وجهة النظر البديلة ، القائلة بأن القالب التمهيدي للحمض النووي يتحرك بينما يظل بوليميراز الدنا ثابتًا ، ممكن أيضًا. في كلتا الحالتين ، يكون آخر نيوكليوتيد مضاف هو الآن نهاية 3 'من التمهيدي ، والنيوكليوتيدات التالية في القالب جاهزة للربط المباشر لنيوكليوزيد ثلاثي فوسفات آخر.

من أجل التوليف الأولي لبداية سلسلة DNA جديدة ، يجب إنتاج مادة أولية بواسطة إنزيم مختلف ؛ سيتم مناقشة هذا بمزيد من التفصيل لاحقًا في الفصل. على سبيل المثال ، قليل النوكليوتيدات القصيرة هي البادئات لشظايا أوكازاكي. تم العثور عليها في الأطراف الخمسة لشظايا أوكازاكي وتتكون من إنزيم يسمى بريماز. تتم إزالة بادئات RNA واستبدالها بـ DNA (بواسطة DNA polymerase I) قبل الربط.

تم اكتشاف هذه المتطلبات لـ Mg2 + و deoxynucleotides ونوعين من خيوط DNA (القالب والتمهيدي) في دراسات DNA polymerase I. نحن ندرك الآن أنها مطلوبة أيضًا من قبل جميع بوليميرات الحمض النووي.

الشكل 5.12.استطالة السلسلة بواسطة بوليميراز الحمض النووي 1. يتم توجيه ارتباط ديوكسينوكليوزيد ثلاثي الفوسفات الوارد الصحيح إلى الموقع النشط للبلمرة بواسطة ديوكسينوكليوتيد على شريط القالب. يحفز البوليميراز تكوين رابطة فوسفوديستر مع ديوكسينوكليوتيد الجديد ، ثم يتحرك بشكل فعال إلى الأمام بحيث يمكن للديوكسينوكليوتيد التالي في القالب توجيه ارتباط ديوكسينوكليوسيد ثلاثي الفوسفات التالي إلى الموقع النشط. أثناء الاستطالة ، فإن خيط DNA الجديد هو أيضًا التمهيدي.

يحتوي موقع البلمرة النشط لـ DNA polymerase I على موقع محدد لربط dNTP (الشكل 5.12) ، ويتكيف الموقع النشط مع deoxynucleotide على حبلا القالب لصالح ربط deoxynucleotide التكميلي في الموقع النشط. وبالتالي فإن البوليميراز يحفز بالإضافة إلى السلسلة المتزايدة من الديوكسينوكليوتيد التكميلي للديوكسينوكليوتيد في حبلا القالب.

في التفاعل المحفز بواسطة DNA polymerase I ، وجميع بوليمرات الحمض النووي الأخرى التي تمت دراستها ، يتم تنشيط deoxynucleotide الوارد. روابط الفوسفوهيدريد في شكل ثلاثي فوسفات الديوكسينوكليوتيد هي روابط عالية الطاقة (أي ، لديها طاقة سلبية ، أو مفضلة ، خالية من التحلل المائي) ، و b- و g- الفوسفات تشكل مجموعة مغادرة جيدة (مثل البيروفوسفات) بعد هجوم محبة النواة. في المقابل ، لا يتم تنشيط نهاية سلسلة الحمض النووي المتنامية ؛ إنه عبارة عن 3-هيدروكسيل بسيط على آخر ديوكسينوكليوتيد مضاف. تسمى هذه الإضافة للمونومر المنشط إلى بوليمر غير نشط النمو أ آلية نمو الذيل. إن بوليميرات الدنا التي تستخدم هذه الآلية يمكنها فقط التوليف في اتجاه 5 'إلى 3' ، وكل بوليميرات DNA و RNA المعروفة تفعل ذلك. يتم تصنيع بعض الجزيئات الكبيرة الأخرى ، مثل البروتينات ، بواسطة a آلية نمو الرأس. في هذه الحالة ، تهاجم النهاية غير النشطة للمونومر النهاية النشطة للبوليمر. تحتوي السلسلة المطولة مرة أخرى على رأس نشط (من آخر مونومر مضاف).

يمارس

السؤال 5.4. وصف آلية نمو الرأس الافتراضية لتخليق الحمض النووي. في أي اتجاه يحدث تخليق السلاسل في هذه الآلية؟

التدقيق اللغوي للحمض النووي المركب حديثًا بواسطة نوكلياز خارجي من 3 "إلى 5" وهو جزء من بوليميريز الحمض النووي

يحتوي بروتين DNA polymerase I على أنشطة إنزيمية إضافية تتعلق بتوليف الحمض النووي. واحد ، من 3 'إلى 5' نوكلياز خارجي ، يشارك بشكل وثيق في دقة النسخ المتماثل. نوكلياز هي إنزيمات تحفز تكسير الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي إلى أجزاء أصغر و / أو نيوكليوتيدات. ان نوكلياز خارجي يحفز انقسام النيوكليوتيدات من نهاية بوليمر DNA أو RNA. ان نوكلياز يحفز القطع داخل بوليمر DNA أو RNA. يمكن تمييز هذين النشاطين من خلال قدرة نوكلياز داخلي ، ولكن ليس نوكلياز خارجي ، على قطع ركيزة دائرية. تزيل نوكلياز 3 'إلى 5' النيوكليوتيدات من الطرف 3 من جزيء DNA أو RNA.

يجب أن يكون تركيب الحمض النووي دقيقًا للغاية لضمان نقل المعلومات الجينية إلى النسل دون تغيير إلى حد كبير. البكتيريا مثل E. القولونيةيمكن أن يكون لها معدل طفرة ، منخفض مثل استبدال نوكليوتيد واحد في حوالي 109 حتى 1010 النيوكليوتيدات. يتم تحقيق هذا التردد المنخفض للخطأ من خلال التفضيل القوي للبوليميراز للنيوكليوتيدات التكميلية للقالب ، مما يسمح باستبدال واحد تقريبًا كل 104 حتى 105 النيوكليوتيدات. يتم تحسين دقة تخليق الحمض النووي بواسطة a التدقيق اللغوي تعمل في البوليميراز الذي يزيل النيوكليوتيدات المدمجة بشكل غير صحيح في نهاية سلسلة النمو. مع التدقيق اللغوي ، يتم تحسين دقة تخليق الحمض النووي بمعامل 102 حتى 103، وبالتالي فإن التأثيرات المجمعة لتمييز النوكليوتيدات في موقع البلمرة النشط بالإضافة إلى التدقيق اللغوي تسمح باستبدال واحد فقط من كل 106 حتى 108 النيوكليوتيدات. يتم تحقيق مزيد من التخفيض في معدل الخطأ عن طريق إصلاح عدم التطابق (الفصل 7).

يتم تنفيذ وظيفة التدقيق اللغوي لبوليميراز الحمض النووي I بواسطة نوكلياز خارجي 3 'إلى 5' (الشكل 5.13). يقع في منطقة مختلفة من الإنزيم عن الموقع النشط للبلمرة. عندما يتم إضافة نيوكليوتيد غير صحيح إلى الطرف 3 من سلسلة النمو ، فإن معدل البلمرة ينخفض ​​بشكل كبير. ينتقل القالب التمهيدي إلى موقع نشط مختلف على الإنزيم ، وهو الموقع الذي يحتوي على 3 "إلى 5" نشاط تحلل خارجي للنواة. يتم شق النوكليوتيدات غير الصحيحة ، ويعود القالب التمهيدي إلى موقع البلمرة النشط لاستئناف التوليف. يميز الإنزيم بين النيوكليوتيدات الصحيحة وغير الصحيحة في نهاية 3 'من التمهيدي ، بحيث يكون 3' إلى 5 'نوكلياز خارجي أكثر من ذلك بكثير نشط عندما لا يتم إقران نهاية سلسلة النمو بشكل صحيح ، ولكن نشاط البوليميراز يتجاوز نشاط 3 'إلى 5' نوكلياز خارجي عند إضافة النيوكليوتيد الصحيح.

تم العثور أيضًا على نشاط البلمرة والتدقيق اللغوي 3 إلى 5 من نوكلياز خارجي موجود في بوليميريز الحمض النووي 1 في معظم بوليميرات الحمض النووي الأخرى. هذه هي الأنشطة المركزية لتكرار الحمض النووي.

تسمح آليات نمو الذيل بالتدقيق اللغوي والاستطالة اللاحقة. إذا تم تنشيط نهاية السلسلة المتنامية (كما هو الحال في نمو الرأس) ، فإن التدقيق اللغوي سيقضي على النهاية النشطة ولا يمكن أن يستمر الاستطالة.

الشكل 5.13.استئصال نيوكليوتيد غير صحيح بواسطة بوليميريز الحمض النووي 1. دمج نيوكليوتيد غير صحيح (على سبيل المثال ، T مقابل C ، اللوحة السفلية) (A) يتسبب في تحول قالب التمهيدي إلى الموقع النشط للنوكلياز الخارجي 3'-5 '(B) حيث يتم استئصال النوكليوتيدات غير الصحيحة (C). يمكن للقالب التمهيدي بعد ذلك العودة إلى موقع البوليميراز النشط لاستئناف التوليف (D).

يمارس

السؤال 5.4 إزالة النيوكليوتيد من 3 'نهاية سلسلة النمو بواسطة 3' إلى 5 'نوكلياز خارجي ليس عكس تفاعل البوليميراز. هل يمكنك تحديد الفرق؟

إزالة النيوكليوتيدات بواسطة نوكلياز خارجي 5 'إلى 3' وهو جزء من بوليميريز الحمض النووي I

بالإضافة إلى البوليميراز و 3 إلى 5 نوكلياز خارجي شائع في معظم بوليميراز الحمض النووي ، فإن بوليميراز الحمض النووي 1 لديه نشاط غير عادي لتحلل النواة من 5 إلى 3. يحفز هذا الإنزيم إزالة النيوكليوتيدات في المناطق المزدوجة القاعدية ويمكنه استئصال الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. يتم استخدامه من قبل الخلية لإزالة المواد الأولية RNA من شظايا Okazaki وإصلاح الحمض النووي التالف.

هذا نوكلياز 5 إلى 3 ، بالاشتراك مع البوليميراز ، له تطبيقات مفيدة في المختبر. أحد الاستخدامات الشائعة هو تسمية الحمض النووي في المختبر بواسطة ترجمة نيك (الشكل 5.14). في هذه العملية ، DNA polymerase I سوف يزيل الحمض النووي من الخيط المكسور بواسطة 5 'إلى 3' نوكلياز خارجي ، ثم استخدم 3 'hydroxyl المكشوف في النك كتمهيدي لتخليق DNA جديد بواسطة 5' إلى 3 'polymerase وبذلك تحل محل الحمض النووي القديم. والنتيجة هي أيضًا حركة ، أو ترجمة ، للنيك من نقطة على الحمض النووي إلى نقطة أخرى ، ومن ثم تسمى العملية ترجمة نيك. إذا تم إجراء التفاعل في وجود واحد أو أكثر من مادة ديوكسينوكليوزيد ثلاثي الفوسفات (على سبيل المثال ، [أ32P] dNTPs) ، فسيتم تصنيف الحمض النووي الجديد إشعاعيًا.

يمكن استخدام عملية مماثلة لإصلاح الحمض النووي في الخلية. كما سيتم مناقشته في الفصل السابع ، تتعرف إنزيمات معينة على النيوكليوتيدات التالفة وتنشق في مقدمة الضرر. تتمثل إحدى طرق إزالة الحمض النووي التالف واستبداله بالتسلسل الصحيح في نوكلياز 5 'إلى 3' الخارجي لبوليميراز الحمض النووي I وتخليق الحمض النووي المصاحب.

32P]

الشكل 5.14.يمكن استخدام نوكلياز 5 'إلى 3' خارجي لبوليميراز الحمض النووي I في ترجمة نيك لتسمية الحمض النووي في المختبر.

المجالات الهيكلية لبوليميراز الحمض النووي 1

يمكن الحصول على مزيد من الفهم لآلية الوظائف الأنزيمية الثلاث لبوليميراز الحمض النووي من دراسة التركيب ثلاثي الأبعاد (3-D) للبروتين. لقد أتى الكثير من معرفتنا بهيكل بوليميريز الحمض النووي 1 من التوصيف الكيميائي الحيوي ومؤخرًا عن طريق تحديد البنية ثلاثية الأبعاد باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية. أظهرت هذه الدراسات أن المجالات الهيكلية المتميزة لبوليميراز الحمض النووي 1 تحتوي على الأنشطة التحفيزية المختلفة. أيضًا ، قدم الهيكل ثلاثي الأبعاد أول نظرة على ما يُعرف الآن بهيكل مشترك للعديد من البوليميرات.

العلاج الخفيف باستخدام البروتياز سبتيليزين يشق DNA polymerase I إلى جزأين. يحتوي الجزء الصغير على نوكلياز خارجي 5 'إلى 3' ، والجزء الأكبر ، أو جزء "Klenow" (المسمى على اسم عالم الكيمياء الحيوية الذي أجرى تحليل الانقسام) يحتوي على البوليميراز وتصحيح التجارب المطبعية 3 'إلى 5' نوكلياز خارجي (الشكل 5.15). وبالتالي فإن النشاطين الشائعين لمعظم البوليميرات موجودان معًا في جزء Klenow ، بينما يكون نوكلياز خارجي مميز 5 'إلى 3' في مجال قابل للفصل. تشير حقيقة أن العلاج الخفيف بالبروتياز بدون تحديد تسلسل دقيق إلى أن المجال المكشوف المشقوق بسهولة يربط بين الأجزاء الكبيرة والصغيرة. تشير هاتان الملاحظتان إلى أن نوكلياز خارجي 5 'إلى 3' كان مجالًا نشطًا تمت إضافته إلى البوليميراز بالإضافة إلى مجال التدقيق اللغوي أثناء تطور بكتريا قولونية. يستخدم Klenow polymerase في العديد من التطبيقات في المختبر ، على سبيل المثال ، وضع العلامات على نهايات شظايا التقييد عن طريق ملء الأجزاء المتراكمة والتسلسل بطريقة إنهاء سلسلة dideoxynucleotide.

الشكل 5.15. بوليميريز الحمض النووي أنا من بكتريا قولونية لديها ثلاثة مواقع نشطة في ثلاثة مجالات هيكلية في عديد ببتيد واحد.

يوفر الهيكل ثلاثي الأبعاد للجزء الكبير من بوليميريز الحمض النووي I ، المحدد بواسطة علم البلورات ، نظرة ثاقبة إضافية للوظائف الأنزيمية للمكونات الهيكلية الرئيسية. تحتوي القطعة الكبيرة على شق عميق ، بعمق حوالي 30 ، حيث يلتصق به خيط القالب والمادة الأولية. هذا الشق يشبه "اليد اليمنى المقعرة" كما هو موضح في الشكل 5.16. يتكون "الكف" من سلسلة من الصفائح B والإبهام والأصابع مصنوعة بواسطة حلزونات على شكل a. تم تعيين موقع البوليميراز النشط داخل الشق العميق ، مع مساهمات من الصفائح b التي تشكل راحة اليد واللوالب التي تشكل الأصابع. يمكنك مشاهدة المزيد من العروض التفصيلية لهيكل جزء Klenow في موقع ويب الدورة / الكتاب (حاليًا www.bmb.psu.edu/courses/bmb400/default.htm. انقر فوق الارتباط الخاص بالصور الحركية ، قم بتنزيل برنامج MAGE وملف kinemage لـ DNA polymerase I ، وقم بعرضها على جهاز الكمبيوتر الخاص بك.)

يقع نوكلياز خارجي مصحح من 3 'إلى 5' في جزء آخر من هيكل جزء Klenow ، على بعد حوالي 25 من موقع البوليميراز النشط. وبالتالي ، يجب أن تتحرك نهاية التمهيدي لهذه المسافة حتى يتمكن الإنزيم من إزالة النيوكليوتيدات التي تم دمجها بشكل غير صحيح.

الشكل 5.16. يشبه الجزء من بوليميراز الحمض النووي الذي استخدمته لتخليق الحمض النووي "اليد اليمنى المقعرة". يتم عرض منظر للهيكل مع dCTP المرتبط بالموقع النشط ، والذي تم تقديمه بواسطة CN3D من موقع ويب NCBI (معرف MMDB: 1395 PDB Id: 1KFD) ، أسفل الرسم. قد نرغب في إضافة نسخة من اللوحة A من الشكل 2 من Kim et al. (1995) التركيب البلوري لبوليميراز DNA Thermus aquaticus ، الطبيعة 376: 612-616 ، الذي يظهر جميع المجالات الثلاثة.

جزء Klenow الكبير من E. القولونيةإن بوليميريز DNA أنا يفتقر إلى نوكلياز خارجي من 5 إلى 3 ، لذا فإن البنية ثلاثية الأبعاد لجزء Klenow لا تعطي أي معلومات حول هذا نوكلياز خارجي. ومع ذلك ، يمكن رؤية مجال نوكلياز خارجي من 5 إلى 3 في بنية بوليميراز الحمض النووي من البكتيريا المحبة للحرارة Thermus aquaticus. تشبه بنية البروتين هذه إلى حد كبير بنية بوليميريز الحمض النووي 1 لـ E. القولونيةفي نطاقات البوليميراز و 3 إلى 5 "نوكلياز خارجية ، ولديها نطاق إضافي من 5 إلى 3" نوكلياز خارجي يقع على بعد حوالي 70 من موقع البوليميراز النشط. هذه مسافة كبيرة ، لكن تذكر أن هذا نوكلياز خارجي يعمل على منطقة مختلفة من جزيء الحمض النووي عن البوليميراز. يستخدم نوكلياز 5 'إلى 3' جزءًا واحدًا من جزيء الحمض النووي كركيزة لاستئصال المواد الأولية أو إزالة الحمض النووي التالف ، بينما يستخدم البوليميراز جزءًا مختلفًا من جزيء الحمض النووي كقالب لتوليف خيط جديد.

من الغريب أن هناك منطقة مماثلة لمجال التدقيق اللغوي من 3 إلى 5 'نوكلياز خارجي لبوليميراز DNA I موجود في ترمس أكواتيكوسالبوليميراز ، لكنها لم تعد تعمل. يؤدي عدم وجود حسابات التدقيق إلى ارتفاع معدل الخطأ في هذا البوليميراز المستخدم بشكل شائع لتضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بالطبع ، يتم استخدام هذا البوليميراز في تفاعل البوليميراز المتسلسل لأنه مستقر عند درجات الحرارة العالية التي تتم مواجهتها خلال دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل. أصبحت بعض البوليمرات المقاومة للحرارة الأخرى ذات معدل الخطأ المنخفض متاحة مؤخرًا للاستخدام في تفاعل البوليميراز المتسلسل.

توجد هياكل "مقعرة لليد اليمنى" مماثلة في البنية الثلاثية لبوليميراز T7 RNA والنسخة العكسية لفيروس نقص المناعة البشرية. وهكذا كنت بوليميريز الحمض النووي أنا أول عضو موصوف فيما ندركه الآن هو فئة كبيرة من بوليميراز الحمض النووي. تشتمل هذه العائلة على وحدة بوليميراز مفردة لكل من تخليق الحمض النووي الريبي والحمض النووي. يمكنك الوصول إلى برنامج تعليمي عن بوليميريز T7 DNA على www.clunet.edu/BioDev/omm/exh...s.htm#displays.هذه البنية لها بعض أوجه التشابه مع تلك الموجودة في DNA polymerase I.

الدور الفسيولوجي لبوليميراز الحمض النووي 1

على الرغم من أن دراسات بوليميريز الدنا الأول قد قدمت الكثير من المعلومات حول آلية تخليق الحمض النووي ، فقد أظهر التحليل الجيني أن وظيفة البلمرة لهذا الإنزيم ليست مطلوبة لتكرار الحمض النووي. يتم ترميز DNA polymerase I بواسطة بولاالجين فيها بكتريا قولونية.ومع ذلك ، لا يوجد أليل متحور لـ بولاتم عزله في شاشات للطفرات الشرطية المعيبة في تكرار الحمض النووي. الحجة الأكثر إقناعًا بأن هذا البوليميراز غير مطلوب للتكرار جاء من فحص الآلاف من E. القولونيةالمسوخ ، مقايستهم لنشاط DNA polymerase I. متحولة بولا تم عزل السلالة (الشكل 5.16). يسمى هذا الأليل المتحور polA1، يحتوي على كودون هراء ، مما يؤدي إلى الإنهاء المبكر لتركيب البولي ببتيد المنتج وبالتالي فقدان وظيفة البوليميراز. ومع ذلك ، نمت السلالة الطافرة بمعدل طبيعي ، مما يدل على أن DNA polymerase I هو ليسمطلوب لتخليق الحمض النووي. النمط الظاهري الأكثر لفتا للانتباه polA1متحولة كانت قدرتها المنخفضة بشدة على إصلاح تلف الحمض النووي. أدى مزيد من التحقيق إلى عزل الأليلات المميتة المشروطة من بولاالجين. إن بروتينات DNA polymerase I الطافرة المشفرة بواسطة هذه الأليلات القاتلة الشرطية معيبة في نشاط نوكلياز خارجي من 5 إلى 3 ، مما يدل على أن هذا النشاط مطلوب من أجل بقاء الخلية. يزيل نشاط نوكلياز 5 'إلى 3' اشعال RNA أثناء تخليق الخيط المتأخر عند شوكة النسخ المتماثل ، ويستخدم في إصلاح الحمض النووي.

الشكل 5.16. مقتطفات من أ polA1 سلالة متحولة معيبة في نشاط بوليميراز الحمض النووي. بلمرة الحمض النووي في مقتطفات من E. القولونيةتم قياس الخلايا من خلال دمج dTTP المسمى إشعاعيًا في الحمض النووي. أظهرت سلالة النوع البري (الخط المسمى W) نشاطًا عاليًا. تم فحص المسوخات من هذه السلالة بشكل منهجي لفقدان نشاط بلمرة الحمض النووي ، وتم العثور على واحد (الخط المسمى P ؛ لاحظ التغيير في المقياس من اللوحة العلوية). تحتوي هذه السلالة المتحولة على أقل من 1٪ من نشاط النوع البري ، كما يتضح من خلط جزء واحد من مستخلص من النوع البري مع 99 جزءًا من مستخلص الطافرة (تخفيف 100 ضعف ؛ تظهر النتائج على شكل خط PW). تم تعيين الطفرة ل بولا، الذي يشفر DNA polymerase I. تنمو السلالة المتحولة مثل النوع البري ، مما يدل على أن DNA polymerase I ليس مطلوبًا لتكرار الحمض النووي. هذا الرقم مأخوذ من De Lucia and Cairns (1969) Nature 224: 1164-1166.

إن بوليميراز الدنا الثالث عبارة عن بوليميراز معالج للغاية ومتضاعف

الاستنتاج القائل بأن DNA polymerase I ليس البلمرة التكراري لـ E. القولونيةأدى إلى السؤال الواضح حول ماهية الإنزيم المستخدم بالفعل أثناء النسخ المتماثل. أدى التحقيق في الجينات المعزولة في شاشات بحثًا عن طفرات ناقصة مشروطًا في النسخ المتماثل إلى الإجابة. إن البوليميراز المتكاثر في E. القولونيةهو DNA polymerase III.

إن بوليميراز الحمض النووي I أكثر وفرة من البوليميرات الأخرى في E. القولونيةويخفي نشاطهم. وبالتالي استنفاد نشاط DNA polymerase I في polA1وفرت الخلايا المتحولة (الشكل 5.17) الفرصة لمراقبة بوليميرات الحمض النووي الأخرى. تم عزل بوليميرات الحمض النووي الثاني والثالث من مقتطفات من polA1الخلايا ، المسماة بترتيب اكتشافها.

بوليميريز الحمض النووي IIهي سلسلة عديد ببتيد واحدة وظيفتها غير مؤكدة. السلالات التي تحتوي على جين متحور لـ DNA polymerase II (بولب 1) لا يظهر أي خلل في النمو أو التضاعف. ومع ذلك ، فإن نشاط DNA polymerase II يزداد أثناء الإصلاح المستحث للحمض النووي ، وقد يعمل على تخليق DNA مقابل قاعدة محذوفة على حبلا القالب.

تظهر الأدلة الجينية ذلك بوضوح بوليميريز الحمض النووي ثالثايستخدم لتكرار بكتريا قولونية كروموسوم. يتكون هذا الإنزيم من عدة وحدات فرعية متعددة الببتيد. تم تحديد العديد من الجينات التي تشفر هذه الوحدات الفرعية متعددة الببتيد في شاشات للطفرات القاتلة الشرطية المعيبة في تكرار الحمض النووي. فقدان وظيفة هذه الحمض النوويتمنع الجينات التكرار ، مما يدل على أن منتجاتها مطلوبة للتكرار.

الوفرة المنخفضة والمعالجة العالية لبوليميراز الحمض النووي III

يحتوي DNA polymerase III على العديد من الخصائص المتوقعة للبوليميراز المتماثل. تتمثل إحدى المضاعفات في دراسات بوليميريز الحمض النووي الثالث في أنه تم عزل الأشكال المختلفة بإجراءات مختلفة. نحن ندرك الآن أن هذه الأشكال تختلف في عدد الوحدات الفرعية الموجودة في الإنزيم المعزول. بالنسبة للإنزيمات ذات الوحدات الفرعية المتعددة ، نشير إلى المركب بكل الوحدات الفرعية اللازمة لوظيفته الرئيسية باسم هولوزيم أو هولوكومبلكس. يحتوي أنزيم DNA polymerase holoenzyme على عشر وحدات فرعية ، والتي سيتم مناقشتها بالتفصيل في القسم التالي.

إن الإنزيم الهولندي DNA polymerase له الخصائص المتوقعة للبوليميراز المتماثل ، في حين أن DNA polymerase I لا (انظر المقارنة في الجدول 5.1). إنها أقل وفيرمن بوليميريز الحمض النووي I ، ولكن لا توجد حاجة لعدد كبير من بوليميرات الحمض النووي التكراري في الخلية. يمكن استخدام بوليميراز واحد أو اثنين فقط في كل شوكة نسخ متماثل ، لذا تكفي الجزيئات العشرة من إنزيم DNA polymerase III holoenzyme. بوليميريز الحمض النووي الثالث يحفز تخليق الحمض النووي في أعلى بكثير معدلمن بوليميريز الحمض النووي I ، بمعامل يبلغ حوالي 70. معدل الاستطالة المقاس لأنزيم DNA polymerase III (42000 نيوكليوتيد في الدقيقة) قريب من معدل حركة شوكة النسخ المقاسة في فيفوفي بكتريا قولونية(60.000 نيوكليوتيدات في الدقيقة).

الخاصية الرئيسية لبوليميراز الدنا التكراري هي معالجة عالية، وهي خاصية مدهشة لأنزيم DNA polymerase III holoenzyme. العملية هي مقدار البلمرة المحفز بواسطة إنزيم في كل مرة يرتبط فيها بقالب مناسب ، أو قالب تمهيدي في حالة بوليميرات الحمض النووي. يتم قياسه بالنيوكليوتيدات المبلمرة لكل حدث ربط. من أجل تكرار 4.5 ميغا بايت كروموسوم من E. القولونيةفي غضون 30 إلى 40 دقيقة ، يحتاج بوليميراز الحمض النووي إلى تخليق الحمض النووي بسرعة وبطريقة معالجة عالية. يقوم DNA polymerase I بتجميع أقل من 200 نيوكليوتيد لكل حدث ربط ، ولكن نظرًا لأن holoenzyme ، فإن DNA polymerase III أكثر معالجة ، ويتجاوز حدود الفحص المستخدم للحصول على النتائج الملخصة في الجدول 5.1. في المقابل ، فإن جوهر DNA polymerase III ، الذي يحتوي على ثلاث وحدات فرعية فقط (انظر القسم التالي) ، له قدرة معالجة منخفضة للغاية.

الجدول 5.1. مقارنة بين بوليميراز الحمض النووي الأول والثالث (Pol I و Pol III)

ملكية

بول أنا

بول الثالث الأساسية

بول الثالث هولوزيم

جزيئات لكل خلية

400

40

10

النيوكليوتيدات المبلمرة مين -1 (إنزيم جزيء) -1

600

9000

42,000

المعالجة [نيوكليوتيدات بلمرة في البداية]

3-188

10

>105

5 إلى 3 'بوليميراز

+

+

+

3 'to 5' نوكلياز خارجي ، تدقيق لغوي

+

+

+

5 'إلى 3' نوكلياز خارجي

+

-

-

ملحوظة: + و - يشيران إلى وجود أو عدم وجود نشاط مذكور في الإنزيم.

السؤال 5.6. إذا تم قياس معدل تكرار شوكة الحركة في الجسم الحي في E. القولونيةهو 60.000 نيوكليوتيد في الدقيقة ، كم عدد الشوكات اللازمة لتكرار الكروموسوم في 40 دقيقة؟ أذكر أن حجم ملف E. القولونيةالكروموسوم 4.64 × 106 بي بي.

الوحدات الفرعية وآلية DNA polymerase III

يحتوي إنزيم DNA polymerase III على أربعة مكونات وظيفية متميزة ، والعديد منها يحتوي على وحدات فرعية متعددة ، كما هو مدرج في الجدول 5.2 والموضح في الشكل 5.18. تحتوي الوحدات الفرعية a و e على أنشطة البلمرة والتدقيق الرئيسية ، على التوالي. تتحد مع الوحدة الفرعية q لتشكيل النواة التحفيزية للبوليميراز. يمكن أن يتقلص هذا اللب بواسطة t2 رابط البروتين لتشكيل مجموعة فرعية تسمى DNA polymerase III. تؤدي إضافة المكون الوظيفي الثالث ، المركب g ، إلى إنشاء مجموعة فرعية أخرى تدل على DNA polymerase III *. تم عزل كل هذه التجمعات الفرعية عن E. القولونيةوتم تمييزها على نطاق واسع. المكون الأخير هو b2 dimer ، والذي عند دمجه مع DNA polymerase III * يشكل holoenzyme.

الشكل 5.18 الوحدات الفرعية والتجمعات الفرعية لبوليميراز الحمض النووي الثالث. تشكل الوحدات الفرعية a و e و q النواة الحفازة ، ويعتقد أن وحدتين فرعيتين t تحملان النوى في مجمع كبير واحد. يوجد مركب g واحد في التجميع الفرعي DNA polymerase III * وفي holoenzyme ، مما يشكل ثنائيًا غير متماثل للهيكل العام. إضافة على شكل حلقة ب2 الثنائيات تزيد بشكل كبير من المعالجة. السهام بين ب2 تشير الثنائيات والتجميع الفرعي PolIII * إلى الإضافة الدورية لهذه الوحدة الفرعية وإزالتها أثناء التركيب ، والتي تم استكشافها بمزيد من التفصيل في الشكل 5.19.

يمكن تخصيص الأنشطة المختلفة لـ DNA polymerase III للوحدات الفرعية الفردية (الجدول 5.2). على سبيل المثال ، يوجد البوليميراز الرئيسي في الوحدة الفرعية ، والتي يتم ترميزها بواسطة الحمض النوويالجين (المعروف أيضًا باسم بولك). إن نوكلياز 3 'إلى 5' موجود في الوحدة الفرعية e ، والتي يتم ترميزها بواسطة dnaQالجين (المعروف أيضًا باسم mutDالجين). ومع ذلك ، يتم الحصول على أقصى نشاط من خلال مجموعات من الوحدات الفرعية. إن جوهر DNA polymerase III هو مركب من الوحدات الفرعية a و e و q ، ونشاط النواة في كل من فحوصات البوليميراز و 3 إلى 5 من النيوكلياز الخارجي أعلى منه في الوحدات الفرعية المعزولة.

الجدول 5.2. مجموعات فرعية من DNA polymerase III ، الوحدات الفرعية الرئيسية ، الجينات والوظائف

المكون الوظيفي

الوحدة الفرعية

الكتلة (كيلو دالتون)

الجين

النشاط أو الوظيفة

البوليميراز الأساسي

أ

129.9

polC = dnaE

5 إلى 3 'بوليميراز

ه

27.5

dnaQ = mutD

3'-5 'نوكلياز خارجي

ف

8.6

يحفز e نوكلياز خارجي

بروتين الرابط

ر

71.1

dnaX

يخفت النوى

محمل المشبك

ز

47.5

dnaX

يربط ATP

(أو ز معقدة)

د

38.7

يرتبط ب

(قاعدة ATPase)

د'

36.9

يرتبط بـ g و b

ج

16.6

يرتبط بـ SSB

ذ

15.2

يرتبط بـ c و g

انزلاق المشبك

ب

40.6

dnaN

عامل المعالجة

يمكن قياس أنشطة الوحدات الفرعية في المختبرعن طريق المقايسات البيوكيميائية المناسبة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يُظهر النمط الظاهري للطفرات في الجين الذي يشفر وحدة فرعية معينة أن الوحدة الفرعية مطلوبة لعملية معينة. المتحولة أ الوحدات الفرعية هي نتاج الأليلات القاتلة المشروطة المكتشفة في شاشات الحمض النوويالجينات ، ولكن تم اكتشافها أيضًا كمنتج للأليلات المعيبة للبوليميراز التي تحدد بولكالجين. وهكذا الحمض النوويالجين هو نفسه مثل polCالجين ، مما يدل على أن هذه الوحدة الفرعية مع نشاط البوليميراز ضرورية في النسخ المتماثل. وبالمثل ، يُظهر النمط الظاهري للطفرات في الجين الذي يشفر الوحدة الفرعية e أنه ضروري للتدقيق اللغوي. الأليلات الطافرة من dnaQتم التعرف على الجين في شاشة لـ متحور الجينات ، التي تولد تواترًا عاليًا للطفرات في البكتيريا عندما تكون معيبة. هذه الأليلات تحدد الجين mutD، والذي تبين لاحقًا أنه هو نفسه dnaQ. النمط الظاهري للطفرة dnaQ /mutDتنتج السلالات من عدم وجود التدقيق اللغوي من قبل الوحدة الفرعية e أثناء النسخ المتماثل ، مما يسمح بدمج النيوكليوتيدات غير الصحيحة في الحمض النووي بشكل متكرر.

ثنائي b2 هو البروتين الرئيسي الذي يمنحه عاليالعمليةعلى بوليميريز الحمض النووي الثالث. يزيد ارتباط ثنائي b2 مع بوليميراز الحمض النووي III من المعالجة من حوالي 10 نيوكليوتيدات مبلمرة لكل حدث ربط إلى أكثر من 100000 نيوكليوتيد تمت بلمرة لكل حدث ربط (الجدول 5.1). يشكل هذا البروتين الثنائي حلقة يمكن من خلالها أن يمر الحمض النووي المزدوج ؛ ستنزلق الحلقة بسهولة على طول الحمض النووي ما لم تُعيق ، على سبيل المثال ، بروتينات مرتبطة بالحمض النووي النموذجي. وبالتالي ، يعمل ثنائي b2 باعتباره a انزلاق المشبك، عقد البوليميراز على الحمض النووي الذي يتم نسخه. بمجرد أن يرتبط DNA polymerase III بالمشابك الموجود على DNA ، فإنه سوف يتبلمر حتى يصل إلى التمهيدي التالي لجزء Okazaki أثناء تخليق الخيوط المتأخرة. من أجل توليف حبلا رائد ، من المفترض أن يظل بوليميريز الحمض النووي مرتبطًا بالحمض النووي عبر المشبك b2 حتى يتم تكرار الحمض النووي الصبغي تمامًا. يُظهر الهيكل ثلاثي الأبعاد لثنائي b2 ، الذي تم تحديده بواسطة علم البلورات بالأشعة السينية ، حلقة جزيئية كبيرة. يمكن الاطلاع على هذا الهيكل على موقع الويب الخاص بالدورة وفي المتحف عبر الإنترنت للجزيئات الكبيرة (www.clunet.edu/BioDev/omm/exh...s.htm#displays).

يحتوي المركب g على عدة وحدات فرعية: جزيئين من وحدات g الفرعية وجزيء واحد لكل من d و d 'و c و y. هو - هي الأحمالب2 ديمر المشبك على قالب التمهيدي ، في عملية تتطلب التحلل المائي ATP (الشكل 5.19). بعد ذلك ، سيرتبط المركز التحفيزي لـ DNA polymerase III بالمشابك المرتبط بالقالب وسيبدأ النسخ المتماثل عالي المعالجة. يعمل المركب g أيضًا على تفريغ المشبك بمجرد اكتمال جزء Okazaki أثناء تخليق الخيوط المتأخرة ؛ ومن ثم فهي عبارة عن محمل ومفرغ ، مما يسمح للبوليميراز والمشابك بالدوران بشكل متكرر من جزء أوكازاكي إلى آخر.

ينفذ مجمع g هذه الأنشطة المعاكسة على هياكل مختلفة ، حيث يتم التحميل على المشبك في قالب تمهيدي وتفريغ المشبك في نهاية جزء Okazaki المكتمل. على سبيل المثال ، قد تكون مواجهة الطرف 5 من جزء Okazaki المركب مسبقًا هو الهيكل المميز الذي يحول مجمع g إلى وضع التفريغ. لا يفرغ المشبك بينما يحفز بوليميراز الدنا الثالث البلمرة.

يوضح الشكل 5.19 الخطوات المقترحة في هذه العملية. المركب g في الشكل المرتبط بـ ATP يربط b2 clamp ، في حين أن مركب g في النموذج المرتبط بـ ADP يطلق ب2 المشبك. وبالتالي ، فإن التحميل والتفريغ يعتمدان على جولة من التحلل المائي ATP. عندما يرتبط المركب g في النموذج المرتبط بـ ATP بـ b2 clamp ، فإن holoenzyme DNA polymerase III في شكل يسمح لها بالعثور على قالب تمهيدي. خاتم ب2 المشبك مفتوح بواسطة g-complex-ATP ، مما يسمح له بالالتصاق حول قالب التمهيدي. التحلل المائي لـ ATP بواسطة مركب g يتركه في شكل مرتبط بـ ADP. في هذا التشكل الجديد المرتبط بـ ADP للمركب g ، ينفصل عن b2 المشبك ، مما يسمح ب2 المشبك لربط النواة الحفازة للأنزيم المجسم وأيضًا إغلاق حول القالب التمهيدي. أصبح الإنزيم الهولندي جاهزًا الآن لتحفيز تخليق الحمض النووي. يستمر الاستطالة حتى يواجه الإنزيم المجسم جزء أوكازاكي المركب مسبقًا. الآن يربط المركب g ATP (من المفترض عن طريق تفاعل تبادل ADP-ATP) ويتحول إلى التشكل للربط بـ b2 المشبك وخلعه من قالب الحمض النووي. هذا النصف من الإنزيم الهولندي قادر الآن على الانفصال عن القالب والعثور على تقاطع القالب التمهيدي التالي لبدء تركيب جزء آخر من أوكازاكي.

تعتبر أنشطة تحميل وتفريغ المشابك الخاصة بمركب g عبارة عن دورة من التغييرات في روابط البروتين. تحدث هذه التغييرات بسبب الأنشطة الأنزيمية للمركب ، والتي بدورها تغير توافق البروتينات وتفاعلاتها المفضلة. كما هو مبين في الشكل 5.19 ، فإن مركب g هو عبارة عن ATPase، وهو إنزيم يحفز التحلل المائي لـ ATP إلى ADP والفوسفات. وهو أيضًا عامل تبادل ATP-ADP.

الشكل 5.19. (الصفحة السابقة)تحميل وتفريغ ب2 المشبك بواسطة g-complex في DNA polymerase III holoenzyme. ب2 يظهر المشبك كحلقة يمكن ربطها وفتحها من خلال الشكل المرتبط بـ ATP من المركب g (يظهر على شكل شكل قرصة ، لكن شكله غير معروف). بعد الربط الأولي لـ b2 clamp ، يؤدي التحلل المائي ATP بواسطة مجمع g إلى تحول هذا المركب إلى شكل مرتبط بـ ADP يسمح له بإطلاق b2 المشبك ، بحيث ب2 يتم تحميل المشبك على قالب التمهيدي ويرتبط أيضًا بالنواة التحفيزية للبوليميراز. بعد الانتهاء من جزء Okazaki ، يتبادل g-complex ADP لـ ATP ، وهو الآن تشكّل لربط b2 المشبك وتفريغها. لم يتم توضيح جميع الخطوات في هذا النموذج ، ولكن من المفيد توضيح كيفية استخدام دورات التحلل المائي لـ ATP في تحميل وتفريغ ب2 المشبك. يوضح الشكل فقط نصف أنزيم DNA polymerase III holoenzyme المنخرط في تخليق الخيط المتأخر ؛ يُعتقد أن النصف الآخر منخرط في تركيب الخيط الرئيسي ، ولكن لم يظهر هنا للحفاظ على الرسم التخطيطي بسيطًا نسبيًا.

التغييرات في تشكيل ونشاط البروتينات اعتمادًا على ما إذا كانت مرتبطة بثلاثي فوسفات النوكليوزيد (ATP أو GTP) أو ثنائي فوسفات النيوكليوزيد (ADP أو الناتج المحلي الإجمالي) هو موضوع شائع في الكيمياء الحيوية. تتوسط أشكال البروتينات المرتبطة بـ GTP ، والتي يمكن إيقافها عن طريق التحلل المائي GTP وإعادة تنشيطها بواسطة بروتينات تبادل الناتج المحلي الإجمالي-GTP ، أحداث إشارات الخلية الحرجة. كما سنرى في الفصل 14 ، فإن أشكال عوامل الترجمة المرتبطة بـ GTP و GDP تؤدي وظائف معاكسة. تفترض البروتينات تكوينات مختلفة اعتمادًا على العامل المساعد المرتبط (في هذه الحالة نيوكليوتيد) ، ولكل تشكيل نشاط مميز. تسمح القدرة على تغيير الشكل من خلال نشاط التحلل المائي (تحويل ATP إلى ADP والفوسفات) للبروتين بتحويل الأنشطة بسهولة.

يتم ربط النوى التحفيزية لبوليميراز الحمض النووي III معًا بواسطة الوحدات الفرعية t لعمل ثنائي غير متماثل (انظر الشكل 5.18). يُقترح نصف holoenzyme بدون المركب g لتجميع الخيط الرئيسي من الحمض النووي الجديد ، ويقترح اللب الذي يحتوي على مركب g لتركيب الخيط المتأخر. يرتبط كل من النوى في dimer غير المتماثل بمشبك b2 في شوكة النسخ المتماثل. في هذا النموذج ، توليف على حد سواءيتم تحفيز الخيوط الرائدة والمتأخرة بواسطة نفسمعقد DNA polymerase III ، وبالتالي تنسيق تخليق كل من الخيوط الجديدة. لاحظ أنه إذا كان القالب الخاص بتركيب الخيوط المتأخرة ملتفًا حول الإنزيم ، فسيحدث تخليق الخيط المتخلف والمتأخر في نفس اتجاه حركة شوكة النسخ المتماثل (الشكل 5.20) ، على الرغم من الأقطاب المعاكسة لجدلي القالب. وبالتالي فإن نموذج dimer غير المتماثل يقترح وسيلة لربط كل من الخيط الرئيسي وتخليق الخيوط المتأخرة.

آلات النسخ المتماثل

الشكل 5.20. توليف متزامن لكل من الخيوط الرائدة والمتأخرة بواسطة ثنائي غير متماثل من بوليميريز الحمض النووي III. في هذا النموذج ، تقوم إحدى النوى المحفزة بتركيب الخيط الرئيسي بينما تقوم الأخرى بتركيب الخيط المتأخر. قد يتم لف قالب الخيط المتأخر حول البوليميراز ، مما يجعل هذا الخيط يشبه الشريحة الموجودة على الترومبون (اللوحة أ) ؛ تم تسمية هذا النموذج بنموذج Trombone Slide. عند القيام بذلك ، يكون توليف شظايا Okazaki في نفس اتجاه تركيب الخيوط الرائدة وحركة الشوكة (أي من اليسار إلى اليمين في الرسم التخطيطي). على نحو فعال ، فإن التفاف حبلا القالب لتخليق الخيوط المتأخرة حول البوليميراز يوجه هذا الخيط في الموقع النشط بنفس القطبية مثل القالب الخاص بتوليف الخيوط الرائدة. (أ) إنزيم بريميز يجعل التمهيدي في حلقة مفردة متضخمة متضخمة ، بينما يحفز نواة بوليميريز الحمض النووي III تمديد جزء أوكازاكي. (ب) اكتمل جزء Okazaki ، ويواجه DNA polymerase III جزء Okazaki المركب مسبقًا.(C) الآن يتم تحرير الحلقة التي تحتوي على جزء Okazaki المكتمل وتشكيل حلقة مفردة جديدة. يبدأ DNA polymerase III النسخ المتماثل عند التمهيدي في الحلقة الجديدة ، ويستأنف تكرار الخيط المتأخر ، ويتحرك مرة أخرى في نفس اتجاه الشوكة (والحبل الرئيسي). SSB عبارة عن بروتين رابط أحادي الخيط ويحفز Primase تخليق البادئات (التي تكون أساسًا RNA) لشظايا Okazaki ؛ سيتم مناقشة هذه بمزيد من التفصيل في وقت لاحق.


Polymerases - علم الأحياء

ملخص المقال:

مقدمة عن بوليمرات الحمض النووي

جزيئات الحمض النووي هي مجموعة من المعلومات الجينية للكائن الحي. الحمض النووي هو أساس الحياة وينتقل من الأب إلى الأبناء و rsquos. يتضاعف محتوى الحمض النووي للوالد عن طريق آلية النسخ بمساعدة إنزيم محدد ، بوليميراز الحمض النووي. يلعب DNA polymerase دورًا مركزيًا في عملية الحياة ويتحمل مسؤولية كبيرة في عمل نسخة دقيقة من جينوم الخلية و rsquos. إن بوليميرات الحمض النووي هي إنزيمات تخلق جزيئات الحمض النووي عن طريق تجميع النيوكليوتيدات ، اللبنات الأساسية للحمض النووي. ظهر أول دليل على وجود نشاط إنزيمي قادر على تخليق الحمض النووي في عام 1958 مع اكتشاف E. coli Pol I بواسطة A. Kornberg وزملاؤه. يتحرك بوليميراز الدنا على طول الخيط القديم في اتجاه 3'-5 '، مكونًا خيطًا جديدًا له اتجاه 5'-3'.

تصنيف بوليمرات الدنا
استنادًا إلى تجانس التسلسل ومقارنة ميزات التسلسل الأولي لبوليميرات الحمض النووي ، يتم تصنيفها إلى سبع عائلات. A و B و C و D و X و Y و RT.


أسرة

أنواع بوليميراز الحمض النووي

صنف

أمثلة

أ

بوليميراز متماثل وإصلاح

حقيقيات النوى وبدائية النواة

بوليميراز T7 DNA ، Pol I ، وبوليميراز DNA وجاما

ب

بوليميراز متماثل وإصلاح

حقيقيات النوى وبدائية النواة

Pol II و Pol B و Pol & zeta و Pol & alpha و delta و & epsilon

ج

بوليميراز متماثل

بدائية النواة

بول الثالث

د

بوليميراز متماثل

Euryarchaeota

لا يتميز بشكل جيد

X

بوليميراز متماثل وإصلاح

حقيقيات النوى

Pol & beta و Pol & Sigma و Pol & lambda و Pol & mu و Terminal deoxynucleotidyl transferase

ص

بوليميراز متماثل وإصلاح

حقيقيات النوى وبدائية النواة

Pol & iota (iota) و Pol & kappa (kappa) و Pol IV و Pol V

RT

بوليميراز متماثل وإصلاح

الفيروسات والفيروسات القهقرية وحقيقية النواة

تيلوميراز ، فيروس التهاب الكبد ب

أنواع وأدوار بوليمرات الدنا (المتماثلة والإصلاحية)

1. بدائية النواة بوليميريز الحمض النووي

  • Polymerase I هو إنزيم إصلاح DNA من العائلة بوليميراز يحتوي على 5 & rsquo إلى 3 & rsquo و 3 & rsquo إلى 5 & rsquo النشاط.
  • يمثل Pol I أكثر من 95٪ من نشاط البوليميراز في القولونية، على الرغم من العثور على الخلايا التي تفتقر إلى هذا البوليميراز ويمكن استبدال نشاطها بالأنواع الأربعة الأخرى من البوليميراز.
  • إن بوليميريز الحمض النووي هذا له معدل معالجة ضعيف ، حيث يضيف حوالي 15 إلى 20 نيوكليوتيد في الثانية.
  • يشارك بوليميراز الإصلاح هذا في إصلاح الختان مع نشاط نوكلياز خارجي 3'-5 'و 5'-3 ومعالجة شظايا أوكازاكي المتولدة أثناء تخليق الخيوط المتأخرة.
  • هذا الإنزيم هو البوليميراز الرئيسي في القولونيةتكاثر الحمض النووي وهي واحدة من عائلة C polymerases.
  • Polymerase III هو مراجع لغوي خارجي ، ويمكنه معالجة كل من خيوط الحمض النووي الرائدة والمتأخرة.
  • ينتمي هذا الإنزيم إلى عائلة Y من بوليميراز الحمض النووي.
  • Polymerase Polymerase عرضة للخطأ ولا يحتوي على نشاط تدقيق من 3 إلى 5 و rsquo ويشارك في الطفرات أو تغيير الحمض النووي لإحداث طفرة.
  • ينتمي Pol V أيضًا إلى عائلة Y من البوليميرات ويسمح بتجاوز تلف الحمض النووي من أجل استمرار النسخ المتماثل.
  • وتشارك في آليات إصلاح الحمض النووي لاستجابة SOS وتخليق الترانزستور.

2. بوليميراز DNA حقيقي النواة

  • POL & alpha هو عضو في عائلة B Polymerases وهم البوليميرات الرئيسية المشاركة في تكرار الحمض النووي النووي.
  • يحتوي هذا الإنزيم الفريد على نشاطين مميزين للبوليميراز: بوليميراز DNA المعتمد على الحمض النووي 5 & rsquo- 3 & rsquo ، و 5 & rsquo- 3 & rsquo.
  • بوليميريز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي. نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي هو بريماز. لهذا السبب ، غالبًا ما يشار إلى الإنزيم باسم Pol a: primase. إنه الإنزيم الوحيد المعروف باحتوائه على أنشطة بوليميراز الدنا وبريماز ، والوحيد القادر على تخليق الحمض النووي ذاتيًا على ssDNA لم يسبق له مثيل.
  • لا يحتوي Pol & alpha على نشاط نووي خارجي جوهري 3'- 5 'ويفتقر أيضًا إلى نشاط نوكلياز خارجي 5'- 3'. في الجسم الحي ، تتمثل الوظيفة الأساسية لـ Pol a: primase في صنع بادئات RNA / DNA قصيرة لتخليق الحمض النووي التكراري.
  • بوليميراز DNA؟ لديه 5 & rsquo- 3 & rsquo نشاط بوليميريز DNA ونشاط نوكلياز خارجي جوهري 3'- 5 '.
  • بول؟ يتطلب بروتين 30 كيلو دالتون مرتبطًا ، يسمى مستضد نواة الخلية المتكاثرة (PCNA) ، من أجل نشاط البوليميراز الكامل والتجهيزية. في حضور PCNA ، بول؟ هو معالج للغاية ، وهو PCNA الذي يعمل كعامل معالجة. تشير الدراسات البيوكيميائية والوراثية في الخميرة وخلايا الثدييات إلى أن بول؟ يشارك أيضًا في بعض أنواع تخليق إصلاح الحمض النووي.
  • نظرًا لقدرتها العالية على المعالجة ، تتولى Pol & delta توليفة الجدائل الرائدة والمتأخرة من Pol & alpha.
  • ينتمي إلى عائلة B Polymerases وهي البوليميرات الرئيسية المشاركة في تكرار الحمض النووي النووي.
  • بول ? لديه نشاط نوكلياز خارجي 3'-5 '.
  • Pol e هو إنزيم معالج بشكل معقول يرتبط أيضًا بـ PCNA عند نهاية التمهيدي. هذا يشير إلى أنه بوليميريز مكرر. نظرًا لارتفاع نشاطه في المعالجة والتدقيق اللغوي ، فقد اقترح كذلك أن Pol ? تشارك في استطالة التمهيدي ، بالإضافة إلى Pol؟
  • يشارك Pol & epsilon في إصلاح الأخطاء التي حدثت في الخيط الرائد أثناء تكرار Pol & delta جنبًا إلى جنب مع آلات إصلاح عدم تطابق الحمض النووي.

  • تنتمي إلى عائلة X polymerases توجد بشكل رئيسي في الفقاريات ، ويوجد القليل منها في النباتات والفطريات.
  • Pol & beta مطلوب لإصلاح ختان قاعدة التصحيح القصير ، وهو مسار لإصلاح الحمض النووي ضروري لإصلاح القواعد المؤلكلة أو المؤكسدة وكذلك المواقع القاعدية.
  • هذا هو أصغر وأبسط من polymerases حقيقية النواة الكلاسيكية ويتكون من واحد

بوليميراز ولامدا و & سيجما ومو (لامدا وسيجما ومو)

  • تحتوي بوليمرات العائلة X أيضًا على بوليميراز حقيقيات النوى المعروف مثل Pol & sigma (sigma) و Pol & lambda (lambda) و Pol & mu (mu) و deoxynucleotidyl transferase (TdT).
  • تشارك Pol & lambda و Pol & mu ، في الانضمام غير المتماثل ، وهي آلية لإعادة الانضمام إلى فواصل الحمض النووي المزدوجة بسبب بيروكسيد الهيدروجين والإشعاع المؤين ، على التوالي.

Polymerases & eta و & iota و & kappa (eta و iota و kappa)

    ، Pol & iota (iota) ، و Pol & kappa (kappa) ، عبارة عن بوليميراز من عائلة Y DNA تشارك في إصلاح الحمض النووي عن طريق التوليف translesion.
  • البوليميراز في العائلة Y عبارة عن بوليميرات منخفضة الدقة ، ولكن ثبت أنها مفيدة أكثر من الضرر لأن الطفرات التي تؤثر على البوليميراز يمكن أن تسبب أمراضًا مختلفة ، مثل سرطان أسكين ومتغير Xeroderma Pigmentosum (XPS).
  • Pol & eta مهم بشكل خاص للسماح بتوليف الترانزستور الدقيق لتلف الحمض النووي الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية.
  • يُعتقد أن Pol & kappa يعمل كموسع أو مدمج لقاعدة معينة في آفات معينة من الحمض النووي.

بوليميراز وزيتا (زيتا)

  • Polymerase Polymerase آخر من عائلة B ، يشارك في تخليق translesion.
  • يفتقر Pol & zeta إلى نشاط نوكلياز خارجي من 3 إلى 5 ، وهو فريد من نوعه من حيث أنه يمكن أن يمد البادئات مع عدم تطابق طرفي.

بوليميراز وجاما وثيتا (جاما وثيتا)

  • تعد Pol & gamma (gamma) و Pol & theta (ثيتا) بوليميراز من عائلة A.
  • Pol & gamma ، هو mtDNApolymerase الوحيد وبالتالي يكرر ويصلح ويصحح لغويًا 3'-5 'نوكلياز خارجي.
  • أي طفرة تؤدي إلى محدودية أو عدم عمل Pol & gamma لها تأثير كبير على mtDNA وهو السبب الأكثر شيوعًا لاضطرابات الميتوكوندريا الوراثية الجسدية.
  • Pol & theta ، الموجود في حقيقيات النوى ، وظيفته غير مفهومة بشكل واضح. ينتمي Pol & theta إلى عائلة A polymerase.
  • تقوم Pol & theta بتمديد نهايات التمهيدي غير المتطابقة ويمكنها تجاوز المواقع الأساسية عن طريق إضافة نوكليوتيد.
  1. النسخ العكسي
  • تحزم الفيروسات القهقرية جينوماتها على هيئة ssRNA لكنها تكرر هذا الحمض النووي من خلال dsDNA وسيط. للقيام بذلك ، يستخدمون بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي (النسخ العكسي).
  • RT هو بوليميريز DNA نموذجي في اتجاه التوليف 5'- 3 '، ومتطلبًا لقالب تمهيدي مع نهاية 3'-OH ، ومتطلبات dNTPs و Mg2 +.
  • لا يحتوي RT على نشاط نوكلياز خارجي خاص بالحمض النووي يمكن اكتشافه ، وبالتالي لا يوجد لديه وظيفة تصحيح التجارب المطبعية. ونتيجة لذلك ، فإن معدل الخطأ فيها مرتفع نسبيًا. ينعكس هذا في ارتفاع معدل الطفرات في متغيرات الفيروس التي يتم إنشاؤها بتردد عالٍ. هذا جانب مهم من التسبب في المرض: الفيروسات القهقرية بارعة في التهرب من المراقبة المناعية للمضيف بسبب تواتر الطفرات العالية.
  • يعتبر RT فريدًا بين بوليميرات الحمض النووي من ناحيتين على الأقل: & bull يمكنه استخدام ssRNAs الطبيعية كقالب. يمكنه أيضًا استخدام ssDNA معدة كقالب. & bull له نشاط RNase H جوهري. RNase H هو نوكلياز خارجي معالج يحلل على وجه التحديد خيط RNA لهجين DNA-RNA بدءًا من الطرف 5 أو 3. يمكن أن يكون أيضًا بمثابة نوكلياز داخلي. يقوم RNase H بتحلل روابط الفوسفوديستر لتترك المنتجات بنهايات 3 'هيدروكسيل و 5' فوسفات.
  • هذا الإنزيم معالج نسبيًا ويمكنه تكرار جينوم الفيروسات القهقرية بسعة 8 كيلو بايت بدون عامل معالجة.

تيلوميراز

    هو بروتين نووي ريبي يتم تجنيده لتكرار نهايات الكروموسومات الخطية لأن بوليميراز الدنا الطبيعي لا يمكنه تكرار النهايات أو التيلومير. يعمل التيلوميراز مثل بوليميرات الحمض النووي الأخرى عن طريق تمديد النهاية 3 و rsquo ، ولكن على عكس بوليميرات الحمض النووي الأخرى ، لا يتطلب التيلوميراز قالبًا.
  • تشكل مكونات البروتين والحمض النووي الريبي (RNA) إنزيمًا نشطًا من

200 كيلو دالتون. مكون الحمض النووي الريبي (

أهمية بوليمرات الحمض النووي في التكنولوجيا الحيوية
تلعب بوليميرات الحمض النووي أيضًا أدوارًا مركزية في البيولوجيا الجزيئية والتكنولوجيا الحيوية الحديثة ، وتمكين التقنيات بما في ذلك استنساخ الحمض النووي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وتسلسل الحمض النووي ، والكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) ، وتضخيم الجينوم الكامل (WGA) ، والبيولوجيا التركيبية ، والجزيئية التشخيص.
بوليميراز DNA قابل للحرارة
طق DNA بوليميراز. التقرير الأصلي لهذا الإنزيم المنقى من بكتيريا الينابيع الحارة Thermus aquaticus، تم نشره في عام 1976. في وقت لاحق ، تم تطوير تفاعل البوليميراز المتسلسل وبعد ذلك بوقت قصير أصبحت كلمة "Taq" كلمة مألوفة في دوائر البيولوجيا الجزيئية.
إن بوليميرات الحمض النووي المحبة للحرارة ، مثل بوليميرات الحمض النووي الأخرى ، تحفز تخليق الحمض النووي الموجه بالقالب من النوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات. يلزم وجود مادة أولية تحتوي على هيدروكسيل مجاني 3 بوصات لبدء التوليف وأيون المغنيسيوم ضروري. بشكل عام ، لديهم أقصى نشاط تحفيزي عند 75 إلى 80 درجة مئوية ، ونشاط منخفض بشكل كبير في درجات حرارة منخفضة. عند 37 درجة مئوية ، يحتوي Taq polymerase على حوالي 10 ٪ فقط من نشاطه الأقصى.
بالإضافة إلى بوليميراز DNA Taq ، تم عزل العديد من بوليميرات الحمض النووي الأخرى القابلة للحرارة والتعبير عنها من الجينات المستنسخة. تم وصف ثلاثة من البوليمرات الأكثر استخدامًا في الجدول التالي:


بوليميراز

3 "- & GT5"
نوكلياز خارجي

المصدر والخصائص

طق

لا

من عند Thermus aquaticus. Halflife عند 95 درجة مئوية 1.6 ساعة.

Pfu

نعم

من عند Pyrococcus furiosus. يبدو أنه يحتوي على أقل معدل خطأ من بوليميراز الحمض النووي المعروف بالحرارة.

تنفيس

نعم

من عند المكورات الحرارية litoralis المعروف أيضًا باسم Tli polymerase. Halflife عند 95 درجة مئوية حوالي 7 ساعات.

تحديات مستقبلية
ستستمر بوليمرات الحمض النووي المهندسة في لعب أدوار مهمة في التكنولوجيا الحيوية وتقديم الرعاية الصحية. على مدى السنوات العديدة القادمة ، ستظهر طرق جزيئية أسهل وأرخص وأسرع. في الوقت نفسه ، سيتجه البيولوجيا الجزيئية نحو تحليل الجزيئات الحيوية منخفضة التركيز (أي مجموعة واحدة من الكروموسومات). تقنيات التضخيم الجديدة مطلوبة أيضًا لتوصيف الاختلافات الجينية بين الخلايا المفردة لأن كمية الحمض النووي الجيني من خلية واحدة غير كافية للتسلسل المباشر. لذلك ، يجب أولاً تضخيم الحمض النووي قبل إجراء مزيد من التحليل. علاوة على ذلك ، هناك حاجة إلى بوليميرات الحمض النووي ذات معدلات الخطأ المنخفضة جدًا لضمان أن الحمض النووي الطويل والمضخم هو نسخ دقيقة من مادة البداية.
لذلك ، هناك حاجة إلى أنظمة جديدة لتضخيم الحمض النووي لتسريع التقدم في التقنيات الناشئة ولجعل الدقة العالية في المختبر روتين تحليل الجينوم والتلاعب. تمتلك بوليميرات الحمض النووي المهندسة أو آليات النسخ الخلوي القادرة على تضخيم شظايا الحمض النووي الكبيرة القدرة على تمكين علم جينوم الخلية المفردة وتخليق الجينوم والتلاعب. يلخص هذا العدد الخصائص المعروفة لأنظمة بوليميراز الدنا المختلفة وكيف يتم حاليًا التلاعب ببوليميراز الدنا لتلبية هذه المتطلبات المتزايدة.

حول المؤلف / معلومات إضافية:

إخلاء مسؤولية هام: جميع المقالات الموجودة على هذا الموقع هي معلومات عامة فقط وليست نصيحة احترافية أو خبراء. لا نتحمل أي مسؤولية عن صحة أو صحة المعلومات الواردة في هذه المقالة ، أو أي خسارة أو إصابة ناتجة عن ذلك. نحن لا نصادق على هذه المقالات ، ولسنا تابعين لمؤلفي هذه المقالات ولسنا مسؤولين عن محتواها. يرجى الاطلاع على قسم إخلاء المسؤولية للحصول على الشروط الكاملة.


بوليميراز الحمض النووي بدائية النواة

في بدائيات النوى ، DNA pol-I و II و III هي الأنواع الثلاثة المهمة التي سنناقشها أدناه.

بوليميريز الحمض النووي أنا

إنه أول إنزيم بوليميراز ، اكتشفه آرثر كورنبرغ في عام 1958. ويتكون من سلسلة أحادية الببتيد. في البداية ، كان يعتقد أن DNA pol-I هو إنزيم تكرار. في دراسة أخرى ، ثبت أنه إنزيم لإصلاح الحمض النووي أكثر من إنزيم النسخ المتماثل. في pol-I ، توجد ذرة واحدة من الزنك في كل سلسلة ، والتي تُعرف أيضًا باسم "الإنزيمات الفلزية”.

أنشطة DNA pol-I: يُظهر كلاً من البوليميراز وكذلك نشاط نوكلياز خارجي.

  • 5'-3 'نشاط البلمرة يتضمن إضافة قواعد النوكليوتيدات لتركيب خيط DNA جديد.
  • 3’-5 ’نشاط نوكلياز خارجي يتضمن حذف قواعد النوكليوتيدات غير المتطابقة أو يساعد في ترجمة نيك.
  • 5’-3 ’نشاط نوكلياز خارجي يتضمن حذف بادئات الحمض النووي الريبي من الجزء الخامس من خيط DNA التكميلي.

بنية: هيكل Pol-I يشبه اليد اليمنى للإنسان. يتكون الهيكل من المناطق الثلاث التالية:

  • منطقة النخيل: هو الموقع النشط الحفزي الذي يمتلك تسلسلات محفوظة. إنه بمثابة موقع نشط لـ pol-I. منطقة النخيل مصنوعة من صفائح مطوية. وتتمثل وظيفتها الأساسية في معالجة إضافة ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوتيد.
  • منطقة الاصبع: إنه موقع القالب ، حيث بمجرد الانتهاء من الاقتران الأساسي فإنه يرفق ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوتيد. وتتمثل وظيفتها الأساسية في تحفيز تخليق النيوكليوتيدات الواردة بمساعدة محفز يعرف باسم أيونات المعادن.
  • منطقة الإبهام: هي المنطقة التي تربط الحمض النووي وتحافظ على الموضع الصحيح للبرايمر والموقع النشط.


بوليميريز DNA II

اكتشفه توماس كورنبرغ في عام 1970. وكفاءته في البلمرة أبطأ من pol-I. يتكون أيضًا من سلسلة عديد ببتيد واحدة. Pol-II بمثابة انزيم احتياطي أو بديل لعملية التكرار ، لأنه في حالة عدم وجود pol-I يمكن أن يطيل شظايا Okazaki.

أنشطة DNA pol-II:

  • 5'-3 'نشاط البلمرة يتضمن إضافة قواعد النوكليوتيدات لتركيب خيط DNA جديد.
  • 3’-5 ’نوكلياز خارجي يتضمن حذف قواعد النوكليوتيدات غير المتطابقة أو يساعد في ترجمة نيك.

بنية: هيكل pol-II غير معروف تمامًا.

بوليميريز الحمض النووي الثالث

إنه الإنزيم الأساسي الذي يشارك بشكل أساسي في عملية النسخ المتماثل. يتكون من سلسلتين عديد الببتيد. يحتوي Pol-III على وحدة فرعية من العديد من الإنزيمات التي تؤدي وظائف مختلفة ، وتسمى أيضًا "إنزيم غير متجانس". يحتوي Pol-III على 10 وحدات فرعية في بنيته تجعل من pol-III إنزيمًا كاملاً ، أي "holoenzyme".

الأنشطة الموجودة في DNA pol-III:

  • 5’-3 ’نشاط البلمرة يتضمن إضافة قواعد النوكليوتيدات لتركيب خيط DNA جديد.
  • 3’-5 ’نشاط نوكلياز خارجي يتضمن حذف قواعد النوكليوتيدات غير المتطابقة أو يساعد في ترجمة نيك.

بنية: يتكون هيكل pol-III من 10 وحدات فرعية ، مثل:

  • α: يشفر جين DNA E ويساعد في تخليق الحمض النووي.
  • Ɛ: رموز لجين DNA Q وتساعد في نشاط التدقيق اللغوي 3’-5.
  • Ɵ: يشفر جين hol E ، ويعمل كبروتين ملحق ويشارك أيضًا في آلية التدقيق اللغوي.
  • Ʈ: يرمز لجين DNA X ويعزز إضعاف مركب البروتين الأساسي.
  • Ƴ: يرمز لجين DNA Y.
  • δ: يشفر الجين A.
  • δ ': رموز لجين هول ب.
  • χ: لتشفير جين هول سي.
  • Ψ: رموز لجين هول د.
  • β: يشفر الجين DNA N. إنه بمثابة بروتين المشبك الذي يحمل جزيء الحمض النووي والمسؤول عن عامل المعالجة. Ƴ و δ و δ 'و χ و كلها تعمل كمركب محمل مشابك وتساعد β- بروتين محمل المشبك على الارتباط بالحمض النووي.

مخطط المقارنة بين وظائف بدائية النواة DNA Polymerases

الخصائصDNA pol-IDNA pol- IIDNA pol-III
5’-3 ’نشاط البلمرةالحاليالحاليالحالي
3’-5 ’نوكلياز خارجيالحاليالحاليالحالي
5’-3 ’نشاط نوكلياز خارجيالحاليغائبغائب
البلمرة المعتمدة على الحمض النووي الريبييمكن أن تنفذ البلمرة المعتمدة على الحمض النووي الريبيلا تستطيعلا تستطيع
خصائص إصلاح الحمض النوويالحاليالحاليغائب
خاصية الربطالحاليغائبغائب
المشاركة في التكراريشارك لا تشاركيلعب دورًا رئيسيًا

مميزات

يحتوي DNA- polymerase على بعض الخصائص المحددة مثل:

  1. نشاط البلمرة
  2. الاخلاص، أي القدرة على التصحيح اللغوي
  3. العملية، أي معالجة الحمض النووي وأسسه
  4. ثبات الحرارة، أي الاستقرار عند درجة حرارة عالية
    مثال: Taq- DNA polymerase of ترمس البكتيريا المائية.

كل هذه الخصائص تجعلها مفيدة في التقنيات الجزيئية مثل PCR وتسلسل الحمض النووي وما إلى ذلك.


ما هي عائلات DNA Polymerase؟

تنقسم بوليميرات الحمض النووي إلى سبع عائلات بناءً على تماثل تسلسلها وتحليل التركيب البلوري. وتشمل هذه العائلات A و B و C و D و X و Y و RT.

تشمل بعض خصائص العائلات المختلفة ما يلي:

الأسرة أ

تصنف البوليميرات في هذه العائلة إما على أنها بوليميرات مضاعفة أو بوليميرات إصلاح. عندما يتم تكرار الحمض النووي ، تتطابق البوليمرات التكرارية مع النيوكليوتيدات الحرة مع التسلسلات في قالب الحمض النووي. يحدث هذا الاقتران بين قواعد النوكليوتيدات دائمًا في مجموعات معينة ، مع اقتران السيتوزين دائمًا بالجوانين والأدينين دائمًا مع الثايمين.

تقوم بوليميرات الإصلاح "بمراجعة" الخيوط الجديدة التي تم إنشاؤها وتصحيح أي أخطاء في الاقتران الأساسي.بهذه الطريقة ، يتم الحفاظ على سلامة خيط DNA الأصلي الذي يتم تمريره إلى الخلايا الوليدة.

تشمل الأعضاء التكاثرية للعائلة A بوليميريز T7 DNA بالإضافة إلى بوليميريز DNA الميتوكوندريا γ. تشمل بوليميرات الإصلاح DNA pol I من E. coli و pol I من Thermus aquaticus و pol I من Bacillus stearothermophilus.

الأسرة ب

تحتوي هذه العائلة بشكل أساسي على بوليميرات مكررة تشارك في معالجة تكرار الحمض النووي أثناء انقسام الخلية. يوجد العديد من البوليميرات في هذه العائلة في الفطريات والنباتات وبعضها موجود في العاثيات. تساهم هذه الإنزيمات في تخليق كل من خيوط الحمض النووي الرائدة والمتأخرة أثناء النسخ المتماثل. تعد بوليميرات العائلة B عالية الدقة في وظيفتها وتقوم بمراجعة 3 & # 8242-5 & # 8242 للحمض النووي المركب حديثًا من أجل تصحيح أي أخطاء تحدث أثناء تكرار الحمض النووي.

الأسرة ج

تعد بلمرات عائلة C هي البوليميرات التكاثرية الرئيسية في البكتيريا. إن إنزيم DNA polymerase III هو عائلة C polymerase الرئيسية المتضمنة في تكاثر E. coli DNA. يتكون Polymerase III من مجمع تحميل المشبك وعامل معالجة المشبك المنزلق بيتا ونواة pol III. يتكون القلب من ثلاث وحدات فرعية - الوحدة الفرعية α التي تمثل محور نشاط البوليميراز ، والوحدة الفرعية التي تعد مصحح التجريب الخارجي للنواة ، والوحدة الفرعية التي قد تستقر δ. يوجد النواة والمشابك المنزلقة بيتا في نسختين ، للسماح بمعالجة كل من خيوط الحمض النووي الرائدة والمتأخرة.

الأسرة د

هذه البوليمرات موجودة في Euryarchaeota ، مجال فرعي من العتائق ، وهي متكررة بشكل أساسي. لم يتم تعريف هذه العائلة من البوليميرات بوضوح ولكن دراسات حول Pyrococcus furiosus يشير DNA polymerase II إلى أن هذا الإنزيم عبارة عن بوليميريز مكرر.

الأسرة X

تشمل هذه العائلة بوليميريز بوليميراز حقيقيات النوى pol ، جنبًا إلى جنب مع آخرين مثل pol μ و pol و pol و deoxynucleotidyl transferase. يقوم البوليميراز بإصلاح رقعة قصيرة من الحمض النووي التالف عن طريق تثبيت الموقع المؤلكل أو المؤكسد أو الأساسي الذي تشكل بسبب تلف الحمض النووي.

يشارك Pol λ و pol μ في إعادة ضم الفواصل التي حدثت في خيوط مزدوجة من الحمض النووي بسبب بيروكسيد الهيدروجين (في حالة pol) والإشعاع المؤين (في حالة pol μ). تم العثور على ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي فقط في الأنسجة اللمفاوية ويضيف نيوكليوتيدات غير مقولبة عند تقاطعات V (D) J ، لتوفير التنوع.

الأسرة Y

تتميز هذه البوليميرات بدقة منخفضة لخيوط الحمض النووي السليمة وهي قادرة على تكرار الحمض النووي التالف.

أحد الأمثلة على عائلة Y polymerase هو polymerase polymerase ، وهو بوليميريز معرض للخطأ وليس له نشاط تدقيق لغوي من 3 إلى 5 ويشارك في الطفرات. يتم التعبير عن الإنزيم بواسطة جين (dinB) يتم تشغيله عندما تتوقف البوليمرات عند شوكة النسخ المتماثل. يتداخل هذا مع عملية pol III التي تعمل كنقطة تفتيش ، وتوقف التكرار وتتيح الوقت لإصلاح الحمض النووي. الخلايا التي تفتقر إلى ثنائي الفينيل متعدد الكلور معرضة لخطر متزايد لتطوير الطفرات التي تسببها العوامل التي تتلف الحمض النووي.

ينتمي Pol V أيضًا إلى عائلة Y من البوليميرات ويسمح بتجاوز تلف الحمض النووي من أجل استمرار النسخ المتماثل.


تفاعل البلمرة المتسلسل: التقنيات والاختلافات

اقرأ هذه المقالة للتعرف على تقنيات وأشكال تفاعل البلمرة المتسلسل مع الرسم التخطيطي.

تفاعل البلمرة المتسلسل:

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو تقنية معملية (في المختبر) لتوليد كميات كبيرة من DNA محدد.

من الواضح أن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عبارة عن تقنية تضخيم خالية من الخلايا لتجميع نسخ متطابقة متعددة (بلايين) من أي DMA محل اهتمام. تم تطويره في عام 1984 بواسطة Karry Mullis ويعتبر الآن PCR أداة أساسية لعلم الأحياء الجزيئي. بما أن آلة التصوير مطلب أساسي في المكتب ، كذلك فإن آلة PCR في مختبر البيولوجيا الجزيئية!

مبدأ PCR:

يتم تغيير طبيعة الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل للانفصال إلى خيطين فرديين. ثم يُسمح لكل حبلا بالتهجين باستخدام مادة أولية (إعادة التأهيل). يتم استخدام قالب التمهيدي المزدوج لتخليق الحمض النووي (إنزيم - بوليميريز الحمض النووي). تتكرر هذه الخطوات الثلاث - التمسخ وإعادة التشبع والتخليق مرارًا وتكرارًا لتوليد أشكال متعددة من الحمض النووي المستهدف.

تقنية PCR:

المتطلبات الأساسية لـ PCR مذكورة أدناه:

1. DNA مستهدف (100-35000 سنة مضت في الطول).

2. اثنان من البادئات (أليغنوكليوتيدات اصطناعية بطول 17-30 نيوكليوتيدات) مكملة للمناطق المحيطة بالحمض النووي المستهدف.

3. أربعة ديوكسي ريبونوكليوتيدات (dATP ، dCTP ، dCTP ، dTTP).

4. بوليميراز DNA يمكنه تحمل درجة حرارة تصل إلى 95 درجة مئوية (أي مستقر حراريًا).

يحتوي خليط التفاعل على الحمض النووي المستهدف ، واثنين من البادئات (الزائدة) ، وبوليميراز الحمض النووي المستقر حراريًا (المعزول من بكتيريا Thermus aquaticus (أي Taq DNA polymerase) وأربع نواتج نزع الأكسجين الريبي.تتضمن التقنية الفعلية لـ PCR دورات متكررة لتضخيم الهدف DNA.

كل دورة لها ثلاث مراحل:

عند رفع درجة الحرارة إلى حوالي 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة تقريبًا ، يتم تغيير طبيعة الحمض النووي ويتم فصل الخيوط.

2. إعادة التشبع أو التلدين:

نظرًا لأن درجة حرارة الخليط يتم تبريدها ببطء إلى حوالي 55 درجة مئوية ، فإن زوج قاعدة البادئات مع المناطق المكملة التي تحيط بخيوط الحمض النووي المستهدفة. تسمى هذه العملية إعادة التشبع أو التلدين. يضمن التركيز العالي من البرايمر التلدين بين كل خيط DNA والبادئة بدلاً من خيطي DNA.

يحدث بدء تخليق الحمض النووي عند 3 & # 8242-هيدروكسيل نهاية كل تمهيدي. يتم تمديد الاشعال من خلال الانضمام إلى القواعد المكملة لخيوط الحمض النووي. إن العملية التركيبية في تفاعل البوليميراز المتسلسل قابلة للمقارنة تمامًا مع تكرار الحمض النووي للخيط الرئيسي.

ومع ذلك ، يجب أن تظل درجة الحرارة مثالية كما هو مطلوب بواسطة إنزيم بوليميريز DNA. بالنسبة لـ Taq DNA polymerase ، تكون درجة الحرارة المثلى حوالي 75 درجة مئوية (بالنسبة لبوليميراز E.coli DNA ، فهي حوالي 37 درجة مئوية). يمكن إيقاف التفاعل برفع درجة الحرارة (إلى حوالي 95 درجة مئوية).

يوضح الشكل 8.1 المراحل الثلاث من تفاعل البوليميراز المتسلسل فيما يتعلق بدرجة الحرارة والوقت. تستغرق كل دورة PCR حوالي 3-5 دقائق. في الممارسة العادية ، يتم تنفيذ PCR في آلة مؤتمتة.

كما يتضح من الشكل 8.2 (الدورة الأولى) ، فإن خيط DNA الجديد المرتبط بكل مادة أولية يتجاوز التسلسل المكمل للبادئ الثاني. يشار إلى هذه الخيوط الجديدة على أنها قوالب طويلة وسيتم استخدامها في الدورة الثانية.

بالنسبة للدورة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم تغيير طبيعة خيوط الحمض النووي (أصلي + قالب طويل تم تصنيعه حديثًا) ، ويتم تلدينها باستخدام مواد أولية وإخضاعها لتخليق الحمض النووي. في نهاية الجولة الثانية ، يتم تشكيل قوالب طويلة وقوالب قصيرة (خيوط DNA مع تسلسل أولي في أحد طرفيها ، وتسلسل مكمل للطرف التمهيدي الآخر).

في الدورة الثالثة من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تكون خيوط الحمض النووي الأصلية مع القوالب الطويلة والقصيرة هي المواد الأولية. تتكرر تقنية التمسخ وإعادة التشبع والتوليف. يتكرر هذا الإجراء مرارًا وتكرارًا لكل دورة. تشير التقديرات إلى أنه في نهاية الدورة الثانية والثلاثين من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم تصنيع حوالي مليون ضعف من الحمض النووي المستهدف (الجدول 8.1). القوالب القصيرة التي تمتلك بالضبط الحمض النووي المستهدف حيث تتراكم الجزيئات المزدوجة الشريطة.

مصادر DNA Polymerase:

في التقنية الأصلية لـ PCR ، تم استخدام جزء Klenow من E. coli DNA polymerase. يتم تغيير طبيعة هذا الإنزيم عند درجة حرارة أعلى ، لذلك يجب إضافة إنزيم جديد لكل دورة. حدث اختراق مع إدخال بوليميراز DNA Taq من البكتيريا المحبة للحرارة ، Thermus aquaticus. إن بوليميراز Taq DNA مقاوم للحرارة وبالتالي ليس من الضروري إضافة هذا الإنزيم حديثًا لكل دورة من PCR.

العوامل الرئيسية لأمثل PCR:

تلعب البرايمر دورًا مهمًا في تحديد تفاعل البوليميراز المتسلسل. تعتبر البادئات (17-30 نيوكليوتيدات) بدون بنية ثانوية وبدون تكامل فيما بينها مثالية. يمكن أن يتم تهجين المواد الأولية التكميلية لتشكيل ثنائي التمهيدي وتضخيمها في تفاعل البوليميراز المتسلسل. هذا يمنع تكاثر الحمض النووي الهدف.

كما تم وصفه بالفعل ، يُفضل بوليميريز DNA Taq لأنه يمكن أن يتحمل درجات الحرارة العالية. في بروتوكول البدء الساخن ، تتم إضافة بوليميراز الحمض النووي بعد خطوة تمسخ الحرارة للدورة الأولى. هذا يتجنب امتداد الاشعال غير المتطابق الذي يحدث عادة في درجات حرارة منخفضة.

يفتقر Taq polymerase إلى إثبات قراءة نوكلياز خارجي (3 & # 8242-5 & # 8242) النشاط الذي قد يساهم في حدوث أخطاء في منتجات PCR. تم التعرف على بعض بوليميرات الحمض النووي الأخرى المستقرة حراريًا مع نشاط إثبات القراءة ، على سبيل المثال ، بوليميريز الحمض النووي Tma من بوليميراز Thermotoga maritama Pfu DNA من Pyrococcus furiosus.

بشكل عام ، كلما كان تسلسل الحمض النووي المستهدف أقصر ، كانت كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل أفضل. ومع ذلك ، في السنوات الأخيرة ، تم الإبلاغ عن تضخيم شظايا الحمض النووي حتى 10 كيلو بايت. تسلسل الحمض النووي المستهدف مهم أيضًا في تفاعل البوليميراز المتسلسل. وبالتالي ، فإن المناطق الغنية بـ CC من حبلا الحمض النووي تعيق تفاعل البوليميراز المتسلسل.

المروجين والمثبطات:

إضافة البروتينات مثل الألبومين المصل البقري (BSA) يعزز تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق حماية إنزيم بوليميراز DNA. الأحماض الدبالية ، التي توجد بشكل متكرر في العينات الأثرية للحمض النووي المستهدف ، تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل.

الاختلافات في PCR:

تم وصف التقنية الأساسية لـ PCR. كونها تقنية متعددة الاستخدامات ، يتم تعديل PCR وفقًا للمتطلبات المحددة للموقف. وبالتالي ، هناك العديد من الاختلافات في PCR الأصلي تتم مناقشة بعضها أدناه.

متداخلة PCR:

كثيرًا ما تُرى أوجه التشابه في التسلسل بين الحمض النووي المستهدف والحمض النووي المرتبط به. نتيجة لذلك ، قد ترتبط المواد الأولية بكل من الحمض النووي ، وبالتالي يتم تضخيم الحمض النووي غير المرغوب فيه أيضًا في تفاعل البوليميراز المتسلسل. يزيد استخدام البادئات المتداخلة من خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ويضخم بشكل انتقائي الحمض النووي المستهدف. تم توضيح PCR المتداخل في الشكل 8.3. في الدورة الأولى من PCR ، تكون المنتجات من الحمض النووي المستهدف والحمض النووي غير المرغوب فيه. يتم الآن استخدام مجموعة ثانية من البادئات الداخلية. سوف يرتبطون بشكل انتقائي لاستهداف الحمض النووي وعائدات التضخيم.

معكوس PCR:

في PCR المعكوس ، يتم تضخيم الحمض النووي للتسلسلات غير المعروفة من التسلسل المعروف (الشكل 8.4). يتم شق الحمض النووي المستهدف باستخدام نوكلياز مقيد لا يقطع التسلسل المعروف ولكنه يقطع التسلسل غير المعروف على كلا الجانبين. يتم قلب شظايا الحمض النووي المتكونة على هذا النحو وتحول إلى دائري (يتم استخدام DNA ligase كعامل مانع للتسرب).

يتم الآن قطع الدائرة التي تحتوي على التسلسلات المعروفة بإنزيم تقييد آخر. هذا يشق فقط التسلسل المعروف. يحتوي الحمض النووي المستهدف الذي تم تكوينه على التسلسل المعروف في كلا الطرفين مع وجود الحمض النووي المستهدف في المنتصف. يمكن الآن إجراء تضخيم PCR. وتجدر الإشارة إلى أن البادئات يتم إنشاؤها في الاتجاه المعاكس للاتجاه الطبيعي ، حيث يتم عكس التسلسل الأصلي أثناء الدوران.

مثبت PCR:

في PCR الراسخ ، يمكن ربط سلسلة صغيرة من النيوكليوتيدات (الموسومة) بالحمض النووي المستهدف ، أي الحمض النووي مثبت. هذا مفيد بشكل خاص عندما يكون التسلسل المحيط بالحمض النووي المستهدف غير معروف. غالبًا ما يكون المرساة عبارة عن ذيل بولي G يستخدم فيه بولي سي التمهيدي. يمكن أيضًا إجراء التثبيت باستخدام المحولات. نظرًا لأن المحولات تمتلك تسلسلًا معروفًا ، يمكن اختيار التمهيدي.

النسخ العكسي PCR:

يمكن أيضًا استخدام تقنية PCR لتضخيم جزيئات الحمض النووي الريبي ، وفي هذه الحالة يُشار إليها باسم النسخ العكسي - PCR (RT-PCR). لهذا الغرض ، يجب أولاً تحويل جزيء الحمض النووي الريبي (mRNA) إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA) بواسطة إنزيم النسخ العكسي للإنزيم. ثم يعمل cDNA كقالب لـ PCR. يمكن استخدام مواد أولية مختلفة لتركيب الخيط الأول من (كدنا). وتشمل هذه استخدام البادئات العشوائية ، والبادئة oligo dT التمهيدي الخاص بالتسلسل (الشكل 8.5).

PCR غير متماثل:

يمكن أيضًا استخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل لتخليق جزيئات الحمض النووي أحادية السلسلة ، وهي مفيدة بشكل خاص لتسلسل الحمض النووي. في PCR غير المتماثل ، يتم استخدام اثنين من البادئات بنسبة 100: 1. بعد 20-25 دورة من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم استنفاد مادة أولية واحدة. والنتيجة هي أنه في 5-10 دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية ، يتم إنشاء الحمض النووي أحادي الجديلة فقط.

في الوقت الحقيقي الكمي PCR:

القياس الكمي لمنتجات PCR في دورات مختلفة ليس بسيطًا كما هو متوقع من خلال الاعتبارات النظرية (الجدول 8.1). في الممارسة العملية ، تحدث اختلافات كبيرة. الأسلوب الأكثر شيوعًا لقياس كمية PCR هو استخدام مركب مضان مثل بروميد الإيثيديوم.

المبدأ هو أن جزيئات الحمض النووي مزدوجة الشريطة ترتبط ببروميد الإيثيديوم الذي ينبعث منه مضان يمكن اكتشافه ، وتحديد كمية الحمض النووي. تم وصف تركيب الجينات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ودور تفاعل البوليميراز المتسلسل في حدوث الطفرات الموجهة بالموقع في مكان آخر.

DNA متعدد الأشكال مضخم عشوائي (RAPD):

عادةً ما يكون الهدف من تفاعل البوليميراز المتسلسل هو توليد أجزاء محددة من الحمض النووي من بادئات محددة للغاية. في حالة RAPD (يُنطق بسرعة) ، يتم اختيار بادئات قليلة النوكليوتيد القصيرة بشكل تعسفي لتضخيم مجموعة من أجزاء الحمض النووي الموزعة عشوائيًا في جميع أنحاء الجينوم. تُعرف هذه التقنية ، الحمض النووي المضخم العشوائي متعدد الأشكال أيضًا باسم PCR المُعد بشكل تعسفي (AP-PCR).

إجراء RAPD مشابه للتقنية العامة لـ PCR. تتضمن هذه الطريقة بشكل أساسي استخدام جهاز تمهيدي واحد بصرامة منخفضة. يرتبط أليغنوكليوتيد قصير واحد (عادة 9-10 قاعدة أولية) بالعديد من المواقع في الجينوم ويتم تضخيم شظايا الحمض النووي منها. يمكن زيادة صرامة الربط التمهيدي بعد بضع دورات PCR. هذا يسمح بتضخيم أفضل حالات عدم التطابق.

يمكن تصميم RAPD بعناية بحيث ينتج أخيرًا أنماط نطاق محددة للجينوم والتي تكون مفيدة للتحليل المقارن. هذا ممكن لأن الحمض النووي الجيني لشخصين مختلفين ينتج غالبًا أنماط تضخيم مختلفة بواسطة RAPD. وبالتالي ، يمكن إنشاء جزء معين من الحمض النووي لفرد واحد وليس لفرد آخر ، وهذا يمثل تعدد أشكال الحمض النووي الذي يمكن استخدامه كعلامة جينية.

يستخدم RAPD على نطاق واسع من قبل علماء الأحياء الجزيئية للنباتات من أجل التحديد الجيني للأنواع النباتية. لهذا الغرض ، تم تصميم مجموعات مختلفة من النيوكليوتيدات ، معظمها بادئات قليلة النوكليوتيد العشوائية وهي متاحة تجارياً. نظرًا لأن كل تمهيدي عشوائي يصلب إلى منطقة مختلفة من الحمض النووي ، يمكن تحديد العديد من المناطق المختلفة على الحمض النووي. وبالتالي ، فإن RAPD مفيد في بناء الخرائط الجينية وكطريقة لبصمات الأصابع الجينية.

حدود RAPD:

ترتبط المشكلة الرئيسية لـ RAPD بإمكانية التكاثر. غالبًا ما يكون من الصعب الحصول على مستويات مماثلة من الربط التمهيدي في تجارب مختلفة. لذلك من الصعب ربط النتائج التي حصلت عليها مجموعات البحث المختلفة حول RAPD.

تعدد الأشكال لطول الجزء المضخم (AFLP):

AFLP هي طريقة حساسة للغاية لاكتشاف تعدد الأشكال في الجينوم. وهو يقوم على مبدأ تقييد طول جزء تعدد الأشكال و RAPD. قد يُنظر إلى AFLP بشكل مناسب على أنه تقنية بصمة تشخيصية تكتشف شظايا التقييد الجينومي.

في AFLP ، يتم استخدام تضخيم PCR بدلاً من النشاف الجنوبي (يستخدم في الغالب في RFLP) للكشف عن شظايا التقييد. وتجدر الإشارة إلى أنه يتم استخدام AFLP للكشف عن وجود أو عدم وجود شظايا التقييد ، وليس أطوال هذه الأجزاء. هذا هو الفرق الرئيسي بين AFLP و RFLP. يستخدم AFLP على نطاق واسع في علم الوراثة النباتية.

لم تثبت فائدتها في رسم خرائط الجينوم الحيواني ، لأن هذه التقنية تعتمد أساسًا على وجود معدلات عالية من الاختلافات البديلة التي لا توجد في الحيوانات. من ناحية أخرى ، فإن الاختلافات البديلة التي تؤدي إلى RFLPs أكثر شيوعًا في النباتات. يتضمن المبدأ الأساسي لـ AFLP تضخيم مجموعات فرعية من RFLPs باستخدام PCR (الشكل 8.6).

يتم عزل الحمض النووي الجيني وهضمه في وقت واحد مع نوعين مختلفين من نوكليازات التقييد - EcoRI مع موقع التعرف على 6 أزواج أساسية و Msel مع موقع التعرف على 4 أزواج أساسية. يمكن لهذين الإنزيمين أن يشقوا الحمض النووي وينتجوا شظايا صغيرة (& لتر 1 كيلو بايت) يمكن تضخيمها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. لهذا الغرض يتم ربط شظايا الحمض النووي بمحولات EcoRI و Msel.

تعمل سلاسل المحولات الشائعة هذه (التسلسلات الجينومية المرافقة) كمواقع ربط أولية على أجزاء التقييد. يمكن تضخيم شظايا الحمض النووي باستخدام بادئات AFLP لكل منها نوكليوتيد انتقائي واحد فقط. يتم تخفيف منتجات PCR هذه واستخدامها كقوالب للتضخيم الانتقائي باستخدام اثنين من البادئات AFLP الجديدة التي تحتوي على 2 أو 3 نيوكليوتيدات انتقائية.

بعد التضخيم الانتقائي بواسطة PCR ، يتم فصل منتجات DNA على مادة هلامية. يتم التعرف على بصمة الحمض النووي الناتجة عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي. تمثل شظايا AFLP مواقع فريدة في الجينوم ، وبالتالي يمكن استخدامها كمعالم لسد الفجوات بين الخرائط الجينية والمادية للجينوم. في النباتات ، يعد AFLP مفيدًا لإنشاء خرائط عالية الكثافة ، واكتشاف الحيوانات المستنسخة الجينومية.

التضخيم السريع لنهايات (كدنا) (RACE):

كما سبق وصفه (انظر ص 115) ، ينتج عن النسخ العكسي ، متبوعًا بـ PCR (RT-PCR) تضخيم تسلسل الحمض النووي الريبي في شكل cDNA. لكن القيد الرئيسي لـ RT-PCR يرتبط بتسلسل الحمض النووي غير المكتمل في (كدنا). يتم حل هذه المشكلة باستخدام تقنية التضخيم السريع لنهايات (كدنا). تم توضيح RACE في الشكل 8.7 ، وتم وصفها بإيجاز أدناه.

يتم تحويل الحمض النووي الريبي الهدف إلى (كدنا) جزئية عن طريق تمديد التمهيدي للحمض النووي. تم أولاً تلدين هذا الحمض النووي التمهيدي في موضع فاصل من الحمض النووي الريبي ، وليس بعيدًا جدًا عن الطرف 5 & # 8242 للجزيء. الآن إضافة dATP (As) و deoxynucleotidyl transferase الطرفية يمتد 3 & # 8242-end of cDNA.

يحدث هذا بسبب إضافة سلسلة من مثل cDNA. هذه بمثابة سلسلة الآن بمثابة التمهيدي لتصلب مرساة التمهيدي. يمكن تشكيل خيط ثان من الحمض النووي عن طريق تمديد مرساة التمهيدي. الحمض النووي مزدوج الشريطة جاهز الآن للتضخيم بواسطة PCR. يسمى الإجراء الموصوف أعلاه 5 & # 8242- RACE ، حيث يتم تنفيذه عن طريق تضخيم نهاية 5 & # 8242 من بدء RNA. يمكن استخدام بروتوكول مشابه لتنفيذ 3 & # 8242-RACE عندما يكون تسلسل RNA 3 & # 8242-end مطلوبًا.

حدود RACE:

نظرًا لاستخدام أساس محدد ، قد لا تكون خصوصية تضخيم RACE عالية جدًا. عيب آخر هو أن النسخ العكسي قد لا يصل بشكل كامل إلى نهايات RNA 5 & # 8242 ، وهذا يحد من فائدة RACE. في السنوات الأخيرة ، تم إجراء بعض التعديلات لتحسين RACE.


نظرة عامة على الحديث

يعطي الدكتور باسبي لمحة عامة عن وظيفة وتنظيم بوليميراز الحمض النووي الريبي البكتيري. يتم تحديد توزيع بوليميراز الحمض النووي الريبي بين الجينات من خلال التفاعلات بين عامل سيغما بوليميريز الحمض النووي الريبي ، وتسلسل المحفز وتفعيل أو قمع عوامل النسخ. من خلال هندسة منشطات إضافية في الإشريكية القولونية وتغيير مكان ارتباطها بالحمض النووي ، تمكن بوسبي وزملاؤه من تغيير تنظيم بوليميريز الحمض النووي الريبي البكتيري في وحدات نسخ معينة.


وظيفة بوليميراز الحمض النووي الريبي

بوليميراز الحمض النووي الريبي هو أهم إنزيم في عملية النسخ. تذكر أن النسخ هو عملية نسخ الحمض النووي مزدوج الشريطة إلى خيط واحد من الحمض النووي الريبي.قد يبدوان مختلفين قليلاً ، لكن كلاهما مكتوب بلغة النيوكليوتيدات. لكي يبدأ بوليميراز الحمض النووي الريبي عمله ، يجب أن يجد أولاً المناسب منطقة المروج. يمكن استهداف هذه المنطقة بواسطة عوامل النسخ في حقيقيات النوى. ترتبط هذه البروتينات بالموقع ، مما يخلق ترتيبًا مناسبًا لـ RNA polymerase لربط وبدء النسخ. في البكتيريا ، يوجد مروج واحد فقط ، وهو عامل بدء سيجما. يمكن رؤية هذه العملية مع جزيء بلمرة RNA المعمم الموضح أدناه نسخ DNA. لا تظهر عوامل النسخ.

عندما يرتبط RNA polymerase بالحمض النووي DNA ، فإنه يتغير التشكل، أو الشكل. يبدأ هذا التفاعل المتسلسل الإنزيمي الذي ينمي سلسلة جديدة من النيوكليوتيدات إلى جزيء RNA قائم على النموذج المقدم. بعد أن ينتج RNA polymerase هذا الجزيء الجديد ، يجب معالجة RNA وإطلاقه من نواة. ينادى الآن رسول RNA، أو mRNA ، سيواجه الريبوسوم الذي يمتلك الآليات المناسبة لعملية ترجمة.

مثل الترجمة من الإنجليزية إلى الإسبانية ، يجب على الريبوسوم "قراءة" تسلسل الحمض النووي الريبي وتحويل الرسالة إلى لغة أحماض أمينية. تشكل هذه الجزيئات الصغيرة سلاسل طويلة ، والتي تنثني إلى أشكال معقدة لتصبح بروتينات نشطة كيميائيًا حيويًا. تقوم هذه البروتينات بدورها بإنشاء أجزاء من الحمض النووي والحفاظ عليها ، فضلاً عن تكرار الحمض النووي. تخزن أجزاء من الحمض النووي المعلومات الجينية لبروتين RNA polymerase نفسه ، والذي يتم فك تشفيره أولاً بواسطة جزيء RNA polymerase. هذا الموقف هو حقًا أساس الدجاجة والبيضة إذا فكرت في الأمر.


استطالة وإنهاء حقيقيات النوى

بعد تكوين معقد ما قبل الاستنشاق ، يتم تحرير البوليميراز من عوامل النسخ الأخرى ، ويسمح للاستطالة بالاستمرار كما هو الحال في بدائيات النوى مع توليف البوليميراز pre-mRNA في اتجاه 5 إلى 3. كما تمت مناقشته سابقًا ، يقوم RNA polymerase II بنسخ الحصة الرئيسية من الجينات حقيقية النواة ، لذلك سيركز هذا القسم على كيفية تحقيق هذا البوليميراز للاستطالة والإنهاء.

على الرغم من أن عملية الاستطالة الأنزيمية هي نفسها بشكل أساسي في حقيقيات النوى وبدائيات النوى ، فإن قالب الحمض النووي أكثر تعقيدًا. عندما لا تنقسم الخلايا حقيقية النواة ، توجد جيناتها ككتلة منتشرة من الحمض النووي والبروتينات التي تسمى الكروماتين. يتم حزم الحمض النووي بإحكام حول بروتينات هيستون المشحونة على فترات متكررة. هذه المجمعات DNA-هيستون ، التي تسمى مجتمعة النيوكليوسومات ، متباعدة بانتظام وتتضمن 146 نيوكليوتيد من الحمض النووي ملفوفًا حول ثمانية هيستون مثل الخيط حول بكرة.

لكي يحدث تخليق عديد النوكليوتيد ، تحتاج آلية النسخ إلى تحريك الهيستونات بعيدًا عن الطريق في كل مرة تواجه فيها جسيمًا نوويًا. يتم تحقيق ذلك من خلال مركب بروتيني خاص يسمى FACT ، والذي يرمز إلى "تسهيل نسخ الكروماتين". يسحب هذا المركب الهيستونات بعيدًا عن قالب الحمض النووي بينما يتحرك البوليميراز على طوله. بمجرد تصنيع ما قبل mRNA ، يستبدل مجمع FACT الهستونات لإعادة تكوين الجسيمات النووية.

يختلف إنهاء النسخ باختلاف البوليميرات. على عكس بدائيات النوى ، فإن الاستطالة بواسطة بوليميريز RNA في حقيقيات النوى تحدث 1000-2000 نيوكليوتيد بعد نهاية الجين الذي يتم نسخه. تتم إزالة هذا الذيل pre-mRNA لاحقًا عن طريق الانقسام أثناء معالجة mRNA. من ناحية أخرى ، تتطلب بوليميرا RNA الأول والثالث إشارات إنهاء. تحتوي الجينات التي تم نسخها بواسطة RNA polymerase I على تسلسل محدد من 18 نيوكليوتيد يتم التعرف عليه بواسطة بروتين إنهاء. تتضمن عملية الإنهاء في RNA polymerase III دبوس شعر mRNA مشابه لإنهاء النسخ المستقل عن rho في بدائيات النوى.


نتائج

في هذه الدراسة ، تم فحص Q5 لتحديد مدى دقته مقارنةً بـ طق بوليميريز الحمض النووي باستخدام الطريقتين الموصوفتين أدناه (الشكل 2). تم تضخيم الهدف 3،874 نقطة أساس في تفاعل البوليميراز المتسلسل مع أي منهما طق (Thermopol Buffer) ، Q5 (Q5 Reaction Buffer مع أو بدون مُحسِّن GC) أو Phusion & reg (Phusion HF Buffer) DNA Polymerase. تم تحديد معدلات الطفرة المرصودة باستخدام كل من طريقة الاختيار الأزرق / الأبيض بعد 16 دورة PCR (4) وعن طريق تسلسل Sanger بعد 25 دورة PCR (الجدول 1). تم تحديد معدل الخطأ لكل قاعدة مدمجة بعد حساب العدد الفعال لدورات التضخيم لكل تجربة كما هو موضح سابقًا (4 ، 5). مقارنة مجموعات البيانات من طق يشير إلى أن الطريقتين تولدان نتائج مماثلة مع معدلات خطأ تبلغ

1 في 3500 قاعدة. من ناحية أخرى ، أسفر Q5 عن عدد أخطاء أقل بكثير من طق في كلا نظامي الفحص ، بما يتوافق مع معدل الخطأ البالغ

10-6. التقييم جنبًا إلى جنب لـ طق و Q5 باستخدام طريقة الأزرق / الأبيض تشير إلى أن Q5 هو

إخلاص 200 مرة في تكرار الحمض النووي أكثر من طق. لوحظت نتائج مماثلة لـ Q5 عندما تمت إضافة مُحسِّن GC إلى التفاعلات (البيانات غير معروضة). بالنسبة إلى Phusion ، تم تحديد معدل الخطأ ليكون 80 & plusmn39 أفضل من طق باستخدام طريقة الأزرق / الأبيض و 84 مرة طق باستخدام طريقة التسلسل.

بالنسبة لتسلسل Sanger ، تم اكتشاف طفرتين فقط في مجموعة بيانات Q5 (على الرغم من تسلسل أكثر من 440.000 نيوكليوتيد). على الرغم من أن هذا يتحدث بشكل مباشر عن الدقة العالية اللافتة للنظر لإنزيم Q5 ، إلا أنه من الصعب التوصل إلى استنتاجات ذات دلالة إحصائية حول معدل الخطأ المطلق Q5 أو معدل الدقة المقارن مقابل طق باستخدام مجموعة البيانات هذه.

الجدول 1. حسابات اختبار الدقة طق و Q5 DNA Polymerases

& plusmn = ثقة 95٪
الأرقام الموجودة بين قوسين لها أهمية إحصائية محدودة حيث تم اكتشاف طفرتين فقط بعد تسلسل 441670 نيوكليوتيد.

ما هو الإخلاص؟

شاركت New England Biolabs في اكتشاف وتطوير البوليمرات عالية الدقة لسنوات عديدة (الجدول 1). بدءًا من اكتشاف Vent & reg DNA Polymerase from المكورات الحرارية litoralis في عام 1990 (1،2) ، قام باحثو NEB بتحديد وهندسة العديد من البوليمرات عالية الدقة و ndash جميعها مع عمليات مختلفة وسرعات ودرجات دقة.

تاريخ بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة في نيو إنجلاند بيولابس

سنوات منتجات) NEB #
1990-91 تنفيس & ريج DNA Polymerase M0254
1992 تنفيس & reg (exo-) DNA Polymerase
تنفيس عميق & ريج DNA بوليميراز
M0257
M0258
1993-1994 تنفيس عميق & reg (exo-) DNA Polymerase M0259
1995 9 درجةم& التجارة DNA Polymerase M0260
2007-2008 Phusion & reg عالي الدقة بوليميريز DNA M0530
2011 Phusion & reg Hot Start Flex DNA Polymerase M0535
2012 Q5 & reg عالي الدقة بوليميريز DNA
Q5 & reg Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase
M0491
M0493

تشير دقة بوليميريز الحمض النووي إلى قدرته على تكرار القالب بدقة. يتمثل أحد الجوانب الحاسمة لهذا الأمر في قدرة بوليميريز الحمض النووي على قراءة خيط قالب ، وتحديد النوكليوزيد ثلاثي الفوسفات المناسب وإدخال النوكليوتيد الصحيح في نهاية التمهيدي 3 & الأولية ، بحيث يتم الحفاظ على الاقتران الأساسي Watson-Crick الأساسي. يُعرف معدل التداخل الخاطئ (بما في ذلك النيوكليوتيدات غير الصحيحة) باسم "معدل الخطأ" للبوليميراز. بالإضافة إلى التمييز الفعال للتصحيح على التضمين غير الصحيح للنيوكليوتيدات ، تمتلك بعض بوليمرات الحمض النووي نشاط نوكلياز خارجي 3 & Prime & rarr5 & Prime. يُستخدم هذا النشاط ، الذي يُطلق عليه أيضًا "التدقيق اللغوي" ، لاستئصال أحادي النيوكليوتيدات المدمجة بشكل غير صحيح والتي يتم استبدالها بعد ذلك بالنيوكليوتيدات الصحيحة. يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة بوليمرات الحمض النووي التي تقرن معدلات سوء التضمين المنخفضة مع نشاط التصحيح لإعطاء تكرار صادق لهدف الحمض النووي محل الاهتمام.

(1) ماتيلا ، ب ، وآخرون. (1991) أبحاث الأحماض النووية ، 19 ، 4967 & ndash4973. بميد: 1923765
(2) Eckert، K.A، & amp Kunkel، T.A (1991) Genome Research، 1، 17 & ndash24. PMID: 1842916

Vent & reg هي علامة تجارية مسجلة لشركة New England Biolabs، Inc.
DeepVent & reg، 9 & degNم& trade هي علامات تجارية لشركة New England Biolabs، Inc.


شاهد الفيديو: ماهو تحليل البى سر أر - PCR - بشرح مبسط جدا (قد 2022).