معلومة

التسلسل الكامل لـ Plasmid pMG101

التسلسل الكامل لـ Plasmid pMG101


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أحاول العثور على تسلسل البلازميد الكامل لـ pMG101. لقد كنت أبحث في أوراق أخرى تسلسل هذا البلازميد. أرقام الوصول إلى GenBank التي حصلت عليها هي التالية: AY009372-AY009396 ، ASRI00000000. ومع ذلك ، عندما أذهب إلى بنك الجينبانك ، يعطيني نتيجة تفيد بأنه ليس هناك ... أنا عالق ولست متأكدًا من الكيفية التي من المفترض أن أجد بها تسلسل البلازميد الكامل. هل يعرف أي شخص طريقة أخرى للعثور عليه؟


يبدو أنه سيتعين عليك القيام ببعض أعمال إعادة البناء لبناء التسلسل الكامل من المعلومات الموجودة هنا وفي أي مكان آخر في هذه الورقة:

أرقام دخول تسلسل النوكليوتيدات. أرقام دخول DDBJ / EMBL / GenBank للتسلسلات المذكورة في هذه الورقة هي AB031076 (جزء SalI-XhoI 3.0 كيلو بايت من pMG101) ، D84187 (rDNA للسلالة S55) ، D86354 (rDNA لـ USDA 4362) و D86355 (rDNA لـ USDA 4377) و AB031077 (البلازميد pMG103) و AB031078 (البلازميد pMG105).

- تحليل التسلسل للبلازميد الخفي pMG101 من Rhodopseudomonas palustris وبناء نواقل الاستنساخ المستقرة


ها هو: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/4206623؟

هذا هو نفس البلازميد الموجود في E. Coli J53. هذا هو أحدث تسلسل.


PWPT-GFP (بلازميد # 12255)

يمكن استخدام pWPT أو pWPXL للتعبير الجيني التأسيسي.
يحتوي pWPXL على محفز EF-1alpha + intron الذي يمنحك تعبيرًا عاليًا ، حيث يحب الحمض النووي الريبي التقسيم (يخرج بشكل أكثر كفاءة من النواة). يحتوي pWPT فقط على مروج EF-1alpha

يتم تكرار موقع loxP في 3 & # 39LTR إلى 5 & # 39LTR أثناء النسخ العكسي في الخلايا المستهدفة. هذا يسمح بإزالة (إذا لزم الأمر) من طيار متكامل بواسطة Cre.

تسمح لك مواقع التقييد الفريدة في المناصب الرئيسية بتغيير المروج والتحويل.

يرجى ملاحظة أن CLI في هذا المتجه يتم حظره بواسطة مثيلة السد.
يحتاج هذا البلازميد إلى النمو في سلالة البكتيريا التالفة إذا كنت ترغب في استخدام ClaI للاستنساخ.

تتوفر أيضًا بلازميدات التغليف لناقلات الفيروسة البطيئة لمختبر Trono في Addgene http://www.addgene.org/rnaitools

يرجى ملاحظة أن التسلسل الكامل لهذا البلازميد تقريبي ولم يتم التحقق منه بالكامل. يرجى زيارة مختبر Trono http://tronolab.epfl.ch لاستراتيجيات الاستنساخ والبروتوكولات والمنشورات والمزيد. راجع LentiWeb http://www.lentiweb.com للحصول على مناقشات حول استراتيجيات الاستنساخ والبروتوكولات.

تم إنشاء هذه البلازميدات من قبل زملائك. يرجى الاعتراف بالباحث الرئيسي ، واستشهد بالمقال الذي تم وصف البلازميدات فيه ، وقم بتضمين Addgene في مواد وطرق منشوراتك المستقبلية.


الأساس الجزيئي لمقاومة كاتيونات الفضة في السالمونيلا

نقدم هنا تقريرًا عن الأساس الجزيئي الجيني والمقترح لمقاومة الفضة في الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض. محدد مقاومة الفضة من جناح الحروق بالمستشفى السالمونيلا يحتوي البلازميد على تسعة إطارات قراءة مفتوحة ، مرتبة في ثلاثة رنا مقاسة ومتباعدة. يشفر محدد المقاومة بروتين ارتباط خاص بالفضة المحيطة بالفضة (SilE) بالإضافة إلى مضختين متوازيتين للتدفق على ما يبدو: أحدهما ، من النوع P- ATPase (SilP) والآخر ، وهو غشاء يعتمد على جهد ثلاثي كاتيون متعدد الببتيد / مضاد بروتون (SilCBA). ال صمت يتم التحكم في المحدد بواسطة مستشعر غشاء مكون من عنصرين ومستجيب نسخي يشتمل على سيلس و سيلر ، التي يتم نسخها بشكل مشترك. توافر صمت سيكون محدد مقاومة الفضة هو الأساس للدراسات الميكانيكية الجزيئية والكيميائية الحيوية بالإضافة إلى علم الأوبئة الجزيئية لمقاومة الفضة في البيئات السريرية التي تستخدم فيها الفضة كمبيد حيوي.


FUGW (بلازميد # 14883)

تم إنشاء Plasmid pFUGW عن طريق إدخال ما يلي في موقع multicloning لـ HR & # 39CS-G: تسلسل رفرف HIV-1 الذي تم تضخيمه بواسطة PCR
من جينوم HIV NLA4.3 ، ومحفز polyubiquitin البشري- C (هدية L. Thiel ، Amgen) ، وجين EGFP ، و WRE (طائر الحطاب)
العنصر التنظيمي لما بعد النسخ لفيروس التهاب الكبد) (هدية من د.ترونو ، جامعة جنيف). يمكن إنتاج فيروسات Lentivirus عن طريق نقل ناقل عبوة HIV-1 Delta8.9 والبروتين السكري المغلف VSVG إلى 293 خلية ليفية.

ترتيب العناصر: CMV LTR PstI flap PacI Ubiquitin المروج SpeI HindIII PstI SalI XbaI BamHI SmaI KpnI GFP NotI EagI XbaI EcoRI EcoRV HindIII ClaI WRE ClaI SalI XhoI KpnI 3 & # 39LTR ApaI PmeI.

تم إنشاء هذه البلازميدات من قبل زملائك. يرجى الاعتراف بالباحث الرئيسي ، واستشهد بالمقال الذي تم وصف البلازميدات فيه ، وقم بتضمين Addgene في مواد وطرق منشوراتك المستقبلية.


PSKI015 (بلازميد # 11570)

تتوافق معززات CaMV 35S في هذه النواقل مع النيوكليوتيدات من -417 إلى -86 بالنسبة إلى بداية النسخ.

سلالة الأجرعية الموصى بها هي GV3101 pMP90RK. علامات بلازميد المضيف والمساعد هي مقاومة الكانامايسين والجنتاميسين والريفامبيسين.

يعتبر اختيار البلازميد في الإشريكية القولونية و A. المورمية مقاومة للأمبيسيلين.

المواقع التي تترك متواليات pBstKS + سليمة وتقطع على جانب واحد فقط بين pBstKS + ويمكن استخدام الحدود اليمنى أو اليسرى لإنقاذ البلازميد. لاحظ أن هناك مواقع BssS1 إضافية غير معروضة على الخريطة.

قد تكون المحسنات الأربعة المتكررة في البنية غير مستقرة في E. coli و Agrobacterium إذا تم تخزينها عند + 4 & # 39C لفترة طويلة. تحقق من PCR مع T7 (أو M13-20) oligo وهذا مشتق من تسلسل RB: 5 & # 39 acc cgc caa tat atc ctg 3 & # 39. يجب أن يعطي هذا النطاق 1.4 كيلو بايت. لاحظ أن هذه القلة لن تعمل في نبات معدّل وراثيًا ، حيث لا يتم نقل تسلسل RB. باستخدام هذا الاختبار ، وجدنا أنه بعد أسبوع إلى أسبوعين في الثلاجة ، تفقد سلالة الأجرعية في المتوسط ​​نسخة واحدة من التكرار ، وبعد شهر في الثلاجة ، لم يتبق سوى نسخة واحدة. إنها لفكرة جيدة استخدام مستعمرة مخططة حديثًا من مخزون جلسرين جيد -70 & # 39C لكل تسلل.

تم إنشاء هذه البلازميدات من قبل زملائك. يرجى الاعتراف بالباحث الرئيسي ، واستشهد بالمقال الذي تم وصف البلازميدات فيه ، وقم بتضمين Addgene في مواد وطرق منشوراتك المستقبلية.


ديناميكيات الجينوم الكاملة لسلالة سلالة سائدة Xanthomonas oryzae الكهروضوئية. اوريزي يحتوي على بلازميد جديد يشفر نظام إفراز من النوع الرابع

Xanthomonas oryzae الكهروضوئية. اوريزي (Xoo) هو أحد مسببات الأمراض الخطيرة التي تسبب مرض اللفحة الجرثومية في الأرز. كشفت الدراسات الجينومية السكانية أن تفشي السلالات بدلاً من الاختلافات بين السلالات تساهم في النجاح التطوري لهذا العامل الممرض. هنا ، نُبلغ عن تسلسل الجينوم الكامل لـ BXO1 ، سلالة من Xoo ينتمي إلى سلالة مهيمنة من الهند. كشف تحقيق كامل قائم على الجينوم عن وجود نوعين من البلازميدات ، pBXO1-1 (66.7 كيلو بايت) و pBXO1-2 (25.6 كيلو بايت). يشفر البلازميد pBXO1-1 71 جينًا ، 38 منها يشفر بروتينات افتراضية ذات وظيفة غير معروفة. ومع ذلك ، فإن هذه الجينات الافتراضية تمتلك محتوى GC غير نمطي ، مما يشير إلى اكتسابها وحركتها من خلال نقل الجينات الأفقي. ومن المثير للاهتمام ، أن pBXO1-2 يشفر نظام إفراز من النوع الرابع (T4SS) ، والذي يُعرف عنه أنه يلعب دورًا مهمًا في النقل الاقتراني للمادة الوراثية ، كما يوفر اللياقة البدنية للبكتيريا المسببة للأمراض من أجل تعزيز بقائها على قيد الحياة. لم يتم الإبلاغ عن أي من البلازميد مسبقًا في أي كاملة أخرى Xoo نشر الجينوم حتى الآن. كشف تحليلنا أيضًا أن البلازميد pBXO1-2 موجود في زانثوموناس ألبلين شارع. GPE PC73 ، المعروف بتسببه في حرق الأوراق ، وهو مرض قاتل في قصب السكر. زودنا تحليل تسلسل الجينوم الكامل الخاص بنا لـ BXO1 برؤى تفصيلية حول البلازميدات الجديدة الخاصة بالسلالة ، بالإضافة إلى فك تشفير قدراتهما الوظيفية ، والتي لم تكن قابلة للتقييم عند استخدام تسلسل الجينوم الأولي للسلالة. بشكل عام ، كشفت دراستنا عن تنقل T4SS جديد في نوعين من مسببات الأمراض زانثوموناس التي تصيب الأنسجة الوعائية لنبتين أحاديتين مهمتين اقتصاديًا ، وهما الأرز وقصب السكر.

الكلمات الدالة: Xanthomonas monocots nanopore تسلسل النوع الرابع من نظام إفراز الخشب.

بيان تضارب المصالح

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

الأرقام

تمثيل دائري لـ BXO1 ...

التمثيل الدائري لجينوم BXO1. تمثل الحلقات (من الخارج إلى الداخل): ...

مخططات دائرية توضح pBXO1-1 و ...

مخططات دائرية توضح البلازميدات pBXO1-1 و pBXO1-2 من سلالة BXO1 من Xanthomonas ...

تحليل مقارن لـ pBXO1-2 مع ...

تحليل مقارن لـ pBXO1-2 مع X. albilineans str. GPE PC73 بلازميد. ال…


تحديد جينات IncA / C Plasmid Replication and Maintenance وتطوير مخطط طباعة تسلسل متعدد البؤرة Plasmid

أصبحت بلازميدات مجموعة عدم التوافق A / C (IncA / C) منتشرة بشكل متزايد داخل البكتيريا المعوية المسببة للأمراض وهي مرتبطة بنشر جينات مقاومة متعددة ذات صلة سريريًا ، بما في ذلك blaCMY و blaNDM تقدم طرق الكتابة الحالية لبلازميدات IncA / C دقة محدودة. في هذه الدراسة ، نقدم التسلسل الكامل لـ blaNDM-1-بلازميد IncA / C إيجابي ، pMS6198A ، معزول من سلالة Escherichia coli المقاومة للأدوية المتعددة. تم استخدام طفرات الينقولات المفرطة المشبعة ، إلى جانب تسلسل موقع الإدخال الموجه بواسطة الترانسبوزون (TraDIS) ، لتحديد العناصر الجينية المحفوظة اللازمة لتكرار وصيانة pMS6198A. حدد تحليلنا لبيانات TraDIS أدوارًا للليكون ، بما في ذلك repA ، ونظام مضاد السموم ، وهما جينات مفترضة للتقسيم ، و parAB وجين مفترض ، 053. تساهم المنطقة التي تضم 053 في الحفاظ على استقرار بلازميدات IncA / C. بعد ذلك ، تم استخدام جينات الصيانة الرئيسية الأربعة (repA و parAB و 053) لإنشاء مخطط جديد لكتابة تسلسل متعدد البؤرة (PMLST) لبلازميدات IncA / C. حدد تطبيق هذا المخطط على قاعدة بيانات 82 IncA / C من البلازميدات 11 نوعًا فريدًا من التسلسل (STs) ، مع اثنين من STs المهيمنة. غالبية blaNDM- البلازميدات الإيجابية التي تم فحصها (15/17 88 ٪) تقع في ST1 ، مما يشير إلى الاستحواذ والتوسع اللاحق لهذا blaNDM- تحتوي على نسب بلازميد. يمثل مخطط IncA / C PMLST أداة موحدة لتحديد وتتبع وتحليل نشر سلالات بلازميد IncA / C الهامة ، لا سيما في سياق الدراسات الوبائية.

الكلمات الدالة: IncA / C plasmid نيودلهي metallo-beta-lactamase الجينوم الوظيفي البلازميد تسلسل متعدد البؤرة كتابة E. coli المسببة للأمراض البولي.

حقوق النشر © 2017 الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة.

الأرقام

الخريطة الجينية لـ pMS6198A. ال…

الخريطة الجينية لـ pMS6198A. الحلقات الخارجية عبارة عن أقراص CDS في الأمام والخلف ...

نظرة عامة على PMS6198A في المختبر…

نظرة عامة على PMS6198A في المختبر الطفرات وتحليل TraDIS. (1) تين 5 ::سم…

الجينات الأساسية TraDIS قراءة البيانات ...

الجينات الأساسية TraDIS قراءة البيانات. (أ) RPKM لكل جين مدرج في ...

مساهمة مكان التقسيم ...

مساهمة موضع التقسيم في استقرار IncA / C. (أ) خريطة Plasmid لـ mini-IncA / C ...

تصف الجينات الأساسية التي تم تحديدها بواسطة TraDIS IncA / C ...

تصف الجينات الأساسية التي تم تحديدها بواسطة TraDIS نسالة IncA / C. الموضح هو مقارنة بين سلالات IncA / C ...

الشجرة الممتدة الدنيا من IncA / C ...

الحد الأدنى من الشجرة الممتدة لـ IncA / C PMLST. تشير أطوال الفروع إلى أرقام ...

ملامح الجينات والمقاومة ...

الملامح الجينية للتطور والمقاومة لبلازميدات IncA / C. تم بناء الشجرة باستخدام ...


محتويات

في النصف الثاني من القرن التاسع عشر ، اقترح عمل جريجور مندل الرائد حول وراثة الصفات في نباتات البازلاء أن "عوامل" محددة (تم تحديدها حاليًا كجينات) هي المسؤولة عن نقل السمات العضوية بين الأجيال. [4] على الرغم من الافتراض في البداية أن البروتينات تعمل كمواد وراثية ، إلا أن أفيري وماكلويد وماكارتي أسسوا الحمض النووي بعد قرن من الزمان ، والذي اكتشفه فريدريش ميشر ، باعتباره الناقل للمعلومات الجينية. [5] مهدت هذه النتائج الطريق للبحث عن الطبيعة الكيميائية للحمض النووي وقواعد ترميز المعلومات الجينية ، وأدت في النهاية إلى اقتراح البنية الحلزونية المزدوجة للحمض النووي بواسطة واطسون وكريك. [6] هذا النموذج ثلاثي الأبعاد للحمض النووي يضيء الآليات المحتملة التي يمكن من خلالها نسخ المعلومات الجينية بطريقة شبه تحفظية قبل انقسام الخلية ، وهي فرضية تم دعمها تجريبيًا لاحقًا بواسطة Meselson و Stahl باستخدام دمج النظائر لتمييز الوالدين عن المركب حديثًا الحمض النووي. [7] [8] كان العزل اللاحق لبوليميراز الحمض النووي ، الإنزيمات التي تحفز تخليق خيوط DNA الجديدة ، بواسطة كورنبيرج وزملائه الرائد في تحديد العديد من المكونات المختلفة لآلية تكرار الحمض النووي البيولوجي ، أولاً في نموذج الكائن الحي البكتيري بكتريا قولونية، ولكن لاحقًا أيضًا في أشكال الحياة حقيقية النواة. [2] [9]

إن أحد المتطلبات الأساسية لتكرار الحمض النووي هو أنه يجب أن يحدث بدقة عالية للغاية وكفاءة مرة واحدة بالضبط في كل دورة خلية لمنع تراكم التعديلات الجينية التي قد تكون لها عواقب ضارة على بقاء الخلية وحيوية الكائن الحي. [10] يمكن أن تؤدي أحداث تكرار الحمض النووي غير المكتملة أو الخاطئة أو المفاجئة إلى حدوث طفرات وتعدد الصبغيات الصبغية أو اختلال الصيغة الصبغية وتغيرات في عدد نسخ الجينات ، وكل منها يمكن أن يؤدي بدوره إلى أمراض ، بما في ذلك السرطان. [11] [12] لضمان التكرار الكامل والدقيق للجينوم بأكمله والتدفق الصحيح للمعلومات الجينية إلى خلايا النسل ، لا يتم تنظيم جميع أحداث تكرار الحمض النووي بإحكام من خلال إشارات دورة الخلية فحسب ، بل يتم تنسيقها أيضًا مع الأحداث الخلوية الأخرى مثل النسخ وإصلاح الحمض النووي. [2] [13] [14] [15] بالإضافة إلى ذلك ، عادةً ما تحتوي تسلسلات المنشأ على محتوى AT عالي في جميع الممالك ، نظرًا لأنه من الأسهل فصل تكرارات الأدينين والثايمين لأن تفاعلات التراص الأساسية ليست قوية مثل تلك الخاصة بالجوانين و السيتوزين. [16]

ينقسم تكاثر الحمض النووي إلى مراحل مختلفة. أثناء البدء ، يتم تجميع آليات النسخ المتماثل - التي يطلق عليها repisomes - على الحمض النووي بطريقة ثنائية الاتجاه. تشكل مواقع التجميع هذه مواقع البدء لأصول النسخ المتماثل أو النسخ المتماثل للحمض النووي. في مرحلة الاستطالة ، تنتقل البدائل في اتجاهين متعاكسين مع شوكات النسخ المتماثل ، وتفكك حلزون الحمض النووي وتوليف خيوط الحمض النووي للابنة التكميلية باستخدام كل من الخيوط الأبوية كقوالب. بمجرد اكتمال النسخ المتماثل ، تؤدي أحداث إنهاء محددة إلى تفكيك repisomes. طالما تم تكرار الجينوم بأكمله قبل انقسام الخلية ، فقد يفترض المرء أن موقع مواقع بدء النسخ المتماثل لا يهم بعد ، فقد ثبت أن العديد من الكائنات الحية تستخدم مناطق الجينوم المفضلة كأصول. [17] [18] من المحتمل أن تنشأ ضرورة تنظيم موقع المنشأ من الحاجة إلى تنسيق تكرار الحمض النووي مع العمليات الأخرى التي تعمل على قالب الكروماتين المشترك لتجنب انكسارات شرائط الحمض النووي وتلف الحمض النووي. [2] [12] [15] [19] [20] [21] [22] [23]

منذ أكثر من خمسة عقود ، اقترح جاكوب وبرينر وكوزين فرضية الريبلكون لشرح تنظيم تخليق الحمض النووي الصبغي في بكتريا قولونية. [24] يفترض النموذج أن مادة قابلة للانتشار ، عبر- عامل التأثير ، ما يسمى بالبادئ ، يتفاعل مع أ رابطة الدول المستقلة- فاعل عنصر الحمض النووي ، المضاعف ، لتعزيز بداية النسخ المتماثل في الأصل القريب. بمجرد ربطها بالنسخ المتماثل ، تقوم البادئات (غالبًا بمساعدة بروتينات اللودر المشترك) بإيداع الهليكازات التكرارية على الحمض النووي ، مما يؤدي لاحقًا إلى تجنيد مكونات إعادة السموم الإضافية وتجميع آلية النسخ بالكامل. وبالتالي تحدد أداة النسخ المتماثل موقع أحداث بدء النسخ المتماثل ، ويتم تعريف منطقة الكروموسوم التي يتم نسخها من أصل واحد أو حدث بدء على أنها النسخة المتماثلة. [2]

من السمات الأساسية لفرضية الريبلكون أنها تعتمد على التنظيم الإيجابي للتحكم في بداية تكرار الحمض النووي ، والذي يمكن أن يفسر العديد من الملاحظات التجريبية في الأنظمة البكتيرية والعاثية. [24] على سبيل المثال ، فإنه يفسر فشل الحمض النووي خارج الصبغيات بدون أصول في التكاثر عند إدخالها في الخلايا المضيفة. كما أنه يبرر عدم توافق البلازميد في الإشريكية القولونية ، حيث تزعزع بعض البلازميدات استقرار ميراث بعضها البعض بسبب المنافسة على نفس آلية البدء الجزيئي. [25] على النقيض من ذلك ، فشل نموذج التنظيم السلبي (مشابه لنموذج مشغل النسخ المتماثل للنسخ) في شرح النتائج المذكورة أعلاه. [24] ومع ذلك ، فإن البحث الذي أعقب اقتراح جاكوب وبرينر وكوزين لنموذج الريليكون قد اكتشف العديد من الطبقات الإضافية للتحكم في النسخ المتماثل في البكتيريا وحقيقيات النوى التي تشتمل على العناصر التنظيمية الإيجابية والسلبية ، مما يبرز كل من التعقيد وأهمية تقييد تكرار الحمض النووي الزماني والمكاني. [2] [26] [27] [28]

أثبت مفهوم المضاعف ككيان وراثي أنه مفيد للغاية في السعي لتحديد تسلسل الحمض النووي المتماثل والبروتينات البادئة في بدائيات النوى ، وإلى حد ما أيضًا في حقيقيات النوى ، على الرغم من أن تنظيم وتعقيد النسخ المتماثلة يختلفان اختلافًا كبيرًا بين مجالات الحياة. [29] [30] بينما تحتوي الجينوم البكتيري عادةً على مكرر واحد يتم تحديده من خلال عناصر تسلسل الحمض النووي المتوافقة والتي تتحكم في تكرار الكروموسوم بأكمله ، فإن معظم مكررات حقيقيات النوى - باستثناء الخميرة الناشئة - لم يتم تعريفها على مستوى الحمض النووي بدلاً من ذلك ، يبدو أنها محددة بشكل اندماجي من خلال الإشارات الهيكلية والكروماتين المحلية للحمض النووي. [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] الكروموسومات حقيقية النواة هي أيضًا أكبر بكثير من نظيراتها البكتيرية ، مما يزيد من الحاجة إلى بدء تخليق الحمض النووي من العديد في وقت واحد لضمان تكرار الجينوم بأكمله في الوقت المناسب. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحميل العديد من المروحيات التكرارية بدلاً من تنشيطها لبدء النسخ المتماثل في دورة خلية معينة. يقترح التعريف الذي يحركه السياق للنسخ المتماثلة واختيار الأصول نموذجًا متماثلًا مريحًا في أنظمة حقيقية النواة يسمح بالمرونة في برنامج تكرار الحمض النووي. [29] على الرغم من أنه يمكن التباعد ماديًا بين الناسخات والأصول على الكروموسومات ، إلا أنهما غالبًا ما يتشاركان في التوطين أو يقعان على مقربة شديدة من أجل البساطة ، وبالتالي فإننا سنشير إلى كلا العنصرين على أنهما "أصول" خلال هذه المراجعة. مجتمعة ، يمثل اكتشاف وعزل تسلسل المنشأ في الكائنات الحية المختلفة علامة بارزة نحو اكتساب فهم ميكانيكي لبدء النسخ المتماثل. بالإضافة إلى ذلك ، كان لهذه الإنجازات آثار عميقة في مجال التكنولوجيا الحيوية لتطوير ناقلات المكوك التي يمكن نشرها في الخلايا البكتيرية والخميرة والثديية. [2] [41] [42] [43]

معظم الكروموسومات البكتيرية دائرية وتحتوي على أصل واحد لتكاثر الكروموسومات (oriC). جرثومي oriC تتنوع المناطق بشكل مدهش من حيث الحجم (تتراوح من 250 نقطة أساس إلى 2 كيلو بايت) ، والتسلسل ، والتنظيم [45] [46] ومع ذلك ، فإن قدرتها على دفع بداية النسخ المتماثل تعتمد عادةً على القراءة الخاصة بالتسلسل لعناصر الحمض النووي المتفق عليها بواسطة البادئ البكتيري ، بروتين يسمى DnaA. [47] [48] [49] [50] أصول البكتيريا إما مستمرة أو ثنائية الأجزاء وتحتوي على ثلاثة عناصر وظيفية تتحكم في نشاط الأصل: تكرارات الحمض النووي المحفوظة التي تم التعرف عليها تحديدًا بواسطة DnaA (تسمى صناديق DnaA) ، وهي AT-rich عنصر فك الحمض النووي (DUE) ، ومواقع الربط للبروتينات التي تساعد في تنظيم بدء النسخ المتماثل. [17] [51] [52] تعد تفاعلات الحمض النووي الريبي مع كل من مناطق DnaA المزدوجة (ds) ومع DNA أحادي السلسلة (ss) في DUE مهمة لتنشيط الأصل ويتم توسطها بواسطة مجالات مختلفة في بروتين البادئ: عنصر ربط DNA Helix-turn-helix (HTH) و ATPase المرتبط بأنشطة خلوية مختلفة (AAA +) على التوالي. [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] في حين أن تسلسل وعدد وترتيب مربعات DnaA المرتبطة بالأصل تختلف في جميع أنحاء المملكة البكتيرية ، فإن مواقعها المحددة وتباعدها في الأنواع حاسمة ل oriC وظيفة وللتشكيل المعقد لبدء الإنتاج. [2] [45] [46] [60] [61] [62] [63] [64]

بين البكتيريا ، بكتريا قولونية هو نظام نموذجي قوي بشكل خاص لدراسة آلية التنظيم والتعرف والتفعيل لأصول النسخ المتماثل. بكتريا قولونية oriC يضم ما يقرب من

260 نقطة أساس تحتوي على أربعة أنواع من عناصر ربط البادئ التي تختلف في صلاتها لـ DnaA وتبعياتها على العامل المشترك ATP. تشكل مربعات DnaA-R1 و R2 و R4 مواقع عالية التقارب مرتبطة بمجال HTH لـ DnaA بغض النظر عن حالة البادئ المرتبطة بالنيوكليوتيدات. [47] [65] [66] [67] [68] [69] على النقيض من ذلك ، فإن مواقع I و τ و C ، التي تتخللها مواقع R ، هي مربعات DnaA منخفضة التقارب وترتبط بشكل تفضيلي مع DnaA المرتبط بـ ATP ، على الرغم من أن ADP-DnaA يمكن أن يحل محل ATP-DnaA في ظل ظروف معينة. [70] [71] [72] [63] إن ربط نطاقات HTH بعناصر التعرف على DnaA عالية ومنخفضة التقارب يعزز أوليغوميرات قليلة الدرجة المعتمدة على ATP لوحدات AAA + في DnaA في خيوط أيمن تلتف الحمض النووي المزدوج حول سطحه الخارجي ، مما يولد التواءً فوق حلزونيًا يسهل ذوبان جزيء AT-rich DUE المجاور. [53] [73] [74] [75] يتم أيضًا مساعدة فصل حبال الحمض النووي من خلال التفاعلات المباشرة لمجال AAA + ATPase الخاص بـ DnaA مع التكرارات الثلاثية ، ما يسمى DnaA-trios ، في منطقة DUE القريبة. [76] إن ارتباط مقاطع ثلاثي النوكليوتيدات أحادية الجديلة بواسطة خيوط البادئ يعمل على تمدد الحمض النووي واستقرار فقاعة البدء عن طريق منع إعادة الربط. [57] عنصر أصل DnaA-trio محفوظ في العديد من الأنواع البكتيرية ، مما يشير إلى أنه عنصر أساسي لوظيفة الأصل. [76] بعد الذوبان ، يوفر DUE موقع دخول لـ بكتريا قولونية هيليكاز التكاثر DnaB ، والتي تترسب على كل من خيوط الحمض النووي المفردة بواسطة بروتين محمل DnaC. [2]

على الرغم من أن أنشطة ربط الحمض النووي المختلفة لـ DnaA قد تمت دراستها على نطاق واسع من الناحية الكيميائية الحيوية والمتنوعة apo، أو ssDNA- ، أو dsDNA- تم تحديد الهياكل المرتبطة ، [56] [57] [58] [74] البنية الدقيقة للرتبة الأعلى DnaA-oriC بدء التجمع لا يزال غير واضح. تم اقتراح نموذجين لشرح تنظيم عناصر الأصل الأساسية و DnaA بوساطة oriC ذوبان. يفترض نموذج الحالتين وجود خيوط DnaA مستمرة تتحول من وضع ربط dsDNA (المركب المنظم) إلى وضع ربط ssDNA في DUE (مجمع الانصهار). [74] [77] على النقيض من ذلك ، في نموذج الحلقة الخلفية ، ينحني الحمض النووي بشكل حاد oriC وتثني مرة أخرى على خيوط البادئ بحيث تشتبك بروتومرات الحمض النووي DNA في نفس الوقت مع مناطق الحمض النووي المزدوجة والمفردة. [78] توضيح كيف بالضبط oriC يتم تنظيم الحمض النووي من قبل DnaA وبالتالي يبقى مهمة مهمة للدراسات المستقبلية. سوف تساعد الأفكار المتعمقة في البنية المعقدة للبدء في شرح ليس فقط كيفية ذوبان الحمض النووي الأصلي ، ولكن أيضًا كيفية تحميل الهليكاز التكراري بشكل مباشر على كل من خيوط الحمض النووي المفردة المكشوفة في DUE غير المنحلة ، وكيف يتم مساعدة هذه الأحداث من خلال تفاعلات الهليكاز مع البادئ وبروتينات محمل محددة. [2]

تشترك أصول الاستنساخ البدائي في بعض وليس كل السمات التنظيمية للبكتيريا oriC. على عكس البكتيريا ، غالبًا ما تبدأ العتائق التكاثر من أصول متعددة لكل كروموسوم (تم الإبلاغ عن واحد إلى أربعة) [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [46] ومع ذلك ، تحمل الأصول أيضًا مناطق تسلسل متخصصة تتحكم في وظيفة الأصل. [87] [88] [89] تتضمن هذه العناصر كلاً من مربعات التعرف على المنشأ الخاصة بتسلسل الحمض النووي (ORBs أو miniORBs) و DUE الغنية بـ AT المحاطة بواحدة أو عدة مناطق ORB. [85] [90] تعرض عناصر ORB درجة كبيرة من التنوع من حيث عددها وترتيبها وتسلسلها ، سواء بين الأنواع البدائية المختلفة وبين الأصول المختلفة داخل نوع واحد. [80] [85] [91] يتم تقديم درجة إضافية من التعقيد بواسطة البادئ ، Orc1 / Cdc6 في العتائق ، والتي ترتبط بمناطق ORB. عادةً ما تقوم الجينومات البدائية بتشفير العديد من نظائر Paralogs لـ Orc1 / Cdc6 التي تختلف اختلافًا كبيرًا في صلاتها لعناصر ORB المميزة والتي تساهم بشكل مختلف في أنشطة الأصل. [85] [92] [93] [94] في Sulfolobus solfataricus، على سبيل المثال ، تم تعيين ثلاثة أصول كروموسومية (oriC1 و oriC2 و oriC3) ، وقد كشفت الدراسات البيوكيميائية عن أنماط ربط معقدة للمبادرين في هذه المواقع. [85] [86] [95] [96] البادئ المشابه لـ oriC1 هو Orc1-1 ، والذي يرتبط بالعديد من ORBs في هذا الأصل. [85] [93] OriC2 و oriC3 مرتبطان بكل من Orc1-1 و Orc1-3. [85] [93] [96] على العكس من ذلك ، فإن Paralog ثالث ، Orc1-2 ، آثار أقدام في جميع الأصول الثلاثة ولكن تم افتراض أنه ينظم سلبًا بدء النسخ المتماثل. [85] [96] بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن بروتين WhiP ، وهو بادئ غير مرتبط بـ Orc1 / Cdc6 ، يربط جميع الأصول أيضًا ويقود نشاط منشأ oriC3 في Sulfolobus Islandicus. [93] [95] نظرًا لأن الأصول البدائية تحتوي غالبًا على العديد من عناصر ORB المتجاورة ، يمكن تجنيد العديد من نظائر Orc1 / Cdc6 في وقت واحد إلى الأصل وقلة القلة في بعض الحالات [94] [97] ومع ذلك ، على عكس الحمض النووي البكتيري ، لا يبدو أن تجميع البادئ ذي الترتيب الأعلى شرطًا أساسيًا عامًا لوظيفة الأصل في المجال البدائي. [2]

قدمت الدراسات الهيكلية نظرة ثاقبة حول كيفية التعرف على Orc1 / Cdc6 البدائي لعناصر ORB وإعادة تشكيل الحمض النووي الأصلي. [97] [98] Paralogs Orc1 / Cdc6 عبارة عن بروتينات ثنائية المجال وتتكون من وحدة AAA + ATPase مدمجة في طية حلزونية مجنحة على شكل C. [99] [100] [101] كشفت الهياكل المعقدة للحمض النووي لـ Orc1 / Cdc6 أن ORBs مرتبطة بمونومر Orc1 / Cdc6 على الرغم من وجود تسلسلات متكررة معكوسة داخل عناصر ORB. [97] [98] تتفاعل كل من منطقتي ATPase واللولب المجنح مع الحمض النووي المزدوج لكنهما تلامسان تسلسل تكرار ORB المتناظر بشكل غير متماثل ، والذي يوجه Orc1 / Cdc6 في اتجاه محدد عند التكرار. [97] [98] ومن المثير للاهتمام ، أن عناصر ORB أو miniORB المحيطة بـ DUE غالبًا ما يكون لها أقطاب متقابلة ، [80] [85] [94] [102] [103] والتي تتنبأ بأن المجالات الفرعية للغطاء AAA + ومجالات اللولب المجنح يتم وضع Orc1 / Cdc6 على جانبي DUE بطريقة حيث يواجه كل منهما الآخر. [97] [98] نظرًا لأن منطقتي Orc1 / Cdc6 ترتبطان بصيانة هيليكس متماثل لصيانة الكروموسوم (MCM) ، [104] [105] من المحتمل أن يكون هذا الترتيب المحدد لعناصر ORB و Orc1 / Cdc6 مهمًا لتحميل مجمعين MCM بشكل متماثل على ال DUE. [85] بشكل مفاجئ ، بينما يحدد تسلسل ORB DNA اتجاه ارتباط Orc1 / Cdc6 ، يقوم البادئ بعمل عدد قليل نسبيًا من اتصالات محددة التسلسل مع DNA. [97] [98] ومع ذلك ، فإن Orc1 / Cdc6 يضعف بشدة ويثني الحمض النووي ، مما يشير إلى أنه يعتمد على مزيج من كل من تسلسل الحمض النووي والميزات الهيكلية للحمض النووي المعتمدة على السياق للتعرف على الأصول. [97] [98] [106] بشكل ملحوظ ، يتم الحفاظ على الاقتران الأساسي في ازدواج الحمض النووي المشوه عند ربط Orc1 / Cdc6 في الهياكل البلورية ، [97] [98] بينما أسفرت الدراسات البيوكيميائية عن نتائج متناقضة حول ما إذا كانت البادئات البدائية يمكن أن تذوب الحمض النووي مشابه للحمض النووي البكتيري. [93] [94] [107] على الرغم من أن القرابة التطورية للمبتدئين البدائيين وحقيقيات النوى والمروحيات التكاثرية تشير إلى أنه من المحتمل تحميل MCM البدائية على الحمض النووي المزدوج (انظر القسم التالي) ، فإن الترتيب الزمني لذوبان المنشأ وتحميل الهليكاز ، وكذلك وبالتالي ، فإن آلية ذوبان الحمض النووي الأصلي ، في الأنظمة الأثرية ، لا تزال بحاجة إلى تحديد واضح. وبالمثل ، فإن كيفية تحميل هليكاز MCM بالضبط على الحمض النووي يحتاج إلى معالجة في الدراسات المستقبلية. [2]

يعتبر تنظيم المنشأ والمواصفات والتفعيل في حقيقيات النوى أكثر تعقيدًا مما هو عليه في المجالات البكتيرية أو البدائية وينحرف بشكل كبير عن النموذج الذي تم إنشاؤه لبدء النسخ المتماثل بدائية النواة. أحجام الجينوم الكبيرة للخلايا حقيقية النواة ، والتي تتراوح من 12 ميجا بت في البوصة S. cerevisiae حتى 3 جيجا بايت في البشر ، يستلزم أن يبدأ تكرار الحمض النووي من عدة مئات (في الخميرة الناشئة) إلى عشرات الآلاف (في البشر) من الأصول لاستكمال تكرار الحمض النووي لجميع الكروموسومات خلال كل دورة خلوية. [27] [36] باستثناء S. cerevisiae وما يتصل بها السكاروميكوتين الأنواع ، أصول حقيقية النواة لا تحتوي على عناصر تسلسل الحمض النووي المتوافق عليها ولكن موقعها يتأثر بالإشارات السياقية مثل طوبولوجيا الحمض النووي المحلي ، والسمات الهيكلية للحمض النووي ، وبيئة الكروماتين. [110] [35] [37] ومع ذلك ، لا تزال وظيفة الأصل حقيقية النواة تعتمد على معقد بروتين بادئ محفوظ لتحميل الهليكازات التكاثرية على الحمض النووي خلال المرحلتين المتأخرتين M و G1 من دورة الخلية ، وهي خطوة تُعرف باسم ترخيص المنشأ. [111] على عكس نظيراتها البكتيرية ، يتم تحميل الهليكازات التكاثرية في حقيقيات النوى على DNA مزدوج الأصل في شكل غير نشط ، سداسي عشري مزدوج ويتم تنشيط مجموعة فرعية منها فقط (10-20٪ في خلايا الثدييات) خلال أي مرحلة S معينة ، الأحداث التي يشار إليها باسم إطلاق النار الأصلي. [112] [113] [114] لذلك يتم تحديد موقع أصول حقيقية النواة النشطة على مستويين مختلفين على الأقل ، ترخيص المنشأ لتحديد جميع الأصول المحتملة ، وإطلاق النار لتحديد مجموعة فرعية تسمح بتجميع آلية النسخ وبدء تخليق الحمض النووي. تعمل الأصول المرخصة الإضافية كنسخة احتياطية ولا يتم تنشيطها إلا عند إبطاء أو توقف شوكات النسخ المتماثل القريبة ، مما يضمن إمكانية اكتمال تكرار الحمض النووي عندما تواجه الخلايا إجهاد النسخ المتماثل. [115] [116] معًا ، تجسد زيادة الأصول المرخصة والتحكم المحكم في دورة الخلية لترخيص المنشأ وإطلاق النار استراتيجيتين مهمتين لمنع التكاثر الناقص والمفرط والحفاظ على سلامة الجينومات حقيقية النواة. [2]

الدراسات المبكرة في S. cerevisiae أشار إلى أن أصول النسخ المتماثل في حقيقيات النوى يمكن التعرف عليها بطريقة خاصة بتسلسل الحمض النووي بشكل مشابه لتلك الموجودة في بدائيات النوى. في الخميرة الناشئة ، يؤدي البحث عن المُكرِّرات الجينية إلى تحديد تسلسل التكرار الذاتي (ARS) الذي يدعم بدء النسخ المتماثل الفعال للحمض النووي خارج الصبغيات. [117] [118] [119] يبلغ طول مناطق ARS هذه 100-200 نقطة أساس تقريبًا وتُظهر تنظيمًا متعدد الأجزاء ، يحتوي على عناصر A و B1 و B2 وأحيانًا B3 والتي تعد معًا ضرورية لوظيفة الأصل. [120] [121] يشمل العنصر A تسلسل توافق ARS 11 نقطة أساس محفوظ (ACS) ، [122] [123] والذي ، بالاقتران مع عنصر B1 ، يشكل موقع الربط الأساسي لمركب التعرف على الأصل غير المتجانسة (ORC) ، البادئ النسخ المتماثل حقيقية النواة. [124] [125] [126] [127] داخل ORC ، تم بناء خمس وحدات فرعية على AAA + ATPase المحفوظة والطيات الحلزونية المجنحة وتتجمع معًا في حلقة خماسية تحيط بالحمض النووي. [127] [128] [129] في الخميرة الناشئة ORC ، يتم وضع عناصر ربط الحمض النووي في نطاقات ATPase ونطاقات اللولب المجنح ، بالإضافة إلى مناطق التصحيح الأساسية المجاورة في بعض وحدات ORC الفرعية ، في المسام المركزي لحلقة ORC بحيث تساعد في التعرف على تسلسل الحمض النووي المحدد لـ ACS بطريقة تعتمد على ATP. [127] [130] على النقيض من ذلك ، فإن أدوار عنصري B2 و B3 أقل وضوحًا. تشبه منطقة B2 منطقة ACS في التسلسل وقد تم اقتراحها لتعمل كموقع ربط ثانٍ لـ ORC في ظل ظروف معينة ، أو كموقع ربط لنواة الهليكاز التكرار. [131] [132] [133] [134] [135] على العكس من ذلك ، يقوم عنصر B3 بتجنيد عامل النسخ Abf1 ، وإن لم يتم العثور على B3 في جميع أصول الخميرة الناشئة ولا يبدو أن ارتباط Abf1 ضروري تمامًا لوظيفة الأصل. [2] [120] [136] [137]

التعرف على المنشأ في حقيقيات النوى بخلاف S. cerevisiae أو أقاربه المقربين لا يتوافق مع القراءة الخاصة بالتسلسل لعناصر DNA الأصلية المحفوظة. فشلت محاولات عزل متواليات مكررة كروموسومية محددة بشكل عام في الأنواع حقيقية النواة ، إما وراثيًا أو عن طريق رسم خرائط على مستوى الجينوم لمواقع بدء الارتباط أو النسخ المتماثل ، في تحديد تسلسل إجماع واضح في الأصول. [138] [139] [140] [141] [142] [143] [144] [145] [146] [147] [148] [149] وبالتالي ، فإن تفاعلات بادئ الحمض النووي الخاصة بالتسلسل في الخميرة الناشئة تدل على وضع متخصص للتعرف على الأصل في هذا النظام بدلاً من وضع نموذجي لمواصفات الأصل عبر مجال حقيقيات النوى. ومع ذلك ، فإن تكرار الحمض النووي لا يبدأ في مواقع منفصلة لا يتم توزيعها عشوائيًا عبر جينومات حقيقية النواة ، بحجة أن الوسائل البديلة تحدد موقع الكروموسومات للأصول في هذه الأنظمة. تتضمن هذه الآليات تفاعلًا معقدًا بين إمكانية الوصول إلى الحمض النووي ، وانحراف تسلسل النوكليوتيدات (تم ربط كل من ثراء AT وجزر CpG بالأصول) ، وموضع النيوكليوسوم ، والميزات اللاجينية ، وطوبولوجيا الحمض النووي وبعض السمات الهيكلية للحمض النووي (على سبيل المثال ، زخارف G4) ، وكذلك كبروتينات تنظيمية وتداخل النسخ. [17] [18] [34] [35] [37] [150] [151] [143] [152] الأهم من ذلك ، تختلف خصائص المنشأ ليس فقط بين الأصول المختلفة في الكائن الحي وبين الأنواع ، ولكن يمكن أن يتغير بعضها أيضًا أثناء التطور وتمايز الخلايا. موضع المشيماء في ذبابة الفاكهة تشكل خلايا الجريب مثالًا راسخًا للتحكم المكاني والتنموي في أحداث البدء. تخضع هذه المنطقة لتضخيم الجينات المعتمد على تكرار الحمض النووي في مرحلة محددة أثناء تكوين البويضات وتعتمد على التنشيط المحدد في الوقت المناسب لأصول المشيمة ، والذي يتم تنظيمه بدوره بواسطة عناصر رابطة الدول المستقلة الخاصة بالأصل والعديد من العوامل البروتينية ، بما في ذلك مجمع Myb ، E2F1 و E2F2. [153] [154] [155] [156] [157] أدى هذا التحديد التجميعي والتنظيم متعدد العوامل لأصول الميتازوان إلى تعقيد تحديد السمات الموحدة التي تحدد موقع مواقع بدء النسخ عبر حقيقيات النوى بشكل عام. [2]

لتسهيل بدء النسخ المتماثل والتعرف على الأصل ، طورت تجمعات ORC من أنواع مختلفة مجالات مساعدة متخصصة يُعتقد أنها تساعد البادئ في استهداف أصول الكروموسومات أو الكروموسومات بشكل عام. على سبيل المثال ، الوحدة الفرعية Orc4 بتنسيق S. بومبي يحتوي ORC على العديد من خطاطيف AT التي تربط بشكل تفضيلي الحمض النووي الغني بـ AT ، [158] بينما في metazoan ORC ، يُعتقد أن المجال الشبيه بـ TFIIB لـ Orc6 يؤدي وظيفة مماثلة. [159] تحتوي بروتينات Metazoan Orc1 أيضًا على مجال تماثل مجاور برومو (BAH) يتفاعل مع H4K20me2-nucleosomes. [109] على وجه الخصوص في خلايا الثدييات ، تم الإبلاغ عن الحاجة إلى مثيلة H4K20 لبدء النسخ المتماثل الفعال ، ويسهل مجال Orc1-BAH ارتباط ORC بالكروموسومات والنسخ المتماثل المعتمد على أصل فيروس Epstein-Barr. [160] [161] [162] [163] [164] لذلك ، من المثير للاهتمام التكهن بأن كلا الملاحظتين مرتبطان ميكانيكيًا على الأقل في مجموعة فرعية من الميتازوا ، ولكن هذا الاحتمال يحتاج إلى مزيد من الاستكشاف في الدراسات المستقبلية. بالإضافة إلى التعرف على بعض سمات الحمض النووي أو الوراثة اللاجينية ، يرتبط ORC أيضًا بشكل مباشر أو غير مباشر بالعديد من البروتينات الشريكة التي يمكن أن تساعد في تجنيد البادئ ، بما في ذلك LRWD1 ، PHIP (أو DCAF14) ، HMGA1a ، من بين أمور أخرى. [33] [165] [166] [167] [168] [169] [170] [171] ومن المثير للاهتمام ، ذبابة الفاكهة ORC ، مثل نظيره في الخميرة الناشئة ، ينحني الحمض النووي ، وقد تم الإبلاغ عن الالتفاف الفائق السلبي لتعزيز ارتباط الحمض النووي لهذا المركب ، مما يشير إلى أن شكل الحمض النووي وقابليته للتطويع قد يؤثران على موقع مواقع ربط ORC عبر جينومات metazoan. [31] [127] [172] [173] [174] الفهم الجزيئي لكيفية دعم مناطق ارتباط الحمض النووي في ORC للقراءة للخواص الهيكلية لمزدوجة الحمض النووي في metazoans بدلاً من تسلسل DNA المحدد كما في S. cerevisiae ينتظر معلومات هيكلية عالية الدقة لتجمعات بادئ metazoan المرتبطة بالحمض النووي. وبالمثل ، ما إذا كانت العوامل اللاجينية المختلفة تساهم في تجنيد البادئ في أنظمة metazoan وكيف يتم تحديدها بشكل سيئ وهي مسألة مهمة تحتاج إلى معالجة بمزيد من التفصيل. [2]

بمجرد تجنيده في الأصول ، يدفع ORC والعوامل المشاركة له Cdc6 و Cdt1 ترسيب مجمع صيانة الكروموسوم 2-7 (Mcm2-7) على الحمض النووي. [111] [175] مثل قلب هيليكاز التكاثر البدائي ، يتم تحميل Mcm2-7 كسداسي مزدوج وجها لوجه على الحمض النووي لترخيص الأصول. [112] [113] [114] في المرحلة S ، كيناز Dbf4 المعتمد (DDK) والكيناز المعتمد على Cyclin (CDK) فسفوريلات عدة وحدات فرعية Mcm2-7 وعوامل بدء إضافية لتعزيز توظيف منشط الهليكس Cdc45 و GINS ، ذوبان الحمض النووي ، وفي النهاية تجميع ثنائي الاتجاه في مجموعة فرعية من الأصول المرخصة. [28] [176] في كل من الخميرة والميتازوان ، تكون الأصول خالية أو مستنفدة من النيوكليوسومات ، وهي خاصية مهمة لتحميل Mcm2-7 ، مما يشير إلى أن حالة الكروماتين في الأصول تنظم ليس فقط تجنيد البادئ ولكن أيضًا تحميل الهليكاز. [144] [177] [178] [179] [180] [181] تعد بيئة الكروماتين المتساهلة مهمة أيضًا لتفعيل الأصل وقد تورطت في تنظيم كل من كفاءة المنشأ وتوقيت إطلاق الأصل. عادةً ما تحتوي الأصول المتجانسة اللون على علامات كروماتين نشطة ، وتتكرر في وقت مبكر ، وتكون أكثر كفاءة من الأصول غير المتجانسة المتأخرة ، والتي تتميز على العكس من ذلك بعلامات قمعية. [27] [179] [182] ليس من المستغرب أن العديد من أجهزة إعادة تشكيل الكروماتين والإنزيمات المعدلة للكروماتين وُجد أنها مرتبطة بالأصول وبعض عوامل البدء ، [183] ​​[184] ولكن كيفية تأثير أنشطتها على أحداث بدء النسخ المختلفة تظل غامضة إلى حد كبير . بشكل ملحوظ ، تم تحديد "عناصر التحكم في النسخ المبكر" (ECREs) التي تعمل برابطة الدول المستقلة مؤخرًا للمساعدة في تنظيم توقيت النسخ والتأثير على بنية الجينوم ثلاثي الأبعاد في خلايا الثدييات. [١٨٥] يعد فهم الآليات الجزيئية والكيميائية الحيوية التي تنظم هذا التفاعل المعقد بين تنظيم الجينوم ثلاثي الأبعاد ، وبنية الكروماتين المحلية والعالية المستوى ، وبدء النسخ المتماثل موضوعًا مثيرًا لمزيد من الدراسات. [2]

لماذا تباعدت أصول النسخ المتماثل للميتازوان عن نموذج التعرف على تسلسل الحمض النووي المحدد الذي يحدد مواقع بدء النسخ المتماثل في بدائيات النوى والخميرة الناشئة؟ الملاحظات التي تشير إلى أن أصول metazoan غالبًا ما تتحد مع مناطق المروج في ذبابة الفاكهة وخلايا الثدييات وتعارضات النسخ المتماثل والنسخ الناتجة عن تصادم الآليات الجزيئية الأساسية يمكن أن تؤدي إلى تلف الحمض النووي ، مما يشير إلى أن التنسيق السليم للنسخ والتكرار مهم للحفاظ على استقرار الجينوم. [139] [141] [143] [146] [186] [20] [187] [188] تشير النتائج الحديثة أيضًا إلى دور مباشر أكثر للنسخ في التأثير على موقع الأصول ، إما عن طريق منع تحميل Mcm2-7 أو عن طريق إعادة وضع Mcm2-7 المحملة على الكروموسومات. [189] [152] يسمح ارتباط البادئ المستقل عن التسلسل (ولكن ليس بالضرورة عشوائيًا) بالحمض النووي بالمرونة في تحديد مواقع تحميل هليكاز ، جنبًا إلى جنب مع التداخل النسخي والتنوع في كفاءة التنشيط للأصول المرخصة ، من المحتمل أن يحدد موقع المنشأ ويساهم إلى التنظيم المشترك لتكرار الحمض النووي وبرامج النسخ أثناء التطور وتحولات مصير الخلية. النمذجة الحسابية لأحداث البدء في S. بومبي، بالإضافة إلى تحديد الأصول الخاصة بنوع الخلية والمنظمة من الناحية التنموية في metazoans ، تتفق مع هذه الفكرة. [140] [148] [190] [191] [192] [193] [194] [152] ومع ذلك ، توجد أيضًا درجة كبيرة من المرونة في اختيار الأصل بين الخلايا المختلفة داخل مجموعة سكانية واحدة ، [143] [149] [191] على الرغم من أن الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى عدم التجانس في استخدام الأصل لا تزال غير محددة. سيكون تعيين الأصول في الخلايا المفردة في أنظمة metazoan وربط أحداث البدء هذه مع التعبير الجيني أحادي الخلية وحالة الكروماتين أمرًا مهمًا لتوضيح ما إذا كان اختيار الأصل عشوائيًا تمامًا أو يتم التحكم فيه بطريقة محددة. [2]


تطبيقات GenBrick & # 8482

  • الجينومات الاصطناعية: تُستخدم الجينومات البكتيرية والفيروسية الاصطناعية في مجموعة متنوعة من التطبيقات ، مثل العلاج الجيني وتطوير اللقاح وتوصيل الأدوية.
  • هندسة التمثيل الغذائي: تمكن من الإنتاج الفعال للجزيئات الحيوية بكميات عالية مع تطبيقات صناعية قيمة.
  • علم الأحياء الدقيقة الصناعي: الميكروبات المهندسة بيولوجيًا لمعالجة النفايات وتوليد أشكال بديلة من الوقود.
  • اكتشاف المنتج الطبيعي: مجموعات الجينات التي يتم إدخالها في الكائنات الحية النموذجية لاكتشاف إنزيمات جديدة لتطبيقات متنوعة.
  • الأحياء الدقيقة البيئية / المعالجة الحيوية: توليد الكائنات الحية الدقيقة المهندسة بيولوجيًا لرصد وتفكيك البيئة وتطوير أساليب زراعية مستدامة.

نتائج

تحرير الجينوم الفعال باستخدام بلازميد AAV-sgRNA-hNmeCas9 الكل في واحد في الخلايا وفي الجسم الحي عن طريق الحقن الهيدروديناميكي

لقد أظهرنا مؤخرًا أن NmeCas9 المضغوط نسبيًا نشط في تحرير الجينوم في مجموعة من أنواع الخلايا (عمراني وآخرون ، مخطوطة قيد المراجعة). لاستغلال الحجم الصغير لتقويم العظام Cas9 ، أنشأنا بنية AAV الكل في واحد مع NmeCas9 المحسّن من قبل الإنسان تحت تعبير مروج الماوس U1a ومع sgRNA مدفوعًا بمروج U6 (الشكل 1 أ).

التحقق من صحة بناء AAV-sgRNA-hNmeCas9 الكل في واحد. أ التمثيل التخطيطي لمتجه rAAV واحد يعبر عن NmeCas9 المُحسَّن للكودون البشري و sgRNA الخاص به. يحيط العمود الفقري بتكرار طرفي مقلوب AAV (ITR). إشارة بولي (أ) من الأرنب بيتا غلوبين (BGH). ب رسم تخطيطى التابع جهاز كمبيوتر شخصى 9 (أعلى) و روزا 26 (قاع) جينات الفأر. أشرطة حمراء تمثل exons. تُظهر العروض المكبرة تسلسل بروتوسباكر (أحمر) بينما يتم تمييز تسلسل NmeCas9 PAM بتنسيق لون أخضر. يُشار إلى مواقع مواقع الفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل (رؤوس سهام سوداء). ج مدرج تكراري مكدس يوضح توزيع النسبة المئوية لعمليات الإدراج-المحذوفة (indels) التي تم الحصول عليها بواسطة TIDE بعد عمليات نقل البلازميد AAV-sgRNA-hNmeCas9 في استهداف خلايا Hepa1–6 جهاز كمبيوتر شخصى 9 (sgPcsk9) و روزا 26 (sgRosa26) الجينات. يتم تقديم البيانات كقيم متوسط ​​± SD من ثلاث مكررات بيولوجية. د مدرج تكراري مكدس عرض النسبة المئوية لتوزيع indels في جهاز كمبيوتر شخصى 9 في كبد الفئران C57Bl / 6 التي تم الحصول عليها بواسطة TIDE بعد الحقن الهيدروديناميكي للبلازميد AAV-sgRNA-hNmeCas9

تم تحديد موقعين في جينوم الفأر مبدئيًا لاختبار نشاط نوكلياز NmeCas9 في الجسم الحي: روزا 26 جين "الملاذ الآمن" (المستهدف بواسطة sgRosa26) والبروتين المحول سوبتيليزين / كيكسين نوع 9 (جهاز كمبيوتر شخصى 9) الجين (المستهدف بواسطة sgPcsk9) ، هدف علاجي شائع لخفض الكوليسترول المنتشر وتقليل مخاطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية (الشكل 1 ب). تم تحديد تنبؤات الجينوم بعيدًا عن الهدف لهذه الأدلة حسابيًا باستخدام حزمة الموصل الحيوي CRISPRseek 1.9.1 [40] مع N4GN3 PAMs وما يصل إلى ستة حالات عدم تطابق. كثير N4GN3 PAMS غير نشطة ، لذلك من المؤكد تقريبًا أن تؤدي معلمات البحث هذه إلى عرض شبكة أوسع من ملف التعريف الحقيقي خارج الهدف. على الرغم من الطبيعة الموسعة للبحث ، كشفت تحليلاتنا عن عدم وجود مواقع خارج الهدف بها أقل من أربعة حالات عدم تطابق في جينوم الماوس (ملف إضافي 1: الشكل S1). تم تقييم كفاءات التحرير على الهدف في هذه المواقع المستهدفة في خلايا الورم الكبدي Hepa1 - 6 بالماوس عن طريق ترانسفيكتس البلازميد وتم إجراء تقدير كمي indel عن طريق تحليل تتبع التسلسل باستخدام أداة ويب تتبع Indels عن طريق التحلل (TIDE). وجدنا & gt 25٪ قيم indel للأدلة المختارة ، ومعظمها كانت عمليات حذف (الشكل 1 ج).

لتقييم الفعالية الأولية للناقل الكل في واحد AAV-sgRNA-hNmeCas9 ، الخالي من السموم الداخلية sgPcsk9 تم إعطاء البلازميد هيدروديناميكيًا في الفئران C57Bl / 6 عن طريق حقن وريد الذيل. يمكن لهذه الطريقة توصيل DNA البلازميد إلى

40٪ من خلايا الكبد للتعبير العابر [42]. كشفت تحليلات Indel بواسطة TIDE باستخدام DNA المستخرج من أنسجة الكبد عن 5-9٪ indels بعد 10 أيام من إعطاء الناقلات (الشكل 1 د) ، مقارنة بكفاءات التحرير التي تم الحصول عليها من خلال الاختبارات المماثلة لـ SpyCas9 [43]. تشير هذه النتائج إلى أن NmeCas9 قادر على تعديل خلايا الكبد في الجسم الحي.

خروج المغلوب من 4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase ينقذ الأنماط القاتلة من الفئران Tyrosinemia الوراثية من النوع الأول

النوع الأول من التيروسين الدموي الوراثي (HT-I) هو مرض وراثي قاتل ناجم عن طفرات وراثية متنحية في الجسم. فاه الجين ، الذي يرمز إلى إنزيم fumarylacetoacetate hydroxylase (FAH). المرضى الذين يعانون من تناقص FAH لديهم مسار تقويضي التيروزين المعطل ، مما يؤدي إلى تراكم السامة فيوماريلاسيتو أسيتات وأسيتو أسيتات ، مما يتسبب في تلف الكبد والكلى [44]. على مدى العقدين الماضيين ، تمت السيطرة على المرض بواسطة 2- (2-Nitro-4-trifluoromethylbenzoyl) -1،3- cyclohexanedione (NTBC) ، والذي يثبط 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase المنبع في مسار تحلل التيروزين ، وبالتالي منع التراكم من المستقلبات السامة [45]. ومع ذلك ، يتطلب هذا العلاج إدارة النظام الغذائي والأدوية مدى الحياة وقد يتطلب في النهاية زراعة الكبد [46].

تم اختبار العديد من استراتيجيات العلاج الجيني لتصحيح الخلل فاه الجين باستخدام الطفرات الموجهة بالموقع [47] أو الإصلاح الموجه بالتماثل بواسطة كريسبر-كاس 9 [47 ، 48 ، 49]. تم الإبلاغ عن أن التعديل الناجح لـ 1/10000 فقط من خلايا الكبد في الكبد كافٍ لإنقاذ الأنماط الظاهرية لـ فاه موت / موت الفئران. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح نهج إعادة برمجة المسار الأيضي حيث تعطلت وظيفة إنزيم هيدروكسي فينيل بيروفات ديوكسيجيناز (HPD) عن طريق حذف exons 3 و 4 من Hpd الجين في الكبد [35]. يوفر لنا هذا السياق الذي نختبر فيه فعالية تحرير NmeCas9 ، من خلال الاستهداف Hpd وتقييم الإنقاذ من النمط الظاهري للمرض في فاه الفئران الطافرة [50]. لهذا الغرض ، قمنا بفحص وتحديد موقعين مستهدفين (واحد في exon 8 [sgHpd1] و exon 11 [sgHpd2]) داخل إطار القراءة المفتوح لـ Hpd (الشكل 2 أ). تسببت هذه الأدلة في متوسط ​​كفاءة indel بنسبة 10.8٪ و 9.1٪ ، على التوالي ، بواسطة انتقالات البلازميد في خلايا Hepa1-6 (ملف إضافي 1: الشكل S2).

خروج المغلوب بوساطة NmeCas9 من Hpd ينقذ النمط الظاهري المميت في الفئران Tyrosinemia من النوع الأول الوراثي. أ رسم تخطيطى التابع Hpd جين الفأر. أشرطة حمراء تمثل exons. تُظهر المشاهدات المكبرة تسلسلات بروتوسباكر (أحمر) لاستهداف exon 8 (sgHpd1) وإكسون 11 (sgHpd2). توجد تسلسلات NmeCas9 PAM بتنسيق لون أخضر ويشار إلى مواقع الكسر المزدوج التي تقطعت بهم السبل (رؤوس سهام سوداء). ب تصميم تجريبي. ثلاث مجموعات من التيروزين الدم الوراثي من النوع الأول فاه −/− يتم حقن الفئران ببرنامج تلفزيوني أو بلازميدات AAV-sgRNA-hNmeCas9 الكل في واحد sgHpd1 أو sgHpd2. ج وزن الفئران المحقونة هيدروديناميكيًا ببرنامج تلفزيوني (لون أخضر) ، AAV-sgRNA-hNmeCas9 البلازميد sgHpd1 الاستهداف Hpd اكسون 8 (أحمر) أو sgHpd2- الاستهداف Hpd اكسون 11 (أزرق) بعد انسحاب NTBC. شريط الاخطاء تمثل ثلاثة فئران لبرنامج تلفزيوني و sgHpd1 المجموعات واثنين من الفئران ل sgHpd2 مجموعة. يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± SD. د مدرج تكراري مكدس عرض النسبة المئوية لتوزيع indels في Hpd في كبد فاه −/− تم الحصول على الفئران عن طريق TIDE بعد الحقن الهيدروديناميكي لبرنامج تلفزيوني أو sgHpd1 و sgHpd2 البلازميدات. تم حصاد الكبد في نهاية انسحاب NTBC (اليوم 43)

عولجت ثلاث مجموعات من الفئران عن طريق الحقن الهيدروديناميكي إما بمحلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS) أو بإحدى المجموعتين. sgHpd1 و sgHpd2 الكل في واحد AAV-sgRNA-hNmeCas9 البلازميدات. فأر واحد في sgHpd1 مجموعة واثنين في sgHpd2 تم استبعاد المجموعة من دراسة المتابعة بسبب فشل حقن الوريد الذيل. تم أخذ الفئران من الماء المحتوي على NTBC بعد سبعة أيام من الحقن وتمت مراقبة وزنها لمدة 43 يومًا بعد الحقن (الشكل 2 ب). عانت الفئران المحقونة ببرنامج تلفزيوني من نقص شديد في الوزن (سمة مميزة لـ HT-I) وتم التضحية بها بعد أن فقدت 20٪ من وزن أجسامها (الشكل 2 ج). بشكل عام ، كل شيء sgHpd1 و sgHpd2 نجحت الفئران في الحفاظ على وزن جسمها لمدة 43 يومًا بشكل عام ولمدة 21 يومًا على الأقل بدون NTBC (الشكل 2 ج). كان لابد من استئناف العلاج NTBC لمدة 2-3 أيام للفئران التي تم تلقيها sgHpd1 والتي تلقت sgHpd2 للسماح لهم باستعادة وزن الجسم خلال الأسبوع الثالث بعد حقن البلازميد ، ربما بسبب انخفاض كفاءة التحرير الأولي ، أو إصابة الكبد بسبب الحقن الهيدروديناميكي ، أو كليهما. على العكس من ذلك ، كل الآخرين sgHpd1 و sgHpd2 حققت الفئران المعالجة indels بترددات في حدود 35-60٪ (الشكل 2 د). من المحتمل أن يعكس هذا المستوى من تعطيل الجينات ليس فقط أحداث التحرير الأولية ولكن أيضًا التوسع التنافسي لسلالات الخلايا المعدلة (بعد سحب NTBC) على حساب نظرائهم غير المحررين [46 ، 47 ، 49]. أظهرت أنسجة الكبد أن تلف الكبد أقل حدة بشكل كبير في sgHpd1- و sgHpd2- الفئران المعالجة بالمقارنة مع فاه موت / موت تم حقن الفئران ببرنامج تلفزيوني ، كما يتضح من الأعداد الأصغر لخلايا الكبد متعددة النوى مقارنة بالفئران المحقونة ببرنامج تلفزيوني (ملف إضافي 1: الشكل S3).

تحرير الجينوم في الجسم الحي بواسطة NmeCas9 الذي يتم تسليمه بواسطة ناقل rAAV

على الرغم من أن حقن البلازميد الهيدروديناميكية يمكن أن تولد indels ، فإن التطوير العلاجي سيتطلب استراتيجيات توصيل أقل توغلاً ، مثل rAAV. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تعبئة بلازميدات AAV-sgRNA-hNmeCas9 الكل في واحد في كبسولات AAV8 الكبدي المدارية لاستهدافها جهاز كمبيوتر شخصى 9 (sgPcsk9) و روزا 26 (sgRosa26) (الشكل 1 ب) [51 ، 52]. جهاز كمبيوتر شخصى 9 و روزا 26 تم استخدامها جزئيًا لتمكين توصيل NmeCas9 AAV ليتم قياسه مع نظيرته الخاصة بأطباء تقويم العظام الآخرين من Cas9 الذين تم تسليمهم بشكل مشابه واستهدافهم لنفس الموقع [18]. تم إعطاء النواقل في C57BL / 6 الفئران عبر الوريد الذيل (الشكل 3 أ). راقبنا مستوى الكوليسترول في المصل وقمنا بقياس بروتين PCSK9 وترددات indel في أنسجة الكبد بعد 25 و 50 يومًا من الحقن.

تسليم AAV لـ NmeCas9 لتحرير الجينوم في الجسم الحي. أ مخطط تجريبي لحقن وريد الذيل المتجه لـ AAV8-sgRNA-hNmeCas9 لاستهداف جهاز كمبيوتر شخصى 9 (sgPcsk9) و روزا 26 (sgRosa26) في C57Bl / 6 الفئران. تم التضحية بالفئران في سن 14 (ن = 1) أو 50 يومًا (ن = 5) بعد الحقن وحصاد أنسجة الكبد. تم جمع مصل الدم في الأيام 0 و 25 و 50 بعد الحقن لقياس مستوى الكوليسترول. ب مستويات الكوليسترول في الدم. ص يتم حساب القيم عن طريق اختبار t غير المزاوج. ج مدرج تكراري مكدس عرض النسبة المئوية لتوزيع indels في جهاز كمبيوتر شخصى 9 أو روزا 26 في كبد الفئران ، كما تم قياسه بواسطة تحليلات التسلسل العميق المستهدفة. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​± SD من خمسة فئران لكل مجموعة. د لطخة غربية تمثيلية لمكافحة PCSK9 باستخدام البروتين الكلي الذي تم جمعه من متجانسات كبد الفأر في اليوم الخمسين. تم تضمين ما مجموعه 2 نانوغرام من الماوس المؤتلف PCSK9 (r-PCSK9) كمعيار للتنقل. ال النجمة يشير إلى بروتين متفاعل متفاعل أكبر من البروتين المؤتلف الضبط

باستخدام مقايسة نقطة النهاية اللونية ، قررنا أن مستوى الكوليسترول في الدم المنتشر في الدم sgPcsk9 انخفضت الفئران بشكل ملحوظ (ص & lt 0.001) مقارنة بـ PBS و sgRosa26 الفئران في 25 و 50 يوما بعد الحقن (الشكل 3 ب). استهدفت تحليلات التسلسل العميق في جهاز كمبيوتر شخصى 9 و روزا 26 كشفت المواقع المستهدفة أنديل فعال للغاية بنسبة 35٪ و 55٪ ، على التوالي ، في 50 يومًا بعد إعطاء النواقل (الشكل 3 ج). بالإضافة إلى ذلك ، تم التخلص من فأر واحد من كل مجموعة في غضون 14 يومًا بعد الحقن وكشف عن كفاءات indel المستهدفة بنسبة 37 ٪ و 46 ٪ في جهاز كمبيوتر شخصى 9 و روزا 26، على التوالي (الشكل 3 ج). كما هو متوقع ، مستويات البروتين PCSK9 في كبد sgPcsk9 تم تخفيض الفئران بشكل كبير مقارنة بالفئران التي تم حقنها ببرنامج تلفزيوني و sgRosa26 (الشكل ثلاثي الأبعاد). يشير التحرير الفعال ، وخفض PCSK9 ، وتقليل نسبة الكوليسترول في الدم إلى النجاح في توصيل NmeCas9 ونشاطه في جهاز كمبيوتر شخصى 9 المكان.

من المعروف أن SpyCas9 الذي يتم توصيله بواسطة نواقل فيروسية يؤدي إلى استجابات مناعية للمضيف [19 ، 53]. للتحقق مما إذا كانت الفئران المحقونة بـ AAV8-sgRNA-hNmeCas9 تولد أجسامًا مضادة لـ NmeCas9 ، استخدمنا الأمصال من الحيوانات المعالجة لإجراء IgG1 ELISA. تظهر نتائجنا أن NmeCas9 يثير استجابة خلطية في هذه الحيوانات (ملف إضافي 1: الشكل S4). على الرغم من وجود استجابة مناعية ، فإن NmeCas9 الذي يتم تسليمه بواسطة rAAV يعمل بشكل كبير في الجسم الحي ، مع عدم وجود علامات واضحة على وجود تشوهات أو تلف في الكبد (ملف إضافي 1: الشكل S5).

NmeCas9 محدد للغاية في الجسم الحي

مصدر قلق كبير في تحرير الجينوم العلاجي CRISPR / Cas9 هو إمكانية إجراء تعديلات خارج الهدف. لقد وجدنا نحن وآخرون أن NmeCas9 من النوع البري هو عبارة عن منصة تحرير جينوم عالية الدقة بشكل طبيعي في خلايا الثدييات المستزرعة [32] (عمراني وآخرون ، مخطوطة قيد المراجعة). لتحديد ما إذا كان NmeCas9 يحافظ على الحد الأدنى من ملف تعريف الاستهداف في خلايا الماوس وفي الجسم الحي ، قمنا بفحص المواقع غير المستهدفة في جينوم الماوس باستخدام تحديد غير متحيز على مستوى الجينوم لـ DSBs تم تمكينه عن طريق التسلسل (GUIDE-seq) [22]. تم نقل Hepa1-6 خلايا مع sgPcsk9, sgRosa26, sgHpd1، و sgHpd2 تم إخضاع بلازميدات AAV-sgRNA-hNmeCas9 الكل في واحد والحمض النووي الجيني الناتج لتحليل GUIDE-seq. تمشيا مع ملاحظاتنا السابقة في الخلايا البشرية (عمراني وآخرون ، مخطوطة في المراجعة) ، كشف دليل تسلسل GUIDE-seq عن عدد قليل جدًا من المواقع غير المستهدفة (OT) في جينوم الفأر. تم تحديد أربعة مواقع OT محتملة ل sgPcsk9 وستة أخرى من أجل sgRosa26. لم نتمكن من اكتشاف التعديلات غير المستهدفة باستخدام sgHpd1 و sgHpd2 (الشكل 4 أ) ، مما يعزز ملاحظتنا السابقة بأن NmeCas9 غالبًا ما يكون شديد الدقة في جوهره (عمراني وآخرون ، مخطوطة قيد المراجعة).

خصائص سلسلة الجينوم GUIDE-seq لـ NmeCas9. أ عدد قراءات GUIDE-seq للمواقع المستهدفة (OnT) وغير المستهدفة (OT). ب التسلسل العميق المستهدف لقياس معدلات الآفة في كل موقع من مواقع OT في خلايا Hepa1-6. يتم تمييز حالات عدم التطابق في كل موقع من مواقع OT مع أجهزة OnT الأولية (أزرق). يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​± SD من ثلاث مكررات بيولوجية. ج التسلسل العميق المستهدف لقياس معدلات الآفة في كل موقع من مواقع OT باستخدام الحمض النووي الجيني الذي تم الحصول عليه من الفئران المحقونة باستخدام AAV8-sgRNA-hNmeCas9 الكل في واحد sgPcsk9 و sgRosa26 ويتم التضحية بها في اليوم 14 (D14) أو اليوم 50 (D50) بعد الحقن. يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± SD

العديد من مواقع OT المفترضة لـ sgPcsk9 و sgRosa26 تفتقر إلى تفضيلات NmeCas9 PAM (N4جات ، ن4جي سي تي تي ، ن4GTTT ، ن4جاكت ، ن4غاتا ، ن4GTCT و N4GACA) (الشكل 4 ب) وبالتالي قد تمثل الخلفية. للتحقق من صحة مواقع OT هذه ، أجرينا تسلسلًا عميقًا مستهدفًا باستخدام الحمض النووي الجيني من خلايا Hepa1-6. من خلال هذه القراءة الأكثر حساسية ، كان indels غير قابل للكشف فوق الخلفية في جميع مواقع OT هذه باستثناء OT1 من جهاز كمبيوتر شخصى 9، والتي كان لها تردد indel & lt 2 ٪ (الشكل 4 ب). للتحقق من الدقة العالية لـ NmeCas9 في الجسم الحي ، قمنا بقياس تكوين indel في مواقع OT هذه في الحمض النووي الجيني للكبد من AAV8-NmeCas9 المعالج ، sgPcsk9-المستهدفة و sgRosa26-استهداف الفئران. وجدنا القليل من التعديل غير المستهدف أو لا يمكن اكتشافه في كبد الفئران التي تمت التضحية بها في 14 يومًا في جميع المواقع باستثناء sgPcsk9 OT1 ، الذي أظهر كفاءة الآفة أقل من 2٪ (الشكل 4 ج). والأهم من ذلك ، ظل هذا المستوى من تحرير OT أقل من 2٪ حتى بعد 50 يومًا وظل أيضًا إما غير قابل للكشف أو منخفضًا جدًا لجميع مواقع OT المرشحة الأخرى. تشير هذه النتائج إلى أن التعبير الممتد (50 يومًا) عن NmeCas9 في الجسم الحي لا يؤثر على دقة الاستهداف (الشكل 4 ج).


محتويات

إن بلازميد Ti هو عضو في عائلة RepABC البلازميد الموجودة في Alphaproteobacteria. [3] غالبًا ما تكون هذه البلازميدات كبيرة الحجم نسبيًا ، وتتراوح من 100 كيلو بايت في الثانية إلى 2 ميجا بايت في الثانية. غالبًا ما يطلق عليها أيضًا النسخ المتماثلة ، حيث يبدأ تكرارها في موقع واحد. أفراد هذه العائلة لهم صفة مميزة ريبابك كاسيت الجينات. [4] عضو آخر بارز في هذه العائلة هو تحفيز الجذر (Ri) بلازميد الذي يحمله أ. ريزوجينيس، والذي يسبب مرضًا نباتيًا آخر يعرف باسم مرض جذور الشعر. [1]

السمة الرئيسية لبلازميدات Ti هي قدرتها على دفع إنتاج الأوبينات ، وهي مشتقات من الأحماض الأمينية المختلفة أو فوسفات السكر ، في الخلايا النباتية المضيفة. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الأوبينات كمغذيات للبكتيريا المسببة للعدوى ، والتي تقوض الأوبينات ذات الصلة باستخدام الجينات المشفرة في بلازميد Ti.

وفقًا لذلك ، تم تصنيف Ti plasmids بناءً على نوع opine الذي يتم تقويضه ، أي أنواع nopaline- أو octopine- أو mannityl ، وهي مشتقات الأحماض الأمينية ، أو نوع agrocinopine ، وهي مشتقات فوسفات السكر. [1]

تحديد A. الورم حيث أن سبب أورام المرارة في النباتات مهد الطريق لإلقاء نظرة ثاقبة على الأساس الجزيئي لمرض المرارة التاجية. [5]

ظهر أول مؤشر على وجود تأثير وراثي على الخلايا النباتية المضيفة في 1942-1943 ، حيث وُجد أن الخلايا النباتية للأورام الثانوية تفتقر إلى أي خلايا بكتيرية بداخلها. ومع ذلك ، فإن هذه الخلايا السرطانية تمتلك القدرة على إنتاج الأفيون التي يتم استقلابها بواسطة السلالة البكتيرية المعدية. [6] بشكل حاسم ، حدث إنتاج الفروع بغض النظر عن الأنواع النباتية وأحيانًا فقط داخل أنسجة المرارة التاجية ، مما يشير إلى أن البكتيريا قد نقلت بعض المواد الجينية إلى الخلايا النباتية المضيفة من أجل السماح بتوليف الأفيون. [5]

ومع ذلك ، كيف وإلى أي مدى حدث نقل الحمض النووي لا يزال سؤالا مفتوحا. مضيفا A. الورم الحمض النووي وحده لا يسبب أورامًا في النباتات ، [7] بينما كان قليلًا جدًا A. الورم تم العثور على الحمض النووي ليتم دمجه في جينوم الخلية النباتية المضيفة. [8] إضافة ديوكسي ريبونوكلياز (DNases) لتحلل الحمض النووي فشل أيضا في منع تكوين ونمو أورام النبات. [9] هذه تشير إلى أن القليل ، إن وجد ، من A. الورم يتم نقل الحمض النووي إلى الخلية النباتية المضيفة لإحداث المرض ، وإذا تم بالفعل نقل الحمض النووي من البكتيريا إلى النبات ، فيجب أن يحدث بطريقة محمية.

بعد ذلك ، تم العثور على السلالات البكتيرية الورمية لتكون قادرة على تحويل البكتيريا غير المسببة للأمراض إلى مسببات الأمراض من خلال عملية الاقتران ، حيث تم نقل الجينات المسؤولة عن الفوعة إلى الخلايا غير المسببة للأمراض. [10] تم دعم دور البلازميد في هذه القدرة المسببة للأمراض بشكل أكبر عندما تم العثور على البلازميدات الكبيرة فقط في البكتيريا المسببة للأمراض ولكن ليس في البكتيريا عديمة الفوعة. [11] في النهاية ، تم الكشف عن أجزاء من البلازميدات البكتيرية في الخلايا النباتية المضيفة ، مما يؤكد أن هذه هي المادة الوراثية المسؤولة عن التأثير الجيني للعدوى. [12]

مع تحديد Ti plasmid ، تم إجراء العديد من الدراسات لتحديد خصائص Ti plasmid وكيف يتم نقل المادة الوراثية من أجروباكتريوم لمضيف النبات. تتضمن بعض المعالم المبكرة البارزة في دراسات بلازميدات Ti رسم خرائط لبلازميد Ti في عام 1978 ودراسة تشابه التسلسل بين بلازميدات Ti المختلفة في عام 1981. [13] [14]

بين 1980-2000 ، تم أيضًا متابعة توصيف منطقة T-DNA ومنطقة "فير". حددت الدراسات التي أجريت على منطقة T-DNA عملية نقلها وتحديد الجينات التي تسمح بتوليف الهرمونات النباتية والأفينات. [15] بشكل منفصل ، كان العمل المبكر يهدف إلى تحديد وظائف الجينات المشفرة في منطقة "فير" - تم تصنيفها على نطاق واسع إلى تلك التي تسمح بالتفاعلات البكتيرية مع المضيف وتلك التي مكنت توصيل T-DNA. [2]

يعتمد تكرار وتقسيم وصيانة بلازميد Ti على ريبابك كاسيت الجينات ، والذي يتكون بشكل أساسي من ثلاثة جينات: ريبا, ريب و repC. ريبا و ريب كل ترميز للبروتينات المشاركة في تقسيم البلازميد ، بينما repC يشفر بادئ النسخ المتماثل. [1] يتم التعبير عن هذه الجينات من 4 محفزات مختلفة موجودة في أعلى المنبع ريبا. ريب يشفر RNA صغير مضاد المعنى ويقع بين ريب و repC. [4] بالإضافة إلى ذلك ، هناك موقع التقسيم (الفصل) وأصل التكرار (oriV) موجودة داخل ريبابك كاسيت. [1]

النسخ المتماثل لتحرير Ti plasmid

يتم إجراء نسخ متماثل لبلازميد Ti بواسطة بروتين بادئ RepC (P05684) ، والذي يمتلك مجالين من البروتين: مجال N- طرفي (NTD) الذي يرتبط بالحمض النووي والمجال الطرفي C (CTD). أظهرت التحليلات الطفرية أنه بدون بروتين RepC وظيفي ، فإن بلازميد Ti غير قادر على التكاثر. [4] وفي الوقت نفسه ، فإن oriV يبلغ طول التسلسل حوالي 150 نيوكليوتيد ويوجد داخل repC الجين. [3] أظهرت التجارب المعملية أن بروتين RepC يرتبط بهذه المنطقة ، مما يشير إلى دوره كأصل للتكاثر. [16] لذلك ، بينما لم يتم وصف العملية الكاملة وراء تكرار بلازميد Ti بالكامل ، فمن المحتمل أن تعتمد الخطوة الأولية للنسخ المتماثل على التعبير عن RepC وربطه بـ oriV. من الجدير بالذكر أن بروتين RepC يعمل فقط في رابطة الدول المستقلة, where it only drives the replication of the plasmid it is encoded in and not any other plasmid also present in the bacterial cell. [16]

Partitioning of the Ti plasmid Edit

Components involved in the RepA/RepB partitioning system of Ti plasmids [1]
مكون وظيفة
RepA (ParA), P05682 A weak ATPase that negatively autoregulates the expression of the repABC cassette and can form filaments to aid in the partitioning of the plasmid during cell division
RepB (ParB), P05683 A DNA binding protein that serves as an adaptor between RepA and the الفصل موقع
الفصل The palindromic binding site for the ParB protein consensus GTTNNCNGCNGNNAAC

The partitioning system of the Ti plasmid is similar to the ParA/ParB system used in other plasmids and bacterial chromosomes and is thought to act in the same way. [17] Mutations in either of the proteins RepA or RepB have resulted in a decrease in plasmid stability, indicating their role and importance in plasmid partitioning. [4] The ability of RepA to form filaments allows it to create a physical bridge along which DNA can be pulled to opposite poles of a dividing cell. Meanwhile, the RepB protein can bind specifically to the الفصل sequence, forming a complex with DNA that can be recognized by RepA. [1] [4] This system is particularly important for the proper partitioning of the Ti plasmid, as the plasmid is only present in few copy numbers in the bacterial cell.

Maintenance of the Ti plasmid Edit

The Ti plasmid is maintained at low copy numbers within a bacterial cell. This is partly achieved by influencing the expression of the replication initiator RepC. [1] When bound to ADP, RepA is activated to work with RepB, acting as a negative regulator of the repABC cassette. [3] The levels of RepC is therefore kept low within a cell, preventing too many rounds of replication from occurring during each cell division cycle. Furthermore, there is a small RNA known as RepE encoded between repB و repC that lowers the expression of repC. [18] RepE is complementary to RepC and will bind with the repC mRNA to form a double-stranded molecule. This can then block the translational production of the RepC protein. [18]

Separately, the expression of the repABC cassette and hence the copy number of the Ti plasmid is also influenced via a quorum sensing system in أجروباكتريوم. [4] Quorum sensing systems respond to bacterial population densities by sensing a molecule, known as an autoinducer, that is produced by the bacterial cells at low levels and would build up to a threshold level when there is a high density of bacteria present. [18] In this case, the autoinducer is the N-3-oxooctanoyl-L-homoserine lactone (3-O-C8-AHL) molecule, which is sensed by a regulator known as TraR. [4] When activated, TraR will bind to regions known as ترا boxes in the repABC gene cassette's promoter regions to drive expression. Therefore, a high level of population density increases the number of plasmids present within each bacterial cell, likely to support pathogenesis in the plant host. [4]

Virulence operon Edit

The expression of the فير region is usually repressed under normal conditions, and only becomes activated when the bacteria senses plant-derived signals from wound sites. This activation is necessary for the production of Vir proteins and the transfer of DNA and proteins into host plant cells. [1]

VirA and VirG form a two-component regulatory system within أجروباكتريوم. [19] This is a type of sensing and signalling system found commonly in bacteria in this case, they act to sense plant-derived signals to drive the expression of the فير منطقة. During the sensing, VirA, a histidine sensor kinase, will become phosphorylated before passing on this phosphate group to the response regulator VirG. [20] The activated response regulator VirG can then bind to a region of DNA known as the فير box, located upstream of each فير promoter, to activate the expression of the فير منطقة. [1] [19] One possible downstream functions of the sensing mediated by VirA and VirG is the directional movement, or chemotaxis, of the bacteria towards plant-derived signals this allows the أجروباكتريوم to move towards the wound site in plants. [21] Furthermore, with the induction of the فير region, the transfer of T-DNA can be mediated by the Vir proteins. [22]

ال virB operon is the largest operon in the فير region, encoding for 11 VirB proteins involved in the transfer process of T-DNA and bacterial proteins into host plant cells (see transfer apparatus below). [23] [24]

ال virC operon encodes for two proteins: VirC1 and VirC2. These proteins influence the pathogenesis of the أجروباكتريوم towards different plant hosts, and mutations can reduce but not remove the virulence of the bacteria. [25] Both the virC و virD operons can be repressed by a chromosomally encoded protein known as Ros. [26] [27] Ros binds to a region of DNA that overlaps with the binding site of the VirG regulator, and therefore competes with VirG to control their expression levels. [26] [27] Functionally, VirC1 and VirC2 promote the assembly of a relaxosome complex during the conjugative transfer of T-DNA from the bacteria to the host plant cell. [28] This is an energy-dependent process mediated via their NTPase activity, and occurs as they bind to a region of DNA known as سرف. [28] As a result, they act to increase the amount of T-DNA strands produced. Following the production of the DNA strand to be transferred (transfer strand, T-strand), the VirC proteins can also help to direct the transfer strand to the transfer apparatus. [28]

ال virD operon encodes for 4 proteins: VirD1-D4. [29] VirD1 and VirD2 are involved in the processing of T-DNA during conjugation to produce the T-strand this is the single-stranded DNA molecule that is transported to the host plant cell (see transfer apparatus below). [30] During the processing, VirD1 will act as a topoisomerase to unwind the DNA strands. [30] VirD2, a relaxase, will then nick one of the DNA strands and remain bound to the DNA as it is transferred to the recipient cell. [31] [32] Within the recipient cell, VirD2 will also work together with VirE2 to direct the transferred DNA to the recipient cell's nucleus. There are suggestions that VirD2 may be phosphorylated and dephosphorylated by different proteins, affecting its ability to deliver DNA. [33] Conversely, little is known about VirD3, and mutational analyses have not provided any support for its role in the virulence of أجروباكتريوم. [34] Finally, VirD4 is a crucial part of the conjugation process, serving as a coupling factor that recognizes and transfers the T-strand to the transport channel. [35]

ال virE operon encodes for 2 proteins: VirE1 and VirE2. [36] VirE2 is an effector protein translocated together with the T-strand into host plant cells. There, it binds to the T-strand to direct its delivery to the nucleus of the host plant cell. [37] [38] Part of this activity involves the presence of nuclear localization sequences within the protein, which marks the protein and the associated DNA for entry into the nucleus. It also protects the T-strand from nuclease attack. [39] There is some speculation regarding the role of VirE2 as a protein channel, allowing DNA to move through the plant cytoplasmic membrane. [40] On the other hand, VirE1 may be involved in promoting the transfer of the VirE2 protein into the host plant cell. [41] It binds to the ssDNA-binding domain of VirE2, therefore preventing the VirE2 protein from prematurely binding to the T-strand within the bacterial cell. [42]

virF is a host specificity factor found in some but not all types of Ti plasmids for example, octopine-type Ti plasmids possess virF but nopaline-types do not. [43] [44] The ability of A. الورم to induce crown gall tumours in certain plant species but not others has been attributed to the presence or absence of this virF الجين. [43] [44]

ال virH operon encodes for 2 proteins: VirH1 and VirH2. [45] A bioinformatics study of the amino acid sequences of the VirH protein showed similarities between them and a superfamily of proteins known as cytochrome P450 enzymes. [46] VirH2 was then discovered to metabolize certain phenolic compounds detected by VirA. [45]

Transfer DNA (T-DNA) Edit

The T-DNA of أجروباكتريوم is approximately 15-20 kbp in length and will become integrated into the host plant genome upon its transfer via a process known as recombination. This process utilizes preexisting gaps in the host plant cell's genome to allow the T-DNA to pair with short sequences in the genome, priming the process of DNA ligation, where the T-DNA is permanently joint to the plant genome. [37] The T-DNA region is flanked at both ends by 24bp sequences.

Within the host plant cell's genome, the T-DNA of أجروباكتريوم is expressed to produced two main groups of proteins. [1] One group is responsible for the production of plant growth hormones. As these hormones are produced, there will be an increase in the rate of cell division and therefore the formation of crown gall tumors. [47] The second group of proteins are responsible for driving the synthesis of opines in the host plant cells. The specific opines produced depends on the type of the Ti plasmid but not on the plant host. These opines cannot be utilized by the plant host, and will instead be exported out of the plant cell where it can be taken up by the أجروباكتريوم cells. The bacteria possess genes in other regions of the Ti plasmid that allows the catabolism of opines. [1]

Transfer apparatus Edit

Transfer apparatuses encoded within the Ti plasmid have to achieve two objectives: allow the conjugative transfer of the Ti plasmid between bacteria and allow the delivery of the T-DNA and certain effector proteins into host plant cells. These are achieved by the Tra/Trb system and the VirB/VirD4 system respectively, which are members of the type IV secretion system (T4SS). [47]

For the Ti plasmid and T-DNA to be transferred via conjugation, they must first be processed by different proteins, such as the relaxase enzyme (TraA/VirD2) and the DNA transfer and replication (Dtr) proteins. Together, these proteins will recognize and bind to a region known as the origin of transfer (oriT) in the Ti plasmid to form the relaxosome complex. For the T-DNA, a nick will be created at the T-DNA's border sequence, and the nicked T-strand will be transported to the cell membrane, where the rest of the transfer machinery is present. [31]

Within the VirB/VirD4 system, the VirD2 relaxase is aided by the accessory factors VirD1, VirC1 and VirC2 while it processes the DNA substrate. [48] Furthermore, the VirD2 relaxase and the VirC proteins will contribute to the delivery of the DNA strand to the VirD4 receptor at the cell membrane. [28] This receptor is an essential component of T4SSs, and is thought to energize and mediate the transfer of the DNA into the translocation channel between two cells. [49] The table below summarizes the proteins encoded in the virB operon that makes up the translocation channel of the VirB/VirD4 system. [1]

Protein(s) وظيفة
VirB4, VirB11 ATPases that provide the energy for DNA transfer [50] [51]
VirB3, VirB6, VirB8 Subunits of a putative inner membrane translocase [50] [52] [53]
VirB7, VirB9, VirB10 Forms a core complex that stabilizes the channel subunits [50] [54]
VirB2 The major pilin subunit of the conjugative pilus [50]
VirB1, VirB5 Minor components of the conjugative pilus [55] [56]

The ability of أجروباكتريوم to deliver DNA into plant cells opened new doors for plant genome engineering, allowing the production of genetically modified plants (transgenic plants). [57] Proteins involved in mediating the transfer of T-DNA will first recognize the border sequences of the T-DNA region. Therefore, it is possible for scientists to use T-DNA border sequences to flank any desired sequence of interest - such a product can then be inserted into a plasmid and introduced into أجروباكتريوم cells. [58] There, the border sequences will be recognized by the transfer apparatus of A. الورم and delivered in a standard manner into the target plant cell. [1] Moreover, by leaving behind only the border sequences of the T-DNA, the resulting product will edit the plant genome without causing any tumours in plants. [59] This method has been used to modify several crop plants, including rice, [60] barley [61] and wheat. [62] Further work have since extended the targets of A. الورم to include fungi and human cell lines. [63] [64]


شاهد الفيديو: What is a Plasmid? - Plasmids 101 (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Dazilkree

    أجب على طلبك - وليس المشكلة.

  2. Zack

    أعتقد أنك مخطئ. يمكنني الدفاع عن موقفي. أرسل لي بريدًا إلكترونيًا في PM ، سنتحدث.

  3. Tarr

    السؤال الترفيهي للغاية

  4. Kak

    يمكنك التحقق :)

  5. Anzety

    مساء الخير . ؛) اليوم على قناة Sport TV ، سيتم عرض مباريات UEFA - لا تفوتها!

  6. Shaker

    أنا آسف ، لأنني قاطعتك ، أرغب في تقديم قرار آخر.



اكتب رسالة