معلومة

3.6.5: حويصلات الغاز - علم الأحياء

3.6.5: حويصلات الغاز - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أهداف التعلم

  • ناقش دور الحويصلة الغازية في البقاء على قيد الحياة.

الحويصلات الغازية عبارة عن هياكل مغزلية الشكل توجد في بعض البكتيريا العوالقية التي توفر الطفو لهذه الخلايا عن طريق تقليل الكثافة الإجمالية للخلايا. هناك حاجة إلى الطفو الإيجابي للحفاظ على الخلايا في الروافد العليا لعمود الماء ، حتى تتمكن من الاستمرار في إجراء عملية التمثيل الضوئي. وهي مكونة من قشرة بروتينية ذات سطح داخلي شديد الكراهية للماء ، مما يجعلها غير منفذة للماء (وتمنع بخار الماء من التكاثف في الداخل) ، ولكنها قابلة للاختراق لمعظم الغازات. نظرًا لأن حويصلة الغاز عبارة عن أسطوانة مجوفة ، فإنها عرضة للانهيار عندما يصبح الضغط المحيط بها كبيرًا جدًا.

لقد صقل الانتقاء الطبيعي بنية حويصلة الغاز لزيادة مقاومتها للالتواء من خلال تضمين بروتين تقوية خارجي ، GvpC ، مثل الخيط الأخضر في خرطوم مضفر. هناك علاقة بسيطة بين قطر حويصلة الغاز والضغط الذي ستنهار عنده - فكلما اتسعت حويصلة الغاز كلما أصبحت أضعف. ومع ذلك ، فإن حويصلات الغاز الأوسع نطاقًا أكثر كفاءة. أنها توفر المزيد من الطفو لكل وحدة من البروتين من الحويصلات الغازية الضيقة. تنتج الأنواع المختلفة حويصلات غازية بأقطار مختلفة ، مما يسمح لها باستعمار أعماق مختلفة من عمود الماء (أنواع سريعة النمو وذات قدرة تنافسية عالية مع حويصلات غازية واسعة في معظم الطبقات العليا ؛ بطيئة النمو ، ومتكيفة مع الظلام ، والأنواع ذات الحويصلات الغازية الضيقة القوية في الطبقات العميقة). سيساعد قطر حويصلة الغاز أيضًا في تحديد الأنواع التي تعيش في المسطحات المائية المختلفة. ستعرض البحيرات العميقة التي تختلط في فصل الشتاء الخلايا للضغط الهيدروستاتيكي الناتج عن عمود الماء الكامل. سيختار هذا الأنواع ذات حويصلات غازية أضيق وأقوى.

النقاط الرئيسية

  • وهي مكونة من قشرة بروتينية ذات سطح داخلي شديد الكراهية للماء ، مما يجعلها غير منفذة للماء (وتوقف بخار الماء من التكثف من الداخل) ، ولكنها قابلة للاختراق لمعظم الغازات.
  • قام الانتقاء الطبيعي بضبط بنية حويصلة الغاز لزيادة مقاومتها للانحناء إلى أقصى حد ، بما في ذلك بروتين تقوية خارجي ، GvpC ، مثل الخيط الأخضر في خرطوم مضفر.
  • سيساعد قطر حويصلة الغاز أيضًا في تحديد الأنواع التي تعيش في المسطحات المائية المختلفة.

3.6.5: حويصلات الغاز - علم الأحياء

يتم توفير جميع المقالات المنشورة بواسطة MDPI على الفور في جميع أنحاء العالم بموجب ترخيص وصول مفتوح. لا يلزم الحصول على إذن خاص لإعادة استخدام كل أو جزء من المقالة المنشورة بواسطة MDPI ، بما في ذلك الأشكال والجداول. بالنسبة للمقالات المنشورة بموجب ترخيص Creative Common CC BY ذي الوصول المفتوح ، يمكن إعادة استخدام أي جزء من المقالة دون إذن بشرط الاستشهاد بالمقال الأصلي بوضوح.

تمثل الأوراق الرئيسية أكثر الأبحاث تقدمًا مع إمكانات كبيرة للتأثير الكبير في هذا المجال. يتم تقديم الأوراق الرئيسية بناءً على دعوة فردية أو توصية من قبل المحررين العلميين وتخضع لمراجعة الأقران قبل النشر.

يمكن أن تكون ورقة الميزات إما مقالة بحثية أصلية ، أو دراسة بحثية جديدة جوهرية غالبًا ما تتضمن العديد من التقنيات أو المناهج ، أو ورقة مراجعة شاملة مع تحديثات موجزة ودقيقة عن آخر التقدم في المجال الذي يراجع بشكل منهجي التطورات الأكثر إثارة في العلم. المؤلفات. يوفر هذا النوع من الأوراق نظرة عامة على الاتجاهات المستقبلية للبحث أو التطبيقات الممكنة.

تستند مقالات اختيار المحرر على توصيات المحررين العلميين لمجلات MDPI من جميع أنحاء العالم. يختار المحررون عددًا صغيرًا من المقالات المنشورة مؤخرًا في المجلة ويعتقدون أنها ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص للمؤلفين أو مهمة في هذا المجال. الهدف هو تقديم لمحة سريعة عن بعض الأعمال الأكثر إثارة المنشورة في مجالات البحث المختلفة بالمجلة.


تحدث حويصلات الغاز بشكل أساسي في الكائنات المائية حيث يتم استخدامها لتعديل طفو الخلية وتعديل موضع الخلية في عمود الماء بحيث يمكن تحديد موقعها على النحو الأمثل لعملية التمثيل الضوئي أو الانتقال إلى مواقع بها أكسجين أكثر أو أقل. [1] الكائنات الحية التي يمكن أن تطفو على السطح البيني بين الهواء والسائل تنافس الأيروبونات الأخرى التي لا يمكنها الارتفاع في عمود الماء ، من خلال استخدام الأكسجين في الطبقة العليا.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الحويصلات الغازية للحفاظ على الملوحة المثلى عن طريق وضع الكائن الحي في مواقع محددة في جسم طبقي من الماء لمنع الصدمة التناضحية. [2] سوف تتسبب التركيزات العالية من المذاب في سحب الماء من الخلية عن طريق التناضح ، مما يتسبب في تحلل الخلية. تعد القدرة على تصنيع الحويصلات الغازية إحدى الاستراتيجيات العديدة التي تسمح للكائنات المحبة للملوحة بتحمل البيئات التي تحتوي على نسبة عالية من الملح.

من المحتمل أن تكون الحويصلات الغازية واحدة من أقدم آليات الحركة بين الكائنات المجهرية نظرًا لحقيقة أنها الشكل الأكثر انتشارًا للحركة المحفوظة داخل جينوم بدائيات النوى ، والتي تطور بعضها منذ حوالي 3 مليارات سنة. [3] [4] تتطلب أنماط الحركة النشطة مثل حركة السياط آلية يمكنها تحويل الطاقة الكيميائية إلى طاقة ميكانيكية ، وبالتالي فهي أكثر تعقيدًا وستتطور لاحقًا. يتم أيضًا حفظ وظائف حويصلات الغاز إلى حد كبير بين الأنواع ، على الرغم من أن طريقة التنظيم قد تختلف ، مما يشير إلى أهمية حويصلات الغاز كشكل من أشكال الحركة. في كائن حي معين مثل البكتيريا المعوية سيراتيا ص. يتم تنظيم الحركة القائمة على الأسواط وإنتاج الحويصلة الغازية بشكل معاكس بواسطة بروتين واحد ملزم للحمض النووي الريبي ، RsmA ، مما يشير إلى أنماط بديلة للتكيف البيئي والتي قد تتطور إلى أصناف مختلفة من خلال تنظيم التطور بين الحركة والطفو. [5]

على الرغم من وجود أدلة تشير إلى التطور المبكر لحويصلات الغاز ، فإن نقل البلازميد بمثابة تفسير بديل لطبيعة العضية المنتشرة والمحافظة عليها. [4] انقسام البلازميد في هالوباكتيريوم هالوبيوم أدى إلى فقدان القدرة على التركيب الحيوي لحويصلات الغاز ، مما يشير إلى إمكانية نقل الجينات الأفقي ، مما قد يؤدي إلى نقل القدرة على إنتاج حويصلات غازية بين سلالات مختلفة من البكتيريا. [6]

D) مقتبس من Ramsay et al. (2011) بإذن من الناشر.

تكون الحويصلات الغازية عمومًا على شكل ليموني أو أسطواني ، وهي أنابيب مجوفة من البروتين مع أغطية مخروطية الشكل على كلا الطرفين. تختلف الحويصلات في معظم أقطارها. يمكن للحويصلات الأكبر أن تحمل المزيد من الهواء وتستخدم بروتينًا أقل مما يجعلها الأكثر اقتصادا من حيث استخدام الموارد ، ومع ذلك ، كلما كانت الحويصلة الأكبر حجمًا أضعف هيكليًا تتعرض للضغط وقل الضغط المطلوب قبل أن تنهار الحويصلة. تطورت الكائنات الحية لتكون الأكثر كفاءة في استخدام البروتين وتستخدم أكبر قطر حويصلة تتحمل الضغط الذي يمكن أن يتعرض له الكائن الحي. من أجل أن يؤثر الانتقاء الطبيعي على الحويصلات الغازية ، يجب التحكم في قطر الحويصلات بواسطة علم الوراثة. على الرغم من وجود الجينات المشفرة لحويصلات الغاز في العديد من أنواع هالواركيا ، إلا أن أنواعًا قليلة فقط هي التي تنتجها. تم استنساخ الجين الأول لحويصلة الغاز Haloarchaeal ، GvpA من Halobacterium sp. NRC-1. [7] يشارك 14 جينًا في تكوين الحويصلات الغازية في هالواركيا. [8]

تم التعرف على أول جين حويصلة غازية ، GvpA في كالوثريكس. [9] يوجد على الأقل نوعان من البروتينات التي تتكون منها حويصلة غاز البكتيريا الزرقاء: GvpA و GvpC. يشكل GvpA أضلاعًا وجزءًا كبيرًا من الكتلة (تصل إلى 90٪) من الهيكل الرئيسي. GvpA كاره للماء بشدة وقد يكون أحد أكثر البروتينات المعروفة كارهة للماء. GvpC محبة للماء وتساعد على استقرار الهيكل عن طريق التضمينات الدورية في أضلاع GvpA. يمكن غسل GvpC من الحويصلة وبالتالي انخفاض في قوة الحويصلة. قد يتراوح سمك جدار الحويصلة من 1.8 إلى 2.8 نانومتر. يظهر الهيكل المضلع للحويصلة على الأسطح الداخلية والخارجية مع تباعد من 4-5 نانومتر بين الأضلاع. قد يكون طول الحويصلات 100-1400 نانومتر وقطرها 45-120 نانومتر.

تكون أحجام حويصلات الغاز داخل الأنواع متجانسة نسبيًا مع انحراف معياري قدره ± 4٪.

د) مقتبس من Pfeifer (2012) و (E) من Shapiro et al. (2014) بإذن من الناشر.

يبدو أن الحويصلات الغازية تبدأ في الوجود على شكل هياكل صغيرة ثنائية المخروط (مخروطان مع القواعد المسطحة مرتبطة ببعضها البعض) والتي تتوسع إلى القطر المحدد بدلاً من النمو وتوسع طولها. من غير المعروف بالضبط ما الذي يتحكم في القطر ولكن قد يكون جزيء يتداخل مع GvpA أو قد يتغير شكل GvpA.

يتم تنظيم تكوين الحويصلات الغازية بواسطة بروتينين Gvp: GvpD ، الذي يقمع التعبير عن بروتينات GvpA و GvpC ، و GvpE الذي يحفز التعبير. [10] تؤثر العوامل البيئية خارج الخلية أيضًا على تكوين الحويصلة ، إما عن طريق تنظيم إنتاج بروتين Gvp أو عن طريق الإخلال المباشر ببنية الحويصلة. [8] [11]

تحرير شدة الضوء

تم العثور على شدة الضوء لتؤثر على إنتاج الحويصلات الغازية وصيانتها بشكل مختلف بين البكتيريا والعتائق المختلفة. ل أنابينا فلوس أكواتؤدي شدة الضوء المرتفعة إلى انهيار الحويصلة نتيجة زيادة ضغط التورغ وتراكم أكبر لمنتجات التمثيل الضوئي. في البكتيريا الزرقاء ، يتناقص إنتاج الحويصلة في شدة الضوء العالية بسبب تعرض سطح البكتيريا للأشعة فوق البنفسجية ، مما قد يؤدي إلى إتلاف الجينوم البكتيري. [11]

تحرير الكربوهيدرات

تراكم الجلوكوز أو المالتوز أو السكروز فيه هالوفيراكس ميديتيراني و هالوفيراكس فولكاني تم العثور على تثبيط التعبير عن بروتينات GvpA ، وبالتالي ، انخفاض في إنتاج حويصلة الغاز. ومع ذلك ، حدث هذا فقط في مرحلة النمو الأسي المبكرة للخلية. يمكن أيضًا تحفيز تكوين الحويصلة في تقليل تركيزات الجلوكوز خارج الخلية. [12]

تحرير الأكسجين

وجد أن نقص الأكسجين يؤثر سلبًا على تكوين حويصلة الغاز في العتائق الملحية. هالوباكتيريوم ساليناروم تنتج القليل من الحويصلات أو لا تنتج أي حويصلات في ظل الظروف اللاهوائية بسبب انخفاض تخليق ترميز نصوص الرنا المرسال لبروتينات Gvp. H. البحر الأبيض المتوسط و H. volcanii لا تنتج أي حويصلات في ظل ظروف نقص الأكسجين بسبب انخفاض في ترميز النصوص المركبة لـ GvpA والنصوص المقطوعة التي تعبر عن GvpD. [12]

تحرير الأس الهيدروجيني

تم العثور على زيادة مستويات الأس الهيدروجيني خارج الخلية لزيادة تكوين الحويصلة في أنواع Microcytis. تحت زيادة الرقم الهيدروجيني ، ومستويات gvpA و ملف gvpC تزداد النصوص ، مما يسمح بمزيد من التعرض للريبوسومات للتعبير ويؤدي إلى تنظيم بروتينات Gvp. قد يُعزى ذلك إلى زيادة نسخ هذه الجينات ، أو انخفاض اضمحلال النصوص المركبة أو زيادة ثبات الرنا المرسال. [13]

تحرير الإشعاع بالموجات فوق الصوتية

تم العثور على الإشعاع بالموجات فوق الصوتية ، عند ترددات معينة ، لكسر حويصلات الغاز في البكتيريا الزرقاء سبيرولينا بلاتنسيس، ومنعهم من التفتح. [14]

تحرير النصاب

في البكتيريا المعوية Serratia sp. سلالة ATCC39006، لا يتم إنتاج حويصلة الغاز إلا عندما يكون هناك تركيز كافٍ لجزيء الإشارة N-acyl homoserine lactone. في هذه الحالة ، يعمل جزيء استشعار النصاب ، N-acyl homoserine lactone كمحفز لتطور العضية. [5] هذا مفيد للكائن الحي حيث يتم استخدام موارد إنتاج حويصلات الغاز فقط عندما يكون هناك حد للأكسجين ناتج عن زيادة عدد البكتيريا.

جين حويصلة الغاز gvpC من هالوباكتيريوم س. يستخدم كنظام توصيل لدراسات اللقاح.

عدة خصائص للبروتين المشفر بواسطة جين الحويصلة الغازية gvpC تسمح باستخدامه كحامل ومساعد لمولدات المضادات: فهو مستقر ومقاوم للتدهور البيولوجي ويتحمل درجات حرارة عالية نسبيًا (حتى 50 درجة مئوية) وغير مُمْرِض للإنسان. [15] تم إعادة تجميع العديد من المستضدات من مختلف مسببات الأمراض البشرية في gvpالجين C لإنتاج لقاحات وحيدات ذات استجابات مناعية طويلة الأمد. [16]

ترميز المقاطع الجينومية المختلفة لعدة المتدثرة الحثرية ترتبط بروتينات الممرض ، بما في ذلك MOMP و OmcB و PompD ، بـ gvpC من هالوباكتيريا. في المختبر تُظهر تقييمات الخلايا تعبيرًا عن جينات الكلاميديا ​​على أسطح الخلايا من خلال تقنيات التخيل وإظهار استجابات مناعية مميزة مثل أنشطة المستقبلات TLRs وإنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات. [17] يمكن استغلال جين حويصلة الغاز كوسيلة لتوليد لقاح محتمل ضد الكلاميديا. تشمل قيود هذه الطريقة الحاجة إلى تقليل تلف بروتين GvpC نفسه مع تضمين أكبر قدر من الجين المستهدف للقاح في gvpقطعة الجين C. [17]

تجربة مماثلة تستخدم نفس جين حويصلة الغاز و السالمونيلا المعوية يفرز العامل الممرض بروتين مؤثر فوسفات الإينوزين SopB4 و SopB5 لتوليد ناقل لقاح محتمل. تفرز الفئران المحصنة السيتوكينات المؤيدة للالتهابات IFN-γ و IL-2 و IL-9. تم اكتشاف الأجسام المضادة IgG أيضًا. بعد تحدي العدوى ، لم يتم العثور على أي كمية أو كمية أقل بكثير من البكتيريا في الأعضاء المحصودة مثل الطحال والكبد. يمكن إعطاء اللقاحات المحتملة باستخدام حويصلة الغاز كعرض للمستضد عبر مسار الغشاء المخاطي كمسار إدارة بديل ، مما يزيد من إمكانية الوصول إليها لعدد أكبر من الأشخاص ويثير نطاقًا أوسع من الاستجابات المناعية داخل الجسم. [15]

تمتلك الحويصلات الغازية العديد من الخصائص الفيزيائية التي تجعلها مرئية في مختلف طرق التصوير الطبي. [18] لقد تم استخدام قدرة حويصلة الغاز على تشتت الضوء لعقود لتقدير تركيزها وقياس ضغط الانهيار. يتيح التباين البصري لحويصلات الغاز أيضًا أن تكون بمثابة عوامل تباين في التصوير المقطعي بالتماسك البصري ، مع تطبيقات في طب العيون. [19] الاختلاف في المعاوقة الصوتية بين الغاز في قلبها والسائل المحيط يعطي حويصلات الغاز تباينًا صوتيًا قويًا. [20] علاوة على ذلك ، فإن قدرة بعض قشور حويصلات الغاز على الالتواء تولد أصداء الموجات فوق الصوتية التوافقية التي تعمل على تحسين التباين مع نسبة الأنسجة. [21] أخيرًا ، يمكن استخدام الحويصلات الغازية كعوامل تباين للتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، بالاعتماد على الاختلاف بين القابلية المغناطيسية للهواء والماء. [22] القدرة على انهيار حويصلات الغاز بدون تدخل جراحي باستخدام موجات الضغط توفر آلية لمحو إشاراتها وتحسين تباينها. يمكن أن يؤدي طرح الصور قبل وبعد الانهيار الصوتي إلى القضاء على إشارات الخلفية مما يعزز اكتشاف حويصلات الغاز.

أتاح التعبير غير المتجانس لحويصلات الغاز في الخلايا البكتيرية [23] والثدييات [24] استخدامها كأول عائلة من جينات المراسل الصوتي. [25] بينما جينات المراسل الفلوريسنت مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) كان لها استخدام واسع في علم الأحياء ، في الجسم الحي التطبيقات محدودة بعمق اختراق الضوء في الأنسجة ، عادة بضعة مم. يمكن الكشف عن التلألؤ بشكل أعمق داخل الأنسجة ، ولكن بدقة مكانية منخفضة. توفر جينات المراسل الصوتي دقة مكانية دون ملليمتر وعمق اختراق يبلغ عدة سنتيمترات ، مما يتيح في الجسم الحي دراسة العمليات البيولوجية العميقة داخل الأنسجة.


قياس أبعاد حويصلة الغاز بالمجهر الإلكتروني

جرانت ج. جنسن ، قسم البيولوجيا والهندسة البيولوجية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا 91125.

ميخائيل ج. شابيرو ، قسم الكيمياء والهندسة الكيميائية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا 91125.

قسم الكيمياء والهندسة الكيميائية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

جرانت ج. جنسن ، قسم البيولوجيا والهندسة البيولوجية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا 91125.

ميخائيل ج. شابيرو ، قسم الكيمياء والهندسة الكيميائية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا 91125.

قسم الكيمياء والهندسة الكيميائية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم الكيمياء والهندسة الكيميائية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم الأحياء والهندسة البيولوجية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم الأحياء والهندسة البيولوجية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

معهد بيكمان ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم الأحياء والهندسة البيولوجية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم الكيمياء والهندسة الكيميائية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم الأحياء والهندسة البيولوجية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية ، جامعة بريغهام يونغ ، بروفو ، يوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية

جرانت ج. جنسن ، قسم البيولوجيا والهندسة البيولوجية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا 91125.

ميخائيل ج. شابيرو ، قسم الكيمياء والهندسة الكيميائية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا 91125.

قسم الكيمياء والهندسة الكيميائية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

جرانت ج. جنسن ، قسم البيولوجيا والهندسة البيولوجية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا 91125.

ميخائيل ج. شابيرو ، قسم الكيمياء والهندسة الكيميائية ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا 91125.

معلومات التمويل: مركز كالتك للتفاعلات الميكروبية البيئية معهد البحوث الطبية التراثية المعاهد الوطنية للصحة ، أرقام المنحة / الجائزة: R01-EB018975 ، R35-GM122588 زمالة باكارد للعلوم والهندسة منحة بيو في العلوم الطبية الحيوية

الملخص

الحويصلات الغازية (GVs) عبارة عن هياكل نانوية بروتينية أسطوانية الشكل أو مغزلية الشكل مملوءة بالهواء وتستخدم لتعويم البكتيريا الزرقاء والبكتيريا غيرية التغذية والعتائق. في الآونة الأخيرة ، اكتسبت GVs اهتمامًا بتطبيقات التكنولوجيا الحيوية نظرًا لقدرتها على العمل كعوامل تصوير ومشغلات للموجات فوق الصوتية والرنين المغناطيسي والعديد من التقنيات البصرية. يُعد قطر GVs معلمة مهمة تساهم في استقرارها الميكانيكي ووظيفة الطفو والتطور في الخلايا المضيفة ، فضلاً عن خصائصها في تطبيقات التصوير. على الرغم من أهميتها ، تختلف الأقطار المبلغ عنها لنفس الأنواع من الوزن الإجمالي اعتمادًا على الطريقة المستخدمة في تقييمها. هنا ، نقدم شرحًا لهذه التناقضات ونستخدم تقنيات المجهر الإلكتروني (EM) لتقدير قطر أكثر أنواع GVs التي تمت دراستها شيوعًا بدقة. نوضح أنه أثناء تجفيف الهواء على شبكة EM ، تتسطح GVs ، مما يؤدي إلى a

1.5 ضعف زيادة قطرها الظاهري. لقد أثبتنا أنه يمكن تحديد قطر GVs بدقة من خلال القياسات المباشرة من عينات cryo-EM أو مشتق بشكل غير مباشر من عروض GVs المنهارة والملطخة بشكل سلبي. تساعد النتائج التي توصلنا إليها في تفسير التناقض في البيانات التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا وتوفير طرق دقيقة لقياس أبعاد GVs.


نتائج

تم تطبيق طريقتين مختلفتين للتحقيق في تفاعلات البروتين والبروتين. كان النهج الأول عبارة عن تجارب منسدلة باستخدام مجال ربط السليلوز كعلامة ، وكان النهج الثاني هو تقسيم GFP لتحديد شركاء التفاعل في الجسم الحي.

التجارب المنسدلة باستخدام مجال ربط السليلوز

تم التحقيق في التفاعلات المفترضة للبروتينات الملحقة GvpF من خلال GvpM من خلال التجارب المنسدلة باستخدام مجال ربط السليلوز ، CBD ، مما يسمح للبروتينات الموسومة بربط السليلوز بتركيزات عالية من الملح (2 & # x20133 M KCl) (Ortenberg and Mevarech ، 2000 Irihimovitch و Eichler ، 2003 Schlesner et al.، 2012). تم دمج CBD في الطرف N أو C لكل ملحق Gvp باستخدام ناقل البلازميد pCBD (الشكل التكميلي 1). النتيجة اتفاقية التنوع البيولوجيX أو Xاتفاقية التنوع البيولوجي تم استخدام التركيبات (X = أي ملحق GvpF عبر GvpM) للتحويل هالوفيراكس فولكاني WR340. لاختبار ما إذا كان يمكن بالفعل تنقية بروتينات انصهار CBD في 2 M KCl ، محللات من كل منهما اتفاقية التنوع البيولوجيتم خلط محولات X مع السليلوز لربط Gvp الموسوم باتفاقية التنوع البيولوجي ، وتم فحص كسور الشطف بواسطة SDS-PAGE بالإضافة إلى التحليل الغربي باستخدام أمصال مضادة مرفوعة ضد بروتينات Gvp المختلفة (الشكل التكميلي 2). باستثناء GvpJ و GvpM ، تم عزل الملحق Gvp بكميات مناسبة (الجدول 1) ، وكان مرئيًا جيدًا في المواد الهلامية الملطخة Coomassie (الشكل التكميلي 2). تم الحصول على GvpJ و GvpM بكميات أقل بكثير ، ويفترض أن ذلك يرجع إلى طبيعتها الكارهة للماء وميلها إلى التجميع. قد تكون مجاميع GvpJ و GvpM موجودة في الجزء الصلب من مستخلصات الخلية ، وإضافة المنظفات DDM (n-dodecyl - & # x03B2-D-maltoside) أو OGP (octyl - & # x03B2-D-glucopyranoside) إلى المخزن المؤقت محلول وغسل تحسن قليلاً من وجود هذه البروتينات في جزء قابل للذوبان (الجدول 1). تم اكتشاف جميع بروتينات Gvp الإضافية بما في ذلك GvpJ و GvpM عن طريق التحليل الغربي (الشكل التكميلي 2). يمكن دائمًا اكتشاف مسحة ذات نطاقات أكبر باستخدام GvpJ ، مما يدل على قدرتها على التجميع (الشكل التكميلي 2). وهكذا ، فإن كل من اتفاقية التنوع البيولوجيتم اختيار بروتينات Gvp ويمكن تنقيتها. للتأكد من أن Gvp غير المميز لا يتفاعل مع مصفوفة السليلوز ولا مع اتفاقية التنوع البيولوجي ، تم إنتاج محولات تحتوي على البلازميدات pCBD (بدون gvp) و pX ex (gvpX-pJAS35 معربا عن أي gvp بدون cbd انصهار). لم يتم اكتشاف أي من بروتينات Gvp التي تم اختبارها في جزء الشطف ذي الصلة مما يدل على عدم ارتباط أي منها بالسليلوز أو بـ CBD نفسها (البيانات غير معروضة).

الجدول 1. كمية اتفاقية التنوع البيولوجيتم استرداد Gvp من ثقافة 400 مل بواسطة CBD.

تم استخدام بروتينات Gvp الموسومة بـ CBD كطعم واختبارها لاختيار شريك تفاعل Gvp مفترض تم إنتاجه في نفس الخلية. كان أول زوج بروتين تم اختباره هو GvpL / GvpM ، حيث تم إثبات التفاعل باستخدام بروتينات Gvp الموسومة. حمل GvpL أو GvpM CBD مدمجًا في الطرف N أو C (اتفاقية التنوع البيولوجيلام ، لاماتفاقية التنوع البيولوجي أو اتفاقية التنوع البيولوجيمماتفاقية التنوع البيولوجي) والتركيبات اتفاقية التنوع البيولوجيL / M ، Lاتفاقية التنوع البيولوجي/ م ، اتفاقية التنوع البيولوجيM / L و Mاتفاقية التنوع البيولوجي/ L تم تحليلها. ليساتس اتفاقية التنوع البيولوجيL / M و Lاتفاقية التنوع البيولوجيتم اختبار محولات / M لوجود GvpM ، وتم تحديد مونومرات وثنائيات هذا البروتين من خلال التحليل الغربي (الشكل التكميلي 3). أيضًا ، كان GvpL موجودًا في كسور الشطف من اتفاقية التنوع البيولوجيM / L و Mاتفاقية التنوع البيولوجي/ L المحولات التي تشير إلى أن GvpL مرتبطة بـ GvpM (الشكل التكميلي 3). أكدت هذه النتائج تفاعل GvpL / GvpM الذي شوهد بالفعل باستخدام بروتينات Gvp الخاصة به ومصفوفة Ni-NTA لكروماتوجرافيا التقارب (Tavlaridou et al. ، 2014).

تم إجراء تجارب منسدلة مماثلة مع CBD مع جميع بروتينات Gvp الأخرى. المعنية HFX. فولكاني تحمل المحولات دائمًا تركيبتين ، أحدهما لبروتين الطُعم (اتفاقية التنوع البيولوجيX) وواحد للفريسة GvpY (مع X أو Y = F أو G أو H أو I أو J أو K أو L أو M). تم التعبير عن كل من إطارات القراءة التي تشفر الطعم والفريسة تحت صfdx المروج لضمان التعبير العالي بالمثل. لم يتم إجراء جميع التفاعلات الممكنة في كلا الاتجاهين (اتفاقية التنوع البيولوجيX + Y و اتفاقية التنوع البيولوجيY + X) ، حيث تم العثور بالفعل على تفاعلات البروتين مع زوج بروتين واحد. يتم عرض نتائج هذه الدراسات في الشكل 1 والجدول الملخص 2. يتم ترتيب البقع الغربية في الشكل 1 وفقًا للمصل المضاد المستخدم للكشف عن بروتين الفريسة. استخدام اتفاقية التنوع البيولوجيحدد X لتحديد GvpM أحاديًا GvpM مع اتفاقية التنوع البيولوجيH ، والمونومرات وكذلك الثنائيات مع اتفاقية التنوع البيولوجياتفاقية التنوع البيولوجيز اتفاقية التنوع البيولوجيJ ، اتفاقية التنوع البيولوجيك و اتفاقية التنوع البيولوجيL (الشكل 1). وقد لوحظ استخدام Dimers و multimers من GvpM اتفاقية التنوع البيولوجيأنا (الشكل 1). وبالتالي ، تم سحب GvpM لأسفل في كل هذه الحالات. تم اختيار GvpL بواسطة اتفاقية التنوع البيولوجيF ، ولكن النتائج التي تم الحصول عليها مع اتفاقية التنوع البيولوجيحور اتفاقية التنوع البيولوجيكنت غامضا (الشكل 1). رغم ذلك، متى اتفاقية التنوع البيولوجيتم استخدام L كطعم أو تم اختيار GvpM أو GvpK أو GvpJ أو GvpG مرة أخرى مما يشير إلى أن كل هذه الملحقات Gvp مرتبطة بـ GvpL. أيضًا ، تفاعل GvpK مع أي من الملحقات Gvp ، منذ ذلك الحين اتفاقية التنوع البيولوجيمن خلال F اتفاقية التنوع البيولوجيJ و اتفاقية التنوع البيولوجيL المنسدلة GvpK و اتفاقية التنوع البيولوجياستعاد K GvpM. تم اختيار مونمرات GvpJ بواسطة اتفاقية التنوع البيولوجيX ، ولكن تم العثور على مسحة بما في ذلك GvpJ multimers إضافية اتفاقية التنوع البيولوجياتفاقية التنوع البيولوجيح اتفاقية التنوع البيولوجيأنا، اتفاقية التنوع البيولوجيL أو اتفاقية التنوع البيولوجيم (الشكل 1). تم استخدام GvpI كطعم فقط ، و اتفاقية التنوع البيولوجيلقد قمت بسحب أي من البروتينات الملحقة Gvp. من المثير ملاحظة ذلك اتفاقية التنوع البيولوجيغالبًا ما كنت أتسبب في تكوين أوليغومرات أكبر ، خاصةً مع GvpM أو GvpK أو GvpJ كفريسة. تم اختيار GvpH بواسطة اتفاقية التنوع البيولوجيل اتفاقية التنوع البيولوجيانا و اتفاقية التنوع البيولوجيقام H بسحب GvpG أو GvpJ أو GvpK أو GvpL أو GvpM (الشكل 1 والجدول 2). تم اختيار مونومرات وثنائيات GvpG بواسطة اتفاقية التنوع البيولوجيF ، حيث اتفاقية التنوع البيولوجيح اتفاقية التنوع البيولوجيانا و اتفاقية التنوع البيولوجيحدد L dimer لـ GvpG (ومعدلات متعددة إضافية في حالة اتفاقية التنوع البيولوجيأنا) (الشكل 1). حيث اتفاقية التنوع البيولوجيأظهرت هذه النتائج GvpM و GvpK و GvpJ المرتبط بـ G ، أن GvpG قادر على التفاعل مع جميع البروتينات الملحقة. تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام GvpF ، حيث تم سحب GvpF لأسفل بمقدار اتفاقية التنوع البيولوجيانا و اتفاقية التنوع البيولوجيقام F بسحب GvpG و GvpH و GvpJ من خلال GvpM (الشكل 1 والجدول 2). بشكل عام ، أشارت نتائج هذه التجارب المنسدلة إلى أن أي ملحق Gvp له شركاء تفاعل متعددون واقترح أن هذه البروتينات قد تشكل معقدًا أكبر.

شكل 1. التحليلات الغربية للمقايسات المنسدلة باستخدام اتفاقية التنوع البيولوجيX. الطعم اتفاقية التنوع البيولوجيتم تصنيع X وبروتين الفريسة Y (X ، Y = أي GvpF من خلال بروتين GvpM) في نفس HFX. فولكاني زنزانة. تم وضع علامة على كلاهما في الجزء العلوي من البقع. يظهر فقط جزء الشطف من مصفوفة السليلوز. في كل حالة ، تم فصل 15 & # x03BCL من جزء الشطف بواسطة SDS-PAGE ، تم نقل البروتينات إلى غشاء PVDF واحتضانها مع المصل المعين المشار إليه أسفله (& # x03B1F حتى & # x03B1M). تم تصور شركاء التفاعل المفترض مع الجسم المضاد الثانوي المسمى الفلوروفور IRDye 800 CW (Licor). يتم قلب البقع إلى الأبيض والأسود وترتيبها وفقًا للمصل المضاد المستخدم. تشير الأسهم إلى مونومر Gvp و dimer المتوقع. الأرقام الموجودة على اليسار هي علامات الحجم بالكيلو دالتون.

الجدول 2. ملخص لتجارب القائمة المنسدلة باستخدام اتفاقية التنوع البيولوجيGvp.

ملحق بروتينات Gvp محدد بواسطة اتفاقية التنوع البيولوجيم

للتحقق مما إذا كان GvpM قادرًا على تحديد كل الملحقات Gvp مرة واحدة ، HFX. فولكاني تم إنتاج المحولات اتفاقية التنوع البيولوجيM بالإضافة إلى التعبير عن البلازميد pF-L السابق gvpFGHIJKL تحت القوي صfdx تحكم المروج. شركاء التفاعل من اتفاقية التنوع البيولوجيتم اختيار M بالتجارب المنسدلة من المحللة لهذا المحول ، وتم اختبار العينات بواسطة التحليلات الغربية باستخدام أمصال مختلفة (الشكل 2). تم تحديد جميع ملحقات Gvp ، مما يعني ذلك اتفاقية التنوع البيولوجيجذبتهم م كلهم. في كل حالة تم الكشف عن Gvp أحادي كل منها. في حالة GvpG ، ظهر نطاقي 30 & # x201334 كيلو دالتون بالإضافة إلى بروتين 10-kDa GvpG المتوقع ، وشكل GvpJ و GvpK أيضًا مولدات متعددة (الشكل 2). مونومر اتفاقية التنوع البيولوجيتم اكتشاف بروتين M الطعم أيضًا (الشكل 2). شاملة، اتفاقية التنوع البيولوجيكان M قادرًا على هدم GvpF من خلال GvpL. من الممكن أن يرتبط كل من بروتينات Gvp هذه بشكل مستقل بـ اتفاقية التنوع البيولوجيM ، ولكن من الممكن أيضًا أن يكون بعضها أو كلهم ​​قد شكلوا معقدًا مرتبطًا بـ GvpM.

الشكل 2. التحليلات الغربية للبروتينات التي اختارها اتفاقية التنوع البيولوجيم في اتفاقية التنوع البيولوجيمحولات M / pF-L السابقة. في كل حالة ، تم فصل 15 & # x03BCL من جزء الشطف بواسطة SDS-PAGE ، وتم نقله إلى غشاء PVDF واحتضانه مع المصل المعين المحدد أسفله (& # x03B1F من خلال & # x03B1M). يتم تصور التفاعلات مع الجسم المضاد الثانوي المسمى الفلوروفور IRDye 800 CW (Licor). تشير الأسهم إلى مونومر Gvp المتوقع الذي تم اكتشافه. تم قلب البقع إلى الأسود والأبيض. الأرقام الموجودة على الجانب الأيسر هي علامات الحجم بالكيلو دالتون.

دراسة تفاعلات البروتين والبروتين بواسطة Split-GFP

تمت دراسة التفاعلات الزوجية لبروتينات Gvp الإضافية في HFX. volcanii في الجسم الحي باستخدام طريقة Split-GFP. كل gvp تم تضخيم إطار القراءة بواسطة PCR وإدخاله في البلازميدات المتجهية الأربعة لدمج نجفب- أو cgfp قراءة الإطار إلى الطرف 5 & # x2032 أو 3 & # x2032 لكل منهما gvp (وينتر وآخرون ، 2018). تشتق شظايا GFP N و C الطرفية NGFP و CGFP من البروتين الفلوري الأخضر المتكيف مع الملح mGFP2 (Born and Pfeifer ، 2019). يتشكل GFP الفلوري فقط عندما يتفاعل شريكان الانصهار ولا يحدث عائق صارم. يتم التعبير عن إطار القراءة لكل بروتين اندماج تحت صfdx تحكم المروج لإنتاج كميات كبيرة مماثلة من هذه البروتينات. تم تحديد عمليات الاندماج الأربعة N / CGFP نX أو جX للانصهار N- طرفي ، و Xج أو Xن للانصهار الطرفي C مع Gvp (مع X = الملحق الخاص به Gvp C = CGFP N = NGFP). تم اختبار المجموعات الثمانية من زوج البروتين في HFX. فولكاني تم قياس المحولات والفلورة في وحدات امتصاص الضوء التعسفي لكل مم 2. يتم عرض أعلى مضان نسبي (قيم rf) المحسوبة لكل زوج من التفاعلات في الشكل التكميلي 4 ، ويتم عرض البيانات الأصلية التي تم الحصول عليها في LAU / مم 2 في الشكل التكميلي 5. ويرد ملخص لهذه البيانات في الشكل 3.

الشكل 3. يتم تحديد تفاعلات الملحق Gvp بواسطة Split-GFP. (أ) أعلى تألق نسبي (قيم rf) المحددة لتفاعلات البروتين البروتين المحسوبة كما هو موضح في قسم الطرق. تم إجراء جميع التجارب باستخدام مكررات بيولوجية وثلاث مكررات تقنية. (ب) ملخص لتفاعلات البروتين البروتين المختلفة التي يحددها Split-GFP. يتم عرض بروتينات Gvp التي تم اختبارها في المربع الرمادي على اليسار ويتم ترتيب شركاء التفاعل وفقًا لأعلى قيمة rf المحددة (الواردة أدناه). تم اعتبار التألق الذي يتجاوز rf & # x003E 5 بمثابة تفاعل واضح. تعتبر قيم Rf & # x003C rf 4 ضعيفة أو معدومة التفاعل.

ولوحظ أعلى تألق نسبي لجميع التفاعلات مع نز /جالمحول L (rf 77.5) مما يدل على تفاعل قوي لـ GvpL مع GvpG (الشكل 3A). أسفر جميع شركاء التفاعل الآخرين لـ GvpL عن قيم rf أقل من 20. لوحظت قيم Rf بين 10 و 20 للتفاعل Fج/نلام ، ناناجمج/ لن، حن/ لج، و Jج/نتم تحديد L و rf 7.4 لـ Kج/نL (الأشكال 3 أ ، ب والشكل التكميلي 5). تشير هذه النتائج إلى أن 32 كيلو دالتون GvpL تفاعل مع جميع الملحقات الأخرى Gvp. GvpL هو أكبر ملحق Gvp وقد يعمل كمنصة لربط كل الآخرين. أيضًا ، تفاعل GvpF مع العديد من بروتينات Gvp (GvpL و GvpH و GvpI و GvpG) (الشكل 3 ب). يقع طراز Fج/ لن أظهر المحول (rf 16.6) أعلى مضان نسبي ، في حين أن شركاء الربط الثلاثة الآخرين أسفروا عن قيم rf أقل (rf 5.0 & # x20136.3). في حالة GvpF ، تجدر الإشارة إلى أن أعلى الفلورة لوحظ دائمًا عندما تم دمج N- أو CGFP في الطرف C من GvpF ، مما يشير إلى أن الاندماج مع الطرف N يعيق تجميع mGFP2. إن 23 كيلو دالتون GvpF أصغر من GvpL ، لكن كلا البروتينين يظهر تشابهًا في التسلسل وبنية ثلاثية الأبعاد مماثلة عند نمذجة التركيب البلوري للبكتيريا الزرقاء GvpF كقالب (Xu et al. ، 2014 Winter et al. ، 2018).

لوحظ ثاني أعلى مضان (rf 20) من جميع التوليفات لـ H.ج/نأنا متحولة (الشكل 3) ، مما يعني أن GvpH و GvpI يجذبان بعضهما البعض. تفاعل كلا البروتينين أيضًا مع GvpF و GvpL (rf 6.3). تم تحديد بروتينين شريكين لـ GvpG (GvpL و GvpF) ، ويبدو أن GvpL هو الشريك التفاعلي الوحيد للبروتينات الثلاثة GvpJ و GvpK و GvpM (الشكل 3 ب). بشكل عام ، أظهرت هذه النتائج التي تم الحصول عليها من خلال تحليلات GFP المنقسمة هذه أن جميع بروتينات Gvp الإضافية تحتوي على بروتين Gvp واحد آخر على الأقل كشريك للتفاعل. نظرًا لأن GvpL ربطهم جميعًا ، فمن الممكن أن يشكلوا مجمعًا أكبر. مقارنة بالنتائج التي تم الحصول عليها باستخدام كروماتوغرافيا التقارب اتفاقية التنوع البيولوجيGvp ، لوحظ تفاعلات أقل مع GFP المقسم ، خاصة بالنسبة للبروتينات الكارهة للماء GvpJ (12 كيلو دالتون) و GvpM (9.2 كيلو دالتون) ، وبالنسبة لـ GvpK (12.6 كيلو دالتون).

شريك (شركاء) التفاعل في GvpA

للكشف عن التفاعلات بين بروتين حويصلة الغاز الهيكلي الرئيسي GvpA وهذه الملحقات Gvp ، تم فحص كل مجموعة من A / X (X = GvpF من خلال GvpM) بواسطة Split-GFP. تم دمج GvpA عند الطرف N أو C إلى N- أو CGFP واختباره مع متغيرات الانصهار N / CGFP ذات الصلة لـ GvpF من خلال GvpM. تم التحقيق في ثماني مجموعات مختلفة لكل زوج ، وترد أعلى قيم الترددات اللاسلكية المحسوبة في كل حالة في الشكل 4 أ. يتم عرض البيانات الأصلية التي تم الحصول عليها في هذه التجارب في الشكل التكميلي 6. تم الحصول على أعلى مضان نسبي لـ Aج/Fن المحول (rf 20) ، في حين أن جميع المحولات الأخرى أسفرت عن قيم rf & # x003C 1 ، مما يشير إلى اتصالات ضعيفة للغاية بين GvpA وبروتينات Gvp الأخرى (الشكل 4 أ). باستثناء نأ / إلج، لوحظ دائمًا أعلى تألق لزوج من البروتين عندما تم دمج N- أو CGFP في الطرف C لـ GvpA. تشير هذه النتائج إلى أن GvpF هو شريك التفاعل الوحيد لـ GvpA ، وأن منطقة N-terminal الخاصة بـ GvpA قد تشارك في التفاعل.

الشكل 4. دراسات تفاعل Split-GFP مع GvpA / GvpX. يتم إعطاء التألق النسبي الأعلى فقط المحدد لكل مجموعة. تم إجراء مكررات بيولوجية وثلاث مكررات تقنية في كل حالة. (أ) دراسة تفاعل GvpA مع البروتينات الملحقة الثمانية GvpF من خلال GvpM. (ب) تفاعل خمسة أجزاء مختلفة من GvpA مع GvpF. (ج) تسلسل أجزاء GvpA الخمسة بالنسبة إلى تسلسل aa لـ GvpA الموضح في الأعلى. توضح الأرقام الموجودة أعلى التسلسل مواضع aa في GvpA. اللولب & # x03B11 و & # x03B12 و & # x03B2-sheets & # x03B21 و & # x03B22 بخط غامق ومميز في الأسفل ومظلل أيضًا باللون الرمادي.

To define the interaction site of GvpF in GvpA more precisely, five GvpA fragments harboring different structural features (according to the model obtained by Strunk et al. (2011)) were studied by split-GFP. Fragment A1-22 encompasses the first 22 amino acids of GvpA including α-helix 1 (㬑), fragment A1-34 contains in addition β-sheet 1 (㬑-㬡), and A1-43 the 㬑-㬡-㬢 elements of GvpA (Figure 4C). Fragment A20-47 contains 㬡-㬢, and A44-76 the α-helix 2 up to the C-terminus of GvpA (㬒) (Figure 4C). Each of these GvpA fragments was fused at the N- or C-terminus to N- or CGFP and tested with the respective N/CGFP fusion of GvpF. Transformant Fن/A1-22ج yielded the highest fluorescence (rf 41), i.e., more than twice as high as obtained for the interaction of GvpF with the entire GvpA (rf 20) (Figure 4B). Smaller protein fragments offer less steric hindrance supporting the interaction (Ghosh et al., 2000 Winter et al., 2018). An increased fluorescence was also found for the transformants harboring F/A1-34 and F/A1-43 (rf 33 – 35), whereas a very low relative fluorescence (rf < 1) was obtained for the transformants harboring F/A20-47 or F/A44-76. These results implied that the C-terminal portion of GvpA is not involved, and that the N-terminal portion contains the interaction site of GvpF.

To further confine the interaction site of GvpF in GvpA, various substitution variants of GvpA were tested by split-GFP. Many of these point mutations in GvpA are known to influence the formation of gas vesicles in 㥊+Amut transformants (Strunk et al., 2011 Knitsch et al., 2017). These transformants carry two vector plasmids, the 㥊 construct (contains except gvpA الكل gvp genes of the p-vac region) and construct A (gvpA or mutant gvpA expressed in pMDS20 under the control of the native صأ promoter). The different GvpA variants were investigated by split-GFP analysis for their potential to interact with GvpF in Hfx. volcanii. يقع طراز Fن fusion protein was used as interaction partner in all these cases (Figure 5A). The strongest reductions in relative fluorescence (rf < 6) compared to GvpA wild type (rf 15-18) were observed for the GvpA substitutions G20D, G20A, D24A, D24Y, R28A, R28D, or E40A, but also R15A, K19D, A27E, or G33V resulted in a low relative fluorescence of the F/Amut transformants (Figure 5A and Supplementary Figure 6). Especially the charged aa in 㬡 and 㬢 (D24, R28, E40) and G20 of GvpA had a strong influence on the interaction with GvpF (Figure 5). All these aa are located in the N-terminal half of GvpA, whereas any of the single substitutions in the C-terminal half had no effect on the interaction with GvpF, supporting the results described above. It is likely that these aa of GvpA are involved in the GvpF/GvpA interaction. In respect to the gas vesicle phenotype of the 㥊+Amut transformants, most of these mutations result in a Vac – phenotype, except for D24A (cylindrical) and R28A (mini gas vesicles) (Knitsch et al., 2017 Figure 5B). It is possible that the Vac – phenotype is caused by the lack of an interaction between GvpF and GvpA, rather than (or in addition to) an influence of the mutation on the GvpA/GvpA contact in the gas vesicle wall.

الشكل 5. Split-GFP studies of GvpF and variants of GvpAmut. (أ) Rf-values of the GvpF/GvpA (WT) and the various F/Amut transformants. The single substitutions in GvpA are indicated below. F/Amut transformants with relative fluorescence φ are labeled in blue. The fluorescence was determined in LAU/mm 2 , and the relative fluorescence in relation to the fluorescence of Hfx. volcanii wild type calculated. Two biological and three technical replicates were performed in each case. (ب). Sequence of GvpA and summary of the rf-values of the various GvpA mutants. The sequence of GvpA is presented on top and the structural features 㬑–㬡–㬢–㬒 shaded in grey. The substitutions in GvpA are summarized underneath each GvpA contains only a single substitution. Rf < 6 is regarded as weak interaction, whereas rf > 11 is similar to GvpA wild type. The Vac phenotype of the respective 㥊+Amut transformants is indicated by color: red, Vac negative green, cylinder shaped yellow, mini gas vesicles without color, wild type gas vesicles.


REACTIVE OXYGEN SPECIES: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction

Klaus Apel and Heribert Hirt
المجلد. 55, 2004

الملخص

▪ Abstract Several reactive oxygen species (ROS) are continuously produced in plants as byproducts of aerobic metabolism. Depending on the nature of the ROS species, some are highly toxic and rapidly detoxified by various cellular enzymatic and . اقرأ أكثر

Figure 1: Generation of different ROS by energy transfer or sequential univalent reduction of ground state triplet oxygen.

Figure 2: The principal features of photosynthetic electron transport under high light stress that lead to the production of ROS in chloroplasts and peroxisomes. Two electron sinks can be used to alle.

Figure 3: The principal modes of enzymatic ROS scavenging by superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), the ascorbate-glutathione cycle, and the glutathione peroxidase (GPX) cycle. SOD converts hydro.

Figure 4: Schematic depiction of cellular ROS sensing and signaling mechanisms. ROS sensors such as membrane-localized histidine kinases can sense extracellular and intracellular ROS. Intracellular RO.

Figure 5: Different roles of ROS under conditions of (a) pathogen attack or (b) abiotic stress. Upon pathogen attack, receptor-induced signaling activates plasma membrane or apoplast-localized oxidase.


REACTIVE OXYGEN SPECIES: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction

Klaus Apel and Heribert Hirt
المجلد. 55, 2004

الملخص

▪ Abstract Several reactive oxygen species (ROS) are continuously produced in plants as byproducts of aerobic metabolism. Depending on the nature of the ROS species, some are highly toxic and rapidly detoxified by various cellular enzymatic and . اقرأ أكثر

Figure 1: Generation of different ROS by energy transfer or sequential univalent reduction of ground state triplet oxygen.

Figure 2: The principal features of photosynthetic electron transport under high light stress that lead to the production of ROS in chloroplasts and peroxisomes. Two electron sinks can be used to alle.

Figure 3: The principal modes of enzymatic ROS scavenging by superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), the ascorbate-glutathione cycle, and the glutathione peroxidase (GPX) cycle. SOD converts hydro.

Figure 4: Schematic depiction of cellular ROS sensing and signaling mechanisms. ROS sensors such as membrane-localized histidine kinases can sense extracellular and intracellular ROS. Intracellular RO.

Figure 5: Different roles of ROS under conditions of (a) pathogen attack or (b) abiotic stress. Upon pathogen attack, receptor-induced signaling activates plasma membrane or apoplast-localized oxidase.


Types of Vesicles

Different types of vesicles are found within the cell that has a wide variety of functions.

  • Vacuoles: These are tiny lipid enclosed structures that usually contain water, and are mostly seen in النباتات and certain بكتيريا. They are used for regulating osmotic pressure in the cell.
  • الجسيمات المحللة: Lysosomes are a type of vesicle which is involved in الخلوية digestion. A lysosome contains proteolytic enzymes that can break down food molecules.
  • بيروكسيسومات: Similar to lysosomes, peroxisomes are specialized vesicles that contain hydrogen peroxide. These vesicles are primarily involved in cellular oxidation reactions.
  • Transport vesicles: As the name suggests, these are tiny sacs enclosed by a lipid bilayer that is heavily involved in the transport of materials from and to the cell and between organelles.
  • Secretory vesicles: A type of specialized vesicle that carries substances out of the cell. They usually generate from the Golgi apparatus.
  • Synaptic vesicles: A type of specialized vesicle found in the types of neurons that store and transport neurotransmitter molecules.
  • Extracellular vesicles: Extracellular vesicles are found outside the cell and are used for transport into the cell. These type of vesicles are seen in both eukaryotic and prokaryotic cells.
  • Gas vesicles: These are found in bacteria and provide buoyancy to the cell.


The Gas Vesicle Gene Cluster from Microcystis aeruginosa and DNA Rearrangements That Lead to Loss of Cell Buoyancy

تين. 1. ال gvp gene cluster region in M. الزنجارية and IS found in the GV-deficient mutants. (A) Strain PCC 7806 (B) strain PCC 9354. From top to bottom, names and sizes of the IS, localizations of the insertions, names of the putative genes, maps of the ORFs and their orientations, and intergenic regions (ig) in base pairs (bp) are shown. Arrows, ORFs black arrows and lines, sequenced regions grey-shaded arrows and lines, nonsequenced regions. Precise locations (with respect to the sequence submitted to DDBJ/EMBL/GenBank under no AJ577136) of the insertion elements are as follows: between nucleotides 115 and 2206 for ISMae1, between nucleotides 4033 and 4034 for ISMae2, between nucleotides 7633 and 7634 for ISMae3, and between nucleotides 8301 and 8302 for ISMae4. تين. 2. Transcription analysis of the gvp العنقودية. (A) RNA blot analysis of the gvpA, gvpC، و rnpB transcripts from M. الزنجارية PCC 7806 grown under a day-night cycle (16 h-8 h). The cells were harvested for RNA extraction after 1 h of light when the culture reached OD750 = 0.4. The same blot (15 μg of total RNA per lane) was successively hybridized with different probes: a 180-bp gvpA fragment (obtained by PCR amplification with primers 635 and 636), a 400-bp gvpC fragment (amplified with primers 870 and 871), and (as a control for RNA loading and transfer) a 0.6-kb rnpB fragment (obtained by PCR with the primers mentioned in Materials and Methods). The sizes of the different transcripts are indicated in kilobases (kb). (B) RT-PCR analysis showing cotranscription between the genes of the gvp العنقودية. ال gvpC-N fragment was amplified with primers 893 and 973, the gvpN-J fragment was amplified with primers 975 and 1108, the gvpJ-X fragment was amplified with primers 974 and 1110, the gvpX-K fragment was amplified with primers 978 and 1109, the gvpK-F fragment was amplified with primers 1111 and 1113, the gvpF-G fragment was amplified with primers 965 and 1018, and the gvpK-G fragment was amplified with primers 965 and 1111. s, analyzed sample (with cDNA as a template) −, negative control (with RNA as a template) +, positive control (with genomic DNA as a template). A DNA ladder (100 bp [Amersham Biosciences] or 1 kb [Invitrogen Life Technologies]) was used as a size marker (lanes م). تين. 3. Detection of the IS by PCR analysis of the gvp region of the wild-type (WT) and the GV-deficient mutant (M1, M2, M3, and M4) strains of M. الزنجارية. Primers used for amplification (see Table 1) were as follows: primers 1006 and 1017 for the 5′ gvpAأنا-5′ gvpC region, primers 1081 and 1082 for gvpV, primers 949 and 972 for gvpN, and primers 983 and 1077 for gvpW. A 1-kb DNA ladder (Invitrogen Life Technologies) was used as a size marker (lanes م). تين. 4. Transcription analysis of gvp genes in the wild-type and the GV-deficient mutant strains of M. الزنجارية. (A) RT-PCR with the gvpA-specific primers 994 and 995 (see Table 1). The results for PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M2 and M3) strains and PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains are shown. (B) RT-PCR results for the three genes carrying an IS (gvpN, gvpV، و gvpW) and for gvpJ و gvpX. The results for PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M3 and M2) strains and PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains are shown. ال gvpV gene was amplified with primers 1081 and 1082, gvpN was amplified with primers 949 and 972, gvpJ was amplified with primers 974 and 975, gvpX was amplified with primers 1109 and 1110, and gvpW was amplified with primers 983 and 1077. A DNA ladder (100 bp [Amersham Biosciences] or 1 kb [Invitrogen Life Technologies]) was used as a size marker (lanes م). تين. 5 . Immunodetection of GvpA on isolated GV and cell extracts from the wild-type and the GV-deficient mutant strains of M. الزنجارية. GV, enriched GV fraction (20 μg) from PCC 7806 wild-type strain. Other lanes show the results for crude extracts (200 μg) from PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M1, M2, and M3) strains and from PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains. تين. 6 . Electron micrographs of the wild-type strains (A and E) and the GV-deficient mutant strains (B, C, D, and F) of M. الزنجارية. (A) PCC 7806 wild type (B) PCC 7806 M1 (C) PCC 7806 M2 (D) PCC 7806 M3 (E) PCC 9354 wild type (F) PCC 9354 M4. gv-l, GV in longitudinal section gv-c, GV in cross-section. Bars, 500 nm.

Supporting information

S1 التين sic1 mutant exhibits developmental defects in rosette leaves.

(A) The 3-week-old sic1 mutant grown on artificial soil shows growth retardation compared to Col-0. Scale bar represents 3 cm. (B) The rosette leaf number of Col-0 and sic1. Scale bar represents 2 cm. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S2 Fig. The leaf developmental phenotype of sic1 is partially driven by root.

The images were taken on the 20th day after grafting. Col-0/sic1, grafted plants with Col-0 shoot and sic1 جذر sic1/Col-0, grafted plants with sic1 shoot and Col-0 root. Col-0, Columbia-0 NG, non-grafted plants SG, self-grafted plants sic1, significant ionome changes 1.

S3 Fig. CTL1 is highly conserved among different species.

Protein sequence alignment of CTL1 among different species shows CTL1 is highly conserved and the mutation site of sic1 is located in a conserved domain. And the red boxes show the TMHs. The red triangle indicates the mutation site of sic1. CTL1, choline transporter-like 1 sic1, significant ionome changes 1 TMH, transmembrane helix.

S4 Fig. The expression of CTL1 في sic1 و cher1-4.

(A) The insertion site of cher1-4 and the position of primers used in this experiment. The triangle showed the insertion site of cher1-4 and the arrows shows the positions of primers used in this experiment (B) RT-PCR analysis of CTL1 transcripts in Col-0, sic1، و cher1-4. UBC was used as an internal standard for the RT-PCR. Single PCR reactions were performed on RNA from individual plants of each genotype. (C) The qRT-PCR result of CTL1 in Col-0, sic1 و cher1-4. The data represent the means ± SE ن = 3. The raw data can be found in S1 Data. Col-1, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 PCR, polymerase chain reaction qRT-PCR, quantitative real-time polymerase chain reaction RT-PCR, real-time polymerase chain reaction sic1, significant ionome changes 1.

S5 Fig. Genetic and transgenic complementation of developmental phenotype sic1.

(A) The 6-day-old seedlings of Col-0, sic1, cher1-4, and complementation lines grown on agar-solidified 1/2 MS medium plate. Scale bar represents 1 cm. (B) Primary root length of Col-0, sic1, cher1-4, and complementation lines. Letters above bars indicate statistically different groups using a one-way ANOVA, followed by an LSD test at the probability of ص & لتر 0.05. Data represent means ± SE, ن = 10 for each genotype. (C) Root patterning of Col-0 and sic1_CO plants. Scale bars represent 50 μm. The raw data can be found in S1 Data. Col-0, Columbia-0 LSD, least significant difference sic1, significant ionome changes 1.

S6 Fig. The expression pattern of CTL1 in different tissues of أ. thaliana.

(A-D) CTL1-GFP showed the expression pattern in root tip (A), root maturation zone (B and C), leaf pavement cells (D). Three independent transgenic lines were observed and showed the same expression pattern. Green channel represents CTL1-GFP signal and red channel represents propidium iodide signal. Scale bars represent 50 μm for (A) and (D). (E) The relative expression of CTL1 in the shoot and root of Col-0 plants. Data represent means ± SE, ن = 3. The raw data can be found in S1 Data. CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein.

S7 Fig. CTL1 localizes to PM and endosome membrane vesicles.

(A) An enlarged view of CTL1-GFP in the root tip of Col-0 plant. Green channel shows the GFP signal and red channel shows the PI signal. Scale bar represents 10 μm. (B) Subcellular localization of CTL1-GFP after plasmolysis in Col-0 root. Green channel shows the GFP signal. Scale bar represents 50 μm. (C) CTL1 is co-localized with FM4-64 in root cells. Green channel shows the CTL1-GFP signal red channel shows the FM4-64 signal. The insets showed an enlarged view of epidermal cell. Scale bars represent 5 μm. Col-0, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein FM4-64, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide PM, plasma membrane.

S8 Fig. The aggregation of NRAMP1 and PDCB proteins locate in different intracellular organelles.

(A) The intracellular aggregation of NRAMP1-GFP is co-localized with FM4-64 signal in sic1. (B and C) The intracellular aggregations of PDCB1-GFP (B) and PDCB2-GFP (C) are not co-localized with FM4-64 in sic1. The transgenic seedlings of sic1 background were stained with FM4-64 for 1 h and then observed in confocal microscope. Green channels represent the GFP signal, and red channels represent the FM4-64 signal. The scale bars represent 7.5 μm in (A) and 5 μm in (B and C). (D) The intracellular aggregation of NRAMP1-GFP in sic1 localized to TGN. The scale bars represent 7.5 μm. Col-0, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein FM4-64, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide NRAMP1, natural resistance-associated macrophage protein 1 PDCB, plasmodesmata callose-binding protein sic1, significant ionome changes 1.

S9 Fig. The expression pattern of HMA4 in the roots of Col-0 and sic1.

The insets showed an enlarged view of sic1 root hair. Scale bars represent 50 μm. Col-0, Columbia-0 HMA4, heavy metal ATPase 4 sic1, significant ionome changes 1.

S10 Fig. The expression of iron uptake related genes in the roots of Col-0 and sic1.

(A-B) The expression levels of IRT1 (A) and AHA2 (B) in the roots of Col-0 and sic1. The data represent the mean ± SE, n = 3. The asterisks above the bar represent a statistically significant difference (ص < 0.01) calculated using Student ر اختبار. The raw data can be found in S1 Data. AHA2, أرابيدوبسيس H + -ATPase 2 Col-0, Columbia-0 IRT1, iron regulated transporter 1 sic1, significant ionome changes 1.

S11 Fig. The recycling of PIN1 was affected in sic1 متحولة.

(A) The BFA compartments were observed after CHX and BFA treatment in Col-0 and sic1. (B) The subcellular localization of PIN1 in Col-0 and sic1 after BFA washout. Scale bars represent 20 μm. (C) The statistics analysis of percentage of cells with BFA bodies. The data represent the mean ± SE, ten seedlings of three independent transgenic lines were used in this analysis. The asterisks above the bar represent a statistically significant difference (ص < 0.01) calculated using Student ر اختبار. The raw data can be found in S1 Data. BFA, brefeldin A CHX, cycloheximide Col-0, Columbia-0 PIN1, PIN formed 1 sic1, significant ionome changes 1.

S1 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 grown in artificial soil.

Data represents means ± SE, ص-values were calculated by Student ر اختبار، ن = 12. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S2 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 grown in Hoagland’s solution.

Data represents means ± SE, ص-values were calculated by Student ر اختبار، ن = 7. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S3 Table. Root ionome of Col-0 and sic1 grown in Hoagland’s solution.

Data represents means ± SE, ص-values were calculated by Student ر اختبار، ن = 7. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S4 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 reciprocal grafting experiment.

Data represents means ± SE. sic1 /Col-0, grafted plants with sic1 shoot and Col-0 root Col-0/sic1, grafted plants with Col-0 shoot and sic1 root. ن = 7–19. Col-0, Columbia-0 NG, non-grafted plants SG, self-grafted Col-0 sic1, significant ionome changes 1.

S5 Table. Leaf ionome of genetic complementation.

Data represents means ± S.E., ن = 12 for each genotype.

S6 Table. Leaf ionome of sic1 transgenic complementation.

Data represents means ± SE, sic1 _CO1, sic1 _CO2 and sic1 _CO3, three independent transgenic complementation lines of sic1 with wild-type pSIC1::SIC1-GFP, ن = 7 for each genotype. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S7 Table. Root ionome of sic1 transgenic complementation.

Data represents means ±S.E., sic1 _CO1, sic1 _CO2 and sic1 _CO3, three independent transgenic complementation lines of sic1 with wildtype pSIC1::SIC1-GFP, ن = 7 for each genotype. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S8 Table. Primers used in this study (from 5ʹ–3ʹ).

بيانات S1. Data used to generate the figures.


شاهد الفيديو: انتقال الأكسجين من الحويصلات الهوائية إلى الشعيرات الدموية. أحياء (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Efrem

    يتفقون معك تماما. أحب فكرتك. أقترح أن تأخذ بها للمناقشة العامة.

  2. Fenrishura

    إنه رائع وبديل؟

  3. Kazigor

    قليل



اكتب رسالة