معلومة

هل يدعم الاقتران اختيار الجينات؟

هل يدعم الاقتران اختيار الجينات؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد قمت بالفعل بنشر هذا على الدردشة ولكن لم أتلق أي رد. حفزني سؤال حديث حول اختيار المجموعة على طرح هذا السؤال هنا.

أسئلة: لماذا يجب أن تترافق البكتيريا؟ إذا اعتبرنا أن البكتيريا هي منافس آخر للبكتيريا (من حيث الحصول على الموارد) فلماذا يجب على البكتيريا أن "تشترك" في الجين المقاوم للمضادات الحيوية ، على سبيل المثال ، مع بكتيريا أخرى؟ أستطيع التفكير في سببين. أحدهما هو اختيار المجموعة ، والآخر هو "اختيار الجينات". تعرض اختيار المجموعة لانتقادات شديدة في السنوات الأخيرة ، وسيطر الاختيار الفردي على التفكير ، ولكن هنا يذهب دعمي لاختيار الجينات بدلاً من الاختيار الفردي.

يبدو لي اختيار الجينات التفسير الأسهل على الاختيار الفردي. حتى لو أخذنا في الاعتبار حقيقة أن المستعمرة تتكون من انقسامات من خلايا مفردة وأن الخلايا متشابهة للغاية وأيضًا أن الاقتران أكثر احتمالًا بين خلايا المستعمرة ، يجب أن نأخذ في الاعتبار أيضًا أن الاقتران يمكن أن يحدث بين أنواع بكتيرية مختلفة جدًا.


سؤال مثير للاهتمام (سعيد لأن منشور "اختيار المجموعة" جعلك تفكر!)

فكرت أنا واثنان من الأصدقاء في سؤالك أثناء البكالوريوس في علم الأحياء في ICL (في الواقع ، فكرنا أيضًا في ظاهرة محيرة أكثر تسمى "التحول البكتيري" وهو ما يشبه الاقتران ، لكنهم يدمجون جينات من في ذمة الله تعالى البكتيريا !!) اعترف منظمنا للدورة في السنة الأولى بأن إجاباتنا هي "المرشحين الأكثر ترجيحًا" ، لذا ها هم:

1. فرضية التجريب الناجم عن الإجهاد

قد تتغير احتمالية حدوث الاقتران / التحول بالنسبة لمجموعة البكتيريا ككل اعتمادًا على مدى إجهادها (أو ربما إلى أي مدى تكون البيئة غير مألوفة؟). يمكن أن تتسبب إشارات الإجهاد في جعل السكان أكثر "خطورة" وأخذ الحمض النووي من البكتيريا الحية / الميتة المحيطة ودمجها مع الجينوم الخاص بها: "بحق الجحيم ، نحن خارج الخيارات ... دعنا نتحول إلى شيء يشبه السكان الأصليين أنواع هذا النظام البيئي الغريب! ". في الواقع ، تمتلك البكتيريا ذاكرة (انظر: الانجذاب الكيميائي) وهذا يعني أنها ربما تكون قادرة على معرفة ما إذا كانت تتعرض لمزيد من الإجهاد. حاليا في مقابل قبلبمعنى أنه يمكنهم "التجربة والخطأ" مع جينات مختلفة تم استيرادها داخل بلازميداتهم! - "لنجرب هذا الجين ، انتظر ... أنا أموت ، هيا لنقتل هذا البلازميد ونأخذ المزيد من الجينات!".

ردًا على هذا ، قال منظمي الدورة:

"آه نعم ، يحدث التحول من التكاثر اللاجنسي إلى التكاثر الجنسي في العديد من الكائنات الحية تحت الضغط. قد تكسب الجينات التي تسبب حدوث الجنس / التحول فائدة صافية من إعادة التركيب مع الجينات المأخوذة من الكائنات الحية الأخرى / البيئة."

2. التنوّع فرضية الانتحال

إذا نظرنا إلى المجموعة الكاملة من البكتيريا المترافقة كوحدة منافسة واحدة بحد ذاتها (على سبيل المثال ، الأنسجة هي مجموعة منسقة من الخلايا المتخصصة) التي يمكنها التنافس مع مجموعات أخرى من البكتيريا التي لا تستطيع اقتران السكان المقترنين سوف "تفوز". هذا لأن السكان المترافقين سيكون لديهم دائمًا تنوع مظهري أعلى بكثير حيث يمكنه مزج السمات بين الأفراد. هذا يعني أن المجتمع المقترن يكون أكثر كفاءة في الخضوع للانتقاء الطبيعي للسمات المفيدة أو مجموعات السمات.

فكر في الانتقاء الطبيعي (مقترنًا بالطفرة) باعتباره مخترع… الشيء الذي يساعدك على ابتكار "بكتيريا مجرب" هو القدرة على فصل الأشياء عن هذه البكتيريا وتلك البكتيريا ولصقها معًا ، وهذا أساسًا ما يفعله الاقتران / التحول !! يسمح لك بسحب أجزاء من هذه البكتيريا وإلصاقها بقطع من تلك البكتيريا للحصول على "بكتيريا فائقة". إنها مثل تقنية مفتوحة المصدر (مجانية للمشاركة) بدلاً من التكنولوجيا الحاصلة على براءة اختراع !! يعتبر الاقتران أمرًا جيدًا على الفور لأنه يعني أنه يمكنك "سرقة" التكنولوجيا الرائعة من البكتيريا الحية / الميتة ودمجها في مجموعة الجينات الخاصة بسكانك!

أتمنى أن يكون هذا مفيدًا!


اقتران

الجينات المساعدة المحمولة على البلازميدات المقترنة

تم تصنيف البلازميدات المقترنة بعدة طرق ، اعتمادًا على جانب الاهتمام:

الجينات الملحقة. في معظم الحالات ، تحمل البلازميدات الاقترانية العديد من الجينات الملحقة الأخرى غير المرتبطة بعملية الاقتران. الأهم من ذلك ، بالنسبة للبشر ، فإن جينات مقاومة المضادات الحيوية هي من بين الجينات المحمولة على البلازميدات ، وتسمى عوامل مقاومة المضادات الحيوية المنقولة هذه عوامل R.

جينات النسخ المتماثل. يقال إن البلازميدات المقترنة غير القادرة على التكاثر المستقر في نفس الخلية تنتمي إلى نفس مجموعة عدم التوافق (Inc). ميزات التحكم في النسخ هي المسؤولة عن عدم التوافق. تم تحديد ما لا يقل عن 30 مجموعة مختلفة من البلازميدات بين البكتيريا المعوية وحدها.


المضادات الحيوية كمحرك انتقائي لديناميات الاقتران

من المفترض عمومًا أن المضادات الحيوية يمكن أن تعزز نقل الجينات الأفقي. ومع ذلك ، بسبب مجموعة متنوعة من العوامل المربكة التي تعقد تفسير الدراسات السابقة ، فإن الآليات التي تعدل بها المضادات الحيوية نقل الجينات الأفقي تظل غير مفهومة. على وجه الخصوص ، من غير الواضح ما إذا كانت المضادات الحيوية تنظم بشكل مباشر كفاءة نقل الجينات الأفقي ، أو تعمل كقوة اختيار لتعديل ديناميكيات السكان بعد حدوث هذا النقل الجيني ، أو كليهما. هنا ، نعالج هذا السؤال من خلال تحديد ديناميكيات الاقتران في وجود وغياب الانتقاء بوساطة المضادات الحيوية. بشكل مفاجئ ، وجدنا أن التركيزات شبه المميتة للمضادات الحيوية من الفئات الأكثر استخدامًا لا تزيد بشكل كبير من كفاءة الاقتران. بدلاً من ذلك ، توضح نتائجنا التجريبية والنمذجة أن ديناميكيات الاقتران تمليها الانتقاء بوساطة المضادات الحيوية ، والتي يمكن أن تعزز وتثبط ديناميكيات الاقتران. تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن مساهمة المضادات الحيوية في تعزيز نقل الجينات الأفقي قد يكون مبالغًا في تقديرها. هذه النتائج لها آثار على تصميم بروتوكولات العلاج الفعال بالمضادات الحيوية ولتقييم مخاطر استخدام المضادات الحيوية.

يعتبر نقل الجينات الأفقي (HGT) عاملاً رئيسياً في انتشار الجينات المقاومة للمضادات الحيوية 1-3. على العكس من ذلك ، تم افتراض أن المضادات الحيوية تعزز HGT 4،5. واحدة من أكثر الآليات شيوعًا لـ HGT ، خاصة لنقل البلازميدات مثل تلك التي تحمل مقاومة المضادات الحيوية ، هي الاقتران 2،6،7. هناك طريقتان عريضتان يمكن من خلالهما للمضادات الحيوية تعزيز HGT عبر الاقتران. أولاً ، عند جرعاتها بتركيزات شبه مميتة ، يمكن للمضادات الحيوية زيادة معدل الاقتران إما عن طريق تنشيط استئصال الجينات القابلة للنقل من كروموسوم المضيف أو عن طريق تحفيز التعبير عن آلية الاقتران (أو كليهما) 8-12. ثانيًا ، تم التكهن ، ولكن لم يتم إثبات ذلك ، أن المضادات الحيوية يمكن أن تسبب استجابات خلوية عالمية ، مثل التغييرات في تكوين جدار الخلية أو زيادة تنظيم جينات البقاء الرئيسية 13 ، 14 ، والتي يمكن أن تزيد بشكل غير مباشر من معدل الاقتران 15-17.


النتائج

على سبيل المثال ، تم إجراء الاقتران باستخدام سلالة المتبرع S17-1 التي تحتوي على البلازميدات المقترنة pARO181 أو pARO190 وسلالة المستلم JM109. بعد الاقتران على أجار LB المحتوي على حمض الناليديكسيك وعلامة اختيارية ، كاناميسين أو أمبيسلين ، بعد اختيار المضادات الحيوية كما ذكرنا سابقًا ، تم حساب المتحولين لحساب كفاءة الاقتران (الجدول 2). تم عزل إجمالي الحمض النووي من بعض المستعمرات على ألواح الاقتران عن طريق الخلط الدوامي مع 15 ميكرولتر من محلول TE لمدة 3 دقائق وتشغيله على 0.8 ٪ من الاغاروز الكهربائي للهلام باستخدام DNA البلازميد المترافق المعزول من سلالات المتبرع كعناصر تحكم إيجابية. كما هو مبين في الشكل 1 ، يجب أن يعطي مجموع الدنا من المتحوِّلات المتحولة نفس النمط مثل البلازميدات المقترنة المعزولة من السلالات المانحة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضًا استخدام طريقة التحلل القلوي miniprep [12] لعزل البلازميدات من أجل المتبرع والمتلقي والمتحول.

الاغاروز الكهربي للهلام المتحولة مقارنة بالبلازميدات المقترنة. حارة M: سلم DNA بسعة 1 كيلو بايت. المسار 1: البلازميدات (أ) pARO181 و (ب) pARO190 معزولة عن المانحين باستخدام الإعداد المصغر. الممرات 2-3: مجموع الحمض النووي الذي يتضمن (أ) pARO181 و (ب) pARO190 المعزول من المتبرعين. الممرات 4-6: مجموع الحمض النووي المعزول من المتحولات المترابطة التي تحتوي على (أ) pARO181 و (ب) pARO190. المسار 7: مجموع الحمض النووي المعزول من المتلقي. المسار 8: مجموع الحمض النووي المعزول من المتبرع E. coli S17-1. إجمالي مستخلصات الحمض النووي من المتحولون متشابهون مع تلك المأخوذة من المتبرع S17-1 الذي يحتوي على pARO181 أو pARO190 ، ولكن لا يوجد بلازميد في سلالة المتلقي JM109. العصابات السميكة المتوقعة في ممرات المتبرعين (الممرات 2–3) والمتحولين (الممرات 4-6) هي DNA البلازميد الفائق (النطاق السفلي) والدنا البلازميدي الدائري المفتوح (النطاق الأعلى). أعلى نطاق في الممرات 2-8 هو الحمض النووي الصبغي.

البلازميد المقترن عدد المتبرعين في 1 مل عدد المستلمين في 1 مل المانح: نسبة المتلقين عدد المتحولين في 1 مل كفاءة الاقتران أ كفاءة الاقتران هي عدد المتحولين لكل خلية مانحة.
بارو 181 1.62 × 10 11 2.83 × 10 11 2:3 1.53 × 10 6 9.44 × 10 −6
بارو 190 1.73 × 10 11 2.83 × 10 11 2:3 1.84 × 10 6 1.06 × 10 −5
  • كانت جميع القيم من مكررين في تجربتين مستقلتين.
  • (أ) كفاءة الاقتران هي عدد المتحولين لكل خلية مانحة.

نتائج

يؤثر الحصول على RP4 على ديناميكيات النمو

لاستكشاف كيفية تأثير اكتساب البلازميد على النمو المتحول ، سعينا إلى مقارنة ديناميكيات النمو لـ من جديد المتحولون المتحدون (الذين لم يخضعوا للتكيف الفسيولوجي) لتلك التي تم إنشاؤها سابقًا (وبالتالي تم تكييفها بالكامل). من جديد يمكن إنشاء transconjugants (T) بسهولة باستخدام البروتوكول الذي وضعناه مسبقًا لتقدير كفاءات الاقتران (Lopatkin وآخرون، 2016 أ): يتم خلط المتبرعين (D) والمستلمين (R) الذين يحملون جينات مقاومة فريدة في ظل ظروف تقلل من النمو. نظرًا لأن T مقاوم بشكل فريد لكل من المضادات الحيوية ، يمكن بعد ذلك اختياره مباشرة من السكان ، وتتبع نموه بمرور الوقت في قارئ الصفيحة الدقيقة (الشكل 1 ب). هذا الإجراء مثالي لأغراضنا لأنه يقلل من النمو والتكيف أثناء نافذة الاقتران ، مما يضمن التوصيف الديناميكي اللاحق لـ من جديد T يلتقط التغيرات المظهرية الناشئة. على النقيض من ذلك ، يمكن عزل T المُعدَّلة عن طريق وضع مخاليط الاقتران على صفائح أجار ثنائية المضادات الحيوية ، ويمكن بعد ذلك زراعة الحيوانات المستنسخة الفردية وتخزينها للاختبار اللاحق (Dahlberg & Chao ، 2003 Rozwandowicz وآخرون، 2019). تُظهِر هذه المتحوِّلات المتحوِّلة المُثبتة معدلات نمو قابلة للتكرار بثبات ، وغالبًا ما تُستخدم لتحديد تكاليف اللياقة البدنية و / أو تحديد النطاق الزمني للطفرات التعويضية (هاريسون) وآخرون، 2015 Hall وآخرون, 2020 ).

باستخدام هذا النهج ، ركزنا أولاً على البلازميد الزوجي الكبير الراسخ RP4 (

60 كيلو بايت). لقد اخترنا RP4 منذ أن كشف التوصيف الأولي أنه يفرض تكلفة لياقة على الخلية ، مما يسمح لنا بالتمييز بين تكاليف الاستحواذ الفورية والطفرات التعويضية بعد ذلك (الملحق الشكل S1A). باختصار ، تم إنشاء D و R باستخدام الإشريكية القولونية تعبر سلالات MG1655 (جدول الملحق S1A) R عن مقاومة سبيكتينوميسين (المواصفات) ، بينما يشفر D ، الذي يحمل البلازميد RP4 ، مقاومة كاناميسين (Kan). لقياس نمو من جديد تم خلط T و D و R لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية ، وتم تخفيفها بمقدار 1000 × في وسائط سائلة من نوع Spec-Kan ، وتعقبها عبر OD600 في قارئ صفيحة ميكروسكوبية. في موازاة ذلك ، تم تحضين الحيوانات المستنسخة T المُكيَّفة في ظل ظروف متطابقة (على سبيل المثال ، ساعة واحدة ، 25 درجة مئوية) للتحكم في أي تأثيرات فسيولوجية للبروتوكول نفسه ، وتم تخفيفها لاحقًا في وسائط سائلة Spec-Kan بكثافة خلية أولية مماثلة ، كما تم التحقق منه مع وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) (الملحق الشكل S1B).

اللافت للنظر ، من جديد يبدو أن T ينمو بشكل عام أبطأ من T المتكيف (الشكل 1C). في الواقع ، كشف تركيب المنحنى باستخدام معادلة باراني (Baranyi & Roberts ، 1994) عن ذلك من جديد كان معدل نمو T أقل بكثير ، ووقت التأخر أعلى بكثير من معدل نمو T (الشكل 1D ، الملحق الشكل S1C ، ص = 1.12e-08 و ص = 5.71e-09 على التوالي). كانت هذه النتائج مستقلة عن مدة الاقتران: أظهرت الخلائط المحتضنة لمدة 15 و 120 دقيقة اتجاهات مماثلة (الشكل 1E والتذييل الشكل S1C). ومع ذلك ، عندما تم تخفيف هؤلاء السكان وإعادة نموهم بعد 24 ساعة ، تمت استعادة كل من معدل النمو ووقت التأخر بالكامل (الشكل 1F). الأهم من ذلك ، في جميع الحالات ، ظلت معدلات النمو المستردة أقل من تلك الخاصة بالسلالة الخالية من البلازميد ، مما يشير إلى احتفاظ البلازميد بتكلفة لياقته (الشكل 1 د). أخيرًا ، كانت هذه النتائج مستقلة عن الطريقة المستخدمة لتحديد معلمات النمو نظرًا لأن ثلاث طرق إضافية للقياس الكمي أدت إلى اتجاهات متسقة نوعياً (الملحق الشكل S2 ، الجدول الملحق S2).

على الرغم من أن هذه النتائج تشير في البداية إلى أن الحصول على RP4 مكلف ، فقد حددنا العديد من العوامل المتعلقة بالبروتوكول والتي من المحتمل أن تكون مسؤولة عن هذه الملاحظات. أولاً ، يتطلب البروتوكول من جديد T للتكيف مع بيئة نمو جديدة ، وربما تغيير ديناميكيات النمو بشكل مستقل عن التأثيرات الخاصة بالاقتران. ومع ذلك ، تعرض T المتكيف لظروف تجريبية متطابقة ، والتي تمثل أي تأثير للتكيف البيئي على النمو المستقل عن الاقتران. ثانيًا ، يمكن أن تتغير المنافسة مع خلايا R / D المتبقية من جديد نمو تي. لاختبار ذلك ، بدأنا نمو T المتكيف مع R / D المخفف 1000 × في وسائط الخلفية ، وهذا يقارب الكثافة الأبوية الموجودة أثناء تجربة الاقتران. لم يؤثر القيام بذلك من الناحية النوعية على مسار T المتكيف ، ولا على تناقض النمو بين المتكيف و من جديد T (الملحق Fig S1D). علاوة على ذلك ، لم يكن هناك اقتران خلفية ملموس لـ R / D بهذه الكثافة (الملحق الشكل S1E) ، مما يشير إلى أنه لم ينج أي من السكان لفترة كافية للاقتران خلال هذه النافذة الزمنية. بشكل عام ، نستنتج أن الحصول على RP4 مكلف بالفعل ، وأن الحصول على البلازميد يمكن أن يعدل كل من معدل النمو ووقت التأخر.

إدخال مقياس كمي لتكلفة اقتناء البلازميد

يعتبر اكتساب RP4 الذي أحدثه تغييرات عابرة في كل من معدل النمو ووقت التأخر أمرًا بديهيًا: يتوافق معدل النمو المنخفض مع تفسيرات تكلفة اللياقة البدنية كعبء استقلابي مرتبط بالتكرار / التعبير عن البروتين. علاوة على ذلك ، من المعروف أن الاستجابة الفورية للخلية لاضطراب التمثيل الغذائي تظهر في ديناميكيات التأخر المتغيرة ، مثل اتباع تحول المغذيات (Madar وآخرون، 2013). لذلك ، لتسهيل القياس الكمي ، سعينا إلى تحديد مقياس اقتناء بلازميد صارم ودقيق من شأنه أن يلتقط جميع تأثيرات اكتساب البلازميد على ديناميكيات النمو. تحقيقًا لهذه الغاية ، اقترح نموذج أدنى لنمو الخلايا أن الوقت المطلوب للوصول إلى كثافة عتبة محددة مسبقًا هو وكيل شامل للتغييرات في كل من معدل النمو ووقت التأخر (الشكل 2 أ والملحق الشكل S3) وهذا يتفق مع دراسة حديثة أن استخدمت طريقة "الوقت حتى العتبة" المماثلة لمقارنة كفاءات الاقتران في المختبر (بيثكي وآخرون, 2020 ).

الشكل 2. تقدير تكلفة الاقتناء ل RP4

  1. يعتمد الوقت (t * ، البرتقالي) الذي يتم فيه الوصول إلى حد كثافة الخلية المحدد (T * ، أعلى بنفسجي) بشكل فريد على كثافة الخلية الأولية (T0، أسفل الأرجواني) ، ومعدل النمو (µ ، مائي) وأوقات التأخر (λ ، برتقالي). بافتراض طرح الخلفية ، يمكن تمثيل الخط بالمعادلة الموضحة.
  2. يظهر جيل المنحنى المعياري التمثيلي. اليسار: لإنشاء المنحنى القياسي ، يتم تخفيف T المتكيف بزيادات قدرها 10 أضعاف ويتم قياس النمو بمرور الوقت (الرمادي الداكن إلى الرمادي الفاتح هو T0). تشير الدوائر إلى t * (الخط الأرجواني) المقابل لـ T * (الخط البرتقالي). يمثل خط أكوا النمو الخارجي لـ T بعد تجربة الاقتران (أي ، من جديد تي). حق: الكثافة الأولية للخلية تتآمر ضدها ر * يشير الخط الأسود إلى المنحنى القياسي.
  3. اليسار: بدأ نمو T المتكيف RP4 بتناقص T صحيح0 تظهر العلامات الزرقاء (الداكنة إلى الرمادي الفاتح) الوقت للوصول إلى OD600 من 0.275 (طن *). حق: يظهر المنحنى القياسي باللون الأزرق. أشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري لثلاث مكررات بيولوجية.
  4. CFU صحيح ومتوقع لـ RP4 مع المستلم بكتريا قولونية سلالة MG1655. تمثل نقاط التشتت ثلاث مكررات بيولوجية ، ويكون ارتفاع الشريط هو المتوسط.
  5. CFU صحيح ومتوقع لـ RP4 مع المستلم K. الرئوية (KPN) سلالة AL2425. تمثل نقاط التشتت أربع مكررات بيولوجية ، ويكون ارتفاع الشريط هو المتوسط.

البيانات المصدر متاحة على الإنترنت لهذا الرقم.

باختصار ، دع T (t) يصف نمو المتحولون المتحولون بمرور الوقت ، و يكون الحد الأقصى لمعدل النمو المحدد. بما يتفق مع الأدبيات السابقة (Métris وآخرون، 2006) ، فإن استقراء منطقة النمو الأسي إلى المحور الأفقي يسمح لنا بتحديد وقت التأخر الهندسي (λ) ، والذي يتوافق مع البداية الملحوظة للنمو الأسي (الشكل 2 أ). خلال المرحلة الأسية ، تي(ر) يمكن وصفها بالسطر التالي: ln (تي(ر)) = ln (تي0) + µ (ر-λ) ، حيث T0 هي الكثافة السكانية الأولية الحقيقية. في ظل هذه الظروف ، فإن الوقت (ر *) يأخذ السكان للوصول إلى مستوى كشف محدد (تي *) يرتبط عكسيا مع تي0. بمعنى آخر ، يمكننا التنبؤ بكثافة خلية أولية غير معروفة (تيمقدس) من الوقت الملحوظ حتى العتبة (ر *) القيمة ، على افتراض تي * و و ثابتة (الشكل 2 ب). على العكس من ذلك ، هناك تناقض بين تيمقدس و صحيح تي0، التي يمكن أن تحددها CFU ، تشير على وجه التحديد إلى أن µ و / أو قد تغيرت. لأغراضنا ، ضع في اعتبارك المنحنى القياسي المرتبط ر * و تي0 باستخدام تكييفها تي، وأ تيمقدس ولدت من أ من جديد تي السكان كما هو موضح أعلاه. في هذه الحالة ، فإن أي تناقض بين T.مقدس وصحيح T0 (على سبيل المثال ، تيمقدس/تي0 & lt 1) إلى عواقب خاصة بالنمو لاكتساب البلازميد. علاوة على ذلك ، فإن استخدام تي0 كمقياس لتكلفة الشراء ، بدلاً من ر * ، يسمح لنا بمقارنة معدلات الاقتران في وقت واحد عبر مختلف الظروف التجريبية والبلازميدات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إنشاء ملف بداهة المنحنى القياسي الذي يمتد على نطاق واسع من الكثافات الأولية يتجنب أيضًا التباين المتأصل في التخفيف المتكيف يدويًا تي إلى رقم مستهدف محدد ، كما فعلنا في البداية (الشكل 2 ب). على هذا النحو ، فإن التنبؤ بالمقارنة مع CFU الحقيقي يمثل طريقة قياس كمية أكثر قوة وجديرة بالثقة.

لقد تحققنا من فائدة هذا المقياس من خلال التأكيد على أنه يمكنه التقاط التناقضات الملحوظة في نمو RP4.على وجه التحديد ، قمنا ببناء منحنى قياسي باستخدام T المعدل (الشكل 2C) وتوقعنا الأولي من جديد الكثافة السكانية T (تيمقدس) استنادًا إلى أوقات العتبة المقدرة من منحنيات النمو المرصودة. بعد التحقق من صحة T0 مع أعداد CFU ، وجدنا ذلك تيمقدس كان أقل بكثير من الصحيح تي0 (ص = 0.0143 ، الطرف الأيمن ر-اختبار) ، مشيرًا إلى تكلفة الاستحواذ لـ RP4 (الشكل 2D) ، كما هو متوقع. نلاحظ أن المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه باستخدام R و D المخفف بمقدار 1000 × في وسائط الخلفية لتقريب الكثافة الأبوية الموجودة أثناء تجربة الاقتران لا يغير بشكل كبير التناقض الملحوظ بين صحيح تي0 و تيمقدس (التين الملحق S4A و B) ، بما يتفق مع سابقًا.

عمومية تكلفة اقتناء البلازميد

للتحقيق في عمومية تكلفة الاستحواذ ، حددنا أولاً ما إذا كانت فريدة من نوعها لظروفنا التجريبية الخاصة. على وجه التحديد ، قارنا الصحيح تي0 و تيمقدس تقديرات لـ RP4 باستخدام معلمات تجريبية مختلفة (على سبيل المثال ، عامل التخفيف ، نافذة وقت الاقتران ، إجهاد المستلم). كشفت النتائج أن تكلفة اقتناء RP4 كانت مستقلة عن نافذة وقت الاقتران كما هو موضح سابقًا (الملحق الشكل S4C i) ، وسلالة المستلم (الملحق الشكل S4C ii) ، وعامل التخفيف (الملحق الشكل S4C iii-iv) في الواقع ، عوامل التخفيف الخاصة بـ توقعت 150 × و 500 × و 1000 × و 5000 × منحنى قياسي منفصل ولكن متوازي (الملحق الشكل S4D) ، مما يشير إلى وجود فرق منتظم بين التقديرين. علاوة على ذلك ، كان الحصول على RP4 مكلفًا لسلالة المتلقي المعزول إكلينيكيًا الكلبسيلة الرئوية(KPN) ، مما يشير إلى العمومية على مستوى الأنواع (الشكل 2E). الفرق الكبير في تكاليف الاستحواذ RP4 بين بكتريا قولونية يشير متلقو KPN إلى أن التكلفة ليست مجرد وظيفة لسلالة معينة من البلازميدات / سمات على مستوى الأنواع من المحتمل أن تكون أساسية أيضًا.

بعد ذلك ، استنتجنا أن وقت التكرار الطويل للبلازميد RP4 الكبير (

60 كيلو بايت) ، إلى جانب الكمية الكبيرة من الطاقة المطلوبة لتجميع آلات الاقتران عند الاستحواذ ، من المحتمل أن يفرض عبئًا هائلًا على الطاقة أدى إلى تثبيط عابر للنمو ، وبالتالي ، تكلفة شراء عالية (San Millan & MacLean ، 2017). على العكس من ذلك ، افترضنا أن البلازميدات القابلة للتعبئة ، والتي يتم نقلها عن طريق الاقتران في العابرة ولكن لا تقوم هي نفسها بتشفير آلات الاقتران ، فمن المرجح أن يؤدي ذلك إلى الحد الأدنى من تكلفة الشراء. يقلل غياب ترميز الجينات لآلات الاقتران من حجم البلازميد وعبء إنتاج الآلات. لاختبار هذا ، استخدمنا Fالموارد البشرية نظام البلازميد المساعد الموصوف سابقًا (Dimitriu وآخرون، 2014) ، وهو غير قابل للانتقال ذاتيًا ولكن يمكنه تعبئة أي بلازميد مشترك يشفر تسلسل التعرف oriT. اخترنا plasmid pR القابل للتعبئة والذي يحمل مقاومة الكلورامفينيكول. كما هو الحال مع RP4 ، يعرض هذا البلازميد تكلفة لياقة شاملة (الملحق الشكل S5). تمشيا مع فرضيتنا ، تتداخل منحنيات النمو بعد الاقتران مع تلك المستخدمة لتحديد المنحنى القياسي (الشكل 3 أ). في الواقع ، كشفت التجارب عن تطابق إحصائي متطابق بين الصواب تي0 و تيمقدس (الشكل 3 ب ، ص = 0.34 و 0.86 للذيل الواحد وذيل واحد ر-الاختبارات ، على التوالي). وبالتالي ، نستنتج أن pR لا يؤدي إلى تكلفة اقتناء كبيرة. بشكل عام ، تؤكد هذه النتائج أن تكاليف الشراء الملحوظة ، على النحو الذي يحدده الاختلاف في تقديرات المتحول (تي0 و تيمقدس) ، ليست من القطع الأثرية للطريقة التجريبية ويمكن اكتشافها باستخدام مقياس القياس الكمي هذا.

الشكل 3. عمومية تكلفة الشراء

  1. التطوير التنظيمي600 ل من جديد (أكوا) و transconjugants المعدلة (رمادي) لبلازميد pR تظهر بمرور الوقت. الخطوط السوداء هي الأنسب. المنحنيات الفردية هي مكررات بيولوجية.
  2. CFU الحقيقية والمتوقعة لـ pR البلازميد متطابقة إحصائيًا (ص = 0.34 و 0.86 للذيل الواحد والثنائي الذيل ر-الاختبارات ، على التوالي). تمثل نقاط التشتت التكرارات البيولوجية ، ويكون ارتفاع الشريط هو المتوسط.
  3. تظهر معدلات النمو للتي تحمل RP4 المعدلة تحت تركيزات متغيرة من الجلوكوز (glu) وحمض الكازامين (caa). تمثل القيم٪ w / v. تمثل نقاط التشتت مكررات بيولوجية.
  4. تم تقدير تكاليف الاقتناء لنفس تركيزات الجلوكوز وحمض الكازامينو من (C). تمثل نقاط التشتت المتوسط ​​، وتمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري لثلاث مكررات بيولوجية. يشير اللون المائي والأحمر إلى الجلوكوز عند 0.4٪ و 0.04٪ وزن / حجم على التوالي. المحور الصادي هو تكلفة الاستحواذ (تيمقدس/تي0) تم تطبيعه مع التكلفة في حالة عدم وجود أحماض الكازامينو.
  5. تيمقدس مقارنة بـ T.0 لستة بلازميدات جيدة التوصيف. يتم عرض الممثلين لاثنين من التكرارات البيولوجية (انظر الملحق الشكل S10 للتغير من يوم إلى يوم). لا تُظهر R1 و R1drd و pRK100 تكلفة اقتناء كبيرة (ص = 0.93 و 0.79 و 0.28 على التوالي) ، في حين أن RIP113 و R6K و R6Kdrd تفعل (ص = 6.79e-05 و 7.57e-05 و 0.037 على التوالي ، وحيد الذيل ر-الاختبار ، جدول الملحق S3A).
  6. تيمقدس كان أقل بكثير من T.0 للبلازميدات السريرية p41 و p168 و p193 و p283 عند 37 درجة مئوية (ص = 7.10e-05 ، 2.10e-05 ، 0.021 ، 1.90e-05 ، على التوالي ، ن = 4 ، 4 ، 3 ، 2 ، على التوالي ، وحيد الذيل ر-الاختبار ، جدول الملحق S3A). في جميع الحالات باستثناء p283 ، تمثل الأعمدة المتوسطات ونقاط التشتت القياسات الفردية من ثلاثة مكررات بيولوجية على الأقل ، يحتوي p283 على نسختين بيولوجيتين.
  7. تيمقدس بالنسبة لاثنين من البلازميدات السريرية ، p193 و p168 ، عند 30 درجة مئوية كان أقل بكثير من T0 (ص = 2.80e-04 ، 2.72e-04 ، على التوالي ، ن = 3 ، 4 ، على التوالي ، وحيدة الطرف ر-الاختبار ، جدول الملحق S3A).
  8. جميع تكاليف الشراء مبعثرة مقابل تكلفة اللياقة المقاسة في ظل نفس الحالة لكل بلازميد. يتم قياس تكاليف الاستحواذ على أنها النسبة بين تيمقدس/تي0. الخط الأسود هو خط الانحدار الخطي الأنسب ، و ص 2 = 0.01 (موضح في أسفل اليسار). تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري ، يتم سرد نوع النسخ المكررة المستخدمة لأشرطة الخطأ هذه في جدول الملحق S3A.

البيانات المصدر متاحة على الإنترنت لهذا الرقم.

بالنظر إلى احتمال ظهور الاختلافات الخاصة بـ RP4 و pR بسبب الاختلافات في الطلب النشط ، افترضنا أن تغيير كفاءة النمو (على سبيل المثال ، كمية الركيزة المستهلكة التي يتم تحويلها إلى الكتلة الحيوية) (Chudoba وآخرون، 1992) من شأنه أن يعدل تكاليف الشراء. بشكل حدسي ، تولد الخلايا النامية غير الفعالة الطاقة الزائدة المتاحة (Russell & Cook ، 1995 Russell ، 2007) والتي يمكن تطبيقها بسهولة على متطلبات التمثيل الغذائي المتعلقة بالبلازميد ، مما قد يؤدي إلى انخفاض تكلفة الشراء. في المقابل ، تكرس الخلايا التي تنمو بكفاءة الجزء الأكبر من الطاقة المتاحة لإنتاج الكتلة الحيوية (Low & Chase ، 1999) ، وبالتالي ، فإن إعادة تخصيص هذه الطاقة لمتطلبات البلازميد قد يزيد من تكاليف الاستحواذ. لاختبار هذه الفرضية ، ركزنا على تعديل ظروف النمو. من المعروف أن الجلوكوز الزائد ينتج عنه عدم كفاءة عالية بكتريا قولونية النمو (ليو ، 1998 باسان وآخرون، 2015) ، ولكن يتم استعادة هذه الكفاءة مع مكملات الأحماض الأمينية الخارجية (Akashi & Gojobori ، 2002 Waschina وآخرون، 2016). تكييف نهج حديث استفاد من هذه المقايضة (Lopatkin وآخرون، 2019) ، قمنا بتحديد تكاليف الحصول على البلازميد في ظل ثلاثة تركيزات من حمض الكازامينو (CAA) (0 ، 0.01 ، و 0.1٪ وزن / حجم) والجلوكوز الزائد (0.4٪ وزن / حجم). نظرًا لأن CAA الأعلى يزيد من الكفاءة ومعدل النمو ، فقد قمنا بتضمين تركيبة رابعة (0.04٪ / 0.1٪ وزن / وزن الجلوكوز / CAA) حيث يكون معدل النمو مشابهًا لـ 0.4٪ / 0.01٪ وزن / حجم ، ولكن ينتج عنه كفاءة أعلى بسبب مستوى الجلوكوز المنخفض (الشكل 3 ج). وفقًا للحدس لدينا ، أدت زيادة CAA إلى انخفاض كبير في تكاليف الاستحواذ (الشكل ثلاثي الأبعاد ص & lt 0.05 ، وحيد الذيل ر-الاختبار ، انظر جدول الملحق S3B على وجه التحديد ص-القيم). علاوة على ذلك ، لم يكن هذا الاتجاه نتيجة لزيادة النمو: كانت تكلفة الاستحواذ في 0.04٪ / 0.1٪ جلوكوز / CAA أقل بكثير مما كانت عليه في 0.4٪ / 0.01٪ جلوكوز / ظروف CAA (ص = 0.04 ، وحيد الذيل ر-اختبار). تشير هذه النتائج معًا إلى أن الظروف البيئية تعدل بشكل كبير تكلفة الاستحواذ من خلال التغييرات في كفاءة النمو.

بعد ذلك نظرنا في تكاليف الاستحواذ عبر لوحة عريضة من البلازميدات لمزيد من التحقيق في عموميتها. على وجه التحديد ، قمنا أولاً بتحديد تكاليف الاستحواذ لستة بلازميدات زوجية جيدة التوصيف (R1، incF R1drd، incF R6K، incX R6Kdrd، incX pRK100، incF RIP113، incN Appendix Table S1B) التي تغطي أربع مجموعات عدم توافق إضافية ومجموعة من تكاليف اللياقة (الملحق الشكل S5). الأهم من ذلك ، زوجان من هذه البلازميدات يمثلان طفرات مكتئبة ونظرائهم المكبوتين الأصليين (R1 و R6K). على الرغم من أن كلا النوعين من البلازميد يعبران عن آلية الاقتران فور نقلهما ، إلا أن البلازميدات المكبوتة تنظم بشكل محكم التعبير الآلي بعد ذلك بوقت قصير ، مما يقلل من تكاليف لياقتهما (Lundquist & Levin ، 1986) (الملحق الشكل S5). ومن المثير للاهتمام ، أننا لاحظنا عدم وجود فروق نوعية في تكاليف الاستحواذ R1 أو R6K ، بغض النظر عن قمع الاقتران (الشكل 3E): كلاهما R6K / R6Kdrd ، ولا R1 / R1drd ، كان الحصول عليه مكلفًا. نظرًا لأن جميع المتغيرات تعبر عن الآلات فور الدخول ، فإن هذه النتائج تشير إلى أن قمع الآلات المقترنة يحدث على نطاق زمني أطول من تكلفة اقتناء هذه البلازميدات الأربعة. بدلاً من ذلك ، لاحظنا فروق تكلفة الاستحواذ عبر مجموعات عدم التوافق. على وجه التحديد ، جميع بلازميدات incF الأربعة (R1 ، R1drd ، و pRK100) ، جنبًا إلى جنب مع pR من وقت سابق ، لم تفرض أي تكلفة اقتناء كبيرة ، في حين أن R6K و R6Kdrd (incX) و RIP113 (incN) تسببت في تكلفة اقتناء قوية. يتم التمييز بين مجموعات عدم التوافق من خلال آليات النسخ / التقسيم البلازميدية بالإضافة إلى رقم النسخ المحدد (Kittell & Helinski ، 1993) على سبيل المثال ، توجد بلازميدات incF عادةً بأرقام نسخ منخفضة (≤

2) برجر وآخرون، 1981) ، بينما يمكن أن توجد بلازميدات incX بمعدل 10-15 نسخة لكل خلية (Rakowski & Filutowicz ، 2013). وبالتالي ، تشير هذه النتائج إلى أن تكاليف الاستحواذ قد تنشأ نتيجة لإنشاء آليات النسخ المتماثل والصيانة الخاصة بالبلازميد.

أخيرًا ، حددنا تكلفة الاستحواذ لأربعة بلازميدات سريرية ذاتية الانتقال تم الحصول عليها مسبقًا من عزلات مسببة للأمراض ترميز إنزيمات β-lactamase (ESBL) واسعة الطيف (Lopatkin وآخرون، 2017). تمنح هذه الإنزيمات مقاومة لمجموعة واسعة من أدوية بيتا لاكتام. كما هو الحال مع البلازميدات جيدة التوصيف ، تشمل هذه مجموعة من تكاليف اللياقة البدنية ، بما في ذلك التكلفة التي أثبتت فائدتها للمضيف (الملحق الشكل S5). على الرغم من هذا التنوع ، تيمقدس كان باستمرار وبشكل ملحوظ أقل من الصحيح تي0 لجميع البلازميدات ESBL (الشكل 3F ، ص & lt 0.05 ، وحيد الذيل ر-الاختبار ، انظر جدول الملحق S3A على وجه التحديد ص-القيم). ثبتت هذه النتيجة في درجات حرارة منخفضة للنمو الخارجي ولأزواج مختلفة من المانحين / المتلقين أيضًا (الشكل 3G). علاوة على ذلك ، لاحظنا تكلفة اقتناء كبيرة حتى عندما كانت التكلفة الإجمالية للياقة مفيدة ، كما كان الحال مع p193. بشكل عام ، نستنتج أن البلازميدات الزوجية المختلفة يمكن أن تتكبد تكاليف اقتناء فريدة ومتغيرة ، من المحتمل أن تعتمد أحجامها على مجموعة من العوامل البيئية والخاصة بالمضيف.

قمنا بتلخيص جميع تكاليف الاستحواذ على أنها النسبة بين Tمقدس وصحيح T0 ومقارنتها بتكاليف اللياقة لتحديد ما إذا كانت هناك أي علاقة ذات دلالة إحصائية بين القياسين. مجتمعة ، تغطي هذه 12 بلازميدات وخمس مجموعات عدم توافق (جدول الملحق S1A). كشف القيام بذلك عن علاقة غير ذات دلالة إحصائية بين المتغيرين (الشكل 3 ح) ، مما أدى بنا إلى استنتاج أنه على الرغم من أن الكلفتين قد يكون لهما قيود أساسية مماثلة ، إلا أنهما مفروضان في النهاية ، على الأقل جزئيًا ، بواسطة عوامل مستقلة.

النموذج الرياضي للاقتران الذي يفسر من جديد المتحولون

حتى الآن ، أظهرنا أن المتحولون المتحولون قد يُظهرون معدل نمو منخفضًا ووقتًا طويلًا للتأخر الكلي بعد الاقتران مباشرة. عادت ديناميكيات النمو المتغيرة هذه إلى المستويات المتوقعة في غضون 24 ساعة ، ومع ذلك ، أشارت معدلات النمو المستقرة إلى أن البلازميد احتفظ بتكلفة لياقته ، مما يشير إلى أن الطفرات التعويضية لم تحدث على الأرجح. في حين أن هذه التجارب قصيرة المدى مكنتنا من التحديد الكمي الدقيق لتأثيرات النمو المعتمدة على البلازميد ، إلا أنها لا توفر بالضرورة رؤى حول ديناميكيات السكان على المدى الطويل. في الواقع ، على مدى فترات طويلة ، من جديد يتم إنشاء المتحولون المتحولون باستمرار ، مما يؤدي إلى تأثيرات تنافسية محتملة وتكيف غير متجانس داخل مجموعة سكانية مختلطة. لالتقاط هذا التعقيد الإضافي وتوضيحه ووصف أفضل لكيفية تعديل تكلفة الاستحواذ للبنية السكانية الإجمالية ، قمنا بتعديل نموذج الاقتران المنشور مسبقًا (لوباتكين وآخرون، 2017) لمزيد من التحقيق في تأثير التكيف الفسيولوجي العابر للبلازميد على الديناميكيات قصيرة وطويلة الأجل (الملحق المعادلات S1-S2 الملحق الشكل S6A).

في أبسط الحالات ، ضع في اعتبارك مجموعة س تحتوي إما (S 1) أو لا (S 0) تحتوي على البلازميد الزوجي (الملحق الشكل S6A). تكتسب S 0 البلازميد من S 1 بمعدل ثابت ، كفاءة الاقتران (η) ، وبالتالي تصبح S 1. وبالمثل ، يمكن أن يفقد S 1 البلازميد بمعدل ثابت مرتبط بخطأ فصل البلازميد (κ) ، وبالتالي ينتقل مرة أخرى إلى S 0. بشكل حاسم ، فإن ديناميكيات النمو في هذا النموذج الأصلي تحكمها بشكل أساسي تكلفة اللياقة النسبية (على سبيل المثال ، µ1 = µ و µ0 = αµ) حيث µ1 و µ0 هي معدلات نمو S 1 و S 0 على التوالي ، و α هي عدد قياسي يمثل تأثير لياقة البلازميد: تشير α & gt 1 إلى أن البلازميد مكلف للمضيف ، بينما تشير α & lt 1 إلى الفائدة.

الشكل 4. نموذج الاقتران الذي يتضمن تكلفة الشراء

  1. مخطط الشبكة لنموذج الاقتران. يكتسب السكان الخاليون من البلازميد (S 0) البلازميد من السكان المتكيفين مع البلازميد (S A) ، ويتحولون إلى مجموعة عابرة من جديد المتحول (S D) بمعدل η (كفاءة الاقتران). أخيرًا ، يمكن أن تعود S A إلى S 0 وفقًا لمعدل خطأ الفصل البلازميدي κ. ال من جديد السكان ، بدورهم ، ينتقلون إلى السكان المكيفين بالمعدل β. يتم قياس معدلات النمو لـ S 0 و S D بالنسبة إلى السكان المتكيفين مع البلازميد (µ) بناءً على العدد القياسي α و ρ ، على التوالي. غير مدرج في الرسم التخطيطي: تمييع جميع السكان خارج النظام بمعدل D.
  2. كانت بيانات RP4 مناسبة للنموذج لحساب β و ρ. يُظهر الخط المنقط ملاءمة النموذج. البيانات مأخوذة من الشكل 1C.
  3. يتنبأ النموذج بمعدلات نمو دقيقة وأوقات تأخير بناءً على المعلمات المجهزة.
  4. حساسية المعلمة لـ ρ. قاع: يتم تعريف متوسط ​​معدل النمو الملحوظ على أنه (S D ρµ + S A µ) / (S D + S A) ، ويتم قياسه لزيادة β من الضوء إلى الظلام. قمة: الكثافة السكانية المقابلة لـ S 1 بمرور الوقت. β ثابت على 0.01 بناءً على تركيب RP4.
  5. حساسية المعلمة لـ β. قاع: تم قياس متوسط ​​معدل النمو الملحوظ لزيادة β من الضوء إلى الظلام حيث ρ = 0.3 (يسار) أو ρ = 0 (يمين). قمة: الكثافة السكانية المقابلة لـ S 1 بمرور الوقت.
  6. يتم إعادة ملاءمة بيانات RP4 (الشكل 4 ب) مع ثابت ρ (أعلى) وثابت (أسفل).

هنا ، ينتج عن الاقتران بين S 0 و S A تكوين S D ، والذي ينتقل لاحقًا إلى السكان المتحولين المتقاربين المتكيفين تمامًا S A بمعدل انتقال خاص بالبلازميد β. كما هو الحال في النموذج الأصلي ، تنمو جميع المجموعات لوجستيًا بقدرة تحمل مشتركة ويتم تخفيفها بمعدل D. علاوة على ذلك ، ينمو S D بمعدل نسبي لـ S A المعطى بواسطة µد = ρµ ، حيث ρ هو عدد قياسي بين 0 و 1. وهكذا ، كما هو الحال مع بياناتنا التجريبية ، فإن التأثير المشترك لـ ρ و يفسر تكلفة اقتناء البلازميد. أخيرًا ، استنادًا إلى بياناتنا التي تفيد بأن تكاليف الاستحواذ لم تكن مختلفة نوعيًا بين البلازميدات غير المضغوطة ونظيراتها المكبوتة أصليًا ، نفترض أن كلا من الاقتران وفقدان البلازميد من SD لا يكاد يذكر مقارنة بـ SA ومع ذلك ، نلاحظ أن هذا الافتراض لا يغير من الناحية النوعية النمذجة النتائج ولا تؤثر على استنتاجاتنا الرئيسية (الملحق الشكل S6C).

حدسيًا ، لا ينبغي أن يؤدي وجود S D إلى تغيير جذري في السلوك النوعي للنموذج الموسع مقارنة بالنموذج الأصلي. في الواقع ، عندما يكون كل من S 0 و S A موجودًا في البداية ، يتراكم S D على نطاقات زمنية قصيرة (على سبيل المثال ، 24 ساعة) ، ولكنه محدود بسبب قيود القدرة الاستيعابية (الملحق الشكل S6B). بدلاً من ذلك ، يقدم S D تأخيرًا زمنيًا في ديناميكيات المتحول الكلية. على وجه التحديد ، اعتمادًا على قيم ρ و ، يقلل نمو S D من معدل النمو الإجمالي لجميع الخلايا الحاملة للبلازميد (على سبيل المثال ، S 1 = S D + S A) ، وبالتالي يؤخر نمو الذروة وكثافة الحالة المستقرة. يتوافق هذا التفسير لتكلفة اقتناء البلازميد تمامًا مع أساليبنا التجريبية ، نظرًا لأنه يسمح بإجراء تغييرات في كل من معدل النمو وأوقات التأخر. علاوة على ذلك ، لم تميز قياساتنا بين S D و S A.

لاستكشاف ما إذا كان هذا النموذج يمكن أن يفسر نتائجنا التجريبية المرصودة ، سعينا أولاً لتحديد ما إذا كان النموذج الموسع يمكنه تلخيص ديناميكيات RP4. على وجه الخصوص ، نفترض أن كلا من التخفيف والفصل البلازميد لا يكاد يذكر ، بما يتوافق مع إعداد نمو الدُفعات هذا (جدول الملحق S4). ثم نلائم المعلمات غير المعروفة المتبقية (ρ و) لجميع السكان المتحولين (S 1) باستخدام محاكاة بدأت بنسبة 100٪ من جديد المتحولون (S D) (الشكل 4 ب). أدى القيام بذلك إلى تنبؤات دقيقة من الناحية الكمية لمعدلات النمو المرصودة وأوقات التأخر (الشكل 4 ج).

سعينا بعد ذلك إلى دراسة تأثير ρ و كميًا على معدل النمو الملحوظ لـ S 1 لفهم تأثيرهما الفردي بشكل أفضل. منذ انتقال S D إلى S A ، فإن معدل النمو الملحوظ لـ S 1 (μObs) يمكن تعريفه على أنه المتوسط ​​المرجح لكل من السكان المتحولين (معادلة الملحق S6) ، وبالتالي يتغير بمرور الوقت حيث يتم إنشاء وتكييف المتحولين حديثًا. كشفت المحاكاة أنه بالنسبة لـ β ثابت ، يكون ملف من جديد يسمح معدل النمو المتحول لمعدل النمو الملحوظ أن يظل أعلى طوال المدة بأكملها (الشكل 4 د قاع) ، ويتم تعديل S 1 وفقًا لذلك (على سبيل المثال ، النمو بشكل أسرع مع زيادة ρ ، الشكل 4D أعلى). وبالمثل ، بالنسبة إلى ثابت ρ ، وصل S 1 إلى الحد الأقصى لمعدل النمو (على سبيل المثال ، ذلك الذي حدده S A) بسرعة أكبر مع زيادة معدل الانتقال (β) وهذا يتوافق مع تثبيط النمو عندما يكون الانتقال بطيئًا (الشكل 4E) اليسار). ومن المثير للاهتمام ، على الرغم من ذلك ، حتى عندما من جديد لا يمكن أن تنمو المتحولون المتحدون (ρ = 0) ، فقد اتبعت معدلات النمو الملحوظة إلى حد كبير مسارات المتوقعة ، لتصل إلى أقصى مستوى داخل

24 ساعة (الشكل 4E حق). اقترحت هذه المحاكاة أن معدل الانتقال () بدلاً من معدل النمو المقاس (ρ) ، قد يكون مسؤولاً بشكل أساسي عن دقة التركيب.في الواقع ، كشف التركيب إما β أو بشكل فردي أن كان كافياً للتنبؤ بديناميكيات نمو RP4 ، بينما لم يكن (الشكل 4F). بناءً على هذه الملاحظات ، اعتبرنا β المحرك الأساسي لتكلفة الشراء للتحقيق اللاحق في تفاعلها مع تكاليف اللياقة البدنية.

إن دمج تكاليف الحصول على البلازميد يتنبأ بشكل أفضل بديناميات الاقتران الزمني

كما هو موضح أعلاه ، من الثابت أن تكاليف اللياقة البدنية تؤثر على البنية السكانية والديناميات الزمنية في المجتمعات غير المتجانسة بمرور الوقت. تحقيقًا لهذه الغاية ، استخدمنا مؤخرًا النموذج الأصلي (الملحق الشكل S6A ، معادلات الملحق S1-S2) للتنبؤ بدقة بمصير البلازميد في المجتمعات المختلطة من الخلايا الخالية من البلازميد والخلايا الحاملة للبلازميد ، وجدنا أنه حتى البلازميدات المكلفة يمكن أن تستمر بسرعة كافية. معدل الاقتران (لوباتكين وآخرون، 2017). ومع ذلك ، لم يكن هذا النموذج دائمًا قادرًا على التقاط السلوكيات الزمنية كميًا لمجموعة البلازميدات التي اختبرناها. بالنظر إلى أن اكتساب البلازميد والتكيف اللاحق هو عملية مستمرة ، فقد اعتقدنا أن نموذجنا الموسع قد يوفر مزيدًا من البصيرة والدقة نحو التنبؤ بديناميات الاقتران على المدى الطويل. في الواقع ، كشفت عمليات المحاكاة التي بدأت بشروط مماثلة كما في الإعداد السابق (على سبيل المثال ، S D = 0 الأولي) أن S D قد لا يزال يساهم بشكل كبير في البنية السكانية الإجمالية عند وجود تكلفة اقتناء (الشكل 5 أ). وبالتالي ، سعينا بعد ذلك إلى استخدام نموذجنا الموسع لتحديد المساهمة النسبية لكل من تكاليف اللياقة والاكتساب: إلى أي مدى تعدل هاتان العمليتان الديناميكيات السكانية الزمنية الإجمالية؟

الشكل 5. تكلفة اللياقة مقابل تكلفة الشراء

  1. تظهر الديناميات الزمنية طويلة المدى لـ S A و S 0 و S D باللون الأحمر والأزرق والرمادي ، على التوالي ، من النموذج الرئيسي (الشكل 4 أ). المحور السيني هو الوقت الذي يزيد عن 21 يومًا ، والمحور الصادي هو جزء من كل مجموعة.
  2. يبدأ السكان بنسبة 1: 1 من S 0 و S A ويتم تتبع إجمالي جزء السكان الحامل للبلازميد (S 1 = S A + S D) بمرور الوقت. اليسار: β ثابت (β = 0.01) ويزيد α من بلا تكلفة (α = 1) إلى تكلفة عالية (α = 1.5). حق: α ثابت (α = 1.2) ويزيد β من الانتقال البطيء (β = 10 −4) إلى الانتقال السريع (β = 1).
  3. تُظهر الخريطة الحرارية مكان معدل النمو الملحوظ لـ S 1 (μObs، المحسوبة باستخدام معادلة الملحق S6) تختلف عن الحد الأقصى لمعدل النمو في ظل الظروف المثالية (على سبيل المثال ، μ ، إذا لم تكن هناك تكلفة اقتناء). تم استخدام عتبة 98٪ لتحديد المنطقة عدديًا حيث μObs تختلف اختلافًا كبيرًا عن μ (على سبيل المثال ، μObs/ μ & lt 0.98). يتم تلوين أي تركيبة α و تستوفي هذا المعيار باللون الأزرق والأحمر بخلاف ذلك. لم يؤدي تغيير هذه العتبة إلى تغيير الاستنتاجات نوعياً (الملحق الشكل S9). يؤدي تغيير كفاءة الاقتران (η) إلى إزاحة الحدود (زيادة من الضوء إلى ظلال زرقاء داكنة).
  4. التحقق من صحة تنبؤات النمذجة باستخدام أربعة بلازميدات من اليسار إلى اليمين: RP4 (في هذه الدراسة) ، p193 ، p41 ، و p168 (من العمل السابق). يتم نسخ البيانات بإذن من Nature Communications (Lopatkin وآخرون، 2017) ، بموجب ترخيص Creative Commons Attribution 4.0 International License. تم تعديل أشكال وألوان العلامة لأغراض التصور. يُظهر الخط الصلب ملاءمة النموذج الأصلي (على سبيل المثال ، معادلة الملحق S1-S2). تُظهر الخطوط المنقطة ملاءمة النموذج المحدّث (على سبيل المثال ، معادلات الملحق S3-S5). تم إجراء التجارب مرتين على الأقل. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري من أربعة إلى ستة قياسات.

لمعالجة هذا السؤال ، قمنا أولاً بفحص الديناميكيات الزمنية في الحالة المحددة الموضحة أعلاه (الشكل 4E) ، أي أن من جديد تتراكم المتحولون المتحدون ويتحولون ، لكنهم لا ينموون (ρ

0). لقد اخترنا هذا السيناريو في البداية بسبب التحدي المتمثل في القياس التجريبي من جديد معدلات النمو بمعزل عن غيرها (أي القياس الكمي ρ). لذلك ، فإن تكلفة اللياقة على المدى الطويل لحمل بقايا البلازميد (α) وتكلفة الشراء تقارب بمعدل الانتقال ،. هنا ، نلاحظ أن هذه الصيغة تحافظ على الانخفاض الملحوظ في معدلات النمو الكلية للمحول. في ظل هذه الظروف ، تؤدي زيادة معدل الانتقال إلى زيادة الجزء المتكيف (مقارنة بـ من جديد الخلايا) ، مع تقريب β = 1 نموذجنا الأصلي (أي S D ≈ 0 و S A S 1.

كشف تحليل الحساسية أن كلاً من تكلفة اللياقة (α) وتكلفة الاستحواذ () تعدل الوقت حتى الوصول إلى الحالة المستقرة لـ S 1 (الشكل 5 ب). لتقدير المساهمة من كل تكلفة ، قمنا بحساب الفرق بين معدل النمو الأقصى المحتمل لـ S 1 (µ ، كما هو محدد بواسطة S A) ، ومعدل النمو المستقر الملحوظ لـ S 1 (µObs، معادلة التذييل S6) ، والتي قد تكون أقل من ، لأنها تتكون من مجموعتي السكان S D و S A. في الحالة التي تكون فيها معدلات النمو القصوى والملاحظة متكافئة (μ = μObs) ، β لا يؤثر على النمو الكلي لـ S 1 ، وتأثير تكلفة الاستحواذ على الديناميات الزمنية ضئيل مقارنة بتكلفة اللياقة البدنية. على العكس من ذلك ، فإن أي انحراف (أي ، μObs/ μ & lt 1) يشير إلى تأثير خاص بـ. في الواقع ، تحدد الحدود المحددة بواسطة α و مناطق المعلمات حيث ينحرف النمو الملحوظ عن الحد الأقصى للنمو (الشكل 5C). على وجه التحديد ، عندما تكون تكلفة الاستحواذ منخفضة بما فيه الكفاية ، فإن نمو S 1 لا يتأثر إلى حد كبير بـ S D ، لذلك من المحتمل أن تلتقط تكلفة اللياقة وحدها الديناميكيات الزمنية. ومع ذلك ، عندما تكون تكلفة الشراء مرتفعة ، فإن S D يؤثر على نمو S 1 ، خاصة بالنسبة للبلازميدات المكلفة في هذه الحالة ، يجب دمج تكاليف الشراء لتحسين التنبؤات الزمنية. تم الحفاظ على هذا الاستنتاج عندما ρ & gt 0 (الملحق الشكل S6D).

تمشيا مع النموذج الأصلي ، تعتمد الحدود التي تملي هذه السيناريوهات على كفاءة الاقتران (η): عندما يكون الاقتران بطيئًا بدرجة كافية ، لا تتغير تكاليف الاستحواذ ولا الملاءمة μObs/ ميكرومتر. حدسيًا ، في هذه الحالة ، نظرًا لوجود تراكم ضئيل لـ S D ، من جديد لا تغير المتحولون المتحولون معدل النمو الإجمالي بشكل ملحوظ. من المدهش أن الاقتران السريع ليس بالضرورة مفيدًا للسكان الحاملين للبلازميد. إذا كان توليد S D عبر الاقتران أسرع بكثير من الانتقال من S D إلى S A (أي ، η & gt & gtβ) ، فإن معدل النمو الملحوظ يقلل من هذه النتيجة غير المنطقية تشير إلى أن الاقتران الأسرع قد لا يفضل الاحتفاظ بالبلازميد ما لم يقترن بالتكيف السريع المقابل.

تؤدي هذه النتائج إلى ظهور سيناريوهين عامين لاستدامة البلازميد. أولاً ، إذا كانت معدلات النمو القصوى المرصودة متساوية تقريبًا (μObs ≈ μ) ، فإن تكلفة الاستحواذ لها تأثير ضئيل وتكون α كافية للتنبؤ بالديناميكيات الإجمالية (الشكل 5C ، المنطقة الحمراء) وهذا يتوافق تقريبًا مع α & lt 1 ، ولكن يمكن أن يشمل المناطق التي تكون فيها α & gt 1 إذا كانت كفاءة الاقتران سريعة بدرجة كافية. علاوة على ذلك ، كما تنبأ نموذجنا الأصلي ، يمكن لكفاءة الاقتران السريع التغلب على عبء البلازميد (α & gt 1) ، وبالتالي حساب المنطقة الحمراء المتوسعة كدالة لـ η. ثانيًا ، مثل μObs تتباعد عن μ (الشكل 5C ، المنطقة الزرقاء) ، وتؤدي زيادة تكاليف اللياقة البدنية إلى تضخيم تأثير β هنا ، وتؤثر تكلفة الاستحواذ على معدل النمو وبالتالي ديناميكيات السكان.

لاختبار هذه التنبؤات ، أعدنا فحص البيانات التي تم إنشاؤها سابقًا حيث تمت تربية المتحولون المتحدون مع السكان الخاليين من البلازميد على مدار 14-21 يومًا. في كل حالة ، نلائم بشكل مستقل β مع بيانات النمو على المدى القصير (الملحق الشكل S7) ومحاكاة الديناميكيات طويلة الأجل (الشكل 5 د). وجدنا أن بياناتنا التجريبية كانت في الواقع متوافقة تمامًا مع تنبؤات النموذج الموسع. على وجه الخصوص ، على الرغم من أنه كان من المتوقع أن يكون لل p193 تكلفة شراء عالية ، إلا أن دمجها لا يؤثر بشكل كبير على الدقة التنبؤية لأن البلازميد مفيد. على العكس من ذلك ، بالنسبة للبلازميدات التي لديها تكلفة لياقة بدنية (على سبيل المثال ، RP4 و p41 و p168) ، يرتبط حجم بما إذا كانت هناك حاجة للدقة التنبؤية: تباعدت البلازميدات ذات القيمة المنخفضة بشكل أكبر عن النموذج الأصلي وتم توقعها بشكل أفضل من خلال التحديث الذي أخذ في الاعتبار آثاره. هنا ، نلاحظ أن تغيير قيمة ρ بحيث تظل منخفضة لم يغير نتائج المحاكاة بشكل ملحوظ. بشكل جماعي ، تتحقق هذه النتائج من صحة نموذجنا وتوضح التأثير المحتمل لتكاليف الاستحواذ على ديناميكيات السكان على المدى الطويل. على سبيل المثال ، أظهر p41 و p168 تكاليف لياقة مماثلة ، ومع ذلك ، فإن تكلفة الاستحواذ المرتفعة للأخير من المرجح أن تكون لصالح الأول في مجموعة سكانية مختلطة.


المواد والأساليب

تم أخذ البيانات الخاصة بالكروموسومات الكاملة والبلازميدات بدائيات النوى من Genbank Refseq (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria/ ، تم الوصول إليه آخر مرة في نوفمبر 2011). وشمل ذلك 1207 كروموسومًا ، و 891 بلازميدًا تم ترتيبها جنبًا إلى جنب مع هذه الكروموسومات ، و 1،391 بلازميدًا تم تسلسلها بشكل مستقل. استخدمنا التعليقات التوضيحية لملفات Genbank ، بعد أن أزلنا جميع الجينات الخادعة والبروتينات ذات أكواد الإيقاف الداخلية. تم أخذ المعلومات حول T4SS من Guglielmini et al. (2011).

بناء ملامح البروتين وأبحاث الجينوم

ما لم يذكر صراحة ، فإن ملامح البروتين المستخدمة هي تلك الموضحة في Guglielmini et al. (2011). لدراسة وجود / عدم وجود مكونات مختلفة من فير النظام ، قمنا بعمل ملفات تعريف بروتين إضافية ، خاصة لـ VirB1 و VirB2 و VirB5 و VirB7 و VirB10 و VirB11. استخدمنا لأول مرة أداة البحث عن المحاذاة المحلية PSI-Basic (BLAST) (ه value & lt 0.1) للبحث عن متماثلات بعيدة ، باستخدام الاستعلام عن كل من هذه الجينات من موضع VirB الخاص بـ A. الورم plasmid pTi SAKURA (إدخال Refseq NC_002147) وبنك البيانات المذكور أعلاه للنسخ المتماثلة المتسلسلة تمامًا. نظرًا لمشاكل تقارب PSI-BLAST عند استخدام الجينوم الكامل ، والتشابه الواسع بين أنظمة اقتران البلازميد والكروموسومات (Guglielmini et al. 2011) ، قمنا بتقييد عمليات بحث التماثل إلى متواليات البلازميد عند بناء ملفات تعريف البروتين. استرجعنا البروتينات بضربات لكل عائلة بروتين وقمنا ببناء محاذاة متعددة باستخدام MUSCLE (Edgar 2004). أزلنا البروتينات القليلة ذات الأحجام المختلفة جدًا عن المتوسط. ثم أعدنا بناء المحاذاة المتعددة باستخدام MUSCLE وقمنا بقصها لإزالة المواقع الموجودة على الحواف التي كانت محاذية بشكل سيئ. استخدمنا HMMER 3.0 (Eddy 2011) لإنتاج ملفات تعريف نموذج ماركوف المخفية (HMM) وإجراء عمليات بحث داخل الجينوم. في تحليل تطور MPFتي النظام ، فقد نظرنا فقط في النتائج التي تم تحديدها مع اكتشافها مسبقًا فير البروتينات (VirB3 ، VirB4 ، VirB6 ، VirB8 ، VirB9). تم استرداد بروتينات FtsK مباشرة باستخدام ملف تعريف PFAM PF01580. تم استرداد بروتينات TraB ، المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بـ FtsK ، من خلال عمليات البحث BLASTP لـ TraB من ستربتوميسيس plasmid pCQ3 (YP_003280879) على بروتينات Actinomycetales من قاعدة بيانات Refseq. أخذنا عينات من أفضل النتائج ثم قمنا ببناء ملف تعريف بروتين لهذا البروتين وبحثنا عن حدوثه كما هو الحال بالنسبة للملفات الشخصية الأخرى. قمنا ببناء خادم ويب للسماح بتشغيل ملفات تعريف البروتين. هذا متاح على http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py#forms::CONJscan-T4SSscan.

تحليل النشوء والتطور

ما لم يُذكر صراحةً ، تم إجراء جميع تحليلات النشوء والتطور بالإجراء التالي. أولاً ، تمت محاذاة التسلسلات باستخدام MUSCLE مع المعلمات الافتراضية كما تم تنفيذها في SeaView (Gouy et al. 2010). ثانيًا ، تمت إزالة جميع الأعمدة في مصفوفة المحاذاة المتعددة التي تحتوي على أكثر من 80٪ من الفجوات. ثالثًا ، تم بناء 100 شجرة مكررة باستخدام RAxML 7.2.7 (Stamatakis 2006) باستخدام نموذج GTRGAMMA. حافظنا على أفضل احتمال. قمنا بحساب bootstraps بالتنفيذ القياسي واستخدمنا معيار إيقاف autoMR للحصول على قيم الثقة لكل عقدة. كان هناك استثناءان لهذه الطريقة. قمنا بمحاذاة قواعد ATP باستخدام MAFFT (Katoh and Toh 2010) مع خوارزمية G-INSI وأزلنا المواقع التي تحتوي على أكثر من 60٪ من الفجوات. أجرينا الاستدلال الوراثي كما ذكرنا سابقًا بالإضافة إلى PhyML 3.0 (Gascuel et al. 2010) في إطار نموذج LG ومع شجرة بدء bioNJ للحصول على قيم دعم aLRT. تم إنشاء محاذاة مجموعة VirB4 و VirD4 باستخدام MAFFT باستخدام خوارزمية E-INSI ، نظرًا لأن هذين البروتينين يظهران تنظيمًا مختلفًا للمجال ، ثم يتم تحريرهما يدويًا. تم استخدام MAFFT بدلاً من MUSCLE لأنه يوفر محاذاة أفضل في هذه الحالات. كان حساب 100 مكرر بالإضافة إلى المئات من أشجار التمهيد مضيعة للوقت بشكل مفرط ، بالنظر إلى حجم مجموعة البيانات في تحليل VirB4 / VirD4. وهكذا ، استخدمنا PhyML 3.0 لبناء شجرة النشوء والتطور ، تحت نموذج LG وشجرة بدء bioNJ. تم حساب قيم دعم aLRT أيضًا لكل عقدة.

كشفت اختبارات الدعم التي أجريناها في هذه الشجرة الأخيرة عن بعض الدعم الضعيف الذي يتعارض مع قيم aLRT. لمزيد من التحقيق في هذا الأمر ، استخدمنا مجموعة بيانات مخفضة تتكون من بروتينات VirB4 ، باستثناء المتماثل البعيد TraU. باستخدام مجموعة البيانات هذه ، أجرينا الاختبارات الموضحة لاحقًا. جميع المحاذاة المتعددة وإعادة بناء النشوء والتطور متاحة مجانًا على DRYAD (http://datadryad.org/).

اختبارات لتحليل النشوء والتطور

لاختبار قوة استنتاجاتنا بناءً على تحليل النشوء والتطور ، أجرينا عددًا من الاختبارات. هدفت هذه التحليلات إلى اختبار مدى قوة الاستنتاجات المتعلقة بالمحاذاة المتعددة ، وتحديد المواقع الإعلامية في محاذاة متعددة ، واستخدام مصفوفة نموذج البروتين. لذلك أنتجنا طريقتين آليتين حيث نجعل محاذاة البروتين باستخدام MAFFT و MUSCLE. تم استخراج المواقع الإعلامية من المحاذاة باستخدام BMGE (Criscuolo و Gribaldo 2010). قمنا بضبط معلمات BMGE لكل محاذاة للحصول على حل وسط جيد بين الجودة وعدد المواقع الإعلامية. تم اختيار أفضل نموذج لتحليل البيانات باستخدام ProtTest (Darriba et al. 2011). لاحظ أن ProtTest لا يحلل نموذج GTR للبروتينات ، لذلك لا يمكننا تقييم ما إذا كان النموذج الذي اختاره ProtTest أفضل من نموذجنا. تم بناء الأشجار كما كان من قبل باستخدام RAxML ، وقمنا بإنشاء 100 شجرة تمهيد لكل تحليل. لمقارنة التحليلات المختلفة ، قمنا بحساب جودة نقاط المحاذاة المتعددة باستخدام المكون الأساسي لـ T-Coffee (Notredame et al. 2000) للطرق الثلاث (تحليلنا الخبير ، التحليلات المستندة إلى MAFFT و MUSCLE). يتم حساب هذه الدرجة ، التي تتراوح من 0 إلى 100 ، من خلال مقارنة تناسق المحاذاة مع قائمة المحاذاة الزوجية المحسوبة مسبقًا تسمى المكتبة. استخدمنا مكتبة "Mproba_pair" الافتراضية. تم اختبار النتائج الرئيسية ، على سبيل المثال ، الوضع الأحادي أو الأساسي لكتل ​​معينة ، للطرق الثلاث ويتم عرضها في الجدول 1 والجدول التكميلي S1 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت. لكل من هذه الاختبارات رقم تعريف في الجداول. يتم عرض هذا الرقم في العقدة المعنية في أشجار النشوء والتطور. على سبيل المثال ، في الشكل 2 ، العقدة ذات المعرف رقم. 3 يشير إلى monophyly لـ TraB ويشار إليه في الجدول 1 على أنه يحتوي على دعم تمهيد التشغيل بنسبة 99٪ في تحليلنا الخبير ، و 100٪ في التحليل التلقائي باستخدام MAFFT ، و 96٪ في التحليل التلقائي باستخدام MUSCLE. في الجدول التكميلي S1 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت ، يشار إلى أن أفضل محاذاة لهذا التحليل ، كما قدمها T-Coffee ، هي واحدة من محاذاة الخبراء (الدرجة 88) ، تليها MAFFT (76) ثم MUSCLE (67) ). العقدة لا. 3 في الشكل 2 يشار إليه في دائرة سوداء (دعم التمهيد العالي).

التحليل الوراثي لحالات AAA + ATPases المرتبطة بالاقتران. تم تحديد موضع الجذر باستخدام AAA + ATPase VirB11 في تحليل منفصل. تتوافق الأسماء الموجودة على طول أطراف FtsK مع الأصول التصنيفية لكل بروتين ، مما يعكس عرض أخذ العينات. تمثل الخطوط السوداء العمودية الغامقة عقدًا ذات قيمة دعم عالية (bootstrap & gt70٪ و aLRT & gt0.7). تمثل الخطوط الرمادية الغامقة العقد ذات الدرجة العالية من aLRT (& gt0.7) ولكنها تمثل التمهيد الأضعف (& lt70٪). تم العثور على متماثلات TcpA فقط في Firmicutes. تم العثور على متماثلات TraB فقط في Actinobacteria. تشير الأرقام الموجودة في الدوائر إلى تحليل المتانة في الجدول 1 (المحدد في العمود الثالث من الجدول 1) تشير الخلفية السوداء إلى دعم عالٍ (≥70٪ تمهيد في أفضل محاذاة درجات) وخلفية رمادية لدعم معتدل (≥ 50٪ bootstrap في أفضل محاذاة الدرجات).

التحليل الوراثي لحالات AAA + ATPases المرتبطة بالاقتران. تم تحديد موضع الجذر باستخدام AAA + ATPase VirB11 في تحليل منفصل. تتوافق الأسماء الموجودة على طول أطراف FtsK مع الأصول التصنيفية لكل بروتين ، مما يعكس عرض أخذ العينات. تمثل الخطوط السوداء العمودية الغامقة عقدًا ذات قيمة دعم عالية (bootstrap & gt70٪ و aLRT & gt0.7). تمثل الخطوط الرمادية الغامقة العقد ذات الدرجة العالية من aLRT (& gt0.7) ولكنها تمثل التمهيد الأضعف (& lt70٪). تم العثور على متماثلات TcpA فقط في Firmicutes. تم العثور على متماثلات TraB فقط في Actinobacteria. تشير الأرقام في الدوائر إلى تحليل المتانة في الجدول 1 (المحدد في العمود الثالث من الجدول 1) تشير الخلفية السوداء إلى دعم عالٍ (≥70٪ تمهيد في أفضل محاذاة درجات) وخلفية رمادية لدعم معتدل (≥ 50٪ bootstrap في أفضل محاذاة الدرجات).

تحليل متانة النتائج الرئيسية للتطور.

(أ) البروتينات المضمنة في مجموعة البيانات.

(ب) الفرضيات المختلفة التي نقدم لها دعم التمهيد.

ج عندما تتوافق الفرضية مع ما نلاحظه في السلالة المرجعية ، وإذا كانت قيمة الدعم أكبر من 50 ، يتم عرضها هنا وفي الشكل المقابل برقم.

د قيم التمهيد لكل فرضية ولكل تقنية محاذاة.

تحليل متانة النتائج الرئيسية للتطور.

(أ) البروتينات المضمنة في مجموعة البيانات.

(ب) الفرضيات المختلفة التي نقدم لها دعم التمهيد.

ج عندما تتوافق الفرضية مع ما نلاحظه في السلالة المرجعية ، وإذا كانت قيمة الدعم أكبر من 50 ، يتم عرضها هنا وفي الشكل المقابل برقم.

د قيم التمهيد لكل فرضية ولكل تقنية محاذاة.

انخفاض نسبي في تشابه البروتين مع الاختلاف

لكل زوج من مواضع T4SS ، قمنا بعمل محاذاة زوجية لكل زوج من أزواج الجينات المتعامدة. تم إجراء المحاذاة باستخدام نسخة خالية من الفجوة النهائية من خوارزمية Needleman-Wunsch (Mount 2004) ، مع مصفوفة BLOSUM60 ، وعقوبة مفتوحة 1.2 ، وعقوبة تمديد قدرها 0.8. ثم قمنا برسم النسبة المئوية للتشابه بين متماثلات VirB4 وكل من الأزواج الأخرى من المتماثلات. تم بعد ذلك تزويد النقاط لكل مخطط مبعثر بشريط (λ = 1500) ، وتم فرض المنحنيات.


محتويات

ظهر التحول في البكتيريا لأول مرة في عام 1928 من قبل عالم البكتيريا البريطاني فريدريك جريفيث. [3] كان جريفيث مهتمًا بتحديد ما إذا كان يمكن استخدام حقن البكتيريا المميتة بالحرارة لتلقيح الفئران ضد الالتهاب الرئوي. ومع ذلك ، اكتشف أن سلالة غير خبيثة من العقدية الرئوية يمكن أن تكون خبيثة بعد تعرضها لسلالات فتاكة تقتل الحرارة. افترض جريفيث أن بعض "المبادئ التحويلية" من السلالة القاتلة للحرارة كانت مسؤولة عن جعل السلالة غير المؤذية خبيثة. في عام 1944 ، تم تحديد "مبدأ التحويل" هذا على أنه جيني من قبل أوزوالد أفيري وكولين ماكليود وماكلين مكارتي. لقد عزلوا الحمض النووي من سلالة خبيثة من الرئوية الرئوية واستخدام هذا الحمض النووي فقط كان قادرًا على جعل سلالة ضارة وخبيثة. لقد أطلقوا على هذا الامتصاص ودمج الحمض النووي بواسطة البكتيريا "التحول" (انظر تجربة Avery-MacLeod-McCarty). تطوير الواسمات الجينية واكتشاف طرق أخرى للنقل الجيني (الاقتران في عام 1947 والتحول في عام 1953) من قبل جوشوا ليدربيرج حيث تم قبول تجارب أفيري. [5]

كان يعتقد في الأصل أن الإشريكية القولونية، وهو كائن معملي شائع الاستخدام ، كان مقاومًا للتحول. ومع ذلك ، في عام 1970 ، أظهر مورتون ماندل وأكيكو هيغا ذلك بكتريا قولونية يمكن حثها على أخذ الحمض النووي من العاثية λ دون استخدام الملتهمة المساعدة بعد العلاج بمحلول كلوريد الكالسيوم. [6] بعد ذلك بعامين في عام 1972 ، أظهر ستانلي نورمان كوهين وآني تشانغ وليزلي هسو أن CaCl
2 العلاج فعال أيضًا في تحويل DNA البلازميد. [7] طريقة التحويل بواسطة Mandel و Higa تم تحسينها لاحقًا بواسطة Douglas Hanahan. [8] اكتشاف الكفاءة المستحثة صناعيًا في بكتريا قولونية ابتكر إجراءً فعالًا وملائمًا لتحويل البكتيريا مما يسمح بأساليب استنساخ جزيئي أبسط في مجال التكنولوجيا الحيوية والبحوث ، وهو الآن إجراء مخبري يستخدم بشكل روتيني.

تم تطوير التحول باستخدام Electroporation في أواخر الثمانينيات ، مما أدى إلى زيادة كفاءة التحول في المختبر وزيادة عدد السلالات البكتيرية التي يمكن تحويلها. [9] تم أيضًا التحقيق في تحول الخلايا الحيوانية والنباتية مع أول فأر معدل وراثيًا يتم إنشاؤه عن طريق حقن جين لهرمون نمو الفئران في جنين فأر في عام 1982. [10] في عام 1897 ، جرثومة تسببت في حدوث أورام نباتية ، أغروباكتريوم توميفاسيانز، وفي أوائل السبعينيات من القرن الماضي ، وجد أن العامل المحفز للورم هو بلازميد DNA يسمى Ti plasmid. [11] عن طريق إزالة الجينات من البلازميد التي تسببت في الورم وإضافة جينات جديدة ، تمكن الباحثون من إصابة النباتات بـ A. الورم والسماح للبكتيريا بإدخال الحمض النووي المختار في جينومات النباتات. [12] ليست كل الخلايا النباتية عرضة للإصابة بالعدوى A. الورم، لذلك تم تطوير طرق أخرى ، بما في ذلك التثقيب الكهربائي والحقن الدقيق. [13] أصبح القصف الجزيئي ممكنًا مع اختراع نظام توصيل الجسيمات البيولوجية (مسدس الجينات) بواسطة جون سانفورد في الثمانينيات. [14] [15] [16]

التحول هو أحد ثلاثة أشكال من نقل الجينات الأفقي التي تحدث في الطبيعة بين البكتيريا ، حيث ينتقل ترميز الحمض النووي للسمات من بكتيريا إلى أخرى ويتم دمجه في الجينوم المتلقي عن طريق إعادة التركيب المتماثل ، أما النوعان الآخران فيتم تنفيذهما عن طريق الوسائل من العاثية ، والاقتران ، حيث يتم تمرير الجين من خلال الاتصال المباشر بين البكتيريا. [1] في التحول ، تمر المادة الجينية عبر الوسط المتداخل ، ويعتمد الامتصاص كليًا على البكتيريا المتلقية. [1]

تشير الكفاءة إلى حالة مؤقتة من القدرة على تناول الحمض النووي الخارجي من البيئة التي قد تحدث في المختبر. [1]

يبدو أنها عملية قديمة موروثة من سلف بدائية النواة المشتركة والتي تعد تكيفًا مفيدًا لتعزيز الإصلاح التأشبي لتلف الحمض النووي ، وخاصة الضرر المكتسب في ظل ظروف مرهقة. يبدو أن التحول الجيني الطبيعي هو تكيف لإصلاح تلف الحمض النووي الذي يولد أيضًا التنوع الجيني. [1] [17]

تمت دراسة التحول في أنواع البكتيريا سالبة الجرام المهمة طبيًا مثل هيليكوباكتر بيلوري, البكتيريا المستروحة, النيسرية السحائية, النيسرية البنية, المستدمية النزلية و ضمة الكوليرا. [18] كما تمت دراسته أيضًا في الأنواع سالبة الجرام الموجودة في التربة مثل Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter baylyi، ومسببات الأمراض النباتية سالبة الجرام مثل Ralstonia solanacearum و Xylella fastidiosa. [18] تمت دراسة التحول بين البكتيريا موجبة الجرام في الأنواع المهمة طبيًا مثل العقدية الرئوية, العقدية الطافرة, المكورات العنقودية الذهبية و العقدية الدم وفي بكتيريا التربة إيجابية الجرام العصوية الرقيقة. [17] كما تم الإبلاغ عنه في 30 نوعًا على الأقل من بروتيوباكتيريا موزعة في فصول alpha و beta و gamma و epsilon. [19] أفضل درس بروتيوباكتيريا فيما يتعلق بالتحول هي مسببات الأمراض البشرية الهامة طبيا النيسرية البنية (فئة بيتا) ، المستدمية النزلية (فئة جاما) و هيليكوباكتر بيلوري (فئة إبسيلون) [17]

يمكن أيضًا استخدام "التحول" لوصف إدخال مادة وراثية جديدة في الخلايا غير البكتيرية ، بما في ذلك الخلايا الحيوانية والنباتية ، ولكن نظرًا لأن "التحول" له معنى خاص فيما يتعلق بالخلايا الحيوانية ، مما يشير إلى التقدم إلى حالة سرطانية ، فإن العملية هي عادة ما تسمى "تعداء". [2]

اعتبارًا من عام 2014 ، كان من المعروف أن حوالي 80 نوعًا من البكتيريا قادرة على التحول ، تقريبًا مقسمة بالتساوي بين البكتيريا موجبة الجرام والبكتيريا سالبة الجرام ، وقد يكون الرقم مبالغًا فيه نظرًا لأن العديد من التقارير مدعومة بأوراق فردية. [1]

تحمل البكتيريا المختصة بطبيعتها مجموعات من الجينات التي توفر آلية البروتين لنقل الحمض النووي عبر غشاء (أغشية) الخلية. قد يتطلب نقل الحمض النووي الخارجي إلى الخلايا بروتينات تشارك في تجميع النوع الرابع من الحبيبات ونظام إفراز النوع الثاني ، بالإضافة إلى مجمع إنزيم ناقلة الحمض النووي في الغشاء السيتوبلازمي. [20]

نظرًا للاختلافات في بنية غلاف الخلية بين البكتيريا موجبة الجرام والبكتيريا سالبة الجرام ، فهناك بعض الاختلافات في آليات امتصاص الحمض النووي في هذه الخلايا ، ولكن معظمها يشترك في سمات مشتركة تشمل البروتينات ذات الصلة. يرتبط الحمض النووي أولاً بسطح الخلايا المختصة على مستقبلات الحمض النووي ، ويمر عبر الغشاء السيتوبلازمي عبر ترانسيلوكاز الحمض النووي. [21] قد يمر عبر الحمض النووي أحادي الجديلة فقط ، بينما يتحلل الخيط الآخر بواسطة نوكليازات في هذه العملية. يمكن بعد ذلك دمج الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل في الكروموسومات البكتيرية عن طريق عملية تعتمد على RecA. في الخلايا سالبة الجرام ، نظرًا لوجود غشاء إضافي ، يتطلب الحمض النووي وجود قناة مكونة من سيكريتينات على الغشاء الخارجي. قد تكون Pilin مطلوبة من أجل الكفاءة ، لكن دورها غير مؤكد. [22] عادةً ما يكون امتصاص الحمض النووي غير محدد التسلسل ، على الرغم من أن وجود تسلسلات معينة لامتصاص الحمض النووي في بعض الأنواع قد يسهل امتصاص الحمض النووي بكفاءة. [23]

تحرير التحول الطبيعي

التحول الطبيعي هو تكيف بكتيري لنقل الحمض النووي الذي يعتمد على التعبير عن العديد من الجينات البكتيرية التي يبدو أن منتجاتها مسؤولة عن هذه العملية. [20] [19] بشكل عام ، يعتبر التحول عملية تنموية معقدة تتطلب طاقة. لكي تتحد البكتيريا وتتناول وتعيد تجميع الحمض النووي الخارجي في كروموسومها ، يجب أن تصبح مختصة ، أي أن تدخل حالة فسيولوجية خاصة. تطوير الكفاءات في العصوية الرقيقة يتطلب التعبير عن حوالي 40 جينًا. [24] عادةً ما يكون الحمض النووي المدمج في كروموسوم المضيف (ولكن مع استثناءات نادرة) مشتقًا من بكتيريا أخرى من نفس النوع ، وبالتالي فهو متماثل مع الكروموسوم المقيم.

في B. الرقيقة طول الحمض النووي المنقول أكبر من 1271 كيلو بايت (أكثر من مليون قاعدة). [25] من المحتمل أن يكون الطول المنقولة عبارة عن دنا مزدوج الجديلة وغالبًا ما يكون أكثر من ثلث إجمالي طول الكروموسوم البالغ 4215 كيلو بايت. [26] يبدو أن حوالي 7-9٪ من الخلايا المتلقية تأخذ كروموسوم كامل. [27]

يبدو أن القدرة على التحول الطبيعي تحدث في عدد من بدائيات النوى ، وحتى الآن 67 نوعًا بدائيات النوى (في سبع شعب مختلفة) من المعروف أنها تخضع لهذه العملية. [19]

عادة ما يتم تحفيز الكفاءة على التحول عن طريق كثافة الخلايا العالية و / أو القيود الغذائية ، وهي الظروف المرتبطة بالمرحلة الثابتة لنمو البكتيريا. التحول في المستدمية النزلية يحدث بشكل أكثر فاعلية في نهاية النمو الأسي حيث يقترب النمو البكتيري من المرحلة الثابتة. [28] التحول في العقدية الطافرة، كما هو الحال في العديد من المكورات العقدية الأخرى ، تحدث بكثافة خلوية عالية وترتبط بتكوين الأغشية الحيوية الرقيقة. [29] الاختصاص في B. الرقيقة يتم إحداثه في نهاية النمو اللوغاريتمي ، خاصة في ظل ظروف الحد من الأحماض الأمينية. [30] وبالمثل ، في ميكروكوكس لوتس (ممثل عن الأقل دراسة أكتينوباكتيريا phylum) ، تتطور الكفاءة خلال منتصف مرحلة النمو الأسي المتأخر ويتم تشغيلها أيضًا عن طريق تجويع الأحماض الأمينية. [31] [32]

من خلال إطلاق العائل السليم والحمض النووي البلازميدي ، يُعتقد أن بعض العاثيات تساهم في التحول. [33]

التحول ، كتكييف لإصلاح الحمض النووي

يتم تحفيز الكفاءة على وجه التحديد من خلال الظروف الضارة للحمض النووي. على سبيل المثال ، يتم إحداث التحول في العقدية الرئوية بواسطة العوامل المدمرة للحمض النووي ميتوميسين C (عامل ربط متقاطع للحمض النووي) وفلوروكينولون (مثبط توبويزوميراز الذي يتسبب في حدوث فواصل مزدوجة الخيط). [34] في B. الرقيقة، يزداد التحول عن طريق ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، وهو عامل ضار للحمض النووي. [35] في هيليكوباكتر بيلوري، سيبروفلوكساسين ، الذي يتفاعل مع DNA gyrase ويقدم فواصل مزدوجة الخيط ، يحفز التعبير عن جينات الكفاءة ، وبالتالي تعزيز وتيرة التحول [36] باستخدام البكتيريا المستروحة، شاربينتير وآخرون. [37] اختبرت 64 جزيءًا سامًا لتحديد أي منها يحفز الكفاءة. من بين هؤلاء ، تسببت ستة فقط ، جميعها عوامل ضارة بالحمض النووي ، في تحريض قوي. كانت هذه العوامل المدمرة للحمض النووي هي ميتوميسين C (الذي يسبب ارتباطات متشابكة للحمض النووي) ، نورفلوكساسين ، أوفلوكساسين وحمض ناليديكسيك (مثبطات جريز الحمض النووي التي تسبب انكسارات الشريط المزدوج [38]) ، البيسيكلوميسين (يسبب انكسارات أحادية ومزدوجة الخيط [38]). 39]) ، وهيدروكسي يوريا (يحث على أكسدة قاعدة الحمض النووي [40]). تسبب ضوء الأشعة فوق البنفسجية أيضًا في الكفاءة في المستروحة. شاربينتير وآخرون. [37] اقترح أن الكفاءة من أجل التحول ربما تطورت كاستجابة لتلف الحمض النووي.

تختلف البكتيريا المتنامية لوغاريتميًا عن بكتيريا الطور الثابت فيما يتعلق بعدد نسخ الجينوم الموجودة في الخلية ، وهذا له آثار على القدرة على تنفيذ عملية إصلاح مهمة للحمض النووي. أثناء النمو اللوغاريتمي ، قد توجد نسختان أو أكثر من أي منطقة معينة من الكروموسوم في خلية بكتيرية ، حيث لا يتطابق الانقسام الخلوي بدقة مع تكرار الكروموسوم. عملية الإصلاح التأشبي المتماثل (HRR) هي عملية أساسية لإصلاح الحمض النووي ، وهي فعالة بشكل خاص لإصلاح الأضرار المزدوجة ، مثل الفواصل المزدوجة. تعتمد هذه العملية على كروموسوم متماثل ثانٍ بالإضافة إلى الكروموسوم التالف. أثناء النمو اللوغاريتمي ، يمكن إصلاح تلف الحمض النووي في كروموسوم واحد بواسطة HRR باستخدام معلومات التسلسل من الكروموسوم المتماثل الآخر. بمجرد أن تقترب الخلايا من المرحلة الثابتة ، فإنها عادة ما يكون لديها نسخة واحدة فقط من الكروموسوم ، وتتطلب HRR إدخال نموذج متماثل من خارج الخلية عن طريق التحويل. [41]

لاختبار ما إذا كانت الوظيفة التكيفية للتحول هي إصلاح أضرار الحمض النووي ، تم إجراء سلسلة من التجارب باستخدام B. الرقيقة المشع بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية كعامل ضار (راجعه ميشود وآخرون [42] وبرنشتاين وآخرون. [41]) أشارت نتائج هذه التجارب إلى أن تحويل الحمض النووي يعمل على إصلاح أضرار الحمض النووي المميتة التي يسببها ضوء الأشعة فوق البنفسجية في المستقبل الحمض النووي. من المحتمل أن تكون العملية الخاصة المسؤولة عن الإصلاح هي HRR. يمكن النظر إلى التحول في البكتيريا على أنه عملية جنسية بدائية ، لأنه ينطوي على تفاعل الحمض النووي المتماثل من شخصين لتشكيل الحمض النووي المؤتلف الذي ينتقل إلى الأجيال التالية. قد يكون التحول البكتيري في بدائيات النوى هو عملية الأسلاف التي أدت إلى التكاثر الجنسي الانتصافي في حقيقيات النوى (انظر تطور الانقسام الاختزالي للتكاثر الجنسي.)

تحرير البكتيرية

يمكن تحفيز الكفاءة الاصطناعية في الإجراءات المختبرية التي تتضمن جعل الخلية منفذة بشكل سلبي للحمض النووي عن طريق تعريضها لظروف لا تحدث عادة في الطبيعة. [43] عادةً ما يتم تحضين الخلايا في محلول يحتوي على كاتيونات ثنائية التكافؤ (غالبًا كلوريد الكالسيوم) في ظل ظروف باردة ، قبل أن تتعرض لنبض حراري (صدمة حرارية). يعطل كلوريد الكالسيوم جزئيًا غشاء الخلية ، مما يسمح للحمض النووي المؤتلف بدخول الخلية المضيفة. تسمى الخلايا القادرة على امتصاص الحمض النووي بالخلايا المختصة.

لقد وجد أن نمو البكتيريا سالبة الجرام في 20 ملي ملغ يقلل من عدد روابط البروتين إلى عديدات السكاريد الدهنية عن طريق زيادة نسبة الروابط الأيونية إلى الروابط التساهمية ، مما يزيد من سيولة الغشاء ، مما يسهل التحول. [44] تم التحقق من دور عديدات السكاريد الدهنية هنا من خلال ملاحظة أن سلاسل O-side الأقصر تحولت بشكل أكثر فاعلية - ربما بسبب تحسين الوصول إلى الحمض النووي.

سطح البكتيريا مثل بكتريا قولونية سالبة الشحنة بسبب الفوسفوليبيدات وعديدات السكاريد الدهنية على سطحها الخلوي ، كما أن الحمض النووي مشحون سالبًا. وبالتالي ، فإن إحدى وظائف الكاتيون ثنائي التكافؤ هي حماية الشحنات عن طريق تنسيق مجموعات الفوسفات والشحنات السالبة الأخرى ، مما يسمح لجزيء DNA بالالتصاق بسطح الخلية.

دخول الحمض النووي إلى بكتريا قولونية الخلايا من خلال قنوات تعرف باسم مناطق الالتصاق أو تقاطع باير ، مع خلية نموذجية تحمل ما يصل إلى 400 منطقة من هذا القبيل. تم تحديد دورهم عندما وجد أن الكوبالامين (الذي يستخدم هذه القنوات أيضًا) يمنع بشكل تنافسي امتصاص الحمض النووي. نوع آخر من القنوات المتورطة في امتصاص الحمض النووي يتكون من بولي (HB): بولي P: Ca. في هذا البولي (HB) من المتصور أن يلتف حول الحمض النووي (نفسه متعدد الفوسفات) ، ويتم حمله في درع مكون من أيونات الكالسيوم. [44]

يُقترح أن تعريض الخلايا للكاتيونات ثنائية التكافؤ في حالة باردة قد يؤدي أيضًا إلى تغيير أو إضعاف بنية سطح الخلية ، مما يجعلها أكثر قابلية للنفاذ إلى الحمض النووي. يُعتقد أن النبضات الحرارية تخلق عدم توازن حراري عبر غشاء الخلية ، مما يجبر الحمض النووي على دخول الخلايا من خلال مسام الخلية أو جدار الخلية التالف.

Electroporation هي طريقة أخرى لتعزيز الكفاءة. في هذه الطريقة ، تُصدم الخلايا لفترة وجيزة بمجال كهربائي من 10-20 كيلو فولت / سم ، والذي يُعتقد أنه يخلق ثقوبًا في غشاء الخلية الذي قد يدخل من خلاله DNA البلازميد. بعد الصدمة الكهربائية ، يتم إغلاق الثقوب بسرعة بواسطة آليات إصلاح الغشاء في الخلية.

الخميرة تحرير

معظم أنواع الخميرة منها خميرة الخميرة، يمكن أن يتحول بواسطة DNA خارجي في البيئة. تم تطوير عدة طرق لتسهيل هذا التحول عند التردد العالي في المختبر. [45]

  • يمكن معالجة خلايا الخميرة بالإنزيمات لتحطيم جدرانها الخلوية ، مما يؤدي إلى إنتاج خلايا كروية. هذه الخلايا هشة للغاية ولكنها تأخذ الحمض النووي الغريب بمعدل مرتفع. [46]
  • إن تعريض خلايا الخميرة السليمة للقلويات مثل تلك الموجودة في السيزيوم أو الليثيوم يسمح للخلايا بامتصاص DNA البلازميد. [47] عدلت البروتوكولات اللاحقة طريقة التحويل هذه ، باستخدام أسيتات الليثيوم ، والبولي إيثيلين جلايكول ، والحمض النووي أحادي السلسلة. [48] ​​في هذه البروتوكولات ، يرتبط الحمض النووي أحادي السلسلة بشكل تفضيلي بجدار خلية الخميرة ، مما يمنع DNA البلازميد من القيام بذلك ويتركه متاحًا للتحول. [49]: تكوين ثقوب عابرة في أغشية الخلايا باستخدام الصدمة الكهربائية مما يسمح للحمض النووي بالدخول كما هو موصوف أعلاه للبكتيريا. [50]
  • يمكن أيضًا استخدام الهضم الإنزيمي [51] أو التحريض باستخدام الكريات الزجاجية [52] لتحويل خلايا الخميرة.

كفاءة - تأخذ أجناس وأنواع الخميرة المختلفة الحمض النووي الغريب بكفاءات مختلفة. [53] أيضًا ، تم تطوير معظم بروتوكولات التحول لخميرة الخباز ، S. cerevisiae، وبالتالي قد لا تكون مثالية للأنواع الأخرى. حتى داخل نوع واحد ، تتمتع السلالات المختلفة بكفاءات تحويل مختلفة ، وأحيانًا تختلف بثلاث مرات من حيث الحجم. على سبيل المثال ، عندما تم تحويل سلالات S. cerevisiae بـ 10 ميكروغرام من البلازميد YEp13 ، أنتجت السلالة DKD-5D-H ما بين 550 و 3115 مستعمرة بينما أنتجت سلالة OS1 أقل من خمس مستعمرات. [54]

تحرير النباتات

يتوفر عدد من الطرق لنقل الحمض النووي إلى الخلايا النباتية. بعض الطرق بوساطة المتجهات هي:

  • أجروباكتريومالتحول الوسيط هو أسهل وأبسط تحول نباتي. يتم تقطيع الأنسجة النباتية (الأوراق غالبًا) إلى قطع صغيرة ، على سبيل المثال 10x10 مم ، وينقع لمدة عشر دقائق في سائل يحتوي على معلق أجروباكتريوم. ستلتصق البكتيريا بالعديد من الخلايا النباتية التي كشفها الجرح. تفرز الخلايا النباتية مركبات فينولية مرتبطة بالجروح والتي بدورها تعمل على تنظيم عامل الضراوة في الأجرعية. يشتمل عامل الفوعة على العديد من الجينات التي تشفر البروتينات التي تعد جزءًا من نظام إفراز من النوع الرابع الذي يصدر من بروتينات البكتيريا والحمض النووي (يتم تحديده بواسطة أشكال تمييز محددة تسمى التسلسلات الحدودية ويتم استئصالها كخيط واحد من بلازميد الفوعة) إلى النبات خلية من خلال هيكل يسمى بيلوس. يتم توجيه الحمض النووي المنقول (المسمى T-DNA) إلى نواة الخلية النباتية عن طريق إشارات التوطين النووي الموجودة في بروتين Agrobacterium VirD2 ، والذي يرتبط تساهميًا بنهاية T-DNA عند الحد الأيمن (RB). تعتبر الطريقة الدقيقة التي يتم بها دمج T-DNA في الحمض النووي الجيني للنبات المضيف مجالًا نشطًا لأبحاث بيولوجيا النبات. بافتراض أن علامة الانتقاء (مثل الجين المقاوم للمضادات الحيوية) قد تم تضمينها في T-DNA ، يمكن زراعة أنسجة النبات المحولة على وسط انتقائي لإنتاج براعم. ثم يتم نقل البراعم إلى وسط مختلف لتعزيز تكوين الجذور. بمجرد أن تبدأ الجذور في النمو من النبتة المعدلة وراثيًا ، يمكن نقل النباتات إلى التربة لإكمال دورة الحياة الطبيعية (صنع البذور). يمكن زرع البذور من هذا النبات الأول (المسمى T1 ، للجيل الأول من الجينات المعدلة وراثيًا) على انتقائي (يحتوي على مضاد حيوي) ، أو إذا تم استخدام جين مقاوم لمبيدات الأعشاب ، فيمكن بدلاً من ذلك زرعها في التربة ، ثم معالجتها لاحقًا بمبيدات الأعشاب قتل أنواع الفصل البرية. بعض أنواع النباتات مثل نبات الأرابيدوبسيس thaliana يمكن تحويلها عن طريق غمس الزهور أو النبات الكامل إلى معلق أغروباكتريوم توميفاسيانز، عادة سلالة C58 (C = Cherry ، 58 = 1958 ، العام الذي تكون فيه هذه السلالة المعينة A. الورم تم عزله من شجرة كرز في بستان في جامعة كورنيل في إيثاكا ، نيويورك).على الرغم من أن العديد من النباتات لا تزال غير قادرة على التحول من خلال هذه الطريقة ، إلا أن البحث مستمر والذي يستمر في إضافة الأنواع التي تم تعديلها بنجاح بهذه الطريقة إلى القائمة. (نقل): قم بتعبئة المادة الوراثية المرغوبة في فيروس نباتي مناسب والسماح لهذا الفيروس المعدل بإصابة النبات. إذا كانت المادة الجينية عبارة عن DNA ، فيمكنها إعادة الاتحاد مع الكروموسومات لإنتاج خلايا محولة. ومع ذلك ، فإن جينومات معظم فيروسات النبات تتكون من الحمض النووي الريبي (RNA) الذي تقطعت به السبل والذي يتكاثر في سيتوبلازم الخلية المصابة. بالنسبة لمثل هذه الجينومات ، تعد هذه الطريقة شكلاً من أشكال تعداء الجسم وليست تحولًا حقيقيًا ، لأن الجينات المُدخلة لا تصل أبدًا إلى نواة الخلية ولا تندمج في جينوم المضيف. نسل النباتات المصابة خالية من الفيروسات وخالية أيضًا من الجينات المدخلة.

تتضمن بعض الطرق الخالية من ناقلات الأمراض ما يلي:

    : يُشار إليه أيضًا بقصف الجسيمات أو القصف الدقيق للقذيفة أو الخصائص البيولوجية. يتم تغليف جزيئات الذهب أو التنجستن بالحمض النووي ثم يتم إطلاقها في الخلايا النباتية الصغيرة أو أجنة النبات. ستبقى بعض المواد الجينية في الخلايا وتحولها. تسمح هذه الطريقة أيضًا بتحويل البلاستيدات النباتية. كفاءة التحويل أقل من في أجروباكتريومبوساطة التحول ، ولكن يمكن تحويل معظم النباتات بهذه الطريقة. : تكوين ثقوب عابرة في أغشية الخلايا باستخدام نبضات كهربائية ذات شدة مجال عالية مما يسمح للدنا بالدخول كما هو موضح أعلاه للبكتيريا. [55]

تحرير الفطريات

هناك بعض الطرق لإنتاج الفطريات المعدلة وراثيا ، ومعظمها مماثل لتلك المستخدمة في النباتات. ومع ذلك ، يجب التعامل مع الفطريات بشكل مختلف بسبب بعض سماتها الميكروسكوبية والكيميائية الحيوية:

  • القضية الرئيسية هي الحالة ثنائية النواة التي تحتوي على أجزاء من بعض الفطريات في خلايا ثنائية النواة تحتوي على نواتين فرديتين ، واحدة من الفطريات الأم. إذا تم تحويل واحدة فقط من هذه ، وهذه هي القاعدة ، فإن النسبة المئوية للنواة المحولة تنخفض بعد كل بوغ. [56]
  • تكون جدران الخلايا الفطرية سميكة جدًا مما يعيق امتصاص الحمض النووي ، لذلك غالبًا ما تكون الإزالة (الجزئية) مطلوبة [57] التدهور الكامل ، والذي يكون ضروريًا في بعض الأحيان ، [56] ينتج عنه بروتينات.
  • تتكون الفطريات الفطرية من خيوط خيطية ، إذا كانت مفصولة على الإطلاق بجدران خلوية داخلية مقطوعة بمسام كبيرة بما يكفي لتمكين المغذيات والعضيات ، وأحيانًا حتى النوى ، من الانتقال عبر كل خيوط. نتيجة لذلك ، لا يمكن فصل الخلايا الفردية عادةً. هذا يمثل مشكلة لأن الخلايا المحولة المجاورة قد تجعل الخلايا غير المحولة محصنة ضد علاجات الاختيار ، على سبيل المثال عن طريق توصيل المغذيات أو البروتينات لمقاومة المضادات الحيوية. [56]
  • بالإضافة إلى ذلك ، يحدث نمو هذه الفطريات (وبالتالي الانقسام الفتيلي) حصريًا عند طرف خيوطها التي يمكن أن تؤدي أيضًا إلى حدوث مشكلات. [56]

كما ذكرنا سابقًا ، فإن مجموعة من الطرق المستخدمة لتحويل النبات تعمل أيضًا في الفطريات:

  • لا تعد الأجرعية قادرة على إصابة النباتات فحسب ، بل أيضًا الفطريات ، ومع ذلك ، على عكس النباتات ، لا تفرز الفطريات المركبات الفينولية اللازمة لتحفيز البكتيريا الأجرعية بحيث يجب إضافتها على سبيل المثال. في شكل أسيتوسيرنغون. [56]
  • بفضل تطوير نظام تعبير للـ RNAs الصغيرة في الفطريات ، أصبح إدخال نظام CRISPR / CAS9 في الخلايا الفطرية ممكنًا. [56] في عام 2016 ، أعلنت وزارة الزراعة الأمريكية أنها لن تنظم سلالة فطر الزر الأبيض التي تم تعديلها باستخدام CRISPR / CAS9 لمنع تحول جسم الفاكهة إلى اللون البني مما يتسبب في نقاش واسع حول وضع المحاصيل المعدلة بتقنية CRISPR / CAS9 في السوق. [58]
  • الأساليب الفيزيائية مثل التثقيب الكهربائي ، علم الأحياء ("بندقية الجينات") ، السونوبوريشن التي تستخدم تجويف فقاعات الغاز التي تنتجها الموجات فوق الصوتية لاختراق غشاء الخلية ، إلخ ، قابلة للتطبيق أيضًا على الفطريات. [59]

تحرير الحيوانات

عادةً ما يطلق على إدخال الحمض النووي في الخلايا الحيوانية ترنسفكأيشن ، ويناقش في المقالة المقابلة.

اكتشاف الكفاءة المستحثة صناعياً في البكتيريا يسمح للبكتيريا مثل الإشريكية القولونية لاستخدامها كمضيف مناسب لمعالجة الحمض النووي وكذلك التعبير عن البروتينات. عادة ما تستخدم البلازميدات للتحول في بكتريا قولونية. من أجل الحفاظ على استقرارها في الخلية ، يجب أن يحتوي جزيء DNA البلازميد على أصل النسخ المتماثل ، والذي يسمح بتكاثره في الخلية بشكل مستقل عن تكرار الكروموسوم الخاص بالخلية.

تُعرف الكفاءة التي يمكن للثقافة المختصة من خلالها تناول الحمض النووي الخارجي والتعبير عن جيناته بكفاءة التحويل ويتم قياسها في وحدة تشكيل المستعمرة (cfu) لكل ميكروغرام من الحمض النووي المستخدم. كفاءة التحويل البالغة 1 × 10 8 cfu / ميكروغرام لبلازميد صغير مثل pUC19 تعادل تقريبًا 1 في 2000 جزيء من البلازميد المستخدم يتم تحويله.

في عملية تحويل كلوريد الكالسيوم ، يتم تحضير الخلايا بواسطة خلايا مبردة في وجود Ca 2+
(في CaCl
2 المحلول) ، مما يجعل الخلية تصبح منفذة للبلازميد DNA. يتم تحضين الخلايا على الجليد باستخدام الحمض النووي ، ثم تتعرض لصدمة حرارة لفترة وجيزة (على سبيل المثال ، عند 42 درجة مئوية لمدة 30-120 ثانية). تعمل هذه الطريقة بشكل جيد للغاية مع DNA البلازميد الدائري. يجب أن تعطي المستحضرات غير التجارية عادة 10 6 إلى 10 7 محولات لكل ميكروجرام من البلازميد ، وسيكون التحضير السيئ حوالي 10 4 / ميكروغرام أو أقل ، ولكن التحضير الجيد للخلايا المختصة يمكن أن يستسلم لما يصل إلى

10 8 مستعمرات لكل ميكروجرام من البلازميد. [60] ومع ذلك ، توجد بروتوكولات لصنع خلايا فائقة الكفاءة قد تسفر عن كفاءة تحويل تزيد عن 10 9. [61] ومع ذلك ، فإن الطريقة الكيميائية عادة لا تعمل بشكل جيد مع الحمض النووي الخطي ، مثل شظايا الحمض النووي الكروموسومي ، ربما لأن إنزيمات نوكلياز خارجية الخلية تعمل على تحلل الحمض النووي الخطي بسرعة. على النقيض من ذلك ، عادةً ما يتم تحويل الخلايا التي تتمتع بالكفاءة الطبيعية باستخدام DNA الخطي بشكل أكثر كفاءة من DNA البلازميد.

كفاءة التحويل باستخدام CaCl
2 تتناقص الطريقة مع حجم البلازميد ، وبالتالي قد يكون التثقيب الكهربائي طريقة أكثر فعالية لامتصاص DNA البلازميد الكبير. [62] يجب تحضير الخلايا المستخدمة في التثقيب الكهربائي أولاً عن طريق الغسيل بالماء البارد المقطر المزدوج لإزالة الجسيمات المشحونة التي قد تخلق شرارات أثناء عملية التثقيب الكهربائي.

الاختيار والفرز في تحويل البلازميد تحرير

نظرًا لأن التحول ينتج عادةً خليطًا من عدد قليل نسبيًا من الخلايا المحولة ووفرة من الخلايا غير المحولة ، فإن الطريقة ضرورية لاختيار الخلايا التي اكتسبت البلازميد. [63] لذلك يتطلب البلازميد علامة انتقائية بحيث يمكن قتل تلك الخلايا التي لا تحتوي على البلازميد أو إيقاف نموها. مقاومة المضادات الحيوية هي العلامة الأكثر استخدامًا بدائيات النوى. يحتوي البلازميد المحول على جين يمنح مقاومة لمضاد حيوي تكون البكتيريا حساسة له. يُزرع خليط الخلايا المعالجة على وسط يحتوي على المضاد الحيوي بحيث لا تتمكن سوى الخلايا المحولة من النمو. طريقة أخرى للاختيار هي استخدام بعض الواسمات المساعدة التي يمكن أن تعوض عن عدم القدرة على التمثيل الغذائي لبعض الأحماض الأمينية أو النيوكليوتيدات أو السكريات. تتطلب هذه الطريقة استخدام سلالات متحولة بشكل مناسب تكون ناقصة في تخليق أو فائدة جزيء حيوي معين ، ويتم استنبات الخلايا المحولة في وسط يسمح فقط للخلايا التي تحتوي على البلازميد بالنمو.

في تجربة الاستنساخ ، يمكن إدخال جين في بلازميد يستخدم للتحول. ومع ذلك ، في مثل هذه التجربة ، قد لا تحتوي كل البلازميدات على جين تم إدخاله بنجاح. لذلك يمكن استخدام تقنيات إضافية للكشف عن الخلايا المحولة التي تحتوي على البلازميد مع الإدخال. يمكن استخدام جينات المراسل كعلامات ، مثل لاكز الجين الذي يرمز لـ β-galactosidase المستخدم في الفحص بالأبيض والأزرق. تعتمد طريقة الفحص هذه على مبدأ تكامل α ، حيث يكون جزء من لاكز الجين (لاك) في البلازميد يمكن أن يكمل طفرة أخرى لاكز الجين (lacZΔM15) في الخلية. كلا الجينين ينتجان بذاتهما ببتيدات غير وظيفية ، ومع ذلك ، عندما يتم التعبير عنها معًا ، كما هو الحال عند احتواء البلازميد lacZ-α يتحول إلى ملف lacZΔM15 الخلايا ، فإنها تشكل وظيفية β-galactosidase. يمكن الكشف عن وجود β-galactosidase النشط عندما تنمو الخلايا في لوحات تحتوي على X-gal ، مكونة مستعمرات زرقاء مميزة. ومع ذلك ، فإن موقع الاستنساخ المتعدد ، حيث يمكن ربط الجين المعني في ناقل البلازميد ، يقع داخل لاك الجين. لذلك ، يؤدي الربط الناجح إلى تعطيل لاك الجين ، ولا يمكن أن يتشكل β-galactosidase وظيفي ، مما يؤدي إلى مستعمرات بيضاء. يمكن بعد ذلك التعرف بسهولة على الخلايا التي تحتوي على إدراج مرتبط بنجاح من خلال تلوينها الأبيض من الخلايا الزرقاء غير الناجحة.

ومن الجينات الأخرى المستخدمة بشكل شائع البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، الذي ينتج الخلايا التي تتوهج باللون الأخضر تحت الضوء الأزرق ، وإنزيم لوسيفيراز ، الذي يحفز التفاعل مع اللوسيفيرين لإصدار الضوء. يمكن أيضًا اكتشاف الحمض النووي المؤتلف باستخدام طرق أخرى مثل تهجين الحمض النووي بمسبار RNA المشع ، بينما يمكن أيضًا اكتشاف الخلايا التي تعبر عن البروتين المطلوب من البلازميد باستخدام طرق مناعية.


يؤثر الانتقاء الطبيعي على جوانب متعددة من الاختلاف الجيني في مواقع محايدة مفترضة عبر الجينوم البشري

السؤال الرئيسي في علم الأحياء التطوري هو كيف شكل الانتقاء الطبيعي أنماط التباين الجيني عبر الجينوم البشري. لقد وثق العمل السابق انخفاضًا في التنوع الجيني في مناطق الجينوم ذات معدلات إعادة التركيب المنخفضة. ومع ذلك ، من غير الواضح ما إذا كانت الملخصات الأخرى للتنوع الجيني ، مثل ترددات الأليل ، مرتبطة أيضًا بمعدل إعادة التركيب وما إذا كان يمكن تفسير هذه الارتباطات فقط عن طريق الاختيار السلبي ضد الطفرات الضارة أو ما إذا كان الاختيار الإيجابي الذي يعمل على الأليلات المفضلة مطلوبًا أيضًا. نحاول هنا معالجة هذه الأسئلة من خلال تحليل ثلاث مجموعات بيانات مختلفة لإعادة التسلسل على مستوى الجينوم من أفراد أوروبيين. نوثق العديد من الارتباطات المهمة بين السمات الجينومية المختلفة. على وجه الخصوص ، نجد أن متوسط ​​تواتر وتنوع الأليل الطفيف ينخفض ​​في مناطق إعادة التركيب المنخفض وأن التنوع البشري ، والاختلاف بين الإنسان والشمبانزي ، ومتوسط ​​تردد الأليل الصغير ينخفض ​​بالقرب من الجينات. تظهر عمليات المحاكاة الجينية السكانية أن الانتقاء الطبيعي الإيجابي الذي يعمل على الطفرات المواتية أو الانتقاء الطبيعي السلبي الذي يعمل ضد الطفرات الضارة يمكن أن يفسر هذه الارتباطات. ومع ذلك ، فإن النماذج ذات الاختيار الإيجابي القوي على الطفرات غير المجهولة والاختيار السلبي القليل تتنبأ بوجود ارتباط سلبي أقوى بين التنوع المحايد والاختلاف غير المجهول مما لوحظ في البيانات الفعلية ، مما يدعم أهمية الاختيار السلبي ، وليس الإيجابي ، في جميع أنحاء الجينوم. علاوة على ذلك ، نظهر أن الوجود الواسع للأليلات الضارة بشكل ضعيف ، بدلاً من عدد صغير من الطفرات المختارة بشكل إيجابي بقوة ، هو المسؤول عن الارتباط بين التنوع الجيني المحايد ومعدل إعادة التركيب. يشير هذا العمل إلى أن الانتقاء الطبيعي قد أثر على جوانب متعددة من الاختلاف المحايد المرتبط في جميع أنحاء الجينوم البشري وأن الاختيار الإيجابي ليس مطلوبًا لشرح هذه الملاحظات.

بيان تضارب المصالح

وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.

الأرقام

الشكل 1. الارتباطات بين ملخصات الجينات ...

الشكل 1. الارتباطات بين ملخصات التباين الجيني ومعدل إعادة التركيب في مجموعة البيانات منخفضة التغطية ...

الشكل 2. مقارنة سبيرمان للجينات ...

الشكل 2. مقارنة سبيرمان للمناطق الجينية مع القيم المتوقعة بناءً على الأمام ...

الشكل 3. الاختيار السلبي مطلوب من أجل ...

الشكل 3. الاختيار السلبي مطلوب لمطابقة جوانب متعددة من البيانات منخفضة التغطية.

الشكل 4. العلاقة بين الاختلاف المحايد بين الإنسان والشمبانزي ...

الشكل 4. العلاقة بين الاختلاف المحايد بين الإنسان والشمبانزي ( د ) ومعدل إعادة التركيب.


شكر وتقدير

نحن ممتنون لـ M. Shirakawa للمساعدة التقنية. نشكر K. Hikosaka للمساعدة في ثقافة المتصورة المنجلية، M. Komatsu (جامعة Juntendo) ل Atg7 + / + و Atg7 - / - MEFs ، S. Sato (Universiti Malaysia Sabah) لمتجه pSSPF2 ، M. Meissner (جامعة جلاسكو) لمتجه P5RT70loxPKillerRedloxPYFP-HX ، S. Yamaoka (جامعة طوكيو للطب والأسنان) لمتجه pMRXIP الرجعي ، T Kitamura (جامعة طوكيو) لمتجه الفيروسة الرجعية pMXs-IP ، و T. Yasui (جامعة أوساكا) لبلازميدات pCG-gag-pol و pCG-VSV-G. تم دعم هذا العمل بتمويل من البرنامج الوطني للبحث والتطوير في الصين (رقم 2017YFD0500400 إلى HJ) منحة مؤسسة طوكيو لأبحاث الكيمياء الحيوية (إلى MHS) في المعونة للبحث العلمي في المجالات المبتكرة (رقم 25111005 ، إلى NM ، ورقم 16H0101200 ، إلى YS) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم والبحوث الاستكشافية للتكنولوجيا المتقدمة (ERATO) (رقم JPMJER1702 ، إلى NM) والبحوث الأساسية للعلوم والتكنولوجيا التطورية (CREST) ​​(رقم JPMJCR13M7 ، إلى NNN من وكالة العلوم والتكنولوجيا اليابانية (JST).


كيمياء كربونيل المتفاعلة

الألدهيدات (RCHO) والكيتونات (RCOR ') هي أنواع متفاعلة من مجموعة وظيفية أكثر عمومية تسمى كاربونيل ، والتي لها رابطة كربون-أكسجين مزدوجة (C = O). إن قطبية هذه الرابطة (خاصة في سياق الألدهيدات) تجعل ذرة الكربون محبة للكهرباء ومتفاعلة مع الكائنات النووية مثل الأمينات الأولية.

على الرغم من أن الألدهيدات لا توجد بشكل طبيعي في البروتينات أو الجزيئات الكبيرة الأخرى ذات الأهمية في العينات البيولوجية النموذجية ، إلا أنه يمكن إنشاؤها في أي مكان توجد فيه مجموعات السكر المؤكسدة (وتسمى أيضًا السكريات المختزلة). هذه السكريات هي مكونات مونومر شائعة للسكريات أو الكربوهيدرات في التعديلات اللاحقة للترجمة (الارتباط بالجليكوزيل) للعديد من البروتينات (أي البروتينات السكرية). بالإضافة إلى ذلك ، فإن ريبوز الحمض النووي الريبي هو سكر مختزل.

حمض الدوري (HIO4) من فترات الصوديوم المذابة (NaIO4) هو عامل معتدل معروف لأكسدة الثنائيات المجاورة بشكل فعال في السكريات الكربوهيدراتية لإنتاج مجموعات ألدهيد تفاعلية. رابطة الكربون والكربون مشقوق بين مجموعات الهيدروكسيل المجاورة. عن طريق تغيير كمية مادة الدوريات المستخدمة ، يمكن إنتاج الألدهيدات على مجموعة أصغر أو أكبر من أنواع السكر. على سبيل المثال ، عادةً ما يؤثر علاج البروتينات السكرية باستخدام 1 ملي مولار على بقايا حمض السياليك ، والتي تحدث غالبًا في نهايات سلاسل السكاريد. بتركيزات من 6 إلى 10 ملي بريدات ، سوف تتأثر مجموعات السكر الأخرى في البروتينات.

يعد تعديل الكربوهيدرات مفيدًا بشكل خاص لإنشاء مواقع مستهدفة للاقتران على الأجسام المضادة متعددة النسيلة لأن السكريات المتعددة توجد في منطقة Fc ، بعيدًا عن موقع ارتباط مولد الضد. ينتج عن هذا وضع العلامات أو مواقع التشابك الموجودة بعيدًا عن مواقع ربط مولد الضد ، مما يضمن أن وظيفة الجسم المضاد لن تتأثر سلبًا بإجراء الاقتران.

يؤدي تفاعل فترة الصوديوم مع مخلفات السكر إلى إنتاج الألدهيدات لتفاعلات الاقتران. تمثل R و R 'ربط مونومرات السكر في عديد السكاريد. تشير العلامات النجمية الحمراء إلى مواقع انقسام الديول. يسمى حمض السياليك أيضًا بحمض N-acetyl-D-neuraminic.

يعد تعديل الكربوهيدرات مفيدًا بشكل خاص لإنشاء مواقع مستهدفة للاقتران على الأجسام المضادة متعددة النسيلة لأن السكريات المتعددة تقع في منطقة Fc. ينتج عن هذا وضع العلامات أو مواقع التشابك الموجودة بعيدًا عن مواقع ربط مولد الضد ، مما يضمن أن وظيفة الجسم المضاد لن تتأثر سلبًا بإجراء الاقتران.

يتعلم أكثر

حدد المنتجات

يعد هذا الدليل المكون من 45 صفحة ذا قيمة للمبتدئين وكذلك أولئك الذين لديهم خبرة سابقة في كواشف الربط المتشابك. يبدأ بمناقشة أساسية حول التشابك والكواشف المستخدمة. يحتوي الدليل أيضًا على مناقشة حول التطبيقات المختلفة التي تم فيها تطبيق الارتباط المتشابك ، بما في ذلك تقنية نقل الملصقات القوية لتحديد أو تأكيد تفاعلات البروتين. تتم معالجة كيمياء التشابك بتنسيق سهل المتابعة مصمم لنقل المعلومات المهمة التي تحتاجها دون أن تضيع في التفاصيل. يظهر كل كاشف بيرس للربط المتشابك جنبًا إلى جنب مع هيكله ووزنه الجزيئي وطول ذراع المباعد والتفاعل الكيميائي. يختتم الكتيب بقائمة من المراجع الممتازة حول استخدام الروابط المتقاطعة ومسرد للمصطلحات الشائعة للربط المتشابك.

مجموعات تفاعلية متشابكة Aldehyde-crosslinker

كما سبق ذكره أعلاه ، فإن الأنواع المحبة للنووية من الأمينات الأولية (–NH2) هي الفئة الرئيسية للمركبات التي تتفاعل مع الألدهيدات. نظرًا لوجود الأمينات الأولية بكثرة في البروتينات ، فمن المهم أن نتذكر أن الألدهيدات تمثل كيمياء الارتباط المتشابك المتفاعل مع الأمين تمامًا مثل الأمينات الأولية التي تشكل كيمياء الارتباط المتشابك المتفاعل مع الألدهيد (هذه الصفحة).

ومع ذلك ، فإن الأمينات الأولية الطبيعية للبروتينات (الطرف N من polypeptides والسلسلة الجانبية من lysines) ، التي تكون على شكل R-C-NH2 ، لا تتفاعل بقوة أو بشكل دائم مع الألدهيدات ، إلا في ظروف معينة وعندما تكون المركبات الإضافية أضيفت لتحقيق الاستقرار في السند. تمت مناقشة التفاعل ، المسمى بالأمين الاختزالي ، في نهاية هذه المقالة ، لأن تطبيقاته الرئيسية لا تتضمن استخدام مجموعات تفاعلية منفصلة يمكن دمجها في الكواشف الجاهزة للاستخدام أو كواشف الارتباط المتشابك.

بدلاً من ذلك ، تعتبر الهيدرازيدات والألكوكسي أمينات أهم مجموعات وظيفية تفاعلية للألدهيد لإدماجها في الكواشف التركيبية والكواشف المتشابكة. المجموعات الأمينية الطرفية في هذه المركبات هي محبة للأنوية بقوة أكبر من أمينات البروتين ، وتتفاعل تلقائيًا مع الألدهيدات لتكوين روابط مستقرة.

كيمياء تفاعل الهيدرازيد

تتفاعل الألدهيدات الناتجة عن أكسدة الدوريات للسكريات في العينات البيولوجية مع الهيدرازيدات عند الأس الهيدروجيني من 5 إلى 7 لتكوين روابط هيدرازون. على الرغم من أن هذه الرابطة لمجموعة هيدرازيد هي نوع من قاعدة شيف ، إلا أنها أكثر ثباتًا من قاعدة شيف المكونة من أمين بسيط. رابطة الهيدرازون مستقرة بدرجة كافية لمعظم تطبيقات وضع العلامات على البروتين. ومع ذلك ، إذا رغبت في ذلك ، يمكن اختزال الرابطة المزدوجة إلى رابطة أمين ثانوية أكثر ثباتًا باستخدام سيانوبوروهيدريد الصوديوم (انظر القسم الخاص بالأمين الاختزالي في نهاية هذه الصفحة).

مخطط تفاعل هيدرازيد للاقتران الكيميائي للألدهيد. يمثل R كاشف وضع العلامات أو أحد طرفي الرابط المتشابك الذي يحتوي على مجموعة تفاعل الهيدرازيد P يمثل بروتين سكري أو جزيء جليكوزيلاتي آخر يحتوي على المجموعة الوظيفية المستهدفة (على سبيل المثال ، ألدهيد يتكون من أكسدة الدوريات لمجموعات السكر الكربوهيدرات ، مثل حمض السياليك) .

مع الأوزان الجزيئية المنخفضة (& lt1000 Da) وإشارات الفلورسنت الساطعة ، يتم استخدام hyrazides كمقتفعات قطبية تعبر تقاطعات الفجوة وتتبع الإسقاطات العصبية. لذلك ، غالبًا ما تستخدم الهيدرازيدات للتحقيق في الاتصالات العصبية بالتزامن مع ديكسترانس المسمى ، والذي يتم الاحتفاظ به داخل الخلية. توجد الهيدرازيدات في مجموعة من الألوان الفلورية ويمكن مضاعفتها مع مجسات أخرى. توفر الصورة (كنفوكل) التالية مثالاً تمثيليًا لهيدرازيد المستخدم في تعقب الخلايا العصبية.

تلطيخ الخلايا العصبية. كومة صور متحد البؤر من ألياف متسلقة ذات لون أخضر كالسيوم بقدرة 10000 ميغاواط في شريحة مخيخية سهمية ، تُظهر محورًا عصبيًا واردًا وتشجيرًا طرفيًا (باللون الأصفر). تم تمييز خلية Purkinje المعصبة بهذه الألياف باستخدام Invitrogen Alexa Fluor 568 hydrazide.

يتعلم أكثر

حدد المنتجات

تقنيات الاقتران الحيوي ، الإصدار الثالث (2013) من تأليف Greg T. Hermanson هو تحديث رئيسي لكتاب معروف على نطاق واسع بأنه الدليل المرجعي النهائي في مجال الاقتران الحيوي.

تقنيات الاقتران الحيوي عبارة عن كتاب مدرسي كامل ودليل بروتوكولات لعلماء الحياة الراغبين في تعلم وإتقان تقنيات الربط المتشابك الجزيئي ووضع العلامات والتثبيت التي تشكل أساس العديد من التطبيقات المختبرية. يعد الكتاب أيضًا مرجعًا شاملاً وقويًا للباحثين الذين يتطلعون إلى تطوير استراتيجيات اقتران جديدة لتطبيقات جديدة تمامًا. كما يحتوي على مقدمة شاملة في مجال الاقتران الحيوي تغطي جميع التطبيقات الرئيسية للتقنية المستخدمة في مختلف التخصصات العلمية بالإضافة إلى احتوائها على نصائح لتصميم الاقتران الحيوي الأمثل لأي غرض.

تحفيز الأنيلين لاقتران هيدرازيد

في الآونة الأخيرة ، تم اكتشاف أن الأنيلين يعمل كمحفز لتفاعلات هيدرازيد - الألدهيد. يشكل أمين الأنيلين العطري بسرعة وكفاءة قاعدة شيف مع الألدهيد ، مما يزيد بشكل فعال من تنشيط الألدهيد. نتيجة لذلك ، يتم استبدال الأنيلين بسهولة بهيدرازيد. وبالتالي ، فإن الأنيلين (يسمى أيضًا محفز اقتران GlycoLink) يسمح بإنتاجية اقتران أكبر بكثير مع الهيدرازيدات و / أو كفاءة أكبر (أي محاصيل متساوية مع كاشف هيدرازيد أقل). يقلل محفز اقتران GlycoLink من أوقات التفاعل ويزيد من كفاءة اقتران الألدهيد هيدرازيد ، مما يؤدي إلى اقتران أكثر من 90٪ من البروتينات السكرية في 4 ساعات.

راجع المراجع التالية للحصول على معلومات إضافية حول تحفيز الأنيلين:

  1. بيون ، جي واي وآخرون. (2010). الاقتران الحيوي الفعال لعوامل التقاط البروتين لأسطح المستشعر الحيوي باستخدام ربط الهيدرازون المحفز بالأنيلين. لانجموير 26 (19): 15430-5.
  2. ديركسن ، أ ، وآخرون. (2006). التحفيز النووي لتشكيل الهيدرازون ونقله: الآثار المترتبة على الكيمياء التساهمية الديناميكية. جيه. تشيم. شركة 128 (49): 15602-3.
  3. ديركسن ، أ. ، داوسون ، بي. (2008). روابط الأوكسيم والهيدرازون السريعة مع الألدهيدات العطرية لوضع العلامات الجزيئية الحيوية. Bioconjug. تشيم. 19 (12): 2543-8.

لمعرفة المزيد عن الأنيلين ، انظر الجدول أدناه.

بروتينالوزن الجزيئي الغرامي# مواقع الارتباط بالجليكوزيلنسبة إشغال المواقع٪ تقارن
الجرذ أحادي النسيلة IgG1150,0002عامل72.93
الماوس أحادي النسيلة IgG1150,0002عامل84.74
مصل الأرنب IgG150,000210089.78
دجاج Polyclonal IgY170,000410090.62
مصل الإنسان IgG150,000210097.13
مصل الإنسان IgM970,0001010097.18
البيضاوي45,000110098.50

الجدول 1. خصائص الارتباط بالجليكوزيل للأجسام المضادة متعددة النسيلة (والألبومين البيضاوي) وكفاءة اقتران البروتين السكري براتنج Thermo Scientific GlycoLink. لكل تجربة ، تم تفاعل 0.4 مجم من البروتين مع 0.1 مل من الراتنج

يتعلم أكثر

حدد المنتجات

تطبيقات تشابك هيدرازيد

1. باستخدام مكرر- مركبات الهيدرازيد

تشتمل مركبات هيدرازيد متجانسة الوظائف المتوفرة تجاريًا (أي تلك التي تحتوي على مجموعة هيدرازيد في كل طرف) على الكربوهيدرازيد (MW 90.1) وثنائي هيدرازيد حمض الأديبيك (ADH ، MW 174.2). هؤلاء مكرريمكن استخدام مركبات الهيدرازيد في تفاعل واحد للربط المتشابك وبلمرة السكريات أو السكريات المحضرة (المحتوية على الألدهيد). ومع ذلك ، فهي تستخدم بشكل متكرر لتعديل الجزيئات وربطها على مرحلتين ، إما بطريقة متجانسة أو غير متجانسة.

على سبيل المثال ، من خلال تفاعل ADH بكمية كبيرة مع ديكستران مؤكسد للدورات (عديد السكاريد) ، سوف يتحد جانب واحد فقط من كل جزيء ADH فردي ، مما يؤدي إلى تنشيط هيدرازيد للديكستران. بعد التحلية لإزالة فائض هرمون ADH غير المتفاعل ، يمكن إضافة ليجند صغير يحتوي على الألدهيد ليتحد في مواقع متعددة على ديكستران أكبر بكثير.

لأن كل هيدرازيد هو أيضًا أمين ، أ مكرريمكن استخدام مركب هيدرازيد بشكل غير متجانس بعدة طرق لأداء اقترانات متخصصة. على سبيل المثال ، يمكن أن يتفاعل ADH بكمية كبيرة مع قليل النوكليوتيد RNA الذي تم أكسدة مجموعات الريبوز الخاصة به لتكوين الألدهيدات. بعد إزالة الملوحة لإزالة ADH الزائد ، يمكن استخدام EDC (كيمياء تفاعل كاربودييميد) لربط ملصق يحتوي على الكربوكسيل أو جزيء ناقل للحمض النووي المشتق من الأمين.

2. إعداد اتحادات بروتين سكري محددة

تعتبر روابط هيدرازيد المتشابكة غير المتجانسة التي تحتوي نهايتها المقابلة على مجموعة مالييميد تفاعلية للسلفهيدريل مفيدة لربط البروتينات السكرية ببروتينات أو جزيئات أخرى. انظر صفحة كيمياء الكروسلينكر المتفاعلة من سلفهيدريل للحصول على معلومات حول مجموعة مالييميد. تم ذكر الروابط المتقاطعة Aldehyde-to-sulfhydryl هنا ، لأن مالييميدات هي واحدة من المجموعات القليلة التي يمكن إقرانها مقابل الهيدرازيدات في كاشف واحد. هذا لأن مجموعة الهيدرازيد تحتوي على أمين أولي ولا يمكن إقرانها في جزيء واحد مع مجموعة أمين متفاعلة ، مثل إستر NHS.

ومع ذلك ، فإن اختيار الكاشف المحدود هذا لا يعني أن تطبيقات الاقتران بالكربوهيدرات تقتصر على البروتينات التي تحتوي على مجموعات سلفهيدريل أصلية. هذا يعني ببساطة أنه يجب أولاً تعديل أي جزيء كبير يرغب المرء في ربطه بالكربوهيدرات لاحتواء مجموعة سلفهيدريل. مشابه ل مكررسيناريوهات هيدرازيد الموصوفة أعلاه ، توجد الكواشف لتعديل الجزيئات لاحتواء مجموعات السلفهيدريل. على سبيل المثال ، فإن كاشف Traut (2-Iminothiolane ، 2-IT) و SATA سيضيفان مجموعات السلفهيدريل إلى مواقع الأمين الأولية.

عندما يتم إجراء الربط المتشابك للمالييميد - هيدرازيد بالتتابع ، عادة ما يتم إجراء التفاعل مع السلفهيدريل أولاً متبوعًا بالتفاعل مع الجزيء المحتوي على الألدهيدات المحضرة. يمكن عمل التسلسل المعاكس ، ولكن يجب تنفيذ الخطوات الأولية بسرعة لمنع التحلل المائي لمجموعة مالييميد.

يعتمد أفضل نهج للربط المتشابك واستراتيجية التعديل لإعداد أهداف جزيئية خاصة للاقتران على عدة عوامل. على الرغم من أنه يمكن تكييف الظروف لاستخدام الروابط المتشابكة مالييميد-هيدرازيد ، يمكن تحقيق العديد من أهداف الاقتران المماثلة باستخدام استراتيجيات مختلفة. على سبيل المثال ، راجع مناقشة التحسين الاختزالي في نهاية هذه الصفحة فيما يتعلق بإعداد اقترانات الجسم المضاد- HRP.


شاهد الفيديو: ABO - تفوق الجينات - تحديد الجنس (أغسطس 2022).