معلومة

ب 4. البروتينات السكرية المرتبطة بـ O - علم الأحياء

ب 4. البروتينات السكرية المرتبطة بـ O - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

عادة ما يتم ربط CHOs من GalNAc Gal (ب 1-3) إلى Ser أو Thr من البروتين.

الشكل: البروتينات السكرية المرتبطة بـ O

من الأمثلة على ذلك ، مستضدات فصيلة الدم (CHO على الخلايا المرتبطة بالبروتينات أو الدهون). السكريات الموضحة على شكل كراسي في الشكل أدناه هي مستضدات فصيلة الدم (على عكس الهياكل الموجودة في العديد من النصوص). وهي متصلة بالسكريات غير المتجانسة الأساسية (كما هو موضح في الشكل الأحمر أدناه) والتي ترتبط إما ببروتين سكري غشائي أو جليكوليبيد.

الشكل: مستضدات فصيلة الدم


ما هي البروتينات السكرية وماذا تفعل

البروتين السكري هو نوع من جزيء البروتين يحتوي على كربوهيدرات مرتبطة به. تحدث العملية إما أثناء ترجمة البروتين أو كتعديل لاحق للترجمة في عملية تسمى الارتباط بالجليكوزيل.

الكربوهيدرات عبارة عن سلسلة قليلة السكاريد (غليكان) مرتبطة تساهميًا بالسلاسل الجانبية متعددة الببتيد للبروتين. بسبب مجموعات -OH من السكريات ، فإن البروتينات السكرية هي أكثر ماءً من البروتينات البسيطة. هذا يعني أن البروتينات السكرية تنجذب إلى الماء أكثر من البروتينات العادية. تؤدي الطبيعة المحبة للماء للجزيء أيضًا إلى الطي المميز للبنية الثلاثية للبروتين.

الكربوهيدرات عبارة عن جزيء قصير ، غالبًا ما يكون متفرّعًا ، وقد يتكون من:

  • السكريات البسيطة (على سبيل المثال ، الجلوكوز ، الجالاكتوز ، المانوز ، الزيلوز)
  • السكريات الأمينية (السكريات التي تحتوي على مجموعة أمينية ، مثل N-acetylglucosamine أو N-acetylgalactosamine)
  • السكريات الحمضية (السكريات التي تحتوي على مجموعة الكربوكسيل ، مثل حمض السياليك أو حمض N-acetylneuraminic)

ينظم الارتباط بالجليكوزيل من نوع الميوسين المرتبط بـ O برنامج النسخ المصب لـ EGFR

يعتبر الارتباط بالجليكوزيل المرتبط بالميوسين من النوع O الشاذ أمرًا شائعًا في السرطان حيث غالبًا ما يُنظر إلى زيادة تنظيم sialyltransferases مما يؤدي إلى الإنهاء المبكر لسلاسل O-glycan. لا يقتصر الارتباط بالجليكوزيل المرتبط بالميوسين من النوع O على الميوسين ويحدث على العديد من البروتينات السكرية على سطح الخلية بما في ذلك EGFR ، حيث يمكن أن يكون عدد المواقع محدودًا. عند ربط EGF ، يستحث EGFR سلسلة إشارات وقد ينتقل أيضًا إلى النواة حيث ينظم نسخ الجينات مباشرةً ، وهي عملية يتم تعديلها بواسطة Galectin-3 و MUC1 في بعض أنواع السرطان. هنا ، نوضح أنه عند ارتباط EGF ، تستجيب خلايا سرطان الثدي التي تحمل O-glycans المختلفة عن طريق نسخ توقيعات التعبير الجيني المختلفة. MMP10 ، الجين الرئيسي الذي يتم تنظيمه عندما يتم تحفيز الخلايا التي تحمل الجليكانات الأساسية sialylated مع EGF ، يتم تنظيمه أيضًا في سرطان الثدي الإيجابي ER الذي تم الإبلاغ عنه للتعبير عن مستويات عالية من ST3Gal1 وبالتالي بشكل أساسي 1 sialylated O-glycans. على النقيض من ذلك ، فإن الخلايا المتجانسة المصممة لنقل الجليكانات الأساسية 2 تنظم CX3CL1 و FGFBP1 ويتم تنظيم هذه الجينات في سرطانات الثدي السلبية ER ، والمعروف أيضًا أنها تعبر عن نواة أطول 2 O-glycans. التغييرات في O- glycosylation لم تغير بشكل كبير تحويل الإشارة في اتجاه مجرى EGFR في الخلايا التي تعبر عن O-glycan الأساسية 1 أو الأساسية 2. ومع ذلك ، لوحظت تغييرات مذهلة في تكوين مركب EGFR / galectin-3 / MUC1 /-catenin على سطح الخلية الموجود في الخلايا التي تحمل O-glycans قصيرة النواة 1 ولكنها غائبة في الخلايا الحاملة الأساسية 2.

الكلمات الدالة: EGFR Galectin-3 MUC1 نسخ الجليكوزيل المرتبط بـ O.


محتويات

ا-ن- أسيتيل جالاكتوزامين (ا-GalNAc) تحرير

إضافة ن- أسيتيل جالاكتوزامين (GalNAc) إلى سيرين أو ثريونين يحدث في جهاز جولجي ، بعد طي البروتين. [1] [6] يتم تنفيذ العملية بواسطة إنزيمات تُعرف باسم GalNAc transferases (GALNTs) ، والتي يوجد منها 20 نوعًا مختلفًا. [6] الأولي ا- يمكن تعديل بنية GalNAc بإضافة السكريات الأخرى ، أو المركبات الأخرى مثل مجموعات الميثيل والأسيتيل. [1] تنتج هذه التعديلات 8 هياكل أساسية معروفة حتى الآن. [2] تمتلك الخلايا المختلفة إنزيمات مختلفة يمكنها إضافة المزيد من السكريات ، والمعروفة باسم إنزيمات الجليكوزيل ترانسفيراز ، وبالتالي تتغير الهياكل من خلية إلى أخرى. [6] السكريات الشائعة المضافة تشمل الجالاكتوز ، ن- أسيتيل جلوكوزامين وفوكوز وحمض السياليك. يمكن أيضًا تعديل هذه السكريات بإضافة مجموعات الكبريتات أو الأسيتيل.

تحرير التخليق الحيوي

يضاف GalNAc إلى بقايا سيرين أو ثريونين من جزيء سلائف ، من خلال نشاط إنزيم GalNAc ترانسفيراز. [1] هذه المادة الأولية ضرورية حتى يمكن نقل السكر إلى مكان إضافته إلى البروتين. لم يتم تحديد البقايا المحددة التي سيتم ربط GalNAc بها ، لأن هناك العديد من الإنزيمات التي يمكن أن تضيف السكر وكل منها يفضل بقايا مختلفة. [7] ومع ذلك ، غالبًا ما توجد بقايا البرولين (Pro) بالقرب من ثريونين أو سيرين. [6]

بمجرد إضافة هذا السكر الأولي ، يمكن أن تحفز ناقلات الجليكوزيل الأخرى إضافة السكريات الإضافية. اثنان من الهياكل الأكثر شيوعًا المتكونة هما Core 1 و Core 2. يتكون اللب 1 من إضافة سكر الجالاكتوز إلى GalNAc الأولي. يتكون Core 2 من بنية Core 1 مع عنصر إضافي ن- سكر الأسيتيل جلوكوزامين (جلكناك). [6] بولي-ن- يمكن تكوين هيكل الأسيتيللاكتوزامين عن طريق الإضافة المتناوبة لسكريات الجلاكتوز و GlcNAc على سكر GalNAc. [6]

السكريات النهائية على O-glycans مهمة في التعرف عليها من خلال الليكتين وتلعب دورًا رئيسيًا في جهاز المناعة. تشكل إضافة السكريات الفوكوزية بواسطة ناقلات الفوكوز حواتم لويس وسقالة لمحددات فصيلة الدم. إضافة الفوكوز وحده ينتج مستضد H ، الموجود في الأشخاص الذين لديهم فصيلة الدم O. [6] عن طريق إضافة الجالاكتوز إلى هذا الهيكل ، يتم إنشاء مستضد B لفصيلة الدم B. بدلاً من ذلك ، ستؤدي إضافة سكر GalNAc إلى إنشاء مستضد A لفصيلة الدم A.

وظائف التحرير

االسكريات -GalNAc مهمة في مجموعة متنوعة من العمليات ، بما في ذلك دوران الكريات البيض أثناء الاستجابة المناعية ، والتخصيب ، والحماية من الميكروبات الغازية. [1] [2]

ا- تعتبر سكريات GalNAc شائعة في البروتينات السكرية الغشائية ، حيث تساعد في زيادة صلابة المنطقة القريبة من الغشاء بحيث يمتد البروتين بعيدًا عن السطح. [6] على سبيل المثال ، يُسقط مستقبل البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) من سطح الخلية بواسطة منطقة جامدة بواسطة O-glycans. [2]

لكي تنتقل الكريات البيض في الجهاز المناعي إلى الخلايا المصابة ، يجب أن تتفاعل مع هذه الخلايا من خلال المستقبلات. تعبر الكريات البيض عن الروابط على سطح الخلية للسماح بحدوث هذا التفاعل. [1] P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) عبارة عن ليجند يحتوي على الكثير من O-glycans الضرورية لوظيفته. يحافظ O-glycans بالقرب من الغشاء على البنية الممدودة ، كما أن حاتمة sLe x الطرفية ضرورية للتفاعلات مع المستقبل. [8]

الميوسين عبارة عن مجموعة من البروتينات شديدة الغلوكوزيلاتي التي تبطن القناة الهضمية والجهاز التنفسي لحماية هذه المناطق من العدوى. [6] الميوسينات مشحونة سلبًا ، مما يسمح لها بالتفاعل مع الماء ومنعها من التبخر. هذا مهم في وظيفتها الوقائية لأنها تزييت المسالك بحيث لا يمكن للبكتيريا أن تلتصق بالجسم وتصيبه. تعتبر التغييرات في الميوسين مهمة في العديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان ومرض التهاب الأمعاء. يؤدي غياب O-glycans على بروتينات mucin إلى تغيير شكلها ثلاثي الأبعاد بشكل كبير وغالبًا ما يمنع الوظيفة الصحيحة. [1] [9]

ا-ن- أسيتيل جلوكوزامين (ا-GlcNAc) تحرير

إضافة ن- أسيتيل جلوكوزامين (O-GlcNAc) إلى بقايا السيرين وثريونين يحدث عادة على البروتينات السيتوبلازمية والنووية التي تبقى في الخلية ، بينما اعادة ما تحدث تعديلات -GalNAc على البروتينات التي سيتم إفرازها. [10] تم اكتشاف التعديل مؤخرًا فقط ، ولكن عدد البروتينات المصاحبة له يتزايد بسرعة. [7] إنه أول مثال على الارتباط بالجليكوزيل الذي لا يحدث في البروتينات الإفرازية.

ا- يختلف الارتباط بالجليكوزيل عن عمليات الارتباط بالجليكوزيل الأخرى لأنه لا توجد عادة سكريات مضافة إلى البنية الأساسية ولأن السكر يمكن ربطه أو إزالته من البروتين عدة مرات. [6] [7] تحدث هذه الإضافة والإزالة في دورات ويتم إجراؤها بواسطة إنزيمين محددين للغاية. تمت إضافة O-GlcNAc بواسطة O-GlcNAc transferase (OGT) وإزالتها بواسطة O-GlcNAcase (OGA). نظرًا لوجود إنزيمين فقط يؤثران على هذا التعديل المحدد ، يتم تنظيمهما بإحكام شديد ويعتمدان على الكثير من العوامل الأخرى. [11]

نظرًا لأنه يمكن إضافة وإزالة O-GlcNAc ، يُعرف باسم التعديل الديناميكي وله الكثير من أوجه التشابه مع الفسفرة. يمكن أن تحدث عملية O-GlcNAcylation والفسفرة على نفس بقايا ثريونين وسيرين ، مما يشير إلى وجود علاقة معقدة بين هذه التعديلات التي يمكن أن تؤثر على العديد من وظائف الخلية. [6] [12] يؤثر التعديل على عمليات مثل استجابة الخلايا للإجهاد الخلوي ، ودورة الخلية ، واستقرار البروتين ، ودوران البروتين. قد يكون متورطًا في الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون ومرض الزهايمر المتأخر [1] [12] وقد وجد أنه يلعب دورًا في مرض السكري. [13]

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يعزز O-GlcNAcylation تأثير واربورغ ، والذي يُعرَّف بأنه التغيير الذي يحدث في عملية التمثيل الغذائي للخلايا السرطانية لصالح نموها. [6] [14] نظرًا لأن كلاً من O-GlcNAcylation والفسفرة يمكن أن يؤثر على مخلفات معينة ، وبالتالي فإن كلاهما لهما وظائف مهمة في تنظيم مسارات الإشارات ، توفر كلتا العمليتين أهدافًا مثيرة للاهتمام لأبحاث السرطان.

ا- مانوز (ا-رجل) تحرير

يتضمن O-mannosylation نقل مانوز من dolichol-ص-جزيء مانوز مانوز على بقايا سيرين أو ثريونين للبروتين. [15] معظم عمليات الارتباط بالجليكوزيل بالأكسجين الأخرى تستخدم نوكليوتيد السكر كجزيء مانح. [7] هناك اختلاف آخر عن عمليات O-glycosylations الأخرى وهو أن العملية تبدأ في الشبكة الإندوبلازمية للخلية ، بدلاً من جهاز جولجي. [1] ومع ذلك ، فإن إضافة المزيد من السكريات تحدث في جولجي. [15]

حتى وقت قريب ، كان يُعتقد أن العملية تقتصر على الفطريات ، ولكنها تحدث في جميع مجالات حقيقيات النوى (eu) والبكتيريا والأركيا (البكتيريا) أ. [16] أفضل بروتين بشري تم وصفه بـ O-mannosylated هو α-dystroglycan. [15] تفصل سكريات O-Man بين مجالين من البروتين ، مطلوبان لربط المناطق خارج الخلية وداخل الخلايا لتثبيت الخلية في موضعها. [17] يمكن إضافة ريبيتول وزيلوز وحمض الجلوكورونيك إلى هذه البنية في تعديل معقد يشكل سلسلة سكر طويلة. [8] هذا مطلوب لتثبيت التفاعل بين α-dystroglycan والغشاء القاعدي خارج الخلية. بدون هذه التعديلات ، لا يمكن للبروتين السكري أن يثبت الخلية مما يؤدي إلى الحثل العضلي الخلقي (CMD) ، الذي يتميز بتشوهات شديدة في الدماغ. [15]

ا- الجلاكتوز (ا-Gal) تحرير

يوجد O-galactose بشكل شائع في بقايا اللايسين في الكولاجين ، والتي غالبًا ما تحتوي على مجموعة هيدروكسيل مضافة لتكوين هيدروكسي ليسين. بسبب هذه الإضافة للأكسجين ، يمكن بعد ذلك تعديل هيدروكسي ليسين بواسطة O- glycosylation. تبدأ إضافة الجالاكتوز إلى مجموعة الهيدروكسيل في الشبكة الإندوبلازمية ، ولكنها تحدث في الغالب في جهاز جولجي وفقط على بقايا الهيدروكسيليسين في تسلسل محدد. [1] [18]

في حين أن ارتباط O- الجالاكتوز ضروري للوظيفة الصحيحة في جميع الكولاجين ، فهو شائع بشكل خاص في أنواع الكولاجين الرابع والخامس. [19] في بعض الحالات ، يمكن إضافة سكر الجلوكوز إلى الجالاكتوز الأساسي. [7]

تحرير O-Fucose (O-Fuc)

تعد إضافة السكريات الفوكوزية إلى بقايا السيرين والثريونين شكلاً غير عادي من أشكال الارتباط بالجليكوزيل O التي تحدث في الشبكة الإندوبلازمية ويتم تحفيزها بواسطة اثنين من ناقلات الفوكوزيل. [20] تم اكتشاف هذه في المتصورة المنجلية [21] و التوكسوبلازما. [22]

تعمل العديد من الإنزيمات المختلفة على تحفيز استطالة لب الفوكوز ، مما يعني أنه يمكن إضافة سكريات مختلفة إلى الفوكوز الأولي على البروتين. [20] جنبًا إلى جنب مع ارتباط O-glucosylation ، يوجد ارتباط O بالفوكوز أساسًا في مجالات عامل نمو البشرة (EGF) الموجودة في البروتينات. [7] يحدث الارتباط بالفوكوز في نطاقات EGF بين بقايا السيستين المحفوظة الثانية والثالثة في تسلسل البروتين. [1] بمجرد إضافة O-fucose الأساسية ، غالبًا ما يتم إطالتها بإضافة GlcNAc والجلاكتوز وحمض السياليك.

Notch هو بروتين مهم قيد التطوير ، مع العديد من مجالات EGF التي هي O-fucosylated. [23] التغييرات في تطوير لب الفوكوز تحدد التفاعلات التي يمكن أن يشكلها البروتين ، وبالتالي أي الجينات سيتم نسخها أثناء التطور. قد يلعب ارتباط O بالفوكوز أيضًا دورًا في تكسير البروتين في الكبد. [1]

تحرير O-Glucose (O-Glc)

على غرار ارتباط O-fucosylation ، فإن ارتباط O- الجلوكوز هو تعديل غير عادي مرتبط بـ O لأنه يحدث في الشبكة الإندوبلازمية ، يتم تحفيزه بواسطة O-glucosyltransferases ، ويتطلب أيضًا تسلسلًا محددًا من أجل إضافته إلى البروتين. غالبًا ما يتم ربط O-glucose بمخلفات السيرين بين بقايا السيستين المحفوظة الأولى والثانية لنطاقات EGF ، على سبيل المثال في عوامل التخثر السابع والتاسع. [7] يبدو أن الارتباط بالغلوكوزيل O ضروري أيضًا من أجل الطي المناسب لنطاقات EGF في بروتين Notch. [24]

تتكون البروتيوغليكان من بروتين به واحد أو أكثر من سلاسل السكر الجانبية ، والمعروفة باسم glycosaminoglycans (GAGs) ، المرتبطة بأكسجين بقايا السيرين والثريونين. [25] تتكون GAGs من سلاسل طويلة من وحدات السكر المتكررة. توجد البروتيوغليكان عادة على سطح الخلية وفي المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وهي مهمة لقوة ومرونة الغضاريف والأوتار. يرتبط غياب البروتيوغليكان بفشل القلب والجهاز التنفسي ، وعيوب في نمو الهيكل العظمي وزيادة ورم خبيث. [25]

توجد أنواع مختلفة من البروتيوغليكان ، اعتمادًا على السكر المرتبط بذرة الأكسجين في البقايا في البروتين. على سبيل المثال ، يتم ربط كبريتات الهيباران GAG ببقايا بروتين سيرين من خلال سكر الزيلوز. [7] الهيكل ممتد مع عدة ن-اسيتيللاكتوزامين وحدات السكر المكرر المضافة إلى الزيلوز. هذه العملية غير عادية وتتطلب ترانسفيرازات زيلوزيل محددة. [6] ترتبط كبريتات الكيراتان بمخلفات سيرين أو ثريونين من خلال GalNAc ، وتمتد مع اثنين من سكريات الجالاكتوز ، تليها وحدات متكررة من حمض الجلوكورونيك (GlcA) و GlcNAc. النوع الثاني من كبريتات الكيراتان شائع بشكل خاص في الغضروف. [25]

يمكن ربط سكريات الجالاكتوز أو الجلوكوز بمجموعة هيدروكسيل من دهون السيراميد في شكل مختلف من ارتباط O-glycosylation ، لأنه لا يحدث على البروتينات. [6] هذا يشكل جليكوسفينجوليبيد ، وهو أمر مهم لتوطين المستقبلات في الأغشية. [8] يؤدي التحلل غير الصحيح لهذه الدهون إلى مجموعة من الأمراض المعروفة باسم شحميات السفينغوليبيد ، والتي تتميز غالبًا بالتنكس العصبي وإعاقات النمو.

نظرًا لأنه يمكن إضافة كل من سكر الجالاكتوز والجلوكوز إلى دهون السيراميد ، فلدينا مجموعتان من شحميات الجليكوسفينجوليبيد. الجالاكتوسفينجوليبيدات بشكل عام بسيطة للغاية في التركيب ولا يتم تعديل الجالاكتوز عادة. ومع ذلك ، غالبًا ما يتم تعديل Glucosphingolipids ويمكن أن تصبح أكثر تعقيدًا.

يحدث التخليق الحيوي لجالاكتو- وجلوكوسفينجوليبيدات بشكل مختلف. [6] يُضاف الجلوكوز إلى السيراميد من سلائفه في الشبكة الإندوبلازمية ، قبل حدوث تعديلات أخرى في جهاز جولجي. [8] من ناحية أخرى ، يضاف الجالاكتوز إلى السيراميد الموجود بالفعل في جهاز جولجي ، حيث يتم غالبًا كبريتات الجالاكتوسفينجوليبيد عن طريق إضافة مجموعات الكبريتات. [6]

يعد إضافة الجلوكوز إلى بقايا التيروزين في الجليكوجينين أحد الأمثلة الأولى والوحيدة للارتباط بالجليكوزيل على التيروزين ، وليس على بقايا السيرين أو الثريونين. [7] الجليكوجينين هو عبارة عن ناقلة جليكوزيل تبدأ في تحويل الجلوكوز إلى جليكوجين ، الموجود في خلايا العضلات والكبد. [26]

جميع أشكال O-glycosylation متوفرة بكثرة في جميع أنحاء الجسم وتلعب أدوارًا مهمة في العديد من الوظائف الخلوية.

حواتم لويس مهمة في تحديد فصائل الدم ، وتسمح بتوليد استجابة مناعية إذا اكتشفنا أعضاء غريبة. فهمهم مهم في زراعة الأعضاء. [1]

تحتوي مناطق المفصلات من الغلوبولين المناعي على مناطق عالية من O-glycosylated بين المجالات الفردية للحفاظ على بنيتها ، والسماح بالتفاعل مع المستضدات الأجنبية وحماية المنطقة من الانقسام التحلل للبروتين. [1] [8]

قد يتأثر مرض الزهايمر بالارتباط بالجليكوزيل. Tau ، البروتين الذي يتراكم لإحداث تنكس عصبي في مرض الزهايمر ، يحتوي على تعديلات O-GlcNAc التي قد تكون متورطة في تطور المرض. [1]

التغييرات في O- glycosylation شائعة جدًا في السرطان. تعتبر هياكل O-glycan ، وخاصة حواتم لويس الطرفية ، مهمة في السماح للخلايا السرطانية بغزو أنسجة جديدة أثناء ورم خبيث. [6] يمكن أن يؤدي فهم هذه التغييرات في الارتباط بالجليكوزيل في الخلايا السرطانية إلى طرق تشخيصية وفرص علاجية جديدة. [1]


المواد والأساليب

الموافقة على الدراسة والسكان

تمت الموافقة على جمع واستخدام اللعاب بالكامل للبحث في هذه الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية لجامعة الشمال الغربي (Xi & # x02019an ، الصين) والمستشفى الثاني التابع لجامعة Zhengzhou (Zhengzhou ، الصين). تم استلام الموافقة الخطية المستنيرة من المشاركين. و أجريت هذه الدراسة وفق المبادئ التوجيهية الأخلاقية لإعلان هلسنكي. بعد إجراء التنظير الداخلي القياسي وتقييم الأنسجة المرضية ، تم تسجيل الأفراد الذين تم تشخيص إصابتهم بـ ESCC الأولي (n & # x0003d16) في هذه الدراسة. تم تجنيد HVs المطابق للعمر والجنس (n & # x0003d 25) من مركز الفحص الصحي في نفس المستشفى حيث خضعوا لفحص طبي. لم يكن لدى جميع المشاركين فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعتين فيما يتعلق بالخصائص الديموغرافية والاجتماعية والاقتصادية ونمط الحياة ، وتم استبعاد أولئك الذين تلقوا العلاج الإشعاعي قبل الجراحة أو العلاج الكيميائي أو العلاج الكيميائي الإشعاعي أو العلاج بالمضادات الحيوية من هذه الدراسة. تم تلخيص الخصائص السريرية لمرضى HVs و ESCC في الجدول 1.

الجدول 1. المعلومات الديموغرافية والسريرية لمرضى ESCC وموضوعات HV في هذه الدراسة.

جمع وتحضير اللعاب الكامل

تم وصف بروتوكول الجمع في الأدبيات السابقة (Liu et al. ، 2018 Shu et al. ، 2018). تم طرد اللعاب الكامل المجمّع عند 10000 & # x000a0g عند 4 & # x000b0C لمدة 15 & # x000a0min لإزالة المكونات غير القابلة للذوبان. وأضيف مزيج مثبط البروتياز (سيجما-ألدريتش ، الولايات المتحدة) إلى المادة الطافية المجمعة وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة & # x02019s وتم تجميدها عند & # x0221280 & # x000b0C حتى الاستخدام.

المصفوفات الدقيقة من Lectin وتحليل البيانات

تم إنتاج المصفوفات الدقيقة للكتين باستخدام 37 محاضرة مع تفضيلات ربط مختلفة تغطي الجليكانات المرتبطة بـ N و O (Shu et al. ، 2017 Yu et al. ، 2020b). تم تحضين البروتينات السكرية المسمى Cy3 على مصفوفة ميكروأري ليكتين مع دوران لطيف في الظلام (37 & # x000b0C ، 3 & # x000a0h). تم غسل المصفوفات الدقيقة باستخدام PBST و PBS ، على التوالي ، بالطرد المركزي الجاف ، وتم مسحها ضوئيًا على الفور باستخدام ماسح ضوئي متحد البؤر Genepix 4000B (Axon Instruments ، الولايات المتحدة). تم تحليل الصور التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج Gene pix (الإصدار 6.0 ، Axon Instruments Inc. ، Sunnyvale ، CA). تم إجراء تحليل الكتلة الهرمية المتوسط ​​غير الخاضع للإشراف (HCA) وتحليل المكون الرئيسي (PCA) بواسطة Expander 6.0 (//acgt.cs.tau.ac.il/expander/) والحزمة الإحصائية متعددة المتغيرات (المملكة المتحدة) ، على التوالي. و ال ص تم اشتقاق القيمة من اختبار Mann & # x02013Whitney اللامعلمي باستخدام برنامج GraphPad Prism (الإصدار 7.0 ، برنامج GraphPad ، Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا).

تحليل النشاف اللاكتين

تم تحليل مستويات التعبير لهياكل الجليكان عن طريق نشاف اللقطة كما هو موصوف سابقًا (Zhang et al. ، 2019 Yu et al. ، 2020b). تم فصل البروتين اللعابي المجمع بنسبة 10 ٪ SDS-PAGE ونقله إلى غشاء PVDF (0.22 & # x000a0mm Millipore ، Bedford ، MA ، الولايات المتحدة). تم حظر غشاء PVDF بواسطة محلول الحجب الخالي من الكربوهيدرات (Vector Labs ، Burlingame ، CA) واحتضانه بـ Cy5 المسمى DSA و ECA و LCA و PSA و UEA-I ، على التوالي. تم فحص الغشاء بواسطة STORM FluorImager (Molecular Dynamics ، Sunnyvale ، CA ، الولايات المتحدة) وتم قياسه باستخدام برنامج ImageJ (NIH).

تحضير متقارن الجسيمات DSA- المغناطيسية

تم شطف الجسيمات المغناطيسية المغلفة بالإيبوكسي (2 & # x000a0mg) بالإيثانول ومخزن اقتران (5 & # x000a0mM NaB4ا7، 180 & # x000a0mM ح3بو4، 150 & # x000a0mM Na & # x0002b ، pH 7.4) ، على التوالي ، وتفاعل مع محلول DSA (يذوب DSA في المخزن المؤقت للاقتران) وفقًا للبروتوكول (Zhang et al. ، 2019 Yang et al. ، 2020b). بعد ذلك ، تم غسل الاتحادات بمخزن مؤقت للاقتران لإزالة الليكتينات غير المنضمة.

عزل انتقائي لكسور بروتين سكري من اللعاب بواسطة DSA- جزيئات مغناطيسية مترافقة

تم عزل البروتينات السكرية المحتوية على GlcNAc و Gal & # x003b21-4GlcNAc من مرضى ESCC و HVs باستخدام اقترانات الجسيمات المغناطيسية DSA كما هو موضح سابقًا (Zhang et al. ، 2019 Yang et al. ، 2020b). باختصار ، تم تخفيف البروتين اللعابي المجمع باستخدام المخزن المؤقت للربط (100 & # x000a0Mm Tris-HCl 150 & # x000a0mM NaCl 1 & # x000a0mM CaCl2، MgCl2، و MnCl2 الرقم الهيدروجيني 7.4) والمحتضنة مع اقتران DSA (درجة حرارة الغرفة ، 3 & # x000a0h). بعد الاهتزاز اللطيف 3 & # x000a0h ، تم غسل الاتحادات باستخدام محلول غسيل (0.1 ٪ توين -20 في محلول ربط ، درجة الحموضة 7.2) لإزالة البروتينات غير المرتبطة ، وتم التصفية من البروتينات السكرية المرتبطة بالاتحادات باستخدام محلول التصفية (8 & # x000a0M اليوريا ، 40 & # x000a0mM NH4HCO3).

عزل وتنقية الجليكانات المرتبطة بـ N

تم إجراء عزل وتنقية N- glycans بناءً على الطرق الموصوفة مسبقًا (Qin et al. ، 2017 Yang et al. ، 2020b). تم تركيز البروتينات السكرية وتحليتها بواسطة وحدات الترشيح الفائق Amicon Ultra-0.5 3 & # x000a0KDa (Millipore ، الولايات المتحدة) ثم تم تغيير خصائصها بإضافة 8 & # x000a0M اليوريا و 10 & # x000a0mM DTT و 10 & # x000a0mM IAM. تم استبدال البروتينات السكرية المشوهة إلى 40 & # x000a0mM NH4HCO3 المخزن المؤقت والمحتضن مع التربسين (37 & # x000b0C ، بين عشية وضحاها). تم تعطيل التربسين في الخليط عن طريق التسخين (80 & # x000b0C، 5 & # x000a0min) ثم تمت إضافة PNGase F (نيو إنجلاند بيولابس ، بيفرلي ، MA) لتحرير N-glycans (37 & # x000b0C ، بين عشية وضحاها). بعد ذلك ، تعرض الملخص إلى خراطيش HyperSep Hypercarb SPE (25 & # x000a0mg ، 1 & # x000a0mL Thermo Scientific) لإزالة الببتيدات. تم جمع N-glycans المنقى وتجفيفها بالتجميد.

توصيف N-Glycans بواسطة MALDI-TOF / TOF-MS

تميزت N-glycans بتأين امتصاص الليزر بمساعدة المصفوفة وقت الرحلة / وقت الطيران (MALDI-TOF / TOF-MS ، UltrafleXtreme ، Bruker Daltonics Bremen ، ألمانيا) كما هو موضح سابقًا (Qin et al. ، 2017 Zhang et al.، 2019 Yang et al.، 2020b). تم تعليق الجليكانات ورُصدت على هدف عينة MTP AnchorChip. بعد ذلك ، تم رصد 2 & # x000a0 & # x003bcL من 10 & # x000a0mg / mL 2،5-dihydroxybenzoic acid (DHB) مع 1 & # x000a0mM NaCl في محلول ميثانول بنسبة 50 ٪ (v / v) لإعادة بلورة N-glycans وتجفيفها بالفراغ للتحليل . تم استخدام معايير معايرة الببتيد (250 نقطة معايرة بروكر) كمعايرة جماعية. تم إجراء وضع الانعكاس الأيوني الموجب ، وتم تحليل نطاق كتلي قدره 1،000 & # x020134،000 & # x000a0Da. تم إنشاء أطياف MS التمثيلية لقمم الكتلة N-glycan مع نسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى من ثلاثة وتم شرحها باستخدام برنامج FlexAnalysis و GlycoWorkbench.


معلومات الكاتب

الانتماءات

قسم الأحياء الدقيقة ، جامعة كورنيل ، إيثاكا ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية

أرافيند ناتاراجان ، ماريليسا كابريرا سانشيز وأمبير ماثيو بي ديليزا

مدرسة روبرت ف. سميث للهندسة الكيميائية والجزيئية الحيوية ، جامعة كورنيل ، إيثاكا ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية

ثاباكورن جارينتوميتشاي ، جودي سي محمد ، أوليفيا يونغ ، مايكل فيلكوفوي ، ساندرا فادن ، جيفري دي فارنر وأمبير ماثيو بي ديليسا

العلوم الطبية الحيوية والبيولوجية ، كلية الطب البيطري بجامعة كورنيل ، إيثاكا ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية

إميلي سي كوكس وأمبير ماثيو بي ديليسا

مركز أبحاث الكربوهيدرات المعقدة ، جامعة جورجيا ، أثينا ، جورجيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

عاصف شجاهان وأب باراستو آزادي

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

أ. صمم وأجرى جميع الأبحاث ، حلل جميع البيانات وكتب الورقة. ت. تصميم وتنفيذ البحوث المتعلقة بالجليكوزيل الخالي من الخلايا والبيانات التي تم تحليلها. م. و O.Y. إجراء البحوث المتعلقة بإنشاء واختبار مسارات التخليق الحيوي للجليكان. ج. إجراء أبحاث تتعلق باختبار البروتينات المختلفة للارتباط بالجليكوزيل. إي سي سي تم إجراء بحث يتعلق بالكشف المستند إلى الأجسام المضادة عن أشكال جليكوفورم MUC1 المختلفة. AS ، M.V. ، S.V. ، J.D.V. و ب. أجرى تحليل مطياف الكتلة وساعد في تفسير البيانات. M.P.D. توجيه البحث وتحليل البيانات وكتابة المخطوطة.

المؤلف المراسل


GlycoProfile ™ IV مجموعة إزالة الجليكوزيل الكيميائية

تزيل مجموعة GlycoProfile IV المحسّنة لإزالة الجليكوزيل الكيميائي الجليكان من البروتينات السكرية باستخدام حمض ثلاثي فلورو الميثان سلفونيك (TFMS). يمكن بعد ذلك استعادة البروتين منزوع الجليكوزيلات باستخدام طريقة معالجة نهائية مناسبة مثل الترشيح الهلامي أو غسيل الكلى. على عكس طرق إزالة الغليكوزيل الكيميائية الأخرى ، فإن التحلل المائي باستخدام TFMS اللامائي فعال للغاية في إزالة الجليكانات المرتبطة بـ O- و N (باستثناء GlcNAc المرتبط بـ Asn الأعمق من الجليكانات المرتبطة بـ N) مع الحد الأدنى من تدهور البروتين. يمكن تقييم مدى ارتباط إزالة الجليكوزيل عن طريق التحول الحركي للبروتين المنحل مقابل البروتين السكري السليم على المواد الهلامية SDS-PAGE (الشكل 5).

الشكل 5. تحليل إزالة الجليكوزيل الكيميائي لـ RNase B على هلام SDS-PAGE متجانس بنسبة 12 ٪. المسار 1 هو عنصر التحكم RNase B (رقم المنتج R1153) ، بينما تمثل الممرات من 2 إلى 5 الكسور المجمعة من عمود الترشيح الهلامي. الممرات 2 و 3 عبارة عن كسور حجمية سابقة الفراغ والممرات 4 و 5 تظهر نطاقات عند 13.5 كيلو دالتون ، تقابل RNAse B.

  • يعالج كل تفاعل 1-2 مجم من البروتين السكري - ما يكفي من الإخراج لتحليل المصب
  • الحد الأدنى من تدهور جوهر البروتين - للحصول على بيانات MS أكثر موثوقية
  • إتمام إزالة الجليكوزيل في أقل من 30 دقيقة - لزيادة الإنتاجية

نعترف بالبروفيسور مالكولم ماكراي لتصحيح الأخطاء المطبعية ، والدكتور ديفيد كلارك لصيانة مقياس الطيف الكتلي Fusion Lumos ، وأنجيلينا سونغ للدعم الفني. نعترف بالخدمة المقدمة من Johns Hopkins Mass Spectrometry and Proteomics Core. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (R21AI122382) ، والمعهد الوطني للسرطان ، وشبكة أبحاث الكشف المبكر (EDRN ، U01CA152813) ، واتحاد تحليل الورم البروتيني السريري (CPTAC ، U24CA210985) ، المعهد الوطني للقلب والرئة والدم ، برامج التميز في علوم السكر (PEG ، P01HL107153) ، و amfAR ، مؤسسة أبحاث الإيدز حول جلب المهندسين الحيوية لعلاج فيروس نقص المناعة البشرية (منحة أمفار 109551-61-RGRL). تم الحصول على الكاشف التالي من خلال برنامج NIH AIDS Reagent ، قسم الإيدز ، NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة: ​​خلايا CEM CD4 + من دكتور جي بي جاكوبس.

تصور WY و HZ المفهوم وكتبوا المخطوطة التي أجرت WY تحليلاً تجريبيًا أجرت WY و MA و YH البرمجة وتحليل البيانات والمعلوماتية الحيوية WY و YH وضعت استراتيجية لتحديد glycopeptides QKL التي تم جمعها وإجراء الفحص المرضي للورم وأنسجة الكلى الطبيعية.


تعديلات ما بعد الترجمة التي تعدل نشاط الإنزيم

Fangxu Sun، Ronghu Wu، in Methods in Enzymology، 2019

الملخص

تعتبر البروتينات السكرية الموجودة على سطح الخلية ضرورية للأنشطة الخلوية المختلفة بما في ذلك اتصالات الخلية الخلوية وتفاعل مصفوفة الخلية. ترتبط تعديلات الارتباط بالجليكوزيل بالعديد من الأمراض مثل السرطان والأمراض المعدية. ومع ذلك ، من الصعب للغاية تحليل البروتينات السكرية بشكل منهجي وموقع خاص فقط الموجودة على سطح الخلية بسبب عدم تجانس الجليكان ، وانخفاض وفرة العديد من البروتينات السكرية السطحية ومتطلبات طرق فعالة لفصل البروتينات السكرية السطحية. في هذا الفصل ، نستعرض بإيجاز الطرق القائمة على قياس الطيف الكتلي (MS) للتحليل العالمي للبروتينات السكرية السطحية. ثم نناقش طريقة فعالة لدمج وضع العلامات الأيضية والنقر والتفاعلات الأنزيمية والبروتينات المستندة إلى MS لإجراء فحص شامل وموقع محدد للبروتينات السكرية على سطح الخلية. يتم أيضًا تضمين بروتوكول مفصل لهذه الطريقة. بالاقتران مع البروتينات الكمية ، طبقنا هذه الطريقة لتحديد البروتينات السكرية N على سطح الخلية ودراسة العلاقة بين غزو الخلية والبروتينات السكرية N على سطح الخلية. بالنظر إلى أهمية البروتينات السكرية السطحية ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع لتعزيز علم السكر ، مما يؤدي إلى فهم أفضل للآليات الجزيئية للأمراض البشرية ، واكتشاف البروتينات السكرية السطحية كمؤشرات حيوية للكشف عن المرض.


11.3.7. يمكن أن تكون السكريات القلة & # x0201cSequenced & # x0201d

بالنظر إلى التنوع الكبير في هياكل قليل السكاريد والعديد من نقاط الارتباط المحتملة لمعظم البروتينات ، كيف يمكن تحديد بنية البروتين السكري؟ تعتمد معظم الأساليب على استخدام الإنزيمات التي تشق السكريات قليلة السكاريد في أنواع محددة من الروابط. على سبيل المثال، نيمكن إطلاق السكريات قليلة السكاريد المرتبطة من البروتينات بواسطة إنزيم مثل الببتيد ن-جليكوزيداز F ، الذي يشق ن- روابط جليكوسيدية تربط السكريات قليلة البروتين بالبروتين. يمكن بعد ذلك عزل السكريات قليلة التعدد وتحليلها. من خلال استخدام MALDI-TOF أو تقنيات قياس الطيف الكتلي الأخرى (القسم 4.1.7) ، يمكن تحديد كتلة جزء قليل السكاريد. ومع ذلك ، نظرًا للعدد الكبير من مجموعات السكريات الأحادية المحتملة ، فإن العديد من هياكل السكاريد قليلة السكاريد الممكنة تتوافق مع كتلة معينة. يمكن الحصول على معلومات أكثر اكتمالا عن طريق شطر قليل السكاريد بإنزيمات ذات خصائص مختلفة. على سبيل المثال ، ينشق & # x003b2-1،4-galactosidase & # x003b2-glycosidic bonds حصريًا في بقايا الجالاكتوز. يمكن تحليل المنتجات مرة أخرى عن طريق قياس الطيف الكتلي (الشكل 11.27). سيؤدي تكرار هذه العملية باستخدام مجموعة من الإنزيمات ذات الخصوصية المختلفة في النهاية إلى الكشف عن بنية قليل السكاريد.

الشكل 11.27

مقياس الطيف الكتلي & # x0201cSequencing & # x0201d للسكريات القليلة. تم استخدام إنزيمات شطر الكربوهيدرات للإفراج عن مكون السكاريد قليل السكاريد الخاص بفيتوين البروتين السكري من مصل الأبقار. يُظهر الجزءان A و B الكتل التي تم الحصول عليها (المزيد).

يمكن تحديد نقاط ارتباط قليل السكاريد من خلال استخدام البروتياز. ينتج عن انقسام البروتين عن طريق تطبيق بروتياز معين نمط مميز لشظايا الببتيد التي يمكن تحليلها كروماتوغرافيا (القسم 4.2.1). ستتغير الخصائص الكروماتوغرافية للببتيدات المرتبطة بالسكريات قليلة الكثافة عند العلاج بالجليكوزيداز. يمكن أن يكشف التحليل الطيفي الكتلي أو التسلسل المباشر للببتيد عن هوية الببتيد المعني ، وبجهد إضافي ، الموقع الدقيق لارتباط قليل السكاريد.

التعديلات اللاحقة للترجمة مثل الارتباط بالجليكوزيل تزيد بشكل كبير من تعقيد البروتين. يمكن أن يحتوي بروتين معين يحتوي على عدة مواقع محتملة للجليكوزيد على العديد من الأشكال المختلفة للجليكوزيلات (تسمى أحيانًا الأشكال السكرية) ، يمكن إنشاء كل منها فقط في نوع خلية معين أو مرحلة تطورية. الآن بعد أن اكتمل تسلسل الجينوم البشري بشكل أساسي ، يمكن أن يبدأ توصيف البروتين الأكثر تعقيدًا ، بما في ذلك الأدوار البيولوجية للبروتينات المعدلة على وجه التحديد ، بشكل جدي.

بالاتفاق مع الناشر ، يمكن الوصول إلى هذا الكتاب من خلال ميزة البحث ، ولكن لا يمكن تصفحه.


شاهد الفيديو: بنية البروتين. الأحياء. الجزيئات الضخمة (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Shihab

    يبدو لي أنك كنت مخطئا

  2. Evrain

    أعتذر ، أنه لا يمكنني المساعدة في شيء. امل لكم مساعدتنا. لا تيأس.

  3. Vilar

    لست متحمسًا للمشاهدة ...

  4. Quintin

    في ذلك شيء ما. الآن كل شيء واضح ، أشكر المعلومات.

  5. Jugis

    أوصي بالبحث عن Google.com



اكتب رسالة