معلومة

كيف يتم قياس تنشيط قناة Na / K على مستوى الغشاء؟

كيف يتم قياس تنشيط قناة Na / K على مستوى الغشاء؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

افترض أن هناك إشارتان مختلفتان تحدثان على مخطط كهربية القلب - أثناء إزالة الاستقطاب وعودة الاستقطاب في مخطط كهربية القلب القياسي. نصحني بعدم استخدام مخطط كهربية القلب القياسي في قياس الأحداث الكهربائية الدقيقة خلال:

  • المراحل 0-2
  • 3-4

يمكننا الحصول على بيانات حول النشاط الكهربائي للخلايا العصبية في الجسم الحي في الشكل 1 حيث توجد بعض البيانات حول النشاط الكهربائي للخلايا العصبية. لذا فإن تفكيري هو أن تقنية مماثلة يمكن أن تعمل على الأرجح مع خلايا عضلة القلب.

الشكل 1 مثال لقياس النشاط الكهربائي للخلايا العصبية في الجسم الحي

أقدر أن هناك حوالي 18 ٪ من عدم اليقين عند استخدام ECG القياسي بسبب الذروة في المرحلة 1 (ظاهرة جيبس) وهاتين المرحلتين المختلفتين الكاملتين.


الحدود في الخلويةوعلم الأحياء الدقيقة العدوى

انتماءات المحرر والمراجعين هي الأحدث التي يتم توفيرها في ملفات تعريف بحث Loop وقد لا تعكس موقفهم في وقت المراجعة.



مشاركه فى

المواد والأساليب

ثقافة الحيوان والخلية

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان بكلية ميازاكي الطبية (كيوتاكي ، ميازاكي ، اليابان). تم اعتماد إجراءات زراعة الخلايا من سيد وآخرون. 11 على وجه التحديد ، استخدمنا الخلايا العصبية RPeD1 التي يمكن تحديدها بشكل فردي من المختبر المرفوعة L. stagnalis (حلزون الماء العذب) في درجة حرارة الغرفة. في هذه الدراسة ، تم اختيار حلزون بعمر 2 إلى 3 أشهر (طول القوقعة ، 20-30 ملم). تم نزع القشرة من القواقع ونقلها إلى طبق تشريح معقم في محلول ملحي عادي مضاد حيوي (150 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين [G3632 Sigma Chemical Co.، St. ليمنيا محلول ملحي: 51.3 ملم كلوريد الصوديوم ، 1.7 ملم بوكل ، 4.1 ملم كلوريد الكالسيوم 2 ، 1.5 ملم MgCl 2 ، 5.0 ملم HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.9). تم عزل الحلقات العقدية المركزية باستخدام إجراءات التشريح القياسية ثم تم تثبيتها لاحقًا بقاعدة مطاط السيليكون في لوحة زراعة الأنسجة. تمت إزالة النسيج الضام الخارجي للعقد قبل العلاج الأنزيمي. عولجت العقد في وسط محدد (وسط خال من المصل بنسبة 50٪ من Leibovitz L-15 [GIBCO-BRL Life Technologies ، برلنغتون ، أونتاريو ، كندا] مع أملاح غير عضوية مضافة ، 20 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، درجة الحموضة 7.9) لمدة 25 دقيقة مع 0.2٪ التربسين (النوع الثالث شركة سيجما الكيميائية). بعد ذلك ، تم علاج العقد أيضًا باستخدام مثبط التربسين بفول الصويا بنسبة 0.2 ٪ (شركة سيجما الكيميائية) لمدة 15 دقيقة في الوسط المحدد. قبل إزالة الخلايا العصبية التي تم تحديدها ، تم تشريح غمد النسيج الضام الداخلي باستخدام ملقط دقيق من العقد. تمت إزالة الخلايا العصبية عن طريق الشفط اللطيف باستخدام ماصة سليكونية دقيقة مصقولة بقطر خارجي يبلغ 1.5 مم (IB-150 F WPI ، Sarasota ، FL) ، ثم تم الحفاظ على هذه الخلايا العصبية في وسط عالي الأسمولية يحتوي على 30 ملم جلوكوز . بعد ذلك ، تم نقل الخلايا العصبية إلى أطباق استزراع مغلفة بالبولي إل ليسين (فالكون بلاستيك ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا) مع 3 مل من الوسط المحدد.

التسجيل داخل الخلايا والتصوير [+] i

تمت مراقبة النشاط العصبي التالي باستخدام التسجيل التقليدي داخل الخلايا. تم تعبئة قطب كهربائي دقيق زجاجي ، قطره الخارجي 1.0 مم (GC100-10 CEI ، لندن ، إنجلترا) بمحلول مشبع من K 2 SO 4 ، مما أدى إلى مقاومة طرف من 20-60 MΩ. لوحظ وجود خلية عصبية تحت مجهر مقلوب (TE-300 نيكون ، طوكيو ، اليابان) وتم تخزيقها بواسطة قطب كهربائي دقيق باستخدام مناور (MM 202 M 204 ، ناريشيج ، اليابان). تم تضخيم الإشارات الكهربائية (IR-283 Cygnus Technologies ، Delaware Water Gap ، PA) ، وعرضها على راسم الذبذبات (VC-11 Nihon Kohden ، طوكيو ، اليابان) ، وتخزينها على الكمبيوتر (G4 Apple Computer Inc. ، Cupertino ، CA) من خلال محول A / D (Powerlab ADInstruments ، كولورادو سبرينغز ، CO) ومسجل الزقاق الحراري (RTA1200 Nihon Kohden).

لقياس [Na +] i ، تم استخدام مؤشر الفلورسنت الإشعاعي ، وهو شكل أسيتوكسيميثيل إستر من إيزوفثالات البنزوفوران المرتبط بالصوديوم (SBFI-AM) (مجسات جزيئية ، يوجين ، أو). تم خلط SBFI-AM ، 1 مم ، في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) مع الوسط المحدد الذي يحتوي على الخلايا العصبية بحجم 0.1 ٪. بعد الحضانة عند 20 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، تمت إزالة هذا الوسط المحدد ، وتم تعليق الخلايا العصبية في محلول ملحي طبيعي لمدة ساعة واحدة لإخراج التحلل المائي لاسترات AM و diacetates. تم إجراء القياسات عن طريق إثارة صبغة المؤشر هذه عند 340 نانومتر ، حيث يكون التألق حساسًا بشكل خاص لتركيز أيون الصوديوم ، و 390 نانومتر ، حيث يكون قريبًا جدًا من النقطة المتساوية. أطوال موجات الإثارة المتناوبة بسرعة (340/390 نانومتر) وتسجيلها بشكل مستمر عند 510 نانومتر بواسطة مجهر فلورسنت مقلوب (TE-300) ، كاميرا فيديو بجهاز عالي السرعة ومبردة بالشحن (C-6970 Hamamatsu Photonics ، هاماماتسو ، اليابان) ، ونظام التصوير الفلوري (Argus-Hisca Hamamatsu Photonics). كان وقت التعرض لصورة واحدة 159 مللي ثانية ، مما أدى إلى إجمالي وقت 600 مللي ثانية المطلوب لصورة زوج 340/390 نانومتر. تم طرح صور الخلفية الفلورية قبل التحليل.

في فيفو معايرة لـ [Na +] i

تم تحويل نسبتي مضان باستخدام SBFI إلى استخدام منحنى المعايرة لـ RPeD1 في الجسم الحي .23-25 ​​تم إنشاء منحنى المعايرة لـ [Na +] i عن طريق رسم نسبة التألق عكس Na + تركيز محاليل المعايرة (الشكل 1). لموازنة [Na +] i مع إضافي ([Na +] o) ، قبل التجربة بـ 30 دقيقة ، تمت إضافة 10 ميكرومتر من حامض الأيون Na + gramicidin D (ICN Biomedicals، Inc.، Costa Mesa، CA) ، ثم تم تعريض الخلايا العصبية RPeD1 لمحلول ملحي بتركيز خالٍ من الصوديوم مع محلول الجراميسيدين D لمدة 30 دقيقة. تم التقاط أزواج الصور الفلورية ، ثم تعرضت الخلايا العصبية RPeD1 لمحلول ملحي بزيادة تركيز الصوديوم (1 ، 25 ، 50 ، 100 ، 150 ملم) لمدة 10 دقائق لكل منهما. تم التقاط أزواج الصور مرة أخرى في نهاية كل تعرض.

التين. 1 في الجسم الحيمنحنى المعايرة لنسبة شدة البنزوفوران الرابطة للصوديوم 340/390 نانومتر عكستركيزات الصوديوم داخل الخلايا ([+] i) في الدواسة اليمنى 1 العصبون. تمثل كل قيمة يعني ± SEM n = 10.

التين. 1 في الجسم الحيمنحنى المعايرة لنسبة شدة البنزوفوران الرابطة للصوديوم 340/390 نانومتر عكستركيزات الصوديوم داخل الخلايا ([+] i) في الدواسة اليمنى 1 العصبون. تمثل كل قيمة يعني ± SEM n = 10.

الإجراء التجريبي للتسجيل داخل الخلايا والتصوير [+] i

تم تقسيم الخلايا العصبية إلى خمس تجارب: محلول ملحي عادي ، عالي الصوديوم + محلول ملحي ، ملح خالٍ من الصوديوم الصوديوم ، فرط الاستقطاب الغشائي ، و tetrodotoxin (سانكيو ، طوكيو ، اليابان 30 ميكرومتر). بالنسبة لتجارب فرط الاستقطاب الغشائي ، تم تعليق إمكانات الغشاء عند -80 بالسيارات بالحقن الحالي قبل دقيقتين من نضح الليدوكائين. في التجارب عالية الصوديوم + محلول ملحي ، تم استخدام الصوديوم المرتفع (103 مم كلوريد الصوديوم ، 1.7 مم بوكل ، 4.1 مم كلوريد الكالسيوم 2 ، 1.5 مم MgCl 2 ، 5.0 مم HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.9) كسائل خارج الخلية. في التجارب الملحية الخالية من الصوديوم + الصوديوم ، محلول ملحي خالٍ من الصوديوم (0 مم كلوريد الصوديوم ، 50 مم ن تم استخدام -methyl-d-glucamine ، 1.7 مم KCl ، 4.1 مم CaCl 2 ، 1.5 مم MgCl 2 ، 5.0 مم HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.9). في تجارب المعالجة بالمحلول الملحي الطبيعي ، وفرط الاستقطاب الغشائي ، و tetrodotoxin ، تم استخدام محلول ملحي عادي.

في التجارب المالحة العادية ، تم ترطيب الليدوكائين (0.01 ، 0.1 ، 1 مم) في طبق الثقافة بعد قياسات القيم الأساسية. في تجارب المعالجة المسبقة للسموم رباعي الصوديوم ، ومحلول ملحي خالٍ من الصوديوم الصوديوم ، وفرط الاستقطاب الغشائي ، و 1 مم ليدوكائين. في تجارب المعالجة المسبقة للسموم الرباعية ، تم تروية الذيفان الرباعي (30 ميكرومتر) لمدة 4-6 دقائق قبل نضح الليدوكائين.

في التجارب الملحية العادية ، تم قياس جهد الغشاء و [Na +] لمدة 5 دقائق بعد كل جرعة من الليدوكائين. في التجارب التي تحتوي على نسبة عالية من الصوديوم والملوحة وتجارب الملح الخالية من الصوديوم + ، تم تغيير المحاليل الملحية العادية إلى محلول ملحي خالٍ من الصوديوم أو الصوديوم في دقيقتين ، وتم قياس إمكانات الغشاء و [+] أنا لمدة 7 دقيقة بعد تناول يدوكائين. في تجارب الاستقطاب الملحي والغشائي العادي ، تم جمع القيم الأساسية خلال 4 دقائق قبل نضح الليدوكائين (عند 0 دقيقة في الأرقام). في تجارب المعالجة المسبقة ذات الصوديوم العالي + الصوديوم ، الصوديوم الخالي من الملح ، والسموم الرباعية ، تم قياس القيم الأساسية قبل دقيقتين من نضح الليدوكائين (عند 0 دقيقة في الأرقام). في كل تجربة ، تم قياس إمكانات الغشاء بالنسبة إلى إمكانات غشاء الراحة البالغة 60 مللي فولت في RPeD1.

تسجيلات المشبك تصحيح الخلية الكاملة

تم إجراء تسجيلات مشبك جهد الخلية الكاملة في الخلايا العصبية RPeD1 باستخدام مضخم EPC9 (HEKA elektronik ، Lambrecht ، ألمانيا). تم سحب أقطاب التصحيح (قطر الطرف مضبوط إلى 1.0 ميكرومتر ، ومقاومة 1-3 متر مكعب) من أنابيب زجاجية (قطر خارجي يبلغ 1.5 مم) بدون خيوط (PG-150T-7.5 Warner Instrument ، Hamden ، CT) على مجتذب ماصة عمودي (كوبف 750 ، توجونجا ، كاليفورنيا). للتحكم في التجربة والحصول على البيانات ، تم إدخال لوحة واجهة محول A / D و D / A (PCI-16 HEKA elektronik) في جهاز كمبيوتر شخصي (G4). تم إجراء الحصول على البيانات وتحليلها باستخدام برنامج Pulse (الإصدار 8.66 HEKA elektronik). تم ترشيح التيار عند 1 كيلو هرتز باستخدام مرشح بيسيل رباعي الأقطاب وتم رقمنته بتردد أخذ العينات يبلغ 20 كيلو هرتز. لدراسة INa ، تمت تعبئة الماصات بمحلول ماصة من السيزيوم مُفلتر (0.22 ميكرومتر) يتكون من 50 مم CsCl ، 5 مم EGTA ، 5 مم MgCl 2 ، 10 مم HEPES ، 2 مم ATP-Mg ، و 0.1 مم GTP-Tris ، وتم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 (مع CsOH). يتكون محلول الحمام من 40 ملم كلوريد الصوديوم ، 10 ملم TEACl ، 4.0 ملم MgCl 2 ، 1.0 ملم CaCl 2 ، 1.0 ملم 4-أمينوبيريدين ، 1.0 ملم CdCl 2 ، و 10 ملم HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.9). درجة حرارة الغرفة (20 - 22 درجة مئوية). بعد الحصول على ختم gigaohm ، تم تعويض المقاومة التسلسلية بحوالي 70-80٪ باستخدام تعويض المقاومة التسلسلي لبرنامج النبض ، وتم تعويض مقاومة السلسلة النهائية تحت 1 MΩ. تم طرح التيارات المتسربة عن طريق تعويض التسرب داخل برنامج النبض لكل تجربة.

الإجراء التجريبي لتسجيلات المشبك التصحيح للخلية الكاملة

في تسجيلات المشبك ذات الجهد الكامل للخلية ، تم تقسيم الخلايا العصبية إلى ثلاث مجموعات: مجموعات التحكم ، 0.1 ، و 1 ملم ليدوكائين نضح. تم قياس التيارات بعد 6 دقائق من كل جرعة من الليدوكائين. تم رسم منحنى التيار والجهد ومنحنى تنشيط الحالة المستقرة ومنحنى تعطيل الحالة المستقرة.

منحنى الجهد الحالي

بالنسبة لمنحنى الجهد والتيار ، تم قياس INa استجابةً لخطوات 10 ملي فولت ، و 20 مللي ثانية من جهد إمساك قدره −120 مللي فولت (1 ثانية) وخطوات تدريجية 10 مللي فولت إلى إمكانات بين 80 و +40 مللي فولت. ، تم تطبيع 27 التيارات إلى الحد الأقصى في التحكم ورسمت كدالة لإمكانات الغشاء.

منحنى التنشيط الثابت

بالنسبة لمنحنى تنشيط الحالة المستقرة ، تم قياس ذروة INa استجابةً لخطوات إزالة الاستقطاب المتزايدة التي تبلغ 20 مللي ثانية و 10 مللي فولت من -120 إلى +40 مللي فولت من قدرة إمساك تبلغ −120 مللي فولت لمدة 1 ثانية. من ذروة INa ، تم حساب قيم التوصيل (G) وفقًا للمعادلة G = INa / (V - ENa) ، حيث كان INa هو ذروة تيار Na + المقاس عند كل جهد غشاء (V) ، و ENa هو جهد الانعكاس المقدرة من خلال منحنى التيار والجهد. 28 تم تطبيع قيم G المحسوبة إلى أقصى عنصر تحكم أو إلى أقصى حد لكل مجموعة وتم رسمها كدالة لإمكانات الغشاء. تم تركيب المخططات على علاقات Boltzmann بالشكل y = G min + (G max - G min) / <1 + exp [(V− V 50) / K]> ، حيث يتم تطبيع y GNa ، G min هي G لـ خط الأساس ، G max هو G من الحد الأقصى ، V هو كل غشاء محتمل ، V 50 هو جهد الغشاء الذي يكون عنده التوصيل في منتصف المسافة بين G min و G max ، و K هو عامل الانحدار.

منحنى تعطيل الحالة المستقرة

بالنسبة لمنحنى تعطيل الحالة المستقرة ، تم دفع إمكانات الغشاء مسبقًا من -120 إلى 40 مللي فولت بزيادات 10 مللي فولت لمدة 5 ثوانٍ. تم قياس INa بنبضة اختبار 20 مللي ثانية إلى -10 مللي فولت. تم تطبيع التيارات إلى الحد الأقصى في التحكم وتم رسمها كدالة لإمكانية النبض. تم تركيب المؤامرات على علاقات Boltzmann بالشكل y = I min + (I max - I min) / <1 + exp [(V - V 50) / K]> ، حيث يتم تطبيع y INa من الحد الأقصى في التحكم أو في كل مجموعة ، I min هي INa لخط الأساس ، I max هي INa من الحد الأقصى ، V هي كل جهد نبضي ، V 50 هو جهد الغشاء الذي يكون عنده التوصيل في منتصف المسافة بين I min و I max ، و K هو عامل منحدر. 10،28،29 في منحنيات التنشيط وتعطيل الحالة الثابتة ، تم إجراء التحليلات باستخدام الرسم البياني Kaleida (الإصدار 3.52 Synergy Software ، Reading ، PA).

تحليل احصائي

يتم التعبير عن النتائج على أنها تعني ± SEM. تم تحليل نتائج القياسات المتكررة في كل جرعة في كل مجموعة من التجارب عن طريق تحليل التباين أحادي الاتجاه للقياس المتكرر ، متبوعًا باختبار شيفيه. من بين الجرعات الثلاث من الليدوكائين في التجارب الملحية العادية وبين المحاليل الملحية العالية الصوديوم ، الصوديوم الخالي من الملح ، مفرط الاستقطاب ، و tetrodotoxin ، تم تحليل المجموعات الثلاث في منحنى الجهد الحالي للتسجيلات المشبكية للخلية الكاملة من خلال تحليل التباين ، متبوعًا باختبار شيفيه. تم استخدام عرض الإحصائيات (الإصدار 4.5 العداد ، بيركلي ، كاليفورنيا) لهذه التحليلات. ص & lt 0.05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية.


نتائج

تأثير زيادة Δψ على تصدير البروتين فلاجلار بواسطة مجمع بوابة التصدير عبر الغشاء.

مطلوب مكونات ∆pH و ∆pNa من أجل العبور الفعال لـ H + و Na + عبر قناة أيون FlhA ، على التوالي ، عندما يكون FliH و FliI مفقودًا (13 ، 17). في السالمونيلا، يتم الحفاظ على الأس الهيدروجيني داخل الخلايا عند حوالي 7.5 على مدى واسع من الأس الهيدروجيني الخارجي (21). نظرًا لأن الأس الهيدروجيني الخارجي أعلى من 7.5 ينتج عنه قيمة سالبة لـ ΔpH ، فإن الخلايا البكتيرية تزيد بشكل مستقل Δψ للحفاظ على إجمالي ثابت PMF قدر الإمكان (22 ، 23). باستمرار ، أدى التحول التصاعدي للأس الهيدروجيني الخارجي من 7.0 إلى 8.5 إلى زيادة Δψ بشكل ملحوظ ولكنه انخفض إجمالي PMF (الشكل 1)أ و الملحق SI، الجدول S1). لقد ثبت أن FliH و FliI يجعلان بوابة تصدير الغشاء قوية ضد مجموعة متنوعة من الاضطرابات. وبالتالي ، يحافظ مجمع بوابة التصدير على نشاط نقل البروتين على نطاق واسع من الأس الهيدروجيني الخارجي من 6.0 إلى 8.0 (13 ، 17).

تأثير Δψ على تصدير البروتين السوطى. (أ) مستوى الإفراز النسبي لل FlgD على مدى خارجي الأس الهيدروجيني 7.0-8.5. ال السالمونيلا SJW1103 (النوع البري ، يشار إليه باسم WT) و MMHI0117 [∆fliH-fliI flhB (P28T)، المشار إليها باسم ∆HI B *] نمت الخلايا عند 30 درجة مئوية في مرق T عند قيم الأس الهيدروجيني الخارجية 7.0 أو 7.5 أو 8.0 أو 8.5. تم تحضير أجزاء الخلية الكاملة والمزرعة الطافية ، متبوعة بـ SDS-PAGE والتكتل المناعي باستخدام الجسم المضاد متعدد النسيلة المضاد لـ FlgD. تم قياس مستويات إفراز FlgD النسبية. هذه البيانات هي المتوسط ​​من ست تجارب مستقلة. تم قياس فرق جهد الغشاء (بالميليفولت) باستخدام رباعي ميثيل رودامين ميثيل استر. تشير القضبان العمودية إلى SDs. تم قياس الأس الهيدروجيني داخل الخلايا باستخدام فلورين (M153R) ، ثم تم حساب إجمالي PMF (الملحق SI، الجدول S1). (ب) تأثير انخفاض Δψ على تصدير البروتين السوطي بواسطة متحولة ∆HI B *. نمت خلايا ∆HI B * عند 30 درجة مئوية في مرق T (درجة الحموضة 8.5). بعد الغسيل مرتين باستخدام مرق T (درجة الحموضة 7.5) ، تم تعليق الخلايا في مرق T عند درجة حموضة 7.5 أو 8.5 وحضنت عند 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تم تحليل الخلية الكاملة (الخلية) والكسور الطافية للثقافة (Sup) عن طريق التكتل المناعي باستخدام الجسم المضاد متعدد النسيلة المضاد لـ FlgD. تم قياس مستويات إفراز FlgD النسبية. هذه البيانات هي المتوسط ​​من ست تجارب مستقلة.

لتوضيح دور Δψ في تصدير البروتين السوطي ، استخدمنا السالمونيلا Δ مرحبا ب* سلالة ، حيث تزيد طفرة B * بشكل كبير من احتمال دخول الركيزة إلى قناة البولي ببتيد في غياب FliH و FliI (20). لقد اخترنا بروتين FlgD ذو السد الخطافي باعتباره ركيزة تصدير تمثيلية لأن مستوى إفراز FlgD بواسطة هذه السلالة الطافرة أعلى من مستوى النوع البري (20). مجمع بوابة التصدير عبر الغشاء لـ ΔHI B.* تفضل السلالة Na + على H + كأيون اقتران في نطاق الأس الهيدروجيني الخارجي 6.0-8.0 (17 ، 18). لذلك ، فإن ΔHI B* نمت الخلايا في T-broth عند قيم الأس الهيدروجيني الخارجية 7.0 أو 7.5 أو 8.0 أو 8.5 في غياب Na + الخارجية لفحص اعتماد Δψ لتصدير البروتين. كمية FlgD التي يفرزها ΔHI B.* تم تحليل متحولة عن طريق التخثر المناعي الكمي باستخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة لـ FlgD (الملحق SI، الشكل S2). يتم تلخيص نتائج جميع السلالات نوعياً في الجدول 1.

في ΔfliH-fliI flhB (P28T) Δflh سلالة (ΔHI B* الجدول 1) ، التحكم السلبي ، لم يتم الكشف عن FlgD في طاف الثقافة (الملحق SI، التين. S2ب). المستويات النسبية لـ FlgD التي يفرزها ΔHI B.* زادت الخلايا بزيادة قدرها أعلى من قيمة العتبة (الشكل 1 أ, حق، و الملحق SI، التين. S2ج). تم تحقيق النشاط الكامل لمجمع بوابة التصدير عندما وصلت إلى 1.5 ضعف فوق قيمة العتبة.

المكون Δψ ضروري لتصدير البروتين السوطي السالمونيلا خلايا من النوع البري (13 ، 19). لذلك ، قمنا باختبار ما إذا كان وجود Δψ أعلى من القيمة الحدية يزيد أيضًا من مستوى إفراز FlgD بواسطة الخلايا البرية. كانت مستويات إفراز FlgD بواسطة الخلايا البرية ثابتة تقريبًا على مدى درجة حموضة خارجية من 7.0-8.5 (الشكل 1). أ, اليسار، و الملحق SI، التين. S2أ) ، مما يشير إلى أن الزيادة في Δψ لا تسهل تصدير البروتين السوطي بواسطة ناقلة البروتين من النوع البري. وبالتالي ، فإن معدل نقل البروتين المزدوج H + بواسطة مجمع بوابة التصدير مرتفع بما يكفي لإخفاء تأثير زيادة Δψ عند وجود FliH و FliI.

وجدنا أن كمية FlgD التي تفرزها خلايا ΔHI B * تزداد بزيادة (الشكل 1). أ, حق). لذلك ، قمنا بالتحقق مما إذا كان الانخفاض في عن طريق تحول في درجة الحموضة إلى أسفل من 8.5 إلى 7.0 يقلل بشكل عكسي من نشاط نقل البروتين السوطي المعتمد على Δψ لخلايا ΔHI B *. نمت الخلايا لأول مرة عند درجة الحموضة 8.5 ، ثم تم تغيير قيمة الأس الهيدروجيني الخارجية من 8.5 إلى 7.5. أدى هذا التحول إلى الأسفل في درجة الحموضة إلى خفض مستوى إفراز FlgD بنحو 3.3 أضعاف (الشكل 1 ب, حق) ، وهو ما يتوافق مع البيانات الموضحة في الشكل 1 أ, الحق السفلي. هذا يؤكد أن مجمع بوابة التصدير يصبح محرك تصدير يعتمد على عندما يزيد فوق العتبة.

تأثير زيادة Δψ على معدل نمو الشعيرة.

يتم نقل كتل البناء فلاجيلار عبر الغشاء السيتوبلازمي عبر مجمع بوابة التصدير الذي يحركه PMF ، وينتشر أسفل القناة المركزية للبنية السوطية المتنامية ، ويتجمع في نهايته البعيدة (24). لذلك ، يتم تحديد معدل نمو السوط من خلال معدل نقل البروتين الذي يحركه PMF بواسطة مجمع بوابة التصدير وكذلك من خلال معدل انتشار كتل البناء السوطية. يقلل انخفاض PMF من معدل نمو الفتيل بشكل ملحوظ (24). لرصد Δψ اعتماد نشاط التصدير في ΔHI B * متحولة ، نمت خلايا ΔHI B * في مرق T عند درجة حموضة خارجية تبلغ 7.5 أو 8.5 ، وتم تصنيف خيوطها السوطية بصبغة فلورية ، Alexa Fluor 594 ، لقياس عدد وأطوال الشعيرات (الشكل 2 و الملحق SI، الجدول S2). معظم خلايا ΔHI B * لا تحتوي على خيوط ، فقط 1.0 ٪ لديها خيوط واحدة عند درجة الحموضة الخارجية 7.5 (ن = 198). في المقابل ، عند درجة حموضة خارجية 8.5 ، أنتجت 60.5 ٪ من خلايا HI B * شعيرات ، بمتوسط ​​1.3 ± 0.5 لكل خلية (يعني ± SD ن = 107) (الشكل 2ب). كان متوسط ​​طول الشعيرة 4.8 ± 1.5 ميكرومتر (ن = 50). تشير هذه النتائج إلى أن خلايا ΔHI B * تنقل كتل بناء سوطية بطريقة تعتمد على Δψ بمجرد تنشيط مجمعات بوابة التصدير الخاصة بها عن طريق زيادة Δψ أعلى من قيمة العتبة.

تأثير زيادة Δψ على تكوين السوط. (أ) صور الفلورسنت لخلايا ∆HI B * المزروعة في السل عند درجة الحموضة 7.5 أو السل عند درجة الحموضة 8.5 مع أو بدون 100 ملي كلوريد الصوديوم. تم تمييز الخيوط الفوطية باستخدام Alexa Fluor 594. تم دمج الصور الفلورية للخيوط المسمى Alexa Fluor 594 (أرجواني) مع صور المجال الساطع لأجسام الخلايا. (ب) قطع مربعة للخيوط السوطية في خلايا HI B *. حدود المربع السفلي والعلوي هي 25 و 75 ، على التوالي. يُظهر الخط الموجود في منتصف المربع الرقم الوسيط. يشير خط الخطأ السفلي والعلوي إلى القيم الأصغر والأكبر ، على التوالي. تم عد أكثر من 150 خلية. (ج) قطع مبعثرة بطول الشعيرات السوطية. يبلغ متوسط ​​طول الشعيرة 50 شعيرة ، وتمثل الخطوط قيمًا متوسطة مع SDs. اثنتان فقط من خلايا ∆HI B * بها خيوط عند درجة الحموضة 7.5 في غياب كلوريد الصوديوم. تم إجراء مقارنات بين مجموعات البيانات باستخدام الطالب ثنائي الذيل ر اختبار. قيمة ص & lt 0.05 ذات دلالة إحصائية. **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 (الملحق SI، الجدول S2).

تأثير النسخ المتعدد لـ FliJ على تصدير البروتين السوطي المعتمد بواسطة خلايا HI B *.

تفاعل بين FliJ و FlhAج، التي تعتمد عادة على FliH و FliI ، تحول مجمع بوابة تصدير الغشاء إلى محرك تصدير عالي الكفاءة يحركه Δψ (13). لذلك ، قمنا بالتحقق مما إذا كان الإفراط في التعبير عن FliJ يؤثر على اعتماد تصدير البروتين السوطي بواسطة متحولة ΔHI B *. أدى الإفراط في التعبير عن FliJ إلى زيادة كبيرة في مستوى إفراز FlgD عند درجة حموضة خارجية من 7.0 إلى حوالي 60 ٪ من المستوى الأقصى. أدت الزيادة في الأس الهيدروجيني الخارجي من 7.0 إلى 8.5 إلى زيادة مستوى إفراز FlgD بحوالي 1.7 ضعفًا مقارنة بالمستوى عند الرقم الهيدروجيني 7.0 (الشكل 3).أ و الملحق SI، الشكل S3). حذف fliJ من متحولة ΔHI B * قلل نشاط نقل البروتين المعتمد على بمقدار أربعة أضعاف (الشكل 3).ب) ، ولكن الزيادة في الأس الهيدروجيني الخارجي من 7.0 إلى 8.5 لا تزال تسبب زيادة في مستوى إفراز FlgD (الشكل 3)ج و الملحق SI، التين. S2د). تقدم هذه النتائج مزيدًا من الدعم لفكرة أن بوابة التصدير عبر الغشاء عبارة عن ناقل بروتين ذي جهد كهربائي وتوضح أن FliJ مطلوب لآلية التنشيط المعتمدة على الجهد الغشائي لمجمع بوابة التصدير.

تحديد البروتينات السوطية المشاركة في آلية التنشيط المعتمدة على لمجمع بوابة التصدير عبر الغشاء. (أ) تأثير تعبير FliJ المفرط على تصدير البروتين السوطي بواسطة خلايا ∆HI B *. نمت خلايا HI B * overexpressing FliJ عند 30 درجة مئوية في مرق T عند قيم الأس الهيدروجيني الخارجية 7.0 أو 7.5 أو 8.0 أو 8.5. تم تحليل الكسور ذات الخلية الكاملة والمزرعة الطافية عن طريق التكتل المناعي باستخدام الجسم المضاد متعدد الأضداد المضاد لـ FlgD ، وتم حساب مستويات الإفراز النسبية لـ FlgD. هذه البيانات هي المتوسط ​​من ثلاث تجارب مستقلة. تشير القضبان العمودية إلى SDs. (ب و ج) تأثير حذف fliJ على تصدير البروتين السوطي بواسطة خلايا ∆HI B *. نمت خلايا ∆HI B * (+ FliJ) و ∆HIJ B * (- FliJ) عند 30 درجة مئوية في مرق T عند قيم الأس الهيدروجيني الخارجية 7.0 أو 7.5 أو 8.0 أو 8.5. تم تحليل الكسور ذات الخلية الكاملة والمزرعة الطافية عن طريق التكتل المناعي باستخدام الجسم المضاد متعدد الأضداد المضاد لـ FlgD ، وتم حساب مستويات الإفراز النسبية لـ FlgD. هذه البيانات هي المتوسط ​​من ثلاث تجارب مستقلة. الخط الأحمر مأخوذ من الشكل 1أ.

تأثير طفرة اكتساب الوظيفة في FlhA على تصدير بروتين فوطي يعتمد على Δψ بواسطة ΔHI B * Mutant.

يرتبط FliJ بـ FlhAج لتسهيل تصدير البروتين المزدوج H + بواسطة مجمع بوابة التصدير عبر الغشاء (13 ، 25). طفرة اكتساب الوظيفة ، flhA (T490M)، وتقع في FlhAج (الشكل 4أ) ، يتغلب على عيب FliJ إلى حد كبير (18 ، 26). لذلك ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كانت طفرة اكتساب الوظيفة تؤثر على اعتماد تصدير البروتين السوطي بواسطة متحولة ΔHI B *. للقيام بذلك ، استخدمنا خلايا HI B * التي تحتوي على flhA (T490M) طفرة (ΔHI B * A *). يفرز هذا المسخ كمية كبيرة من FlgD في طاف الثقافة حتى عند درجة حموضة خارجية تبلغ 7.0 (الشكل 4).ب و الملحق SI، التين. S4أ). ظلت كمية FlgD المفرزة ثابتة تقريبًا في متحولة ΔHI B * A * (الشكل 4ب). كما هو متوقع ، فإن fliJ لم يؤثر الحذف بشكل كبير على مستويات إفراز FlgD بواسطة متحولة ΔHI B * A * (الشكل 4).ب و الملحق SI، التين. S4ب). تشير هذه النتائج إلى أن ملف flhA (T490M) تسمح الطفرة لـ FlhA بتبني التشكل الذي يحاكي حالة FliJ المرتبطة بـ FlhA ، وبالتالي القضاء على اعتماد Δψ لتصدير البروتين السوطي بواسطة مجمع بوابة التصدير.

تأثير طفرة اكتساب الوظيفة في FlhA على تصدير البروتين السوطي المعتمد على. (أ) هيكل FlhA. يتكون FlhA من منطقة الغشاء الطرفية N (FlhATM) ونطاق حشوي كبير C- طرفي (FlhAج). FLHAج تشكل منصة لرسو السفن لـ FliH و FliI و FliJ ومرافقي التصدير وركائز التصدير. FLHAج (معرف PDB 3A5I) يتكون من أربعة مجالات ، D1 ، D2 ، D3 ، D4 ورابط مرن (FlhAإل). العمود الفقري لـ Cα مرمز بالألوان من الأزرق إلى الأحمر ، ويمر عبر ألوان قوس قزح من الطرف N إلى الطرف C. البقايا المحفوظة جيدًا Asp-456 و Phe-459 و Thr-490 من FlhA هي المسؤولة عن تفاعل FlhAج مع مرافقي تصدير السوط في مجمع مع ركائزهم المماثلة. تعتبر بقايا Arg-94 و Lys-203 و Asp-208 و Asp-249 المحفوظة للغاية ضرورية لتصدير البروتين السوطي المزدوج H +. حلقة FHIPEP محفوظة للغاية بين حلزونات الغشاء 4 و 5 من FlhATM يرتبط بـ FlhAج لتنسيق تدفق H + لتصدير البروتينات السوطية. (ب) تأثير flhA (T490M) طفرة (A *) على تصدير البروتين السوطي المعتمد على. نمت خلايا ∆HI B * A * (+ FliJ) و ∆HIJ B * A * (- FliJ) عند 30 درجة مئوية في مرق T عند قيم الأس الهيدروجيني الخارجية 7.0 أو 7.5 أو 8.0 أو 8.5. تم تحليل الكسور ذات الخلية الكاملة والمزرعة الطافية عن طريق التكتل المناعي باستخدام الجسم المضاد متعدد الأضداد المضاد لـ FlgD ، وتم حساب مستويات الإفراز النسبية لـ FlgD. هذه البيانات هي المتوسط ​​من ثلاث تجارب مستقلة. (ج) نموذج FlhAج حلقة. يتم عرض مواقع الربط لمرافقي تصدير السوط المعقدة مع ركائز التصدير المتشابهة في اللون الأرجواني. يرتبط FliJ بشق بين مجالات D4 في FlhA المجاورةج الوحدات الفرعية.

تأثير flhA (T490M) على أنشطة قناة H + و Na في FlhA.

وجدنا أن متحولة ΔHI B * A * تفرز كمية كبيرة من FlgD في وسائط الثقافة عند درجة حموضة خارجية تبلغ 7.0 (الشكل 4).ب و الملحق SI، التين. S4أ) ، مما يزيد من احتمال أن flhA (T490M) قد تؤثر الطفرة على أنشطة قناة H + و Na في FlhA. نظرًا لأنه تم الإبلاغ عن أن جزيئات FlhA المنتشرة بحرية في غشاء الخلية تؤدي إلى توصيل كل من H + و Na + (17) ، فقد قمنا بإفراط في التعبير عن النوع البري FlhA و FlhA (T490M) في الإشريكية القولونية خلايا BL21 (DE3) وقياس درجة الحموضة داخل الخلايا وتركيز Na + داخل الخلايا باستخدام مسبار مؤشر الرقم الهيدروجيني ، pHluorin (M153R) (27 ، 28) ، وصبغة مؤشر Na + الفلورية ، CoroNa Green (17) ، على التوالي. كان الرقم الهيدروجيني داخل الخلايا لخلايا الإفراط في التعبير عن FlhA 7.10 ± 0.06 (يعني ± SD) ، والذي كان أقل من 0.06 وحدة أس هيدروجيني من الرقم الهيدروجيني الداخلي للتحكم في المتجه (7.16 ± 0.06) (الملحق SI، التين. S5أ والجدول S3). كان هذا الانخفاض الصغير في درجة الحموضة قيمة ذات دلالة إحصائية (ص = 0.037) ، مما يشير إلى أن FlhA المجاني له نشاط قناة H +. الأس الهيدروجيني داخل الخلايا للخلايا التي تعبر عن FlhA مع flhA (T490M) كانت الطفرة في الأساس مماثلة لتلك الموجودة في الخلايا التي تعبر عن النوع البري FlhA (الملحق SI، التين. S5أ) ، مشيرا إلى أن هذا flh الطفرة لا تزيد من نشاط قناة H + لـ FlhA.

تسبب الإفراط في التعبير عن FlhA من النوع البري في زيادة كبيرة في تركيز الصوديوم داخل الخلايا في وجود 100 ملي كلوريد الصوديوم ولكن ليس في غيابه (الملحق SI، التين. S5ب والجدول S3) بالاتفاق مع تقرير سابق (17). زاد تركيز Na داخل الخلايا لخلايا FlhA-overexpressing من 4.5 ± 2.1 مم (متوسط ​​± SE ن = 30) إلى 73.1 ± 10.8 ملم (ن = 30) (الملحق SI، التين. S5ب والجدول S3). تركيز الصوديوم داخل الخلايا يزيد من التعبير عن FlhA مع flhA (T490M) وصلت الطفرة 75.6 ± 13.7 مم (ن = 30) (الملحق SI، التين. S5ب والجدول S3) ، مما يشير مرة أخرى إلى أن هذا التغيير في البقايا لا يزيد من نشاط قناة Na الجوهرية لـ FlhA. باستمرار ، لا يزال متحولة ΔHI B * A * تظهر اعتمادًا واضحًا على Na + لتصدير البروتين السوطي عند درجة حموضة خارجية تبلغ 7.5 مثل متحولة ΔHI B * (الملحق SI، الشكل S6). لذلك ، نقترح أن Δψ أعلى من القيمة الحدية قد تعمل على FlhAج لتحقيق الاستقرار في تفاعلها مع FliJ لفتح قناة أيون FlhA بكفاءة لتوصيل البروتونات لدفع تصدير البروتين السوطي بطريقة تعتمد على.

تأثير SMF على تصدير البروتين فلاجيلار بواسطة ΔHI B * Mutant.

يُظهر تصدير البروتين فلاجيلار بواسطة متحولة ΔHI B * اعتمادًا واضحًا على تركيز Na + الخارجي على نطاق الأس الهيدروجيني الخارجي 6.0-8.0 (17 ، 18). باستمرار ، زاد مستوى إفراز FlgD بشكل كبير عندما كان 100 ملي كلوريد الصوديوم موجودًا في الوسط (الملحق SI، الشكل S6). لم يتغير Δψ ولا إجمالي PMF عند إضافة 100 ملي كلوريد الصوديوم (الملحق SI، الجدول S4). لتحليل تأثير SMF على عملية تصدير البروتين السوطي بأكملها ، قمنا بتحليل عدد وطول الخيوط السوطية التي تنتجها خلايا ΔHI B * في وجود 100 ملي كلوريد الصوديوم (الشكل 2 و الملحق SI، الجدول S2). كان إجمالي SMF عبر غشاء الخلية أكبر بنحو 45 مللي فولت عند درجة حموضة خارجية 8.5 من تلك الموجودة عند درجة حموضة خارجية قدرها 7.5 (الملحق SI، الشكل S7 والجدول S4). أنتجت حوالي 73.5 ٪ من خلايا Δ HI B * شعيرات سوطية ، بمتوسط ​​1.4 ± 0.6 خيوط لكل خلية (يعني ± SD ن = 125) عند درجة الحموضة الخارجية 7.5 (الشكل 2ب). كان متوسط ​​طول الشعيرة 7.6 ± 2.5 ميكرومتر (ن = 50) (الشكل 2ج). أنتجت حوالي 96.3 ٪ من خلايا Δ HI B * خيوطًا عند درجة حموضة خارجية تبلغ 8.5 ، بمتوسط ​​1.8 ± 0.8 لكل خلية (ن = 180) (الشكل 2ب). كما زاد متوسط ​​طول الشعيرة بشكل ملحوظ (9.0 ± 2.6 ميكرومتر [ن = 50]) عند الرقم الهيدروجيني 8.5 (الشكل 2ج). وبالتالي ، فإن الزيادة Δψ تسهل أيضًا تصدير البروتين المزدوج للصوديوم. عند درجة الحموضة 8.5 ، كان متوسط ​​طول الشعيرة أطول بكثير في وجود 100 ملي كلوريد الصوديوم مقارنة بغيابه (الشكل 2).ج). لأن SMF كان أكبر من PMF في ظل ظروفنا التجريبية (الملحق SI، الجدول S4) ، نقترح أن تعمل المتزايدة على قناة أيون FlhA لتسهيل التدفق الموجه إلى الداخل لكل من H + و Na عندما يقترن بنقل البروتين الموجه للخارج.


الأساس الجزيئي للوظيفة

حدد العمل الكلاسيكي لهودجكين وهكسلي [1] السمات الرئيسية الثلاث لقنوات الصوديوم: التنشيط المعتمد على الجهد ، والتثبيط السريع ، والتوصيل الأيوني الانتقائي. بناءً على هذا الأساس ، قدمت لنا دراسات هيكلية حديثة باستخدام التقنيات الجزيئية والكيميائية الحيوية والفيزيولوجية الكهربية فهماً جيداً للأساس الجزيئي لوظيفة قناة الصوديوم. كان من الأهمية بمكان في ذلك هو السموم العصبية رباعي الذيفان والساكسيتوكسين ، والتي تم استغلال خصائصها المسدودة لتنقية بروتينات قناة الصوديوم والكشف عن بقايا الأحماض الأمينية المتضمنة في المسام الخارجية وفي مرشح الانتقائية. يتكون المسام الخارجي من حلقات إعادة الدخول بين مقاطع الغشاء S5 و S6 لكل مجال. يُعتقد أن اثنين من الأحماض الأمينية المهمة في مواقع متشابهة في جميع المجالات الأربعة يشكلان الحلقات الخارجية والداخلية سالبة الشحنة التي تعمل كموقع مستقبل لحاصرات المسام ومرشح الانتقائية (الشكل 1 أ). تحولات هذه البقايا لها تأثيرات كبيرة على ارتباط الذيفان الرباعي والساكسيتوكسين [20] ، ولها أيضًا تأثيرات ملحوظة على انتقائية نفاذية الكاتيونات أحادية التكافؤ العضوية وغير العضوية عبر قناة الصوديوم [21 ، 22]. يأتي الدليل الأكثر إقناعًا من دراسة أجراها Heinemann وآخرون. [23] ، الذي أنتج قناة صوديوم انتقائية للكالسيوم عن طريق تحور بقايا الحلقة الداخلية (DEKA في رمز الأحماض الأمينية أحادي الحرف) إلى نظيراتها في قنوات الكالسيوم (EEEE).

كما هو الحال بالنسبة للقنوات الأيونية الأخرى ذات الجهد الكهربائي ، فإن الاعتماد على الجهد لتنشيط قنوات الصوديوم ينشأ من الحركة الخارجية للبقايا المشحونة نتيجة لتغير المجال الكهربائي عبر الغشاء [1]. تعمل الأجزاء S4 لكل مجال متماثل كمستشعرات الجهد للتنشيط. وهي تتكون من أشكال متكررة لبقايا موجبة الشحنة متبوعة بمتبقيين كارهين للماء ، مما قد يؤدي إلى إنشاء ترتيب حلزوني للشحنات الموجبة عبر الغشاء. عند إزالة الاستقطاب ، تؤدي الحركة الخارجية للولزات S4 ودورانها المتزامن إلى بدء تغيير توافقي يفتح مسام قناة الصوديوم. إن نموذج "اللولب المنزلق" [24] أو نموذج "اللولب الحلزوني" [25] مدعوم بأدلة قوية [3]. على سبيل المثال ، معادلة البقايا الرئيسية المشحونة إيجابياً في S4 يقلل بشكل ملحوظ من اعتماد الجهد على البوابة [26]. تم أيضًا اكتشاف حركة البوابات الخارجية للمقاطع S4 مباشرة من خلال حقيقة أنه عندما يتم استبدال بعض المخلفات في هذه الحلزونات بالسيستين ، تتفاعل كواشف السلفهيدريل خارج الخلية معها فقط بعد تنشيط القناة [27-29].

يعد تعطيل قناة الصوديوم عملية حاسمة تحدث في غضون أجزاء من الثانية من فتح القناة. في النموذج المقبول عمومًا لهذه العملية ، تعمل الحلقة داخل الخلايا المحفوظة بشكل كبير والتي تربط المجالين الثالث والرابع كبوابة تعطيل ، تشبه إلى حد كبير الغطاء المفصلي ، الذي يرتبط بالمسام داخل الخلايا للقناة لتعطيله (الشكل 2 أ). نضح البروتياز داخل الخلايا [30] أو تطبيق الأجسام المضادة داخل الخلايا التي تتعرف على هذه الحلقة ، ولكن ليس الأجسام المضادة للتركيبات الأخرى داخل الخلايا [31] ، يمنع التعطيل السريع. يتكون "مزلاج" بوابة التعطيل من ثلاثة مخلفات رئيسية كارهة للماء (IFM الشكل 2) ، ويمكن للببتيدات التي تحتوي على هذا الشكل أن تعيد تعطيل قنوات الصوديوم التي تحتوي على بوابة تعطيل متحولة [32]. تؤدي الطفرات في بقايا الفينيل ألانين الرئيسية (Phe1489) إلى المخلفات المحبة للماء المختلفة إلى إعاقة التثبيط بدرجات متفاوتة. علاوة على ذلك ، إذا تم استبداله ببقايا السيستين ، يتم منع التعديل التساهمي للسيستين عند إغلاق بوابة التعطيل [33]. يكشف التحديد الهيكلي وتحليل الرنين المغناطيسي النووي للجزء الأساسي من بوابة التعطيل عن هيكل حلزوني ألفا جامد محاط بعزر IFM [4] (الشكل 2 ب). في هذا الهيكل ، تشير السلسلة الجانبية لـ Phe1489 بعيدًا عن لب الببتيد على نفس الوجه مثل ثريونين قريب (Thr1491) ، وهو بقايا حرجة أخرى للتثبيط [33]. على عكس نموذج IFM القصير الذي يشكل بوابة التعطيل ، قد يتكون مستقبل بوابة التعطيل على جسم القناة من بقايا كارهة للماء بالقرب من الفم داخل الخلايا للمسام. تشير تجارب مسح الطفرات إلى وجود بقايا كارهة للماء في الحلقات داخل الخلايا S4-S5 للمجالات الثالث والرابع ، بالإضافة إلى النهاية داخل الخلايا لأجزاء الغشاء S6 لهذه المجالات ، كمكونات لمستقبل بوابة التعطيل [3].

من المحتمل أن يوفر الاكتشاف المثير لقناة الصوديوم البكتيرية (NaChBac الشكل 1 ج) ، التي تتكون من مجال واحد من ستة مقاطع حلزونية ألفا عبر الغشاء [10] ، أدوات جديدة لدراسة العلاقات بين بنية قناة الصوديوم ووظائفها. يبدو أن قناة NaChBac تشكل مقياسًا متجانسًا وهي قناة صوديوم وظيفية ذات جهد كهربائي. لديها معدل تعطيل أبطأ 100 مرة من Naالخامس القنوات (لأنها لا تحتوي على ما يعادل بوابة التعطيل). علاوة على ذلك ، يبدو أن مرشح انتقائية الصوديوم الخاص به متماثل ، يتكون من أربعة بقايا غلوتامات في مواضع رئيسية في جميع حلقات المسام الأربعة ، تشبه قناة Ca 2+. ستوفر قناة الصوديوم البكتيرية هذه إطارًا أبسط من قنوات الثدييات لتجارب الطفرات لاختبار الفرضيات المتعلقة ببنية ووظيفة قنوات الصوديوم ذات الجهد الكهربائي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يسهل الحجم الصغير للقناة الحصول على معلومات التركيب البلوري ، كما كان الحال بالنسبة لمنطقة المسام لقناة البوتاسيوم البكتيرية (KcsA) [5].


الجزء الخامس: المعدل المتأخر

قم بإيقاف تشغيل المؤامرة الصفراء (حدد "-") في القائمة المنبثقة واضبط المؤامرة الخضراء على "I_K" ، تيار المعدل المتأخر.

قم باستدعاء نافذة التحفيز واضبط Stim1 على 100 nA منبه يستمر 5 مللي ثانية. اضغط على Stim1 زر في نافذة المحاكاة الرئيسية لإزالة استقطاب الخلية ، ومعرفة ما يحدث.

    السؤال 1. بناءً على مخطط Vm (الخط الأحمر) ، ما هي قيمة الذروة التي وصل إليها جهد الغشاء؟ انقر فوق الخط الموجود على يمين القمة واستخدم & lt زر للعثور على الحد الأقصى.


البيانات الموسعة الشكل 1 التنوع الهيكلي والوظيفي للقنوات الأيونية الرباعية.

أ، يتم تمييز فئتين رئيسيتين من القنوات ، المبادلة بالمجال وغير المبادلة بالمجال من خلال المواضع النسبية لاستشعار الجهد ومجالات المسام. ب، تم حل الهياكل للقنوات الأيونية غير المبادلة بالمجال ، وحدتان فرعيتان موضحتان للتوضيح ج, جي(الخامس) علاقات كل فئة فرعية للقناة د، تصوير التدرج للنيوكليوتيدات الحلقية وحساسية الجهد لأعضاء الفئة الفرعية. الشكل مستوحى من المرجع. 75.

البيانات الموسعة الشكل. 2 الكيمياء الحيوية KAT1em وسير عمل cryo-EM.

أ، SEC من KAT1em المنقى في digitonin ، يعمل على عمود Superose 6. ب، SDS خالية من البقع – PAGE من KAT1em المنقى. تتوافق نتائج SEC و SDS-PAGE مع التحضير المستخدم للتصوير (د) وتمثل ثلاث تنقية مستقلة. ج، SEC لـ KAT1em في 2N2 nanodiscs (أثر أصفر) ، تُظهر الأوكتامر المفترض ، والرباعي ، والقرص النانوي الفارغ. الكشف عن الإسفار SEC لـ KAT1 – GFP كامل الطول (تتبع أزرق) يُظهر الأوكتامر المفترض والرباعي. لم يتم إخضاع هاتين العينتين لأي تجارب cryo-EM ، وتم تضمينهما فقط لغرض المقارنة. دسير عمل KAT1em cryo-EM. From 1,500 movies, 120,000 particles were picked and subjected to 2D classification, which then yielded 110,000 particles, which were classified in 3D without imposing symmetry (4 coloured classes). Particles from the best two classes (blue and green classes, 91,000 total) were subsequently refined, imposing C4 symmetry, and using successive masks to focus on one of the tetramers and finally on the transmembrane region of one of the tetramers. Additional details are given in Methods.

Extended Data Fig. 3 Cryo-EM map and model validation.

أ, ResMap colouring of unfiltered half map of full molecule ب, Same ResMap colouring as أ on sharpened full molecule map. ج, د, Ninety-degrees-rotated angular-distribution plots for refined full molecule. ه, FSC plot for map focused on the transmembrane region. FSC 0.143 criterion is used for resolution determination 41 . F, FSC (map and model) plot from phenix.mtriage 76 , indicating correspondence of tetramer atomic model to transmembrane domain-focused-refined density map. ز, Details of sharpened cryo-EM density map are shown with fitted atomic model.

Extended Data Fig. 4 KAT1em pore domain and pseudo cyclic nucleotide-binding domain.

أ, Side view of pore, with only two subunits shown for clarity. Permeation pathway is shown in blue, with inner gate radius calculated by MOLE 74 (1.4 Å) or HOLE 77 (1 Å), inner gate-forming I292 side chains shown as sticks. ب, جي(الخامس) relations of pore alanine scan. Shaded error regions represent s.d., surrounding the symbols which represent the mean. Wild type (ن = 11), L287A (ن = 19), T288A (ن = 4), L291A (ن = 10), I292A (ن = 10), T296A (ن = 10), V299A (ن = 8) and H301A (ن = 10) are shown ن is the number of biologically independent cells. ج, Overlay of KAT1em pseudo-CNBD (tan) and holoHCN1 CNBD (green, PDB ID: 5U6P). The ligand, HCN1-cAMP is shown as sticks in the cAMP-binding pocket. د, Overlay of KAT1em (tan) and EAG1 (blue, PDB ID: 5K7L). KAT1 lacks the ‘intrinsic ligand’ loop of EAG1. ه, Top-down view of KAT1em (tan), holo HCN1 (green) and EAG1 (blue) overlay. Structures were aligned and superimposed on the basis of the transmembrane helices. Only C-linker hairpins are shown for clarity to compare relative rotation of the C-linker to the transmembrane domain for each structure. The relative rotation of the KAT1 C-linker matches that of EAG1 and not HCN1. F, ز, Surface electrostatic potential of HCN1 (F) and KAT1 (ز)، على التوالى. Ligand-binding pockets are circled in black. KAT1 lacks a deep electropositive (blue) pocket as seen in HCN1.

Extended Data Fig. 5 The voltage-sensing domain of KAT1em in the up conformation.

أ, Diagram of key VSD features, showing hydrophobic gasket (F102 and V70, yellow) as well as all S4 charges (blue) and distributed countercharges (or counter dipoles) (red). Dashed lines indicate likely interactions in the up conformation. ب, ج, Overlays of KAT1em (tan) with HCN (green, PDB ID: 5U6O) and Kالخامس1.2/2.1 (pink, PDB ID: 2R9R), respectively, highlighting structural differences between S4 helices. Cα atoms of the positively charged residues of S4 are shown as spheres.

Extended Data Fig. 6 Structural and functional characterization of KAT1 VSD–pore interfaces.

أ, جي(الخامس) relations of S4–S5–C-linker interfacial mutants. Wild type (ن = 11) and K187A (ن = 8), D188A (ن = 9), R190A (ن = 6), F191A (ن = 12), N192A (9), T303A (ن = 13), R307A (ن = 14), R314A (ن = 31) and R314E (ن = 9) mutants are shown ن is the number of biologically independent cells. Shaded regions represent s.d. and symbols represent the mean. ب, جي(الخامس) relations of upper-interface mutants. Wild type (ن = 11) and F81A (ن = 12), F81L (ن = 19), I166A (ن = 18), M169A (ن = 5), V178A (ن = 19) and F215A (ن = 19) mutants are shown ن is the number of biologically independent cells. Shaded regions represent s.d. and symbols represent the mean. ج, Deactivation energies of upper-interface mutants calculated from جي(الخامس) relations in ب (same sample sizes). د, Mapping of upper-interface functional data (shown in ج). Displayed as sticks are key residues on S1: F80, F81, F83, key S4 residues: I166, M169, L172, V178, and key S5 residues: Y193, R197, K200, F207, C211, F215. ه, F, Comparison of similar lipid-binding conformations observed in the structure (ه) and after about 3.5 μs molecular dynamics simulation (F). ز, Cryo-EM density map, with one bound lipid coloured green, contoured at the same contour level as the full map. ح, SDS–PAGE and GFP in-gel imaging of Xenopus oocyte membrane fractions, extracted in gentle detergent (Methods). The experiment was performed once and each lane is derived from ten cells. أنا, Confocal imaging of Xenopus oocyte animal poles expressing various GFP-tagged constructs. Imaging was performed in a single session with normalized exposure times, and each image is representative of five independent oocytes.

Extended Data Fig. 7 Detailed functional characterization of selected VSD–pore interface mutants.

أ, جي(الخامس) relations for cRNA mixing-coinjection experiments. cRNA encoding loss-of-function mutants (I189A, R197K, K200Q, T306A and R310K), for which no currents were observed were selected. These loss-of-function mutant cRNAs were each individually mixed with cRNA encoding a gain-of-function double mutant (Q80A–177K). Data are mean ± s.e.m. Q80A–R177K (ن = 12), I189A + Q80A–R177K (ن = 7), K200Q + Q80A–R177K (ن = 8), R197K + Q80A–R177K (ن = 9), R310K + Q80A–R177K (ن = 8) and T306A + Q80A–R177K (ن = 9) are shown. ب, Plot of activation midpoints (الخامسح) من جي(الخامس) relations shown in أ. ج, د, Limiting-slope analyses for wild-type KAT1 (ج) and D188A (د). Top, raw currents evoked by voltage ramp protocol. Middle, conductance–voltage relations, with conductance plotted on a log scale. Data points are black, fits are red. Blue vertical lines mark the first and second inflection points of the curve, the region between which was used to calculate limiting-slope (ض) values (Methods). Wild type, ض = 2.83 ± 0.5 D188A, ض = 3.28 ± 0.2. data are mean ± s.d. Bottom, data (black) and fits (red) on a linear scale. ن is the number of biologically independent cells.

Extended Data Fig. 8 VSD movement during gating.

أ, Schematic of double-mutant cycle analysis. The difference between ΔΔجيx,ذ and the quantity (ΔΔجيx + ΔΔجيذ) determines the extent of differential interaction between residues x و ذ in the up and down states. ب, جي(الخامس) relations for single and double mutants, illustrating residue–residue pairs displaying additivity (gray) and non-additivity in different directions (green, up-state interaction red, down-state interaction). Shaded regions represent s.d. and symbols represent the mean. Wild type (ن = 11) and M64A (ن = 11), V67A (ن = 33), C77A (ن = 15), Q80A (ن = 11), D95A (ن = 12), Q149A (ن = 21), R165A (ن = 21), S168A (ن = 17), V178A (ن = 19), M64A/V178A (ن = 15), V67A/Q80A (ن = 13), V67A/S168A (ن = 16), V67A/V178A (ن = 10), C77A/S168A (ن = 14), Q80A/R165A (ن = 6), D95A/R165A (ن = 5) and Q149A/R165A (ن = 14) mutants are shown ن is the number of biologically independent cells. ج, Displacement of charge for the isolated VSD in the up, one-click down and two-click down conformations at different transmembrane potentials. Data are mean ± s.d. calculated using the last 40-ns snapshots (ن = 4,000) of 50-ns trajectories. Each system was simulated once at each chosen potential. The gating charge was then calculated as the offset constant between the linear fits, resulting in a gating charge of 1.02 ه and 0.55 ه between the up and one-click down, and one-click down and two-click down states, respectively. د, Mapping of double-mutant cycle constraints onto up VSD structure. Thick red and green lines connect Cα carbons of interacting pairs. Thin grey lines connect negative-control pairs. ه, Mapping of literature KAT1 down-state interacting pairs 21 onto up structure. Thick red lines connect Cα carbons of interacting pairs.

Extended Data Fig. 9 A cysteine–Cd 2+ –cysteine bridge in the KAT1 VSD promotes channel opening.

أ, Raw current traces for all four combinations of C77(S) and R165(C). On washing with 100 μM CdCl2, current increases only in the C77/R165C condition (red box, middle), and then decreases again upon EDTA wash. Representative data are shown from the same oocyte, and each experiment was repeated five independent times (five biologically independent oocytes) with similar results. ب, Pulse protocol used during experiment. ج, Mapping of C77 (on S1) and R165 (on S4) onto the up VSD structure of KAT1. Cα atoms are indicated by a red line.


How to measure Na/K channel activation at the membrane level? - مادة الاحياء

Ion Channels: Structure and Function

Ion channels are membrane protein complexes and their function is to facilitate the diffusion of ions across biological membranes. Membranes, or phospholipid bilayers, build a hydrophobic, low dielectric barrier to hydrophilic and charged molecules. هم انهم electrical insulators. Ion channels provide a high conducting, hydrophilic pathway across the hydrophobic interior of the membrane. The channel, or pore structure, is said to catalyze the 'reaction' of transporting charged molecules across a low dielectric medium. The 'catalytic site', the central channel, is either افتح أو مغلق. The open channel conformation can be compared to the transition state of the enzyme-substrate complex, where ions are tightly associated to the catalytic site. The conformational change between closed and open state is called gating, as in opening and closing a gate. Channel gating is controlled by external factors like enzymes are controlled by modulators and effectors. Ion channels can be classified according to which chemical or physical modulator controls their gating activity. Thus we have different groups of channels as summarized below:

- ligand gated channels neurotransmitters

- voltage gated channels transmembrane potential (electric field)

- second messenger gated channels nucleotides, G-proteins

- mechanosensitive channels osmotic pressure, membrane curvature

- gap junctions, porins not gated


Channels are also ion selective. They can discriminate between size and charge of the permeant molecule. All ion channels are complexes of transmembrane proteins, sometimes they contain cytoplasmic subunits, often they are glycosylated. The 3-D structure of most ion channels, is not known, with two notable exceptions, porins and a K-channel, both of bacterial origin. There exists, however, a multitude of biochemical and functional data, combined with mutagenesis experiments that give information about the transmembrane topology of these proteins, dividing it into transmembrane segments and extramembraneous loops/domains. Often size and location of loops on one side or the other of the membrane can be determined by chemically modifying the protein and analyzing which amino acids have been modified.

The first structure (in 1990) of an ion channel solved at atomic resolution <0.3nm is that of the bacterial porins, a family of homo-trimeric channel proteins. Each subunit contains 16 to 18 transmembrane, anti-parallel b -strands forming a b -barrel structure. The b -strands are amphipathic, they contain alternating polar and non-polar residues and the inter-strand interaction is fully saturated with H-bonding. This creates a hydrophilic pore interior providing a water filled channel. The channel has a large diameter of 0.8x1.1nm, and is non-selective for small ions. However, it has an upper exclusion size limit corresponding to molecular weights of about 600 Dalton of permeants. Because most metabolites have molecular weights lower than 600 Da and have been shown to pass through porin channels, porins are called general diffusion pores.

تين. Ribbon diagram of porin barrel and projection of outer face of this barrel

تين. Projection map of porin barrel

from Weiss and Schulz, 1992

3. Nicotinic Acetylcholine Receptor - nAChR

The structure of another ion channel, the nicotinic acetylcholine receptor, has been determined to 0.9nm resolution by cryo-electron microscopy. The nAChR is a heteromeric glycoprotein complex composed of five integral membrane proteins in a stoichiometry of a2bgd .

The five subunits are arranged in a circular fashion around a central hole that provides an ion pathway across the post-synaptic cell membrane. The pentameric complex has a five fold pseudo-symmetry because its subunits are not identical. The receptor complex binds two molecules of acetylcholine. Acetylcholine binding induces the opening of the channel. Coupling between the two ACh binding sites and the channel gate is an allosteric mechanism because the binding of a ligand causes a structural change on a distant place in the receptor unit.

تين. Pentameric arrangement of nAChR subunits

ال transmembrane topology of the AChR has been inferred from hydrophobicity analysis و secondary structure prediction of the primary sequence. So called hydropathy plots indicate the grouping of hydrophobic stretches in the sequence that are identified as spanning the membrane, usually in the form of a -helices. Four transmembrane segments have been proposed for the nAChR subunits, and the orientation of the receptor within the post-synaptic membrane has been modeled has having a large N-terminal domain outside the cell facing the synaptic cleft. This is also the location of the agonist binding site in the alpha subunits discussed above.

تين. Two hydrophobicity scales of amino acids

The figure compares two hydrophobicity scales showing the sometimes different results obtained by different groups. Upper scale by Kyte and Doolittle, 1982, A simple method for displaying the hydropathic character of a protein, J.Mol.Biol. 157:105-132. The lower scale by Rose et. al., 1985, Hydrophobicity of amino acid residues in globular proteins, Science 229:834. تين. Hydropathy plot for acetylcholine receptor subunit

الاختصارات: LSS-leader signal sequence ED-extracellular domain CL-cytoplasmic domain M1-M4-transmembrane spanning segments positive hydropathy means non-polar, negative values polar domains Early experiments on identifying the amino acids involved in ion flux through the nAChR channel indicated that residues in transmembrane segment 2, or M2, form the channel lining structure of the receptor. Each of the five subunits contributes its M2 segment to the channel thus forming a five fold symmetry. Rings of identical (or similar, because M2 sequences of different subunits are not totally conserved) amino acids thought to be part of the channel thereby determining its selectivity الخصائص. The M2 segment is likely to line the pore also because it is the only transmembrane segment that could form an برمائي a -helix. The hydrophilic residues are aligned on the side of the helical cylinder that faces the channel interior.

Electron microscopy providing a high resolution of 0.9nm shows the presence of such an a -helix surrounding the central pore. It also shows that the helix is found in a linear form when the channel is open, but exhibits a kink in the middle of the membrane when the channel is closed. أ ليسين residue in each subunit is located at this kink. The large part of the membrane buried structure, however, does not seem to exhibit any a -helices. It has tentatively been proposed (but not shown) to form a b -barrel structure giving the nAChR pentamer a similar membrane anchoring structure as found in porin trimers. تين. Channel cross section (electron density map) with positions of the pore lining transmembrane segment M2 (left solid bars) and helical plot of the amino acid sequence of transmembrane segment M2.

4. The acetylcholine binding site

Acetylcholine is a neurotransmitter and the natural agonist of the acetylcholine receptor.

تين. Chemical structure of acetylcholine

Besides ACh there are many other agonists that are important pharmacological agents or drugs that affect the activity of the receptor. The most important one is النيكوتين, which also gave this receptor type its specific name, nicotinic acetylcholine receptor. ناهضات are positive modulators of the receptor activity. الخصوم are molecules that have the opposite effect of agonists, they inhibit receptor activity. The most commonly known inhibitors are the curare alkaloids و a -bungarotoxin, a small protein that irreversibly binds to the agonist binding pocket thus inactivating the receptor by blocking access for the agonist.

There are two ACh binding pockets in the receptor complex located in the clefts (subunit interface) between the a subunits and the g and b subunits respectively. Two molecules of ACh must bind to activate the receptor, i.e., to open the channel for ions to flow across the membrane. Labeling experiments, where small detector molecules can be covalently linked to amino acid side chains, showed that 5 residues in the N-terminal part (extracellular) of the a subunits are involved in agonist binding. These are residues Tyr93, Trp149, Tyr190, Cys192, and Cys193. The location of the amino acids in the polypeptide indicates that loops from different sites in the sequence are forming the binding pocket, similar to the catalytic triade of serine proteases and the heme binding pocket in globins.

The mechanism to open the channel is a long range effect of a conformational change that starts out as a small local conformational change as described for the oxygen binding to the heme group in globins. The distance between two heme binding sites in hemoglobin is about 2.5nm and the distance between the acetylcholine binding sites and the channel gate (distance between ACh binding site and membrane), the structure in the complex that opens and closes the ion pathway across the membrane, is about 2.5nm as well. This allosteric mechanism can be summarized in the following reaction scheme:

CLOSED R + A <=> RA + A <=> RA2 <=> R*أ2 افتح

The scheme shows that the combined effect of two bound agonists brings the receptor into its transition, or open state (R*), where the receptor exhibits an equilibrium between the closed and open channel. This equilibrium is measured as open probability of the channel P(open).

In addition to the kinetic scheme of ligand binding and channel opening, the receptor can switch into a desensitized state, i.e., a conformation where the channel is closed in the presence of two bound acetylcholine molecules. The channel is unable to reopen until the ligands first dissociate from their binding site. It could be shown that the affinity of the ligand to the receptor in the desensitized state, D, is much higher than in the normal, open or closed state R therbey preventing the postsynaptic membrane from overstimulation.

The crystal structure of a non-voltage gated, two-transmembrane spanning K-channel from the bacteria Streptomyces lividans (KcsA K + channel) has been solved to 3.2 angstrom resolution (amino acids 126-158 at the carboxy terminal end have been cleaved off). Like several other membrane proteins (see projection map for porin barrel), it has two rings of aromatic amino acids positioned to extend into the lipid bilayer, presumably near the membrane-water interfaces. A subunit is inserted into the tetramer such that one transmembrane helix (inner helix) partially facing the central pore (45Å long) while the other (outer helix) faces the lipid membrane. The inner helices are tilted with respect to the membrane normal by about 25° and are slightly kinked with the wider part facing the outside of the cell allowing the structure to form the pore region near the extracellular surface of the membrane. This region contains the K + channel signature sequence, which forms the selectivity filter. Within the selectivity filter the side chain orientation preclude their participation in ion coordination, leaving this function to the oxygen atoms of the main chain carbonyls. They are forming an oxygen ring coordinating a dehydrated K + ion. The K + ion thus has only a very small distance to diffuse from one site to the next within the selectivity filter. Fig. Three different views of the K-channel structure from Streptomyces lividans (KcsA K + channel)

electrostatic surface pore volume selectivity filter & ion binding sites
(from Doyle, 1998)

The crystal structure includes permeating ions (Rb + or Cs + ) and shows three binding sites. One of three cations is stabilized in the middle of the membrane within an aqueous cavity (10 Å diameter) at the negatively charged carboxyl end (helix dipole) of four central a -helices, one from each subunit. Because of the size of the cavity, this central ion is proposed to be hydrated. Furthermore, the structure shows that, with the exception of the selectivity filter (12Å long), the pore lining is mainly hydrophobic (cytoplasmic side of channel lumen, corresponds to lower half of pore in above figure), a general property of K-channels. This might explain why most K-channels have a very high flux rate, or ion conductance.

Potassium channels form a family of K + selective, voltage-gated channels in excitable membranes such as neuronal and muscle cell membranes. So far over 50 different genes have been cloned and sequenced from mammals, plants, and microorganisms. Most potassium channels form homo- or hetero-tetrameric protein complexes with each subunit having 6 transmembrane segments (S1 - S6) and a pore loop structure connecting the fifth and sixth segments. Transmembrane segment S4 contains a series of positively charges amino acids which have been shown to be essential for voltage-sensing. Although the crystal structure of KcsA is a non-voltage-gated type, the sequence similarities of the pore loop strongly suggest that all potassium channels have the same quaternary pore architecture.

6. Measuring single channel activity

How are ion channels studied experimentally? Ion channels catalyze the diffusion of ions across membranes with electrical currents in the order of pico Amperes (10 -12 A). The recording of single channel currents shows two current levels corresponding to the closed and open state respectively. Transitions between these two states are very fast and in the order of fractions of a millisecond, and appear in the recordings as rectangular jumps from one level to the other. The amplitude of the jump corresponds to the current. The current can be normalized and expressed as resistance (or its inverse, the conductance) because it is proportional to the membrane potential as defined by Ohm's law (E = R*I). Channels have ion flux rates of up to 10 6 ions/second.

Normally, the channels stay open for only a fraction of seconds, allowing the flux of tens of thousands of ions through the pore. The activity of the channel can be quantified as open probability, the fraction of time it stays in the open conformation. The open probability of a channel can be compared to the fractional saturation of hemoglobin with molecular oxygen. Whereas in hemoglobin the fractional saturation is related to the saturation pressure of the oxygen (the ligand of the heme), the open probability is related to the concentration of the acetylcholine in the synaptic cleft.

تين. Single channel activity and voltage dependence of a Na-channel (from Catterall, 1988)


This work is funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) Projektnummer 374031971 TRR 240 A04 and DFG Projektnummer 417451587, as well as supported by the Prix-Louis-Jeantet foundation to GN. This publication was supported by the Open Access Publication Fund of the University of Wuerzburg. تم تمكين تمويل Open Access وتنظيمه بواسطة Projekt DEAL.

الانتماءات

Department of Neurophysiology, Institute of Physiology, Biocenter, University of Wuerzburg, 97070, Wuerzburg, Germany

Yuehui Tian, Georg Nagel & Shiqiang Gao

Present address: Environmental Microbiomics Research Center, School of Environmental Science and Engineering, Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Zhuhai), Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510006, China


مناقشة

We have combined LLSM with optogenetic activation for measuring the morphodynamics of PA-Rac1-based ruffling processes with high spatio-temporal resolution. Processes on the dorsal side of the cell are difficult to measure by many traditional geometries of imaging. We demonstrate that optogenetic approaches to study processes, where a threshold number of molecules need to be activated over time, can be achieved using simpler optical arrangements of wide-field photoactivation, even though use of SLMs offers precision control over space and time.

The results presented here clearly demonstrate that to achieve efficient ruffling, the photoactivation needs to be continuous. This is in line with previous studies that postulate a concentration dependence of Rac1 by virtue of its bivalent interaction with the wave regulatory complex (WRC). Chen et al. [34] propose a model where maximal WRC activation is evinced by simultaneous engagement of two Rac1 molecules per WRC and may control actin dynamics by sensing the local density of Rac1 [37]. From the results demonstrated in this study, along with previously reported molecular interactions that govern branched actin formation downstream of Rac1, a multi-step process can be envisaged. Photoactivation of Rac1 triggers Arp2/3-mediated actin branching, which is mediated through the WRC [48, 49]. However, Arp2/3’s mediation and suggested role in dictating ruffle morphology would require time for further molecular rearrangements in specific patterns [18]. A study complementary to ours, where the authors use single particle tracking of Rac1 coupled with optogenetic activation of Rac1 (albeit, indirect, using Tiam1 recruitment to membrane) demonstrates that activated Rac1 immobilizes at the protrusion tip [50]. With actin polymerization generating pushing forces against the membrane that can generate negative curvature, I-Bar protein IRSp53, which is known to interact with Rac1, and WAVE is recruited, which positively reinforces the protrusion geometry [25, 51, 52]. This positive feedback loop of curvature seeded by stimulated PA-Rac1 promoting I-Bar sensing would presumably enable sustained activation of Rac1. However, the extent of this reinforcement via IRSp53 may potentially be limited by a recently described mode of action of the I-Bar protein. The mechanism entails IRSp53 forming a higher order oligomer structure to enhance favourable protrusion geometry a process which may also present a threshold. Taken together, a complex interplay between the membrane tension, polymerization forces of actin and organization of the branched actin meshwork through PA-Rac1-IRSp53-Wave-Arp2/3, positive feedback to reinforce protrusion geometry and Rac1-WRC activation kinetics is envisaged that leads to generation of lamellar protrusion (Fig. 6). This complex interaction cycle is sustained as long as PA-Rac1 is active and the local concentration of active Rac1 is constantly maintained. This organizational architecture is maintained at least for a few minutes even after switching off the photoactivation laser, which results in re-initiation of protrusion upon re-activating PA-Rac1. As has been highlighted, it is clear that polymerization events and ruffle formation is a complex, multifaceted process whereby the multitude of events imposes a time-based limitation, attributing for the lack of ruffling under a discontinuous excitation mode. Our approach will be valuable to decipher the roles of other molecular effectors of the acto-myosin protrusion machinery such as Cdc42, formins and specific myosins [53].

Summary figure of threshold-based assembly of lamellar ruffles generated by PA-Rac1


شاهد الفيديو: أسرار الغشاء الخلوى قنوات الايون نوبل الطب 1991 (سبتمبر 2022).