معلومة

لماذا يوجد تسلسل N بعد Sanger؟

لماذا يوجد تسلسل N بعد Sanger؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

بعد إرسال عينة DNA للتسلسل ، كان التسلسل الناتج يحتوي على N في بداية ونهاية التسلسل. أعلم أن حرف N يعني أن الكمبيوتر لا يمكنه معرفة ما هو الزوج الأساسي ، ولكن لماذا هذا؟


عادةً ما يحدث تسلسل Sanger مع بعض الأخطاء. في بعض الأحيان تتداخل الآثار كما هو موضح أدناه باللون الأحمر وسيتصل الكمبيوتر بـ N. إذا كنت تريد حقًا معرفة القيمة الأساسية الصحيحة ، فيمكنك إلقاء نظرة على التتبع.


كما ذكرت بدقة ، فإن قواعد N في بيانات التسلسل تعني عمومًا أن البرنامج غير قادر على تحديد القاعدة. قد تظهر قواعد N في بداية نتيجة التسلسل لعدد من الأسباب. أحد الأسباب هو تنقية المنتج المضخم قبل الرحلان الكهربائي. قد تترك الأملاح في العينة أو التنقية السيئة صبغات زائدة في العينة وتظهر على شكل "نقاط صبغية". سبب آخر هو أن البرنامج ربما بدأ التحليل في وقت مبكر جدًا قبل أن يبدأ التسلسل الدقيق. عادة ، تبدأ بيانات تسلسل الجودة 30 قاعدة من التمهيدي. يمكن أن تكون قواعد N في نهاية التسلسل ببساطة نهاية بيانات التسلسل كما هو مذكور سابقًا. تشمل الأسباب الأخرى حلقات دبوس الشعر ومناطق القاعدة المتعددة التي تسبب الإنهاء المبكر. أفضل طريقة لتحديد السبب هي إلقاء نظرة على بيانات التتبع.


تسلسل سانجر

تسلسل سانجر

تسلسل سانجر هو عملية الدمج الانتقائي للديديوكسينوكليوتيدات المنتهية بالسلسلة بواسطة بوليميراز الحمض النووي أثناء تكرار الحمض النووي في المختبر ، وهي الطريقة الأكثر استخدامًا للكشف عن SNVs. نظرًا لأن كلا من أليلات موضع جسمي جسمي يتم تسلسلهما بشكل متزامن ويتم عرضهما على شكل مخطط كهربية تماثلية ، فإن تسلسل سانجر غير قادر على اكتشاف أليلات الفسيفساء أقل من 15-20٪ (Rohlin et al. ، 2009) ويمكن أن يفوت نسبة كبيرة من انخفاض طفرات الفسيفساء ذات المستوى (Jamuar et al. ، 2014). بالإضافة إلى ذلك ، فإن طفرات الفسيفساء في كسور الأليل الأعلى هي "خط جرثومي" خطأ ، مما يسلط الضوء على قيود تسلسل سانجر في اكتشاف الفسيفساء على طرفي الطيف (Jamuar et al. ، 2014).


محتويات

ولد فريدريك سانجر في 13 أغسطس 1918 في Rendcomb ، وهي قرية صغيرة في جلوسيسترشاير ، إنجلترا ، وهو الابن الثاني لفريدريك سانجر ، وهو ممارس عام ، وزوجته سيسيلي سانجر (ني كرودسون). [5] كان واحدًا من ثلاثة أطفال. كان شقيقه ، ثيودور ، أكبر منه بسنة واحدة فقط ، بينما كانت أخته مي (ماري) تصغره بخمس سنوات. [6] عمل والده كمبشر طبي أنجليكاني في الصين لكنه عاد إلى إنجلترا بسبب اعتلال صحته. كان يبلغ من العمر 40 عامًا في عام 1916 عندما تزوج سيسلي التي كانت تصغرها بأربع سنوات. تحول والد سانغر إلى Quakerism بعد فترة وجيزة من ولادة ولديه وتربية الأطفال على أنهم الكويكرز. كانت والدة سانغر ابنة أحد مصنعي القطن الثريين ولديها خلفية من الكويكرز ، لكنها لم تكن من الكويكرز. [6]

عندما كان سنجر يبلغ من العمر خمس سنوات تقريبًا ، انتقلت العائلة إلى قرية تانوورث إن أردن الصغيرة في وارويكشاير. كانت الأسرة ثرية بشكل معقول وكانت تعمل مربية لتعليم الأطفال. في عام 1927 ، في سن التاسعة ، تم إرساله إلى مدرسة داونز ، وهي مدرسة إعدادية سكنية يديرها الكويكرز بالقرب من مالفيرن. كان شقيقه ثيو يسبقه بسنة في نفس المدرسة. في عام 1932 ، عندما كان يبلغ من العمر 14 عامًا ، تم إرساله إلى مدرسة Bryanston التي تم إنشاؤها مؤخرًا في دورست. استخدم هذا نظام دالتون وكان له نظام أكثر ليبرالية كان سانجر يفضله كثيرًا. في المدرسة كان يحب أساتذته وكان يستمتع بشكل خاص بالمواد العلمية. [6] كان سانجر قادرًا على إكمال شهادة مدرسته قبل عام ، حيث حصل على سبعة اعتمادات ، وكان قادرًا على قضاء معظم سنته الدراسية الأخيرة في التجارب في المختبر جنبًا إلى جنب مع أستاذ الكيمياء جيفري أورديش ، الذي درس في الأصل في جامعة كامبريدج وكان باحثًا في مختبر كافنديش. أحدث العمل مع Ordish تغييرًا منعشًا من الجلوس ودراسة الكتب وأيقظ رغبة Sanger في ممارسة مهنة علمية. [7] في عام 1935 ، قبل التوجه إلى الكلية ، تم إرسال سانجر إلى شول شلوس سالم في جنوب ألمانيا في برنامج التبادل. ركزت المدرسة بشدة على ألعاب القوى ، مما جعل سانجر أكثر تقدمًا في مادة الدورة مقارنة بالطلاب الآخرين. لقد صُدم عندما علم أنه بدأ كل يوم بقراءات من كتاب هتلر كفاحي ، تليها تحية Sieg Heil. [8]

في عام 1936 ، ذهب سانجر إلى كلية سانت جون بكامبريدج لدراسة العلوم الطبيعية. كان والده قد التحق بنفس الكلية. بالنسبة للجزء الأول من Tripos ، أخذ دورات في الفيزياء والكيمياء والكيمياء الحيوية والرياضيات لكنه واجه صعوبات في الفيزياء والرياضيات. درس العديد من الطلاب الآخرين المزيد من الرياضيات في المدرسة. في سنته الثانية استبدل الفيزياء بعلم وظائف الأعضاء. استغرق ثلاث سنوات للحصول على الجزء الأول. بالنسبة للجزء الثاني ، درس الكيمياء الحيوية وحصل على مرتبة الشرف من الدرجة الأولى. كانت الكيمياء الحيوية قسمًا جديدًا نسبيًا أسسه جولاند هوبكنز مع محاضرين متحمسين من بينهم مالكولم ديكسون وجوزيف نيدهام وإرنست بالدوين. [6]

توفي والديه بسبب السرطان خلال أول عامين له في كامبريدج. كان والده في الستين من عمره ووالدته في الثامنة والخمسين. وبصفته طالبًا جامعيًا ، تأثرت معتقدات سانغر بشدة بتربيته في الكويكرز. كان من دعاة السلام وعضوا في اتحاد تعهد السلام. من خلال مشاركته مع مجموعة كامبريدج للعلماء المناهضين للحرب ، التقى بزوجته المستقبلية ، جوان هاو ، التي كانت تدرس الاقتصاد في كلية نيونهام. كانوا يتوددون بينما كان يدرس لامتحانات الجزء الثاني وتزوجوا بعد تخرجه في ديسمبر 1940. سانجر ، على الرغم من نشأته وتأثره بتربيته الدينية ، إلا أنه بدأ في وقت لاحق يتجاهل طرقه المتعلقة بالكويكر. بدأ يرى العالم من خلال عدسة أكثر علمية ، ومع نمو أبحاثه وتطوره العلمي ابتعد ببطء عن الإيمان الذي نشأ معه. ليس لديه سوى احترام الدين ويصرح أنه أخذ منه شيئين ، الحقيقة واحترام كل الحياة. [9] بموجب قانون التدريب العسكري لعام 1939 ، تم تسجيله مؤقتًا كمستنكف ضميريًا ، ومرة ​​أخرى بموجب قانون الخدمة الوطنية (القوات المسلحة) لعام 1939 ، قبل أن يتم منحه إعفاء غير مشروط من الخدمة العسكرية من قبل محكمة. في غضون ذلك ، أجرى تدريبًا في أعمال الإغاثة الاجتماعية في مركز كويكر ، Spicelands ، ديفون وعمل لفترة وجيزة كمستشفى منظم. [6]

بدأ سانجر الدراسة للحصول على الدكتوراه في أكتوبر 1940 تحت إشراف N.W. "بيل" بيري. كان مشروعه هو التحقيق فيما إذا كان يمكن الحصول على البروتين الصالح للأكل من العشب. بعد أكثر من شهر بقليل ، غادر بيري القسم وأصبح ألبرت نويبرجر مستشاره. [6] قام سانجر بتغيير مشروعه البحثي لدراسة التمثيل الغذائي لليسين [10] ومشكلة أكثر عملية تتعلق بالنيتروجين في البطاطس. [11] كان عنوان أطروحته ، "استقلاب الحمض الأميني ليسين في جسم الحيوان". تم فحصه من قبل تشارلز هارينغتون وألبرت تشارلز شيبنال وحصل على الدكتوراه في عام 1943. [6]

تحرير الأنسولين التسلسلي

انتقل Neuberger إلى المعهد الوطني للبحوث الطبية في لندن ، ولكن Sanger بقي في كامبريدج وفي عام 1943 انضم إلى مجموعة تشارلز شيبنال ، كيميائي البروتين الذي تولى مؤخرًا كرسي قسم الكيمياء الحيوية. [12] كان شيبنال قد قام بالفعل ببعض العمل على تكوين الأحماض الأمينية للأنسولين البقري [13] واقترح أن ينظر سانجر إلى المجموعات الأمينية في البروتين. يمكن شراء الأنسولين من سلسلة الصيدليات Boots وكان أحد البروتينات القليلة جدًا التي كانت متوفرة في شكل نقي. حتى هذا الوقت كان سانجر يمول نفسه. في مجموعة شيبنال ، تلقى في البداية دعمًا من مجلس البحوث الطبية ، ثم من عام 1944 حتى عام 1951 من قبل زمالة بيت التذكارية للأبحاث الطبية. [5]

كان أول انتصار لسانغر هو تحديد التسلسل الكامل للأحماض الأمينية لسلسلتي عديد الببتيد من الأنسولين البقري A و B في عامي 1952 و 1951 على التوالي. [14] [15] قبل ذلك كان من المفترض على نطاق واسع أن البروتينات كانت غير متبلورة إلى حد ما. في تحديد هذه التسلسلات ، أثبت سانجر أن البروتينات لها تركيبة كيميائية محددة. [6]

للوصول إلى هذه النقطة ، صقل سانجر طريقة كروماتوغرافيا التقسيم التي طورها ريتشارد لورنس ميلينجتون سينج وآرتشر جون بورتر مارتن لتحديد تكوين الأحماض الأمينية في الصوف. استخدم سانجر كاشفًا كيميائيًا 1-fluoro-2،4-dinitrobenzene (يُعرف الآن أيضًا باسم كاشف سانغر ، فلورودينيتروبنزين ، FDNB أو DNFB) ، مصدره أبحاث الغازات السامة من قبل برنارد تشارلز سوندرز في قسم الكيمياء في جامعة كامبريدج. أثبت كاشف سانجر فعاليته في وسم المجموعة الأمينية N-terminal في أحد طرفي سلسلة البولي ببتيد. [16] ثم قام بتحليل الأنسولين جزئيًا إلى ببتيدات قصيرة ، إما باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو باستخدام إنزيم مثل التربسين. تم تجزئة خليط الببتيدات إلى بعدين على ورقة من ورق الترشيح ، أولاً عن طريق الرحلان الكهربي في أحد الأبعاد ، ثم عموديًا على ذلك ، عن طريق اللوني في الآخر. انتقلت شظايا الببتيد المختلفة من الأنسولين ، التي تم الكشف عنها باستخدام النينهيدرين ، إلى مواضع مختلفة على الورق ، مما أدى إلى إنشاء نمط مميز أطلق عليه سانجر "بصمات الأصابع". يمكن التعرف على الببتيد من الطرف N من خلال اللون الأصفر الذي تم نقله بواسطة ملصق FDNB وهوية الحمض الأميني المسمى في نهاية الببتيد المحدد بواسطة التحلل المائي للحمض الكامل واكتشاف أي حمض أميني ثنائي نتروفينيل كان موجودًا. [6]

من خلال تكرار هذا النوع من الإجراءات ، تمكن سانجر من تحديد تسلسل العديد من الببتيدات المتولدة باستخدام طرق مختلفة للتحليل المائي الجزئي الأولي. يمكن بعد ذلك تجميعها في تسلسلات أطول لاستنتاج البنية الكاملة للأنسولين. أخيرًا ، نظرًا لأن السلاسل A و B غير نشطة من الناحية الفسيولوجية بدون روابط ثاني كبريتيد الرابطة الثلاثة (سلسلتان متداخلتان ، وسلسلة واحدة داخل سلسلة A) ، حدد سانجر وزملاؤه مهامهم في عام 1955. [17] [18] وكان الاستنتاج الرئيسي لسانغر هو أن البولي ببتيد تحتوي سلاسل بروتين الأنسولين على تسلسل دقيق للأحماض الأمينية ، وبالتالي ، كان لكل بروتين تسلسل فريد. كان هذا الإنجاز هو الذي أكسبه أول جائزة نوبل في الكيمياء عام 1958. [19] كان هذا الاكتشاف حاسمًا لفرضية التسلسل اللاحقة لكريك لتطوير أفكار حول كيفية تشفير الحمض النووي للبروتينات. [20]

تسلسل تحرير الحمض النووي الريبي

منذ عام 1951 ، كان سانجر عضوًا في الطاقم الخارجي لمجلس البحوث الطبية [5] وعندما افتتحوا مختبر البيولوجيا الجزيئية في عام 1962 ، انتقل من مختبراته في قسم الكيمياء الحيوية بالجامعة إلى الطابق العلوي من المبنى الجديد . أصبح رئيس قسم كيمياء البروتين. [6]

قبل انتقاله ، بدأ سانجر في استكشاف إمكانية تسلسل جزيئات الحمض النووي الريبي ، وبدأ في تطوير طرق لفصل شظايا الريبونوكليوتيد المتولدة من نوكليازات معينة. قام بهذا العمل أثناء محاولته تحسين تقنيات التسلسل التي طورها أثناء عمله على الأنسولين. [20]

كان التحدي الرئيسي في العمل هو العثور على قطعة نقية من الحمض النووي الريبي لتسلسلها. في سياق العمل الذي اكتشفه في عام 1964 ، مع Kjeld Marcker ، فورميل ميثيونين tRNA الذي يبدأ تخليق البروتين في البكتيريا. [21] تعرض للضرب في السباق ليكون أول من قام بتسلسل جزيء الحمض الريبي النووي النقال بواسطة مجموعة بقيادة روبرت هولي من جامعة كورنيل ، الذي نشر تسلسل 77 ريبونوكليوتيد من ألانين الحمض الريبي النووي النقال من خميرة الخميرة في عام 1965. [22] بحلول عام 1967 ، حددت مجموعة سانغر تسلسل النيوكليوتيدات للحمض النووي الريبوزي 5S من الإشريكية القولونية، وهو RNA صغير من 120 نيوكليوتيد. [23]

تسلسل تحرير الحمض النووي

ثم تحول سانجر إلى تسلسل الحمض النووي ، الأمر الذي يتطلب نهجًا مختلفًا تمامًا. لقد نظر في طرق مختلفة لاستخدام DNA polymerase I من بكتريا قولونية لنسخ الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل. [24] في عام 1975 ، نشر مع آلان كولسون إجراء تسلسل باستخدام بوليميريز الحمض النووي مع نيوكليوتيدات موسومة إشعاعيًا أطلق عليها تقنية "زائد وناقص". [25] [26] تضمن ذلك طريقتين مترابطتين بشكل وثيق ولدت أليغنوكليوتيدات قصيرة مع نهايات محددة 3 '. يمكن تجزئة هذه بواسطة الرحلان الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد وتصور باستخدام التصوير الشعاعي الذاتي. يمكن لهذا الإجراء تسلسل ما يصل إلى 80 نيوكليوتيد دفعة واحدة وكان تحسنًا كبيرًا عما حدث من قبل ، لكنه كان لا يزال شاقًا للغاية. ومع ذلك ، كانت مجموعته قادرة على تسلسل معظم النيوكليوتيدات البالغ عددها 5386 نيوكليوتيد من العاثيات أحادية السلسلة φX174. [27] كان هذا أول جينوم قائم على الحمض النووي متسلسلًا بالكامل. ولدهشتهم اكتشفوا أن مناطق الترميز لبعض الجينات متداخلة مع بعضها البعض. [3]

في عام 1977 ، قدم سانجر وزملاؤه طريقة إنهاء السلسلة "ديديوكسي" لتسلسل جزيئات الحمض النووي ، والمعروفة أيضًا باسم "طريقة سانجر". [26] [28] كان هذا اختراقًا كبيرًا سمح بتسلسل امتدادات طويلة من الحمض النووي بسرعة وبدقة. حصل على جائزة نوبل الثانية له في الكيمياء عام 1980 ، والتي تقاسمها مع والتر جيلبرت وبول بيرج. [29] تم استخدام الطريقة الجديدة من قبل سانجر وزملاؤه لتسلسل الحمض النووي البشري للميتوكوندريا (16569 زوجًا قاعديًا) [30] وجراثيم λ (48502 زوجًا قاعديًا). [31] تم استخدام طريقة dideoxy في النهاية لتسلسل الجينوم البشري بأكمله. [32]

طلاب الدراسات العليا تحرير

خلال مسيرته المهنية ، أشرف سانجر على أكثر من عشرة طلاب دكتوراه ، فاز اثنان منهم أيضًا بجوائز نوبل. كان أول طالب دراسات عليا له هو رودني بورتر الذي انضم إلى مجموعة البحث في عام 1947. [3] تقاسم بورتر لاحقًا جائزة نوبل عام 1972 في علم وظائف الأعضاء أو الطب مع جيرالد إيدلمان لعمله على التركيب الكيميائي للأجسام المضادة. [33] درست إليزابيث بلاكبيرن للحصول على الدكتوراه في مختبر سانغر بين عامي 1971 و 1974. [3] [34] شاركت في جائزة نوبل لعام 2009 في علم وظائف الأعضاء أو الطب مع كارول دبليو جريدر وجاك دبليو زوستاك عن عملها في التيلوميرات و عمل تيلوميراز. [35]

الجوائز والتكريمات تحرير

اعتبارًا من عام 2015 [تحديث] ، سانجر هو الشخص الوحيد الذي حصل على جائزة نوبل في الكيمياء مرتين ، وواحد من أربعة فقط من الحائزين على جائزة نوبل مرتين: الثلاثة الآخرون هم ماري كوري (الفيزياء ، 1903 والكيمياء ، 1911) ، لينوس بولينج (الكيمياء ، 1954 والسلام ، 1962) وجون باردين (مرتين فيزياء ، 1956 و 1972). [4]

  • زميل منتخب في الجمعية الملكية (FRS) عام 1954 [3] - 1963 [3] - 1981 [3] - 1986 [3]
  • زميل مراسل في الأكاديمية الأسترالية للعلوم - 1982 [3] - 1976 [3] - 1958 ، 1980 [19] [29] - 1951 [3] - 1969 [3] - 1971 [3] - 1977 [3]
  • غيغاواط. جائزة ويلاند - 1978 [3] جامعة كولومبيا - 1979 [3] - 1979 [3] جائزة - 1994 [36]
  • جائزة الصفيحة الذهبية للأكاديمية الأمريكية للإنجاز - 2000 [37] [38]
  • جائزة الاختراق الكيميائي من قسم تاريخ الكيمياء بالجمعية الكيميائية الأمريكية - 2016 [39] [40] [41]

معهد ويلكوم ترست سانجر (المعروف سابقًا باسم مركز سانجر) على شرفه. [3]

الزواج والأسرة تحرير

تزوج سانجر من مارجريت جوان هاو (يجب عدم الخلط بينه وبين مارغريت سانجر) في عام 1940. وتوفيت في عام 2012. وأنجبا ثلاثة أطفال - روبن ، مواليد 1943 ، بيتر ولد في عام 1946 وسالي جوان من مواليد 1960. [5] قال ذلك كانت زوجته قد "ساهمت في عمله أكثر من أي شخص آخر من خلال توفير منزل يسوده السلام والسعادة." [42]

في وقت لاحق تحرير الحياة

تقاعد سانجر في عام 1983 ، عن عمر يناهز 65 عامًا ، في منزله "Far Leys" في Swaffham Bulbeck خارج كامبريدج. [3]

في عام 1992 ، أسس Wellcome Trust ومجلس البحوث الطبية مركز Sanger (الآن معهد Sanger) ، الذي سمي باسمه. [43] المعهد موجود في حرم ويلكوم ترست جينوم الجامعي بالقرب من هينكستون ، على بعد أميال قليلة من منزل سانغر. ووافق على تسمية المركز باسمه عندما سأله جون سولستون ، المدير المؤسس ، لكنه حذر من أنه "من الأفضل أن يكون جيدًا". [43] تم افتتاحه من قبل سانجر شخصيًا في 4 أكتوبر 1993 ، مع طاقم من أقل من 50 شخصًا ، واستمر في القيام بدور رائد في تسلسل الجينوم البشري. [43] المعهد الآن [ عندما؟ ] لديها أكثر من 900 شخص وهي واحدة من أكبر مراكز أبحاث الجينوم في العالم.

قال سانجر إنه لم يجد دليلاً على وجود إله لذلك أصبح ملحدًا. [44] في مقابلة نشرت في مرات نُقلت صحيفة سانجر عام 2000 قولها: "كان والدي ملتزمًا من جماعة الكويكرز ، وقد نشأت ككويكر ، والحقيقة مهمة جدًا بالنسبة لهم. لقد ابتعدت عن تلك المعتقدات - من الواضح أن المرء يبحث عن الحقيقة ، لكن المرء يحتاج بعض الأدلة على ذلك. حتى لو أردت أن أؤمن بالله سأجده صعبًا للغاية. سأحتاج إلى رؤية الدليل ". [45]

لقد رفض عرض وسام الفروسية ، لأنه لم يرغب في أن يُطلق عليه لقب "سيدي". نُقل عنه قوله: "الفروسية تجعلك مختلفًا ، أليس كذلك ، ولا أريد أن أكون مختلفًا." في عام 1986 قبل القبول في وسام الاستحقاق ، والذي لا يمكن أن يضم سوى 24 عضوًا على قيد الحياة. [42] [44] [45]

في عام 2007 ، حصلت الجمعية البريطانية للكيمياء الحيوية على منحة من Wellcome Trust لفهرسة وحفظ 35 دفتر ملاحظات معمل سجل فيها سانجر بحثه من عام 1944 إلى عام 1983. وعند الإبلاغ عن هذا الأمر ، علم أشار إلى أن سانجر ، "أكثر شخص يمكن أن تأمل في مقابلته" ، كان يقضي وقته في البستنة في منزله في كامبردجشاير. [46]

توفي سانجر أثناء نومه في مستشفى أدينبروك في كامبريدج في 19 نوفمبر 2013. [42] [47] كما هو مذكور في نعيه ، فقد وصف نفسه بأنه "مجرد شاب عابث في المختبر" ، [48] و "أكاديميًا" ليس رائعا ". [49]


لماذا يوجد تسلسل N بعد Sanger؟ - مادة الاحياء

ملخص المقال:

تسلسل الصاعقة / طريقة إنهاء السلسلة لتسلسل الحمض النووي
المؤلفون: راجاني فيرما 1 و م. جاكر 2
1 قسم تربية النبات وعلم الوراثة ، SKNAU ، Jobner 303329 (راج) (الهند)
2 أستاذ ورئيس قسم تربية النبات وعلم الوراثة ، SKNAU ، جوبنر 303329 (راج) (الهند)

ما هو تسلسل الحمض النووي

يشير تسلسل الحمض النووي إلى عملية تسجيل التسلسل الدقيق للنيوكليوتيدات في جزء DNA من كائن حي يتوافق مع جين معين. التسلسل الجيني هو عملية لتحديد ترتيب النيوكليوتيدات لجزء معين من الحمض النووي ، يسمى تسلسل الحمض النووي. تسلسل الحمض النووي هو عملية تحديد تسلسل قواعد النوكليوتيدات (As و Ts و Cs و Gs) في قطعة من الحمض النووي.

النقاط الرئيسية المتعلقة بتسلسل الحمض النووي:

  1. يعتبر تسلسل الحمض النووي مفيدًا في كل من البحوث الأساسية والتطبيقية في العلوم البيولوجية وخاصة في علم الأحياء الجزيئي.
  2. يمكن إجراء التسلسل الجيني لجين معين وكذلك للجينوم بأكمله.
  3. تعتبر معرفة تسلسل الحمض النووي مفيدة جدًا في العلوم الطبية. يمكن استخدامه لتحديد وتشخيص وعلاج الأمراض الوراثية.
  4. في النباتات ، ستساعد معرفة تسلسل الجينات في السيطرة على المرض وتحسين جودة المنتج ومقاومة الضغوط الحيوية وغير الحيوية.
  5. يشار إلى تسلسل الحمض النووي أيضًا باسم التسلسل الجيني أو تسلسل النوكليوتيدات.

مكونات تسلسل سانجر:

  • قالب DNA المراد تسلسله
  • إنزيم بوليميريز DNA
  • أ التمهيدي، وهو عبارة عن قطعة قصيرة من الحمض النووي أحادي الخيط الذي يرتبط بقالب الحمض النووي ويعمل بمثابة "بداية" للبوليميراز
  • نيوكليوتيدات الحمض النووي الأربعة (dATP ، dTTP ، dCTP ، dGTP)
  • Dideoxy أو سلسلة إنهاء، إصدارات من جميع النيوكليوتيدات الأربعة (ddATP ، ddTTP ، ddCTP ، ddGTP) ، كل منها مُسمى بلون مختلف من الصبغة

طريقة تسلسل سانجر يتم دمج عينة الحمض النووي المراد ترتيب تسلسلها في أنبوب مع مادة أولية ، وبوليميراز DNA ، ونيوكليوتيدات الحمض النووي (dATP ، و dTTP ، و dGTP ، و dCTP). تضاف أيضًا النيوكليوتيدات الأربعة الموصوفة بصبغة ، والتي تنتهي بالسلسلة ، ولكن بكميات أقل بكثير من النيوكليوتيدات العادية.

يُسخن الخليط أولاً لإفساد قالب الحمض النووي (افصل الخيوط) ، ثم يتم تبريده بحيث يمكن أن يرتبط التمهيدي بالقالب أحادي الجديلة. بمجرد أن يلتصق التمهيدي ، ترتفع درجة الحرارة مرة أخرى ، مما يسمح لبوليميراز الحمض النووي بتخليق الحمض النووي الجديد بدءًا من التمهيدي. سيستمر بوليميراز الحمض النووي في إضافة النيوكليوتيدات إلى السلسلة حتى يحدث إضافة نيوكليوتيد ثنائي أوكسي بدلاً من النيوكليوتيدات العادية. عند هذه النقطة ، لا يمكن إضافة المزيد من النيوكليوتيدات ، لذلك سينتهي الخيط بنوكليوتيد ديديوكسي.

تتكرر هذه العملية في عدد من الدورات. بحلول الوقت الذي تكتمل فيه عملية التدوير ، يكون مضمونًا فعليًا أنه سيتم دمج نيوكليوتيد ثنائي أوكسي في كل موضع فردي من الحمض النووي المستهدف في تفاعل واحد على الأقل. أي أن الأنبوب سيحتوي على شظايا ذات أطوال مختلفة ، تنتهي عند كل موضع من مواضع النيوكليوتيدات في الحمض النووي الأصلي (انظر الشكل أدناه). ستتم تسمية نهايات الشظايا بأصباغ تشير إلى نيوكليوتيداتها النهائية.


(مصدر الصورة: https://universe-review.ca/R11-16-DNAsequencing.htm)

بعد الانتهاء من التفاعل ، يتم تمرير الشظايا عبر أنبوب رفيع طويل يحتوي على مادة أساس هلامية في عملية تسمى الرحلان الكهربائي للهلام الشعري. تتحرك الأجزاء القصيرة بسرعة عبر مسام الهلام ، بينما تتحرك الأجزاء الطويلة ببطء أكبر. نظرًا لأن كل جزء يعبر & # 8220 خط النهاية & # 8221 في نهاية الأنبوب ، فإنه يضيء بواسطة الليزر ، مما يسمح باكتشاف الصبغة المرفقة. أصغر جزء (ينتهي فقط نوكليوتيد واحد بعد التمهيدي) يعبر خط النهاية أولاً ، متبوعًا بالجزء الأصغر التالي (ينهي اثنين من النيوكليوتيدات بعد التمهيدي) ، وهكذا دواليك. وهكذا ، من خلال ألوان الأصباغ المسجلة واحدة تلو الأخرى على الكاشف ، يمكن بناء تسلسل القطعة الأصلية من الحمض النووي نيوكليوتيد واحد في كل مرة. تتكون البيانات المسجلة بواسطة الكاشف من سلسلة من القمم في شدة التألق. يُقرأ تسلسل الحمض النووي من القمم الموجودة في مخطط التسلسل.

  1. يمكن أيضًا تلدين مادة التمهيدي المستخدمة إلى موقع ثانٍ. سيؤدي هذا إلى تسلسلين للتفسير في نفس الوقت.
  2. في وقت ما يلوث الحمض النووي الريبي التفاعل ، والذي يمكن أن يعمل مثل التمهيدي ويؤدي إلى نطاقات في جميع الممرات على الإطلاق بسبب فتيلة غير محددة.
  3. يمكن أن يؤدي التركيب الثانوي للحمض النووي الذي تتم قراءته بواسطة بوليميراز الحمض النووي إلى مشكلة في القراءة.
  4. يمكنه تسلسل طول قصير فقط من الحمض النووي في المرة الواحدة. يمكنه تسلسل بحد أقصى حوالي 1000 زوج أساسي.

حول المؤلف / معلومات إضافية:
أسعى حاليًا للحصول على درجة الدكتوراه في تربية النباتات وعلم الوراثة من جامعة SKNAU ، JOBNER ، JAIPUR.

إخلاء مسؤولية هام: جميع المقالات الموجودة على هذا الموقع هي معلومات عامة فقط وليست نصيحة احترافية أو خبراء. لا نتحمل أي مسؤولية عن صحة أو صحة المعلومات الواردة في هذه المقالة ، أو أي خسارة أو إصابة ناتجة عن ذلك. نحن لا نصادق على هذه المقالات ، ولسنا تابعين لمؤلفي هذه المقالات ولسنا مسؤولين عن محتواها. يرجى الاطلاع على قسم إخلاء المسؤولية للحصول على الشروط الكاملة.


1. يمكنك استخدام أي من البرامج التالية لعرض ملف chromatogram .ab1 الخاص بك

2. يجب أن ترى قممًا فردية وحادة ومتباعدة بشكل متساوٍ

3. توقع الحصول على 500-700 قاعدة لتسلسل DNA موثوق ونظيف

أي شيء أقل من ذلك وقد تشك في وجود تلوث في عينتك أو تفكر في مطالبة مرفق التسلسل الخاص بك بتطبيق بروتوكول خاص لقالب صعب. أي شيء أكثر وأنت تغامر في التضاريس غير المؤكدة.

4. لا تثق أبدًا في أول 20-30 قاعدة لقراءة تسلسل الحمض النووي

عادةً ما تكون القمم هنا صغيرة وغير محلولة ، لذلك أقترح تصميم التمهيدي الخاص بك على الأقل 50 نقطة أساس في المنبع لتسلسل الاهتمام.

5. استخدم عمود دوران السيليكا لتنقية العينات التي ترسلها لتسلسل الحمض النووي

إذا تطلبت منك منشأة التسلسل إجراء تفاعل تضخيم Big Dye PCR الخاص بك (بدلاً من استخدام الخدمة الشاملة التي تقدمها بعض الشركات) ، فيمكنك تنقية المنتج إما عن طريق طريقة ترسيب خلات الصوديوم / الأيزوبروبانول أو باستخدام عمود دوران السيليكا المتاح من عدة بائعين. طريقة الترسيب لها تأثير جانبي مؤسف لإفساد التفاعل حول القاعدة 70-75 من القراءة (انظر الصورة أدناه) ، لذلك أوصي بشدة باستخدام عمود تدور السيليكا. يمكن أن تكون باهظة الثمن ، لكنها تستحق ذلك.

6. قم بتحرير تسلسل الحمض النووي الخاص بك

أخيرًا ، عندما ترى ذروة خاطئة ، لا تخجل. لا تتردد في تحريره. تسمح لك معظم برامج عرض الكروماتوجرام (حتى البرامج المجانية) بتعديل التسلسل.

آمل أن تساعدك هذه النصائح في تحقيق أقصى استفادة من نتائج تسلسل الحمض النووي الخاص بك واستكشاف أي مشاكل قد تظهر. حظا سعيدا في تحليل التسلسلات الخاصة بك!

المزيد من موارد تسلسل الحمض النووي:

    شكرًا لك BitesizeBio على نشر هذا في الأصل والسماح لنا بمشاركته مع قرائنا!


سؤال وجواب: تأكيد نتائج تسلسل الجيل التالي مع سانجر

تريسي فونس
11 أكتوبر 2016

WIKIMEDIA ، BAINSCOU للأغراض السريرية ، استبدل تسلسل الجيل التالي (NGS) سلفه المنهجي ، تسلسل سانجر. إنه أسرع. إنه أرخص. ولكن هل تسلسل الجيل التالي وحده حساس ومحدد بما يكفي للقبض على كل متغير مرتبط بالمرض يصعب اكتشافه مع تجنب الإيجابيات الكاذبة؟

& ldquo هناك جدل كبير داخل مجتمع التشخيص فيما يتعلق بضرورة تأكيد مكالمات متغير NGS من خلال تسلسل Sanger ، مع الأخذ في الاعتبار أن العديد من المختبرات تشير إلى وجود خصوصية بنسبة 100 ٪ من بيانات NGS وحدها ، وكتب الرئيس التنفيذي لشركة Ambry Genetics ، آرون إليوت وزملاؤه في دراسة نشرت الأسبوع الماضي (6 أكتوبر) في مجلة التشخيص الجزيئي.

قام إليوت وزملاؤه بمحاكاة معدل إيجابي كاذب قدره صفر عند مقارنة نتائج 20000 سرطان وراثي وألواح NGS و mdash بما في ذلك 47 مرضًا-NGS وحده ، اكتشف الباحثون و ldquomissed [] اكتشاف 176 متغيرًا أكده سانجر ، معظمها في مناطق الجينوم المعقدة (n = 114) وطفرات الفسيفساء (ن = 7) ، & rdquo ذكرت في ورقتهم.

في مقابلة مع العالم، أعرب إليوت عن أسفه لعدم وجود إرشادات لمراقبة الجودة فيما يتعلق بطرق التسلسل التأكيدي بين مختبرات التشخيص.

العالم:ما الذي دفع هذا التحليل بالذات؟

آرون إليوت: النقاش داخل صناعة التشخيص بقدر الحاجة إلى تأكيد المتغيرات. كل نوع من أنواع المختبرات له موقفه الخاص بشأن ما إذا كان هناك حاجة إلى شيء مثل تأكيد Sanger. ويزداد الجدل احتدامًا حيث تقدم الشركات اختبارات أرخص وأرخص. مع استمرار انخفاض سعر الاختبار ، من الصعب جدًا الاحتفاظ بهذه الأساليب [التأكيدية]. . . . لذا فإن المعامل المختلفة تخرج بمواقف مختلفة بشأن الحاجة إلى القيام بذلك ، وفي الحقيقة أن [بعض] المختبرات تحاول ، بشكل أساسي ، الحصول على أسعار منخفضة للغاية.

أردنا العودة وإلقاء نظرة على بياناتنا الداخلية الخاصة حيث بدأنا الاختبار عن طريق Sanger - تأكيدًا لكل متغير تسلسلي من الجيل التالي غير حميدة - المتغيرات الخاصة بك ذات الأهمية غير المعروفة ، ومسببات الأمراض المحتملة والمتغيرات المسببة للأمراض. لقد فعلنا ذلك على 20000 عينة. . . . إن ما يقرب من 2 في المائة من الطفرات الحقيقية هو ما ستفتقده إذا لم تقم بتأكيد سانجر على الإطلاق.

في الأساس ، أظهرت النتائج أنه رقم واحد ، إذا لم تقم بتأكيد مكالمات Sanger على الإطلاق ، فأنت كذلك. . . ستقوم بالإبلاغ عن المكالمات الكاذبة ، أو إذا قمت بتعيين الحدود الخاصة بك بناءً على أرقام عينة منخفضة ، فستفقد مكالمات.

TS: لا يزال فريقك يكشف عن بعض النتائج الإيجابية الخاطئة ، وأشار إلى أن هذه "لم يتم توزيعها بالتساوي عبر جميع الجينات كما هو متوقع إذا كانت عشوائية أو مصنوعات تسلسلية."

AE: نظرنا إلى 47 جينًا في تلك 20000 عينة. والإيجابيات الكاذبة ليست موجودة في كل جين: لقد كانت في 20 من أصل 47 جينًا نظرنا إليها. وفوق كل ذلك ، توجد في مناطق جينومية محددة يصعب تسلسلها. لكن تلك هي المناطق الجينومية التي تحتوي أيضًا على طفرات حقيقية فيها أيضًا. لذا إذا كنت ستجري عملية تحقق من 1000 عينة - وهو تحقق كبير جدًا - ونظرت إلى نفس الجينات الـ 47 التي نظرنا إليها ، فسترى حوالي خمس إيجابيات خاطئة.

TS: لماذا لا توجد إرشادات للطرق التأكيدية؟

AE: الكثير من المعامل لا تريد أن تفعل ذلك. إنه سير عمل كامل في المختبر ، يكلف الكثير من المال. . . ويزيد من الوقت المستغرق في الاختبار بحوالي يومين إذا كان عليك تأكيد شيء ما. . . . هناك المزيد والمزيد من الضغط لإجراء هذه الاختبارات بشكل أسرع وأسرع وأرخص وأرخص.

TS: بعد تعديل تحليلاتك لمحاكاة النتائج الإيجابية الخاطئة الصفرية ، أبلغ فريقك عن فقد 2.2 في المائة من الطفرات ذات الصلة سريريًا. هل كان ذلك مفاجئًا على الإطلاق؟

AE: لم أكن أعتقد أنه كان مفاجئًا. تتمثل فلسفتنا في البدء بالمقايسة الأكثر حساسية ، وهي أكثر خطوط أنابيب المعلوماتية الحيوية حساسية التي يمكنك البدء بها عند بدء الاختبار ، الأمر الذي يتطلب المزيد من تأكيد Sanger. لكنه يسمح لك بالتقاط المزيد من الطفرات التي كنت ستفتقدها أو قد يتم تصفيتها. وخير مثال على ذلك هو طفرات الفسيفساء. في الدراسة ، كانت هناك سبع طفرات فسيفسائية كنا سنفتقدها إذا لم نكن دعوات تؤكد سانجر.

TS: تقترح أنت وزملاؤك حدود الجودة لشاشات التشخيص القائمة على التسلسل من الجيل التالي. بالنسبة إلى جميع الشاشات التي لا تتوافق مع هذه ، هل تنصح بالتأكيد عن طريق تسلسل Sanger أو طريقة أخرى؟

AE: نعم ، ليس بالضرورة أن يكون تأكيدًا من سانجر. هناك طرق أخرى يمكنك استخدامها. للحذف / الازدواجية ، يمكنك استخدام MLPA [تضخيم المجس المعتمد على الربط المتعدد] أو المصفوفة. يمكنك استخدام qPCR لاختبارات معينة. . . بالنسبة لأي شيء لا يلبي تلك الحدود المحددة ، يجب تأكيده.

لا يمكن تحديد هذه الحدود بدقة إلا إذا كان لديك عشرات الآلاف من العينات.

TS: أبلغت مجموعتك عن إنفاق 1.9 مليون دولار لتضمين تأكيد تسلسل Sanger لـ 20000 عينة. بالنظر إلى التكلفة الإضافية للفحص التأكيدي ، هل تعتقد أن مختبرات التشخيص الأخرى ستستجيب لتوصيات مجموعتك؟

AE: أنت تعرف ، لا أعرف. من الصعب القول. . . . بالتأكيد عندما تنظر إلى مختبرات التشخيص ، هناك بالتأكيد اختبار جودة متدرج مختلف. هناك مختبرات معينة نعتقد أنها ذات مستوى عالٍ تتجاوز الجودة ، ومن ثم يكون لديك مختبراتك الأرخص تكلفة. وهي مختبراتك الأرخص تكلفة التي تهدف نماذج أعمالها إلى خفض [تكلفة] الاختبارات الجينية ، ولكي تفعل ذلك ، تحتاج إلى التخلص من هذه الاختبارات الخاصة ، التي تحافظ على الحساسية عالية جدًا.

هذا النوع من الاختبارات - خاصة نوع الاختبار الذي تعتمد عليه هذه الورقة ، اختبار السرطان الوراثي - ليس هو الوقت المناسب للتغلب على المشكلة. يتخذ الناس قرارات كبيرة جدًا بناءً على هذه النتائج. . . . لا أعتقد أن هذا هو الوقت المناسب لمحاولة توفير بضع مئات من الدولارات من خلال عدم تأكيد مكالمات الجيل التالي المتسلسلة. تظهر البيانات أنه يجب القيام بذلك.

TS: ماذا تأمل أن تأتي من هذه الدراسة؟

AE: آمل أن ينظر الناس إلى دراسات مثل هذه وأن يفهموا أن جميع اختبارات التسلسل من الجيل التالي في السوق ليست متماثلة - فهي ليست متساوية. يحتاج الناس إلى فهم حقًا كيف تقوم الشركات باختبارها. يجب أن تتحلى الشركات بالشفافية فيما يتعلق بمراقبة الجودة التي تطبقها للاختبار.


ما هو تسلسل سانجر

تسلسل سانجر (SGS) هو أول جيل من طرق التسلسل التي طورها فريدريك سانجر في عام 1977. وهو يتضمن الدمج الانتقائي للديوكسينوكليوتيدات المنتهية بالسلسلة بواسطة بوليميراز الدنا أثناء في المختبر تكرار الحمض النووي . بعد ذلك ، يتم فصل الأمبليكون المنتجة عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري. بشكل عام ، يعمل تسلسل Sanger كطريقة تسلسل سريعة وفعالة من حيث التكلفة للمشاريع الصغيرة الحجم مع أهداف amplicon أقل من 100. علاوة على ذلك ، فمن الأفضل لتسلسل الجينات الفردية.

الشكل 1: تسلسل سانجر

علاوة على ذلك ، يعد تسلسل Sanger طريقة تمثيلية تولد تسلسلًا واحدًا من خلال دمج الإشارات من جميع أجزاء الحمض النووي في العينة. لا يسمح بعزل الإشارات الفردية. Thus, the resultant signal is a mixed-signal, which does not allow the identification of variants, which occur below 25% frequency in a sample.


الهيكل الثانوي

مشكلة:

Sharp drop or premature termination of sequencing signal during the sequencing run.

كيفية التعرف:

Sequencing signal drops off sharply or terminates before the end of the sequencing run (termination of sequencing signal also occurs with PCR products, depending on how long the PCR fragment is).

Cause:

Secondary structure in the template can cause various anomalies that result in inefficient chain elongation after the region of secondary structure.

Solution: Many of the same techniques used to eliminate compression can be helpful in obtaining good sequence data past regions of secondary structure. Although not always practical, changing sequencing chemistries can produce better results as well.

At Amplicon Express, we use strict protocols and internal quality controls to insure our reactions are as consistent as possible. Most often when there is trouble with the sequencing reaction, the cause lies with the DNA template itself, making it very important that the materials we sequence are of the highest quality possible. If you have further questions or need technical support, please contact us.


Module 1 : Synthetic Biology and Central Dogma

We discussed the chain termination method by Sanger’s technique. Now Sanger’s
technique is really beautiful, because it is based on a principle that you can terminate a
growing DNA chain by using a nucleoside which lacks the 3’-OHgroup.
Now the problem with this type of technique is that it is not very quick or rapid. Because,
first of all you need to have four lanes in the gel and then in one go, you can determine
up to 100 base sequences. Now, suppose you have millions of base pairs in the genome
من كائن حي.
So, it will a huge amount of time. It will take years, before you can really determine the
whole sequence of the genome. By the way genome is basically the complete DNA that
is present in an organism. Thus determination of the sequence of the entire genome is
very difficult using Sanger’s technique because of several limitations. الأول
limitation is that it can go up to only 100 (maximum) base sequences and then the

second one is more important that is that after everything is done, you have to run four
lanes for the electrophoresis. These are the two limitations there.
If you run four lanes your gel size will be more, your applied voltage has to be more. وبالتالي،
it may not be very economic. Thus, apart from time constrain, economy is also
الأهمية. So, people started looking at other ways using the same principle of
dideoxynucleoside triphosphate, but trying to do something which can work in one lane,
so that you do not have to do the four lane gels. So, four lane gels need to be replaced by
a single lane.
(Refer Slide Time: 03:33)

Now initially what was done? Initially the change that was brought in Sanger’s technique
was that the primer it was realized that radioactivity is one issue that people try to avoid
Both Maxam-Gilbert and Sanger’s technique used radioactive phosphorus. For Sanger’s
method the primer had the radioactivity.
So people thought that let us take a primer, which has got a fluorescent label at this end
and these fluorescent labels have different colors. Suppose one fluorescent label is red,
another is blue, another is green and the fourth one is deep violet. So, these are the four
fluorescent labels that are put at the end of the primer. Now what you do? You take that
strand for which, you want to know the sequence. Earlier there were four test tubes, now
also there are four test tubes. In one test tube, you add this primer. So, this primer will be
attached here. And suppose in your first test tube, you are adding ddATP, along with the

all the dNTPs and the DNA polymerase and magnesium. So, what will happen now?
Since you are adding ddATP, so the chain will terminate wherever there is requirement
of A.
Suppose the chain will terminate here and another chain will terminate here but the
interesting point is that whatever you, whatever truncated oligonucleotides are made
when there is requirement of dATP, and instead of that dATP, ddATP is taken they will
all have the same primer with this, dark violet fluorescent label.
So, in the first test tube, you added this primer you added ddATP. So, all the truncated
oligonucleotides will show this dark violet fluorescence. Now in another test tube what
you do? You do a very similar experiment. You take the primer which is having a green
fluorescent tag. In the second test tube, you are adding ddCTP.
So, then all the truncated oligonucleotides will have only green fluorescence containing
label, where ever there is a requirement of C. So, all that truncated pieces will all have
green fluorescence. Then in this third case, you take the blue fluorescent labeled primer
in another eppendorf and now you add ddGTP.
So, you know that for blue fluorescent labeled truncated oligonucleotides, showing blue
fluorescence, there must be G that is required at that point, because you are adding
dideoxy GTP there, and the fourth one is the red fluorescence, you add the ddTTP you
add the red fluorescent primer and then add the ddTTP.
So what is the outline? After doing all these, that in one test tube, wherever there is
truncation of A that piece will show this dark violet fluorescence wherever there is
truncation of C, that will show the green fluorescence wherever there is truncation of G,
that will show blue fluorescence and finally, wherever there is truncation of T, that we
show the red fluorescence.
So, after doing all these reactions in four test tubes, you mix all these four contents
سويا. Now, it will have pieces which will show dark violet fluorescence, green
fluorescence, blue fluorescence, red fluorescence. Suppose you now put everything
together on a gel and run the electrophoresis. This is an electrophoresis gel in a column,
you can load in a glass column and then you apply voltage.

So, all these pieces will now come down, because this will be the positive side. وبالتالي،
everything will come down and there is a laser camera which is aimed at this point and
then whatever color comes out, it will tell to the detector. This is the detector when the
laser hits a green fluorescent oligonucleotide, it records that colored fluorescent band.
So, now as we apply voltage, they will be slowly separated. How they will be separated?
That will depend on the length of the truncated oligonucleotide. Suppose you initially get
a green fluorescent band, followed by a blue, then suppose red and then suppose the dark
البنفسجي.
So, so you know the sequence of colors now you continue the gel electrophoresis. So as
the first band comes here, the detector records the color that goes away the second band
comes here, it records the color and then the third one comes and it records the color. وبالتالي،
you do not have to move the detector only these bands are moving and finally they come
خارج. Only thing that you should do is to detect the sequence of these colors and
depending on the sequence of these colors, you conclude the base sequence.
So, this is the actual picture that you will get that is the chromatogram that you will see.
And then from the color of these peaks, you can tell the sequence. Whenever you see a
green sequence, you know that must be coming from the test tube where you have used
the green primer. So, where you have used green primer? It has been used where you
have added the ddCTP. So, there must be a C here then.
Then for the blue primer, you have used a G, so that oligonucleotide must be having a G
and then you have a red. The red one implies TTP. So, you have a T and then for the
dark violet, you have used the ATP. So, like that, the sequence will be according to the
color, color sequence your base sequences will be determined. I hope this is clear.
To summarize this technique, you have to use four primers with different fluorescent
colors and then you have to do the reactions in different test tubes and you have to add
that ddATP like previously. In previous cases, Sanger used the same primer in all the
cases, because all are radioactive. Here the primers have different colors, the base
sequence in primers are same only the fluorescent, the 5’ OH is attached to a fluorescent
labels which give different colors. And then the steps are same you add ddATP in
addition to whatever else is required all the time and then ddATP, ddCTP. ddGTP and
ddTTP.

What is the difference between Sanger’s method and this technique? In this method, you
mix all these and you can run only a single lane gel electrophoresis. And then you detect
the color sequence, and depending on the fluorescent color sequence, you predict the
base sequence. In this method, light is required the laser detects fluorescence as it hits
the band and then this records that what is the color that is coming as the truncated
oligonucleotides migrate from here to there.
So, this is the next development after Sanger’s method. But then people again questioned
it that can we simplify it even further? Because one drawback of this method is that you
are doing the reactions in four test tubes or four eppendorfs. So, can we do the reaction in
one container and then do the sequence technique?
So, the next challenge is to do the reaction in only single eppendorf and then do a similar
kind of assay but if you use the primer of different colors, then you have to use different
test tubes or different eppendorfs. So, then somebody thought that the best way to do
these reactions in one test tube or one eppendorf is to you use the ddNTPs
(dideoxynucleoside triphosphate) having fluorescent labels NTP has a sugar and base
with lot of reactive nitrogens. So, what you can do? You can put fluorescent label in the
base of the dideoxynucleotide triphosphate and these fluorescent labels are different for
different bases.
(Refer Slide Time: 15:35)

That means now instead of the primer being colored differently, which means
fluorescently label differently, now the primer is same, but your dideoxy bases have
different colors. Suppose ddATP is colored with a red fluorescence. Then ddGTP, has
got a blue fluorescence. I am just arbitrarily giving some colors. Then you have ddCTP
has the green and ddTTP has the dark violet fluorescence. So, instead of putting the color
on the primer, now you put the fluorescent labels on the dideoxy nucleoside
triphosphates thus these labels are in the bases.
Fortunately the DNA polymerase does not discriminate it accepts the fluorescent tagged
ddNTP as a substrate, although the size is bigger because some of these fluorescent
labels are quite big, but the DNA polymerase is not that selective, it accepts even if the
base has some handle which is a fluorophoric handle. Now you can do the all the
reactions in the same test tube.
So, you have the primary sequence of DNA and you do the reaction that means, you are
adding all the dideoxy nucleotide triphosphates. So, this contains your DNA polymerase,
magnesium, the regular primer without the label, all the dNTPs and finally it contains all
the ddNTPs.
When you do the reaction, what will be the outcome? Now you will again have
truncation the oligonucleotide upon picking up a ddATP will be truncated. إذا كان
truncated portion is red that means, there was the requirement of A at that time. متي
the truncated piece is showing a blue fluorescence, that means, there was a requirement
of G at that time.
And then the green fluorescence means there was a requirement of C and then this violet
fluorescence indicate that a T is required. So, now, what will happen? You can do all the
reactions in the same test tube and again run the same single lane gel. Then you just
check the color of the bands that are coming through the column containing your agarose
gel.
So, by just checking the color sequences, you can immediately write the base sequence.
Now all these things are computerized. So, the computer will see the colors that are
constantly fed to the computer and the computer already knows that this color means this
base, so it will immediately write all the base sequences.

So Sanger used the radioactive primer, then the improvement was that using a primer
containing the fluorescent label, but that required the reactions to be done in different test
tubes or eppendorfs and then the subsequent development was doing the reaction in one
container (either the test tube or eppendorf), but using the deoxynucleoside triphosphates
which are differently labeled with fluorescent markers.
Then what you can do? You can quicken the process. , One lane gel will be much more
rapid more number of bases can be sequenced if you have radioactivity then you have
to take the photograph of that, a photographic plate has to be put on top of the gel and the
next day you have to take the print of that, you have to develop that.
But when you have these fluorescent labels, you do not care whether something has
passed through. Suppose this color has passed through, that goes away into the solution,
you do not need to know what goes away in the solution what you need to know is that
what comes after what (basically the sequence of colors). If this blue violet band comes
first, then the second one which was following it was yellow, then that will come here
and then the detector records the color and then all these go away.
So, you can actually sequence much greater number of bases in one attempt. About 600-
700 base sequences can be done by this technique. Now why this became important? As
I told you that the genome mapping of different organisms of different living species was
taken up scientist wanted to know that why a cat is different from a dog or why a dog is
different from a man there must be differences in their genome sequence, because
everything is ultimately dependent on the base sequence of the DNA that are present in
the cells.
So, that is why this became a very important issue and a big program was taken which
was called the ‘Human Genome Project’. So, they attempted to map the entire human
الجينوم. Now how many base pairs are there in the human genome? Around 3.2 billion
قاعده ازواج.
So, if the Sanger’s method would have been followed to sequence the entire human
genome, it would have taken 10-12 years to complete that or maybe more. لكن،
after all these changes, this is one project, which was finished much earlier than the
predicted date. This could happen because of these new developments that took place in
the late 20th century.

Why this became very important? We know that the same drug does not work equally for
all of us. A drug may cause acidity to some person, whereas the same drug works very
well for another person. What does it signify? That means, every person has some
differences somewhere in their gene with respect to the other person. If you know those
differences, then you can develop, what is called the personalized medicine.
So, today we are in the era of personalized medicine that means, if your gene sequence
is known and then the doctor can say that this drug is going to work for you or this drug
may not work for you. So, now, this is person specific, although we are not right there,
but now in the in the western world there are cases where personalized medicine is in
استعمال. Specially when they treat cancer, they actually adapt this strategy they determine
the gene sequence of that person very quickly, and then compare that with a healthy
individual and then immediately they can find where the problem is.
So, this type of medicine has to be given to that person. This is called personalized
medicine and that is only possible after the development of the human genome project.
(Refer Slide Time: 24:37)

All these methods that I have told you so far, the fluorescent based methods, that also
take took 3-4 years to complete the process of DNA sequencing, I give you some
statistics here. For human genome project, the goal was to sequence the individual
genome at an affordable price.

If you want to take benefit of this personalized medicine, you have to analyze the whole
gene sequence of your body, but that should be at an affordable price if it is really very
expensive, then it is very difficult. US dollar 1000 is the figure that is often quoted. هذه
would permit comparison of many thousands of human genome sequence and hence the
correlation of specific sequence with susceptibility to particular disease. I said that
different diseases have different gene sequence.
But now they want that the human genome sequence should be known very quickly,
because when somebody is suffering from some terminal illness, you need to know the
sequence very rapidly, so that the proper medicine can be given and also it should be at
an affordable price. It cannot cost thousands and thousands of dollars that is number 1
and number 2 is that it cannot take months and months or years to know the sequence,
because somebody who is terminally ill, he might have only 2 to 3 months.
So, by that time you have to know the gene sequence and start giving the proper
دواء. So, now, it is the era of Next Gen Sequencing (next generation sequencing).
Now, we have more rapid method of sequencing, even within 4-5 days, the mapping the
base sequence can be completed. In Next Gen Sequencing, there are different methods. أنا
will not describe all the methods. I will just take one of the methods of that next Gen
Sequencing.
There is a method which is called the Illumina method that is developed in Cambridge.
In earlier methods, whatever we have said, they are not real time determination of the
base sequence. What is real time determination of base sequence? عندما
dideoxynucleoside triphosphate is added, or any other correct base is added, at that time
you cannot determine the result. You have to wait till all the reactions are over and then
compile them and do the electrophoresis. That is not real time because the you first do
the reactions, then you do the electrophoresis and then come to the result.
Under the real time analysis, as soon as the base is taken, you get to know which base
وقد تم اتخاذ. What I am saying is that under real time analysis, whenever a base is
added, you immediately know that which base is being taken and whenever the next base
is added you immediately get to know what is added. This is called real time
عزم.

This appeared to be very difficult at the beginning. The base is having this fluorescent
marker and you have to amplify these strands. So, you have many strands suppose and
the base has a fluorescent marker. Suppose the there is a requirement of A. So, you do
not add the dideoxy NTP here if there is requirement of A you attach a fluorescent label
to A and you should have a detector which is extremely powerful that whenever A is
added there is a constant shining of the light at this point. So, A is added and you know
that what type of fluorescence you are getting and from that color of the fluorescence,
you can determine the sequence.
But today I am just concentrating on another method which is called pyrosequencing.
Pyrosequencing is a method based on this simple chemistry. I told you that the DNA
polymerase joins the growing oligonucleotide to a new nucleoside triphosphate. So, for
DNA synthesis, what you need is the oligo nucleotide which should have a 3’ OH and
which should have a triphosphate.
So, this is your the chemistry that is happening. This 3’ OH is attacking this phosphate
and pyrophosphate (PPi) goes out. A diphosphate or a pyrophosphate (PPi) is an
inorganic phosphate, no organic, no carbon is there. So, an inorganic diphosphate comes
خارج. If the DNA had n number of nucleotides earlier, after this reaction, you have n plus
1 number of nucleotide and one pyrophosphate molecule is generated.
(Refer Slide Time: 31:33)

So, the first reaction is that you have a DNA residue, you added the dNTP. لذا ، أ
pyrophosphate P2O7

4-(pyrophosphate) is formed. It has been found that there is a
compound called adenosine-5’-phosphosulfate that means, you have adenosine and you
have a phosphosulfate at the 5’-position.
. There is an enzyme called ATP sulfurylase. What is sulfurylase? It breaks this P-O
bond and puts the pyrophosphate here. If you put the pyrophosphate that means this
becomes triphosphate and the sulfate comes out.
So, the reaction is pyrophosphate plus adenosine phosphosulfate in presence of the
enzyme ATP sulfurylase gives ATP plus sulphate. So, a molecule of high energy is
generated which is known as ATP. Now this ATP reacts with a compound called
luciferin. Luciferin is a compound which is present in fireflies, which gives light, light
comes out of the insect which is called the firefly.
So, this luciferin in presence of molecular oxygen and in presence of this enzyme which
is called luciferase, it reacts with ATP and then forms a compound which is called
oxyluciferin this is its structure and it generates light. So, in the pyrosequencing, you
take your DNA strand, you add the primer, that is requirement.Suppose you have added
dATP and then you have added ATP sulfurylase and you have added luciferin and you
also add luciferase that is the enzyme which generates light when luciferin reacts with
the ATP in presence of oxygen. So, light comes out.
There is another enzyme that you have to add which is known as apyrase,. Now I have
told you what is the function of this ATP sulfurylase the function of ATP sulfurylase is
to generate ATP from pyrophosphate. Actually you have to add that adenosine-5’-
phosphosulfate in the same test tube.
So, you have added all this. So, first the P2O7

4- (diphosphate) is generated then it reacts
with this adenosine-5’-phosphosulfate, in presence of ATP sulfurylaseto generate ATP.
As soon as ATP is generated, luciferin reacts with the ATP. In presence of oxygen and
luciferase, it generates light and then there is an enzyme apyrase. Now you have added
dATP to start with. Suppose your DNA that you want to sequence does not require dATP
to start with, maybe it requires a dGTP to start with, but you do not know which one is
the first one.

So, you added first dATP suppose it does not react if it does not react that means, there
will be no generation of pyrophosphate. Now before you add the dGTP, you have to
break down this dATP. So, this apyrase is an enzyme which has the ability to break
down these dNTPs. That means, if unused, then these dATP or dGTP or dCTP or dTTP
will be broken down into nucleoside monophosphate (harmless products) by apyrase.
So, basically what happens now as you have added dATP, if it reacts then you will get
some light if it does not react then what will happen? It will be broken down by apyrase
into some harmless thing. So, after some time, you add the dGTP, if that reacts, then you
will get light. If that does not react, that will be broken down by the apyrase and then if
you add CTP, if it does not react that will be broken down.
So, you will get no light in case of C and in case of the next one say TTP, either you will
get light or you may not get some light. So, basically the whole instrument measures the
ضوء. It actually measures how much light is generated, when you are adding deoxy
ATP, deoxy GTP, deoxy CTP or when you are adding deoxy TTP.
(Refer Slide Time: 39:13)

So, if there is no light that means, that base is not required at that moment. إذا كان هناك
light that means, there is a requirement of that base at that moment. If there are two
consecutive Gs which are required, as you have added your dGTP, both will be
incorporated one after another, and you will get a light which will be having twice the
intensity as that obtained for the requirement of only one GTP. Ultimately, you have this

kind of a graph. In this direction (along X-axis), you have the bases that you are adding
one after another and on this Y-axis, you have the intensity of the light.
So, how to know what is the sequence? You have added G here and that is the light
intensity that you got. Remember the light comes from the generation of ATP, which
reacts with luciferin to give oxyluciferin, and that happens in presence of luciferase
enzyme to gives light. The intensity of the light will depend on how many Gs or how
many Cs are required. So, now, after G you add that dTTP and you see that the light
intensity is double with respect to C this means two Ts are there. Then you have added
C with practically no light intensity. That means we do not have a C after T. Then
addition of dATP yielded double intensity light, that means two As are there.
Light intensity upon addition of dCTP is three times with respect to your base value.
Base value is basically the intensity obtained when one of the bases are incorporated. وبالتالي،
now, it is easy to read the sequence of the DNA. This is G then the T has twice the
intensity of the light that is emitted when you have added the dGTP.
So, that will be two Ts that means, there are two Ts because you have double the
intensity then there is no C, because you have not got any light then there are two As
then there is a G, one G because the light is the base value of the light that you get then
there is no T, then there are 3C s. So you may have the following sequence: It is G T T A
A G C C C A T A A A C C G C C A.
So, that is the way to read this diagram. This is what is called pyrosequencing and I say
there are other methods in Next Gen Sequencing. All are direct methods that means at
the time when it is added, you are analyzing the product and then your computer will
ultimately tell you what is coming out and finally what is the sequence of the bases.
شكرا لك.


شاهد الفيديو: Sanger sequencing (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Roswalt

    نعم ، لقد تم حلها.

  2. Brami

    أنا قادر على تقديم المشورة لك بشأن هذه المسألة ، وخاصة التزاما بالمشاركة في المناقشة.

  3. Mora

    أعتذر ، لكنه لا يأتي في طريقي. هل هناك متغيرات أخرى؟

  4. Tariq

    رائعة ، معلومات جيدة جدا

  5. Bryen

    يؤسفني أنني لا أستطيع المشاركة في المناقشة الآن. القليل جدا من المعلومات. لكن الموضوع يهمني كثيرا.



اكتب رسالة